Korean J. Plant Res. 25(5):568-577(2012) http://dx.doi.org/10.7732/kjpr.2012.25.5.568 Original Research Article 임태진 *, 최무영 1, 박희준 2 상지대학교동물생명자원학부동물생명공학전공, 1 식품영양학과, 2 제약공학과 Antioxidative Activity of Rumex crispus L. Extract Tae-Jin Rhim*, Moo-Young Choi 1 and Hee-Juhn Park 2 Department of Animal Biotechnology in Division of Animal and Life Resources, 1 Department of Food and Nutrition, 2 Department of Pharmaceutical Engineering, Sangji University, Wonju 220-702, Korea Abstract - The objective of this study was to investigate the antioxidative capacity of ethanol extracts from Rumex crispus L. The concentration of R. crispus L. extract at which DPPH radical scavenging activity was inhibited by 50% was 2.15 mg/ml, which was lower than that of α-tocopherol (0.43 mg/ml), as compared to 100% by pyrogallol as a reference. Total antioxidant status was examined by total antioxidant capacity against ABTS radical reactions. Total antioxidant capacities of R. crispus L. extract at concentrations of 0.1 and 1 mg/ml were 0.47 and 2.33 mm Trolox equivalents, respectively, which were higher than those of α-tocopherol. Superoxide scavenging activities of R. crispus L. extract at concentrations of 0.1 and 1 mg/ml were 21.5 and 78.9%, respectively, which were not significantly (p>0.05) different from those of catechin. Oxygen radical absorbance capacities of R. crispus L. extract at concentrations of 20 and 100 μg/ml were 62.5 and 156.4 μm μm Trolox equivalents, respectively, which were lower than those of ascorbic acid. Cupric reducing antioxidant capacities of R. crispus L. extract at concentrations of 0.1 and 1 mg/ml were 0.28 and 1.88 mm Trolox equivalents, which were similar or significantly (p<0.05) higher than those of α-tocopherol, respectively. R. crispus L. extract prevented supercoiled DNA strand breakage induced by hydroxyl radical and peroxyl radical. Total phenolic contents of R. crispus L. extract at concentrations of 0.5 and 5 mg/ml were 0.58 and 3.85 mm gallic acid equivalents, respectively. R. crispus L. extract at concentration of 0.1 and 0.5 mg/ml inhibited 0.2 mm tert-butyl hydroperoxide-induced cytotoxicity by 38.5 and 63.5%, respectively, in HepG2 cell culture system. Thus, strong antioxidant and cytotoxicity-inhibiting effects of R. crispus L. extract seem to be due to, at least in part, the prevention from free radicals-induced oxidation as well as high levels in total phenolic contents. Key words - Rumex crispus L., DPPH radical, ABTS radical, Superoxide, ORAC, CUPRAC, Supercoiled DNA breakage, Total phenolic content, Cytotoxicity 서언 활성산소라고도불리우는반응산소종 (reactive oxygen species, ROS) 은호흡과정에서체내에유입된산소가산화과정에이용되면서여러대사과정에서생성되어생체조직을공격하고세포를손상시키며, 암, 동맥경화증, 당뇨병등많은질병들이 ROS와관련이있는것으로보고되고있다 (Halliwell et al., 1992; Thannickal and Fanburg, 2000). 항산화제는이러한 ROS를제거시킴으로써생체내 * 교신저자 (E-mail) : tjrhim@sangji.ac.kr 산화성스트레스로인하여생성되는산화물질들을방어하는작용을한다. 최근에는페놀화합물과같이식물계에널리분포되어있는천연항산화제의중요성과이에관한연구가증대되고있다. 소리쟁이 (Rumex crispus L.) 는마디풀목마디풀과에속하는여러해살이풀로써, 들습지에서잘자라며, 급성간염, 기관지염, 창독등에효능이있다고알려져있다 (Bae, 2000). 소리쟁이의유용성분으로는사포닌, 탄닌, 플라보노이드, anthraquinone 등이알려져있고 (Kim et al., 1998; Günaydin et al., 2002; Hwang et al., 2004), c 본학회지의저작권은 ( 사 ) 한국자원식물학회지에 -568- 있으며, 이의무단전재나복제를금합니다.
항균 (Yildirim et al., 2001; Jeong et al., 2006), 항진균 (Kim et al., 2004), 항염증 (Lee et al., 2007) 활성등이보고된바있다. 소리쟁이뿌리, 종자또는지상부추출물은 butylated hydroxyanisole(bha) 이나 ascorbic acid 와유사한 DPPH 라디칼소거활성 (Jeong et al., 2006; Kim et al., 2010; Maksimović et al., 2011; Suh et al., 2011) 과 singlet oxygen 소거활성 (Suh et al., 2011) 을나타내었다고보고된바있다. 또한, 소리쟁이열매추출물의지질과산화억제효과도보고된바있다 (Maksimović et al., 2011). 이와같이, 소리쟁이추출물의항균, 항염증및항산화효과에관해보고된바는있으나, 다양한자유라디칼에대한소거활성과세포독성억제효과에관한연구결과는거의보고된바없다. 따라서, 본연구에서는소리쟁이추출물의자유라디칼소거, 총페놀함량및세포독성억제등항산화활성을조사하였다. 재료및방법시약 Fetal bovine serum(fbs) 은 Lonza(Walkersville, MD, USA) 로부터구입하였고, pbr322 DNA 는 KOSCHEM(Seoul, Korea) 으로부터구입하였으며, GelRed nucleic acid gel stain은 Biotium(Hayward, CA, USA) 으로부터구입하였다. 항산화활성분석과세포배양에사용한다른모든시약들은분석급이상으로 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA) 로부터구입하여사용하였고, HPLC 분석에사용한 CH 3 CN, methanol, trifluoroacetic acid 는모두 HPLC 급으로 Avantor Performance Materials(Center Valley, PA, USA) 에서구입하여사용하였다. 소리쟁이추출물소리쟁이는경상북도경산시에서구입하여본연구의시료로사용하였다. 건조된시료 500 g을마쇄하여, 수직으로환류냉각관을부착시킨 round flask에넣고 450 ml의 95% 에탄올을첨가하여혼합한후, heating mantal(e105, Minsung Scientific Co., Seoul, Korea) 로 80 에서 4시간강열환류추출하였다. 이과정을 3회반복하여얻은추출액을 Whatman No.2 여과지로여과하여불순물을제거하였다. 여과된용액은감압농축기 (Eyela N-1 NW, Tokyo Rikakikai Co., Tokyo, Japan) 를사용하여 45 에서감압농축시켰으며, 동결건조후 72.5 g의추출물을회수하였다. 소리쟁이추출물은분석시까지 -80 에서보관하였다. 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 소거활성측정 DPPH 라디칼소거활성은 Malterud et al.(1993) 의방법에따라측정하였다. DPPH 용액 (45 μg/ml methanol) 을추출물과혼합한다음 515 nm에서흡광도의감소를 30 초간격으로 5분간측정하였다. 흡광도는 GENESYS 10S spectrophotometer(thermo Scientific, Waltham, MA, USA) 를사용하여측정하였다. DPPH 소거활성은 pyrogallol 용액 (125 μg/ml DMSO) 의흡광도감소를 100% 로기준하여표기하였다. 또한, 양성대조군으로 α-tocopherol 을사용하여 DPPH 소거활성을비교조사하였다. Total antioxidant capacity(tac) 측정총항산화능 (total antioxidant status) 은 Trolox equivalent antioxidant capacity(teac) 방법을수정한 Erel(2004) 의방법에따라 TAC 를측정하였다. 추출물에 0.35 M acetate 완충용액과 0.89 mm 2,2'-azino-bis(3-ethyl benzothiazoline- 6-sulfonic acid) diammonium salt(abts) 용액및 0.44 mm H 2 O 2 용액등을첨가하고혼합한뒤 5분후에 660 nm 에서흡광도를측정하였다. Trolox를표준시약으로사용하여표준곡선을작성하였고, TAC 활성은 mm Trolox equivalent 로표기하였다. 또한, 양성대조군으로 α-tocopherol 을사용하여 TAC를비교조사하였다. Superoxide 소거활성측정 Superoxide 소거활성은 Liu et al.(1997) 의방법에따라측정하였다. 추출물에 62 μm nitro blue tetrazolium (NBT) 과 98 μm β-nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) 를함유한 20 mm Tris 용액 (ph 8.0) 을혼합한다음, 20 mm Tris 용액과 33 μm phenazine methosulfate (PMS) 를각각첨가하였다. 즉, 비효소적으로 PMS/NADH 로유발된 superoxide 는 NBT를자주색의 formazan 으로환원시키며, 생성된 formazan을측정하기위해 560 nm 에서 10 분동안반응물의흡광도를측정하였다. 추출물의 superoxide 소거활성 (%) 은 [( 흡광도추출물무첨가 -흡광도추출물 )/ 흡광도추출물무첨가 ] 100의공식으로계산하였다. 또한, 양성 -569-
韓資植誌 Korean J. Plant Res. 25(5) : 568~577(2012) 대조군으로 catechin 을사용하여 superoxide 소거활성을비교조사하였다. Oxygen radical absorbance capacity (ORAC) 측정 ORAC는 Huang et al.(2002) 의방법에따라추출물에 6 10-5 mm fluorescein 용액을첨가하고 37 에서 10분간가열한다음, 19 mm 2,2'-azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride(aaph) 용액을첨가한뒤, GEMINI XS fluorescence microplate reader(molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) 를사용하여 excitation 파장 485 nm와 emission 파장 530 nm에서 2분간격으로 60분간형광도를측정하였다. 표준시약으로 Trolox를사용하였으며, 표준시약과추출물의 area under the curve(auc) 를측정하였다. ORAC 는표준시약농도와 AUC 간의회귀곡선을이용하여 μm Trolox equivalent 로표기하였다. 또한, 양성대조군으로 ascorbic acid를사용하여 ORAC를비교조사하였다. Cupric reducing antioxidant capacity(cuprac) 측정 CUPRAC는 Apak et al.(2004) 의방법에따라측정하였다. 추출물에 2.44 mm cupric chloride 용액과 1.83 mm neocuproine 및 0.24 M ammonium acetate 완충용액 (ph 7.0) 등을첨가하고혼합한뒤, 실온에서 1시간방치한후 450 nm에서흡광도를측정하였다. Trolox를표준시약으로사용하여표준곡선을작성하였고, CUPRAC 활성은 mm Trolox equivalent 로표기하였다. 또한, 양성대조군으로 α-tocopherol 을사용하여 CUPRAC를비교조사하였다. Supercoiled DNA Strand 절단 1 Hydroxyl radical 에의한 DNA strand 절단은 Hiramoto et al.(1996) 의방법에따라측정하였다. Supercoiled pbr322 DNA 0.2 μg에추출물을넣고 0.1 mm H 2O 2 용액과 0.1 mm FeSO 4 용액을함께 37 에서 1시간배양하였다. 양성대조군으로 sesamol 을사용하였다. 2 Peroxyl radical 에의한 DNA strand 절단은 Hu et al.(2000) 의방법에따라측정하였다. Supercoiled pbr322 DNA 0.2 μg에추출물을넣고 5 mm AAPH와함께 37 에서 2시간배양하였다. 양성대조군으로 Trolox를사용하였다. 배양이끝난다음, gel loading buffer 를첨가하고, 0.01% GelRed nucleic acid stain이포함된 0.8% agarose에서전기영동을실시하였다. 자외선하에서사진을촬영한후, DNA band 의 density 는 Image J 1.44 program(nih, Bethesda, MD, USA) 을사용하여측정하였으며, 소리쟁이추출물의 supercoiled DNA strand 절단억제효과는 supercoiled DNA strand의 retention percent를측정함으로써조사하였다. Retention percent 는 (A sample /A native ) 100의공식으로계산하였으며, A sample 은라디칼과추출물처리시의 supercoiled DNA strand의 amount를나타내며, A native 는라디칼과추출물무처리시의 supercoiled DNA strand 의 amount 를나타낸다. 총페놀함량 (total phenolic content) 측정추출물내총페놀함량은 Singleton and Orthofer(1999) 의방법에따라추출물에 0.08 N Folin-Ciocalteu 시약을첨가하고실온에서 6분간방치한다음, 3% Na 2 CO 3 용액을첨가하고 90분간방치한뒤, 760 nm에서흡광도를측정함으로써결정하였다. 표준시약으로 gallic acid를사용하여표준곡선을작성하였고, 총페놀함량은 mm gallic acid equivalent 로표기하였다. 세포독성억제효과측정소리쟁이추출물의세포독성억제효과를조사하기위해, tert-butyl hydroperoxide(t-bhp) 로유도된 HepG2 세포배양실험에서추출물첨가에의한세포생존율을측정하였다. HepG2 세포 (KCLB No. 88065) 는한국세포주은행으로부터구입하였다. HepG2 세포를 10% FBS 와 100 U/mL penicillin 및 100 μg/ml streptomycine 이포함된 RPMI-1640 배지를사용하여 5 10 4 cells/well이되도록 24-well plate(spl, Pocheon, Korea) 에분주하고 37, 5% CO 2 incubator(napco 6001, Precision Scientific In., Chicago, IL, USA) 에서배양하였다. 100% confluent 에도달한후 t-bhp(0.2 mm) 또는소리쟁이추출물이포함된배지로교체하고 5시간동안배양하였다. 배양액을제거하고세포단층에 Mosmann(1983) 의방법에따라 thiazolyl blue tetrazolium bromide(mtt) 시약 (5 mg/ml) 을첨가하고 37, 5% CO 2 incubator 에서 3시간배양한후 0.04 M HCl 용액을첨가한뒤 570 nm에서흡광도를 -570-
측정함으로써 MTT 값을측정하였다. 세포생존율은대조군의 MTT 값을 100% 로기준하여처리군의 MTT 값으로표기하였다. HPLC 분석표준화합물과추출물을각각메탄올에녹이고, 0.50 μm syringe filter로여과한후, Prostar 210 solvent delivery module, Prostar 325 UV-Vis detector로구성된 HPLC system(varian Inc., Walnut Creek, CA, USA) 에주입하였다. HPLC 용컬럼은 Shiseido(Tokyo, Japan) Capcell Pak C18 컬럼 (5 μm, 250 mm 4.6 mm i.d.) 이었다. 이동상용매로 A 용매는 0.05% trifluoroacetic acid(tfa) 용액을사용하였고, B 용매는 MeOH-CH 3CN(60:40) 을포함한 0.05% TFA 용액을사용하였으며, 이동상의흐름속도는 1.0 ml/min이었고, 용리구배조건은다음과같다 (0 min, 85% A:15% B; 0-35 min, 35% A:65% B; 35-42 min, 0% A:100% B; 42-49 min, 85% A:15% B). 자외선흡광도는고정파장 254 nm에서 40분동안측정하였다. 표준액으로부터각각의 peak 면적을얻어표준검량선의회귀방정식을작성하였다. 추출물 (1 mg/ml) 을주입하여 chromatogram 의 peak를얻고, 각표준화합물의회귀방정식을이용하여농도를측정함으로써, 추출물중표준화합물의함량을측정하였다. 통계분석추출물농도별항산화활성은일원분산분석을사용하여조사하였고, 농도별평균값의차이는 Duncan's multiple range test(steel and Torrie, 1980) 를사용하여 p<0.05 에서유의성을조사하였다. 또한, 추출물과양성대조군의항산화효능비교는대응표본 T-검정을사용하여 p<0.05 에서유의성을조사하였다. 결과및고찰 DPPH 라디칼소거활성소리쟁이추출물의농도별 DPPH 라디칼소거활성은 Fig. 1에나타나있다. Pyrogallol의억제율을 100% 로기준하였을때소리쟁이추출물의 0.01 mg/ml 농도에서 DPPH 라디칼소거활성은 2.2% 이었고, 추출물농도가증가할수록소거활성도증가하여, 0.1, 0.5, 1, 2.5 및 5 Fig. 1. DPPH radical scavenging activities of R. crispus L. extracts. Data results were expressed as % radical scavenging activity relative to 100% radical scavenging activity of pyrogallol solution as a reference. Each bar represents the mean ± SD of quadraplicate determinations. : extract, : α-tocopherol (positive control). abcdef Values with different letters are significantly different at p<0.05. * p<0.05 when compared with the extract within same group. mg/ml 농도의추출물은각각 11.9, 33.4, 46.5, 66.3 및 83.3% 의소거활성을나타내었다. 반면에, 양성대조군으로사용한 α-tocopherol 의 DPPH 라디칼소거활성은 0.1, 0.5 및 1 mg/ml 농도에서각각 20.0, 71.1 및 94.6% 로나타나, 소리쟁이추출물의 DPPH 라디칼소거활성이 α -tocopherol 의약절반임을알수있었다. 또한, 추출물농도와 DPPH 라디칼소거활성간의회귀분석결과, 50% 의라디칼소거활성에필요한소리쟁이추출물의농도 (IC 50 ) 는 2.15 mg/ml 로나타난반면, α-tocopherol 의 DPPH IC 50 은 0.43 mg/ml 로나타나, 소리쟁이추출물의 DPPH 라디칼소거활성이 α-tocopherol 에비해낮음을알수있었다. 소리쟁이의 DPPH 라디칼소거활성은부위및추출용매별로상이하게보고되고있다. 소리쟁이뿌리에탄올추출물의 DPPH 라디칼소거활성은 BHA 활성의 1/3이라고보고된바있으나 (Kim et al., 2010), 종자또는지상부에틸아세테이트추출물및열매메탄올추출물의 DPPH 라디칼소거활성은 BHA와유사하게나타났다고보고된바있다 (Jeong et al., 2006; Maksimović et al., 2011; Suh et al., 2011). -571-
韓資植誌 Korean J. Plant Res. 25(5) : 568~577(2012) TAC 총항산화능은 Trolox를표준물질로사용하여 ABTS 라디칼에대한소거활성을흡광도로측정하였으며, 소리쟁이추출물의농도별 TAC는 Fig. 2에나타나있다. 소리쟁이추출물 0.01 mg/ml 농도의 TAC는 0.14 mm Trolox equivalent 이었으며, 추출물농도가증가함에따라 TAC 도비례적으로증가하여, 0.1, 0.5 및 1 mg/ml 농도에서는각각 0.47, 1.33 및 2.33 mm Trolox equivalent 를나타내었다. 반면에, 양성대조군으로사용한 α-tocopherol 의 TAC는 0.01, 0.1, 0.5 및 1 mg/ml 농도에서각각 0.11, 0.29, 0.83 및 1.49 mm Trolox equivalent 로측정되었다. 모든농도에서소리쟁이추출물의총항산화능이 α -tocopherol 에비해유의적으로 (p<0.05) 높게관찰되어, 소리쟁이추출물의 ABTS 라디칼소거활성이 α-tocopherol 에비해탁월함을알수있었다. Superoxide 소거활성 Superoxide 소거활성은추출물무첨가군의흡광도변화를 100% 로기준하여, 추출물첨가군의흡광도변화를 superoxide 생성억제율로표시하였다. 소리쟁이추출물의농도별 superoxide 소거활성은 Fig. 3에나타나있다. 소리쟁이추출물 0.01 mg/ml 농도의 superoxide 소거활성은 3.1% 이었으며, 추출물농도가증가함에따라소거활성도증가하여, 0.1, 0.5 및 1 mg/ml 농도에서 superoxide 소거활성은각각 21.5, 61.1 및 78.9% 로나타났다. 반면에, 양성대조군으로사용한 catechin 의 superoxide 소거활성은 0.01, 0.1, 0.5 및 1 mg/ml 농도에서각각 1.8, 22.3, 60.8 및 80.4% 로측정되었다. 모든농도에서소리쟁이추출물과 catechin 간의 superoxide 소거활성에는유의적인 (p>0.05) 차이가관찰되지않아, 소리쟁이추출물의 superoxide 소거활성이 catechin 의활성과유사함을알수있었다. ORAC ORAC는자유라디칼손상에대한억제시간과억제율을모두반영하는항산화능으로, Trolox 를표준물질로사용하여 AAPH 에의해생성된 peroxyl 라디칼에대한소거활성을나타낸다. 소리쟁이추출물의농도별 ORAC는 Fig. 4 에나타나있다. 10 μg/ml 농도에서소리쟁이추출물의 ORAC는 38.2 μm Trolox equivalent 이었으며, 추출물농도가증가함에따라 ORAC도증가하여, 20, 50 및 100 μg/ml 농도의소리쟁이추출물의 ORAC는각각 62.5, 112.2 및 156.4 μm Trolox equivalent 로나타났다. 반면에, 양성대조군으로사용한 ascorbic acid의 ORAC는 10, 20, 50 및 100 μg/ml 농도에서각각 39.9, 87.8, 151.1 및 160.6 μm Trolox equivalent로측정되었다. 10 μg/ml 농도를제외 Fig. 2. Total antioxidant capacity of R. crispus L. extracts. Data results were expressed as in terms of mm Trolox equivalent. Each bar represents the mean ± SD of quadraplicate determinations. : extract, : α-tocopherol (positive control). abcd Values with different letters are significantly different at p<0.05. * p<0.05 when compared with the extract within same group. Fig. 3. Superoxide radical scavenging activities of R. crispus L. extracts. Data results were expressed as % inhibition of the activity. Each bar represents the mean ± SD of quadraplicate determinations. : extract, : catechin (positive control). abcd Values with different letters are significantly different at p<0.05. -572-
Fig. 4. Oxygen radical absorbance capacity of R. crispus L. extracts. Data results were expressed as in terms of μ M Trolox equivalent. Each bar represents the mean ± SD of triplicate determinations. : extract, : ascorbic acid (positive control). abcd Values with different letters are significantly different at p<0.05. * p<0.05 when compared with the extract within same group. 한모든농도에서소리쟁이추출물의 ORAC가 ascorbic acid에비해유의적으로 (p<0.05) 낮게관찰되어, 소리쟁이추출물의 peroxyl 라디칼소거활성이 ascorbic acid에비해낮음을알수있었다. CUPRAC CUPRAC는 Trolox를표준물질로사용하여구리이온환원력의활성을흡광도로측정하였으며, 소리쟁이추출물의농도별 CUPRAC는 Fig. 5에나타나있다. 소리쟁이추출물 0.05 mg/ml 농도의 CUPRAC는 0.12 mm Trolox equivalent 이었으며, 추출물농도가증가함에따라 CUPRAC 도비례적으로증가하여, 0.1, 0.2, 0.5 및 1 mg/ml 농도에서는각각 0.28, 0.51, 1.24 및 1.88 mm Trolox equivalent 를나타내었다. 반면에, 양성대조군으로사용한 α-tocopherol 의 CUPRAC 는 0.05, 0.1, 0.2, 0.5 및 1 mg/ml 농도에서각 각 0.13, 0.25, 0.48, 1.08 및 1.67 mm Trolox equivalent 로측정되었다. 저농도에서는유의적차이가관찰되지않았지만, 0.5 mg/ml 이상의농도에서소리쟁이추출물의 CUPRAC가 α-tocopherol 에비해유의적으로 (p<0.05) 약간높게관찰되어, 소리쟁이추출물의구리이온환원력이 Fig. 5. Cupric reducing antioxidant capacity of R. crispus L. extracts. Data results were expressed as in terms of mm Trolox equivalent. Each bar represents the mean ± SD of triplicate determinations. : extract, : α-tocopherol (positive control). abcde Values with different letters are significantly different at p<0.05. * p<0.05 when compared with the extract within same group. 우수함을알수있었다. Supercoiled DNA Strand 절단억제효과 DNA 전기영동을이용하여소리쟁이추출물농도별 hydroxyl 라디칼및 peroxyl 라디칼에의해유도된 DNA strand 절단에미치는효과는 Fig. 6과 Table 1에나타나있다. Fenton 시약인 H 2O 2 와 FeSO 4 처리에의해생성되는 hydroxyl 라디칼존재하에, pbr322 DNA 의 supercoiled form은 nicked open circular form 및 linear form 으로전환되었다 (lane 1 vs 2, Fig. 6A). Hydroxyl 라디칼존재하에 plasmid DNA 를소리쟁이추출물과함께배양하였을때, 0.001 mg/ml 농도의추출물첨가는 supercoiled DNA strand 절단에영향을주지않았다 (lane 2 vs 3, Fig. 6A). 그러나, 추출물 농도가증가함에따라 nicked open circular form은감소한반면 supercoiled form은증가하여, 0.01 및 0.05 mg/ml 농도에서 supercoiled DNA strand 의 retention percent 는각각 29.2 및 39.5% 로나타났다. 특히, 0.1 mg/ml 농도의소리쟁이추출물과양성대조군으로사용한동일한농도의 sesamol 간에 hydroxyl 라디칼에대한 supercoiled DNA strand 의 retention percent(82.9 vs -573-
韓資植誌 Korean J. Plant Res. 25(5) : 568~577(2012) (A) (B) Fig. 6. Electrophoresis of pbr322 DNA treated with hydroxyl radical and peroxyl radical in the presence of R. crispus L. extracts. (A) hydroxyl radical was generated by 0.1 mm H 2 O 2 and 0.1 mm FeSO 4 ; (B) peroxyl radical was generated by 5 mm AAPH. Lane 1, DNA alone; Lane 2, DNA+radical; Lane 3, DNA+radical+0.001 mg/ml extracts; Lane 4, DNA+radical+0.01 mg/ml extracts; Lane 5, DNA+radical+0.05 mg/ml extracts; Lane 6, DNA+ radical+0.1 mg/ml extracts; Lane 7, DNA+radical+0.1 mg/ml sesamol (A) or 0.01 mg/ml Trolox (B). N, nicked open circular form; L, linear form; S, supercoiled form. 94.2%) 에는유의적 (p>0.05) 차이가발견되지않았다 (lane 6 vs 7, Fig. 6A). AAPH 처리에의해생성되는 peroxyl 라디칼존재하에, pbr322 DNA 의 supercoiled form은 nicked open circular form 및 linear form 으로전환되었다 (lane 1 vs 2, Fig. 6B). Peroxyl 라디칼존재하에 plasmid DNA 를소리쟁이추출물과함께배양하였을때, 0.001 mg/ml 농도의추출물첨가는 supercoiled DNA strand 절단에영향을주지않았으며 (lane 2 vs 3, Fig. 6A), 0.01 mg/ml 농도에서도 supercoiled DNA strand 의 retention percent 는 9.9% 에지나지않았다. 그러나, hydroxyl 라디칼의경우와는달리, peroxyl 라디칼존재하에 0.05 mg/ml 농도의추출물첨가시 peroxyl 라디칼에의한 supercoiled DNA strand 의 retention percent는 66.0%(vs 39.5%) 로높게나타났다 (lane 5, Fig. 6A vs lane 5, Fig. 6B). 추출물농도가증가함에따라 nicked open circular form은감소한반면 supercoiled form은증가하여, 0.1 mg/ml 농도의추출물첨가시 supercoiled DNA strand 의 retention percent 는 82.4% 로나타났지만, 양성대조군으로사용된 0.01 mg/ml 농도의 Trolox(96.5%) 에비해서는 supercoiled DNA 절단효과가낮게관찰되었다 (lane 6 vs 7, Fig. 6B). 총페놀함량소리쟁이추출물의농도별총페놀함량은 Fig. 7에나타 Table 1. Retention percent of supercoiled DNA strand with the addition of R. crispus L. extracts in hydroxyl radicaland peroxyl radical-induced pbr322 plasmid DNA breakage Retention percent Hydroxyl radical Peroxyl radical Extract (mg/ml) 0.01 29.2 ± 5.7 a 9.9 ± 0.4 a 0.05 39.5 ± 14.0 a 66.0 ± 11.1 b 0.1 82.9 ± 2.9 b 82.4 ± 6.1 c Positive Control Z 94.2 ± 1.9 b 96.5 ± 0.7 d Supercoiled pbr322 DNA were treated with hydroxyl radical and peroxyl radical in the presence of R. crispus L. extracts. Retention percent of supercoiled DNA strand was calculated as described in Materials and Methods. The values are means±sd of triplicate determinations. Z 0.1 mg/ml sesamol for hydroxyl radical- and 0.01 mg/ml Trolox for peroxyl radical-induced supercoiled DNA strand breakage. abcd Values in the same column with different superscripts are significantly different (p<0.05). Fig. 7. Total phenolic content of R. crispus L. extracts. Data results were expressed as in terms of mm gallic acid equivalent. Each bar represents the mean ± SD of quadraplicate determinations. abcde Values with different letters are significantly different at p<0.05. -574-
나있다. 소리쟁이추출물 0.1 mg/ml 농도의총페놀함량은 0.17 mm gallic acid equivalent이었으며, 추출물농도가증가함에따라총페놀함량도비례적으로증가하여, 0.5, 1, 2.5 및 5 mg/ml 농도에서각각 0.58, 1.04, 2.33 및 3.85 mm gallic acid equivalent로나타났다. 항산화활성이높다고알려진개머루덩굴과만병초의 1 mg/ml 농도에서총페놀함량이각각 1.12와 1.25 mm gallic acid equivalent 로보고된바있어 (Rhim and Choi, 2010, 2011), 소리쟁이추출물의총페놀함량이높음을알수있었다. 세포독성억제효과 소리쟁이추출물의농도별세포독성억제효과는 Fig. 8 에나타나있다. 세포생존율은대조군 (t-bhp 무첨가군 ) Fig. 8. The effect of R. crispus L. extracts on HepG2 cell viability. HepG2 cells were cultured for 5 h in the presence of 0.2 mm t-bhp and R. crispus L. extracts. Cell viability was determined using MTT method. Each bar represents the mean±sd of triplicate determinations. abcde Values with different letters are significantly different at p<0.05. 의 MTT값을 100% 로기준하여표기하였다. HepG2 세포에 0.2 mm 농도의 t-bhp 를첨가한뒤 5시간배양한결과, 세포생존율은 6.6% 로나타나, t-bhp 가 HepG2 세포독성을유발하였음을알수있었다. HepG2 세포배양에서 0.2 mm 농도의 t-bhp 존재하에소리쟁이추출물 0.01 mg/ml 농도의첨가는 11.2% 의생존율을나타내었다. 추출물농도가증가함에따라세포생존율도유의적으로 (p<0.05) 증가하여, 0.1 및 0.5 mg/ml 농도에서각각 38.5 및 63.5% 로나타났다. 본연구에서관찰된소리쟁이의간세포독성억제효과는생쥐에소리쟁이종자메탄올추출물투여시간독성이억제되었다는기존연구결과 (Lee et al., 2007) 와도일치하고있다. HPLC 분석분석에사용된 5종의표준화합물의 retention time, 표준검량선의회귀방정식및 R 2 value 는 Table 2에나타나있다. Gallic acid, catechin, quercitrin, quercetin 및 kaempferol 의 linear range는각각 3.13 100, 6.88 220, 1.56 50, 1.88 60 및 1.56 50 μg/ml이었고, detection limit 은각각 0.24, 1.51, 0.12, 0.08 및 0.13 μg/ml 이었다 (data not shown). 소리쟁이추출물의 HPLC 분석결과는 Table 3에나타나있다. Catechin의함량이 32.1 mg/g 으로가장높게나타난반면, gallic acid, kaempferol, quercitrin, quercetin 등은 1 mg/g 이하로측정되어, 이들의함량이낮은것으로나타났다. 따라서, 본연구결과들은소리쟁이추출물의강력한항산화효과와세포독성억제효과를나타내보이고있으며, 이러한효능들은적어도자유라디칼의산화억제와높은총페놀함량에기인하는것으로사료된다. 또한, 향후소리쟁이추출물의항산화성분분석과동정및항산화기전 Table 2. Retention time and calibration equation of standard phenolic compounds used for HPLC analysis Compound Retention time (min) Calibration equation (linear model) Z R 2Y Gallic acid 4.01 Y=243.27X+46.54 0.9997 Catechin 7.68 Y=28.78X+61.55 0.9995 Quercitrin 19.27 Y=458.11X+62.59 0.9998 Quercetin 24.63 Y=659.28X+87.33 0.9999 Kaempferol 28.70 Y=456.72X+56.83 0.9998 Z Y, peak area at 254 nm; X, concentration of the standard (μg/ml). Y R 2, correlation coefficient for 6 data points in the calibration curves (n=3). -575-
韓資植誌 Korean J. Plant Res. 25(5) : 568~577(2012) Table 3. Content of poly phenolic compounds in R. crispus L. extracts Compound Content (mg/g extract) Z Gallic acid 0.86 ± 0.023 Catechin 32.10 ± 0.189 Quercitrin 0.22 ± 0.007 Quercetin 0.10 ± 0.004 Kaempferol 0.31 ± 0.007 Z The values are means±sd of triplicate determinations. 타내며, 이러한효능은적어도자유라디칼의산화억제와높은총페놀함량에기인하는것으로사료된다. 사사이논문은 2011년도상지대학교교내연구비지원에의한것임. 인용문헌 연구와더불어소리쟁이추출물의천연항산화제로의개발가능성을시사하고있다. 적요본연구에서는소리쟁이에탄올추출물의항산화효과를조사하였다. Pyrogallol의억제율을 100% 로기준하였을때, DPPH 라디칼을 50% 억제시키는데필요한소리쟁이추출물의농도는 2.15 mg/ml 으로 α-tocopherol 의 IC 50 (0.43 mg/ml) 에비해높게나타났다. 총항산화능은 ABTS 라디칼에대한소거활성으로측정하였다. 소리쟁이추출물 0.1 및 1 mg/ml의총항산화능은각각 0.47 및 2.33 mm Trolox와동등한수준이었으며, α-tocopherol 에비해높게나타났다. 소리쟁이추출물 0.1 및 1 mg/ml 의 superoxide 소거활성은각각 21.5 및 78.9% 이었으며, catechin에비해차이가없었다. 소리쟁이추출물 20 및 100 μg/ml 의 peroxyl 라디칼소거활성은각각 62.5 및 156.4 μm Trolox와동등한수준이었으며, ascorbic acid에비해낮게나타났다. 소리쟁이추출물 0.1 및 1 mg/ml 의구리이온환원력은각각 0.28 및 1.88 mm Trolox와동등한수준이었으며, α-tocopherol 에비해유사하거나높게나타났다. 소리쟁이추출물은 hydroxyl 라디칼및 peroxyl 라디칼로유발된 supercoiled DNA strand 절단을억제시켰다. 소리쟁이추출물 0.5 및 5 mg/ml 의총페놀함량은각각 0.58 및 3.85 mm gallic acid와동등한수준으로높게나타났다. 또한, HepG2 세포주를이용한세포배양에서소리쟁이추출물 0.1 및 0.5 mg/ml 농도의첨가는 0.2 mm tert-butyl hydroperoxide 로유도된세포독성을각각 38.5 및 63.5% 감소시켰다. 따라서, 본연구결과들은소리쟁이추출물의강력한항산화효과와세포독성억제효과를나 Apak, R., K. Güçlü, M. Özyürek and S.E. Karademir. 2004. Novel total antioxidant capacity index for dietary polyphenols and vitamins C and E, using their cupric ion reducing capability in the presence of neocuproine: CUPRAC method. J. Agric. Food Chem. 52:7970-7981. Bae, K. 2000. The Medical Plants of Korea. Kyo-Hak Publising Co., Seoul, Korea. p. 92 (in Korean). Erel, O. 2004. A novel automated direct measurement method for total antioxidant capacity using a new generation, more stable ABTS radical cation. Clin. Biochem. 37:277-285. Günaydin, K., G. Topçu and R.M. Ion. 2002. 1,5-Dihydroxyanthraquinones and an anthrone from roots of Rumex crispus. Nat. Prod. Lett. 16:65-70. Halliwell, B., J.M.C. Gutteridge and C.E. Cross. 1992. Free radicals, antioxidants and human disease:where are we now? J. Lab Clin. Med. 119:598-620. Hiramoto, K., N. Ojima, K.I. Sako and K. Kikugawa. 1996. Effect of plant phenolics on the formation of the spin-adduct of hydroxyl radical and the DNA strand breaking by hydroxyl radical. Biol. Pharm. Bull. 19:558-563. Hu, C., Y. Zhang and D.D. Kitts. 2000. Evaluation of antioxidant and prooxidant activities of bamboo Phyllostachys nigra var. Henonis leaf extract in vitro. J Agric. Food Chem. 48:3170-3176. Hwang, S.W., T.J. Ha, J.R. Lee, J. Lee, S.H. Nam, K.H. Park and M.S. Yang. 2004. Isolation of anthraquinone derivatives from the root of Rumex japonicus H. J. Korean Soc. Appl. Biol. Chem. 47:274-278 (in Korean). Huang, D., B. Ou, M. Hampsch-Woodill, J. A. Flanagan and R. L. Prior. 2002. High-throughput assay of oxygen radical absorbance capacity (ORAC) using a multichannel liquid handling system coupled with a microplate fluorescence reader in 96-well format. J. Agric. Food Chem. 50:4437-4444. Jeong, G.T., K.M. Lee and D.H. Park. 2006. Study of -576-
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