大韓本草學會誌제 24 권제 4 호 (2009 년 12 월 ) J. Herbology 2009;24(4):101-106 九蒸九炮醱酵韓藥混合物이皮膚老化에미치는影響 최재환, 황승진, 정수나, 이윤경, 진무현, 박선규, 이천구 * 1) ( 주 ) LG 생활건강기술연구원화장품연구소 Anti-aging Effect on Skin with 9 Repetitive Steaming and Fermenting Process Herbal Composition Extract Jae-Hwan Choi, Seung-Jin Hwang, Su-Na Jeong, Yun-Kyung Lee, Mu-Hyun Jin, Sun-Gyoo Park, Cheon-Koo Lee * Cosmetic R&D Center, LG Household & Healthcare Ltd./Research Park ABSTRACT Objectives : We investigated the anti-aging effects on skin with 9 Repetitive steaming and fermenting herbal composition extract (FHE). Methods : Herbal composition is comprised of Panax Ginseng, Rehmannia glutinosa, Polygonum multiflorum and Polygonatum Sibiricum. They steamed and fermented with Saccharomyces cerevisiae and Lactobacillus brevis by turns at 9 times. We measured various effects related to skin aging such as scavenging activity against free radical, cell proliferation, collagen synthesis and toxicity of 9 repetitive steaming and fermenting herbal composition extract were evaluated and compared with herbal composition extract (HE). Results : As the number of steaming and fermenting cycle increased free-radical scavenging activity were increased. But cell proliferating ratio was not increased when the number of steaming and fermenting cycle. The FHE could significantly increase the collagen synthetic ratio compared with HE treated group. And, FHE was showed no toxicity at all tested concentrations. Conclusions : The results of our study propose that FHE has good anti-aging effects on skin. Key words : Anti-aging, Herbal Composition, Steaming, Ferment, Saccharomyces cerevisiae, Lactobacillus brevis 서론 사람의피부는노화가진행됨에따라내적으로는신진대사를조절하는각종호르몬의분비가감소하고, 면역세포및피부세포의기능과활성이저하되어생체에필요한면역단백질및생체구성단백질들의생합성이줄어들게되어생기는내인성노화 (intrinsic aging) 와, 외적으로는각종오염물질과자외선에의한광노화 (photo aging) 에의해, 주름증가, 탄력감소, 피부건조의증가가나타날뿐만아니라, 기미, 주근깨및검버섯등이증가하게되어피부외관의아름다움이점차상실하게된다 1,2). 그러나현대 에이르러젊고아름다운, 이른바동안의외모를중시하기때문에내적인자뿐만아니라자외선, 스트레스등의외적인자에의한피부노화현상을예방또는해결하고자하는욕구가크다. 韓醫學적관점에서피부의상태는외부요인뿐만아니라인체의각종내부요인에의해영향을받게되며특히五臟중肺와관련이깊다. 피부상태를판별할수있는대표적인韓醫學적診斷방법중望診은神, 色, 態의변화는주요한요소로서관찰하며, 특히피부와관련된色澤의변화는五臟의氣血盛衰를표현하는중요인자로인식되어왔다 3). 五臟을구성하는肝 心 脾 肺 腎의 * 교신저자 : 이천구, 대전시유성구장동 84 ( 주 )LG생활건강기술연구원화장품연구소 Tel : 042-860-8680 E-mail : cklee@lgcare.com 접수 :2009년 11월 19일 수정 :2009년 12월 11일 채택 :2009년 12월 21일
102 大韓本草學會誌 Vol. 24, No. 4, 2009 虛實변화는靑 赤 黃 白 黑으로표현되는五色에영향을끼쳐診斷의중요요소로서활용되고있다 4). 九蒸九炮란약재를찜통이나시루속에넣어隔水하고가열함으로써水熱과증기를이용하여약재를蒸製하는방법인蒸製法을 9 번반복시행하는것으로그목적은약성을변화시켜치료효과를높이며, 혹은가공이나절편에편리하도록하고, 아울러저장하기에도편리하도록하는데있으며, 대표적인약재들로人蔘 熟地黃 何首烏및黃精등이있다 5). 현재까지九蒸九炮를통한약효증강에대한연구를보면生地黃을九蒸九炮하여熟地黃으로제조시당이증가되고 6) 악성빈혈을유도한 Rat 의치료효능이蒸數가높아질수록증가됨을확인할수있었다 7). 그리고人蔘을九蒸九炮한黑蔘의 Ginsenoside 의함량은감소되나 Ginsenoside-Rg3 의함량이증가되며, 또한 Streptozotocin- 유도당뇨병모델마우스의혈당강하효과도유의성있음이밝혀졌으며 8), 黑蔘의산성다당체는九蒸九炮처리시초기에는증가하나 5 차이후에는감소하고페놀성물질중 maltol 의함량은 5, 7 및 9 차가진행될수록소량감소되는것을알수있었다. 그리고 DPPH 를이용한항산화능, 과산화저해능분석결과 7 차蒸炮까지는증가하나 9 차에는감소하는것으로보고되는등다양한특성이밝혀지고있다 9). 醱酵는아주오래전자연에서찾아낸우리에게매우유용한친환경가공기술로서장류, 요구르트, 술등의식품에서널리사용되었을뿐만아니라韓醫學에서도韓藥의효능을변화시키거나높이는炮製法중하나인醱酵法을이용해환자들을치료하였다. 醱酵法이란약물을일정한처리를거친후일정온도와습도의조건하에서곰팡이와효소의촉매분해작용에의해약물을발효시키는방법으로서, 韓藥에따라일정한방법을채용한후온도와습도가적합한환경에서발효를진행한다. 이는적당한수분을가지는고체기질의표면에미생물을직접배양하는방법인현대발효공학의고체발효법 (Solid culture fermentation) 및각종미생물을혼합하여발효하는혼합발효법 (Mixed culture fermentation) 과유사한방법이다. 고체발효의대표적인예로는된장 간장등으로양조식품에많이쓰이며韓藥으로는神麯 淡豆豉등이있다 10,11). 최근醱酵를이용하여韓藥의효능을높이거나새로운기전을찾으려는연구가점점늘어나고있으며특히피부에대한醱酵韓藥의다양한연구가대폭늘어나고있다. 그예로배의씨방및과피를알코올발효하면피부보습력이증강되며, 桑支 桑白皮및桑葉醱酵藥鍼液의미백효과등활발한연구가진행되고있다 12,13). 이렇듯韓藥을醱酵하면그효과가높아짐에도불구하고어떤균이관여하는지쉽게알수없었고, 오염이쉽게되며, 효과의재현성이떨어지는등의단점이있었으나, 최근연구를통하여관여미생물, 오염방지, 재현성확보이외에작용기작에대한연구가활발해져점차醱酵韓藥의실체를밝히고있다. 본연구에서는피부노화를예방혹은치유할수있는새로운醱酵韓方化粧品원료를발굴하고자, 炮製法중가장대표적인九蒸九炮및현대발효공학기술중고체발효법과혼합발효법을응용하여人蔘 生地黃 何首烏및黃精을酵母와乳酸菌을번갈아찌고고체발효한새로운발효법을개발하였고이에따른九蒸九炮발효를통해얻은발효물에대한항산화, 세포활성, 콜라겐생합성효과및세포독성등피부효능및안전성을살펴본결과우수한결과를확인할수있었기에보고하는바이다. 1. 재료 1) 약재및균주 재료및방법 본실험에서사용된人蔘 (6 년근, 충남금산 ), 生地黃 ( 충남금산 ), 何首烏 ( 경북의성 ) 및黃精 ( 충남금산 ) 등의生藥材는 ( 주 ) 오비엠랩을통하여구입하였으며, 이를세척하여사용하였으며실험에사용된균주인 Saccharomyces cerevisiae (KTCT1904) 와 Lactobacillus brevis (KTCT3102) 는한국생명공학연구원에서입수하여사용하였다. 2) 시약및기기 실험에사용된시약으로 Procollagen Type Ⅰ C-Peptide (PICP) EIA Kit는 TAKARA (Japan) 사의제품을사용하였다. Dulbecco s Modified Eagle s Medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), streptomycin 과 penicillin 등은 GibcoBRL (USA) 사제품을사용하였으며, 1,1-diphenyl-2- picryl-hydrazyl (DPPH), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrzoliumbromide (MTT), trichloro acetic acid (TCA), potassium phosphate, sodium chloride and sodium phosphate 등은 Sigma Co (USA) 제품을사용하였다. 그리고 Difco TM Lactobacillus MRS Broth, Difco TM YM Broth 및 Difco TM BD Agar 등은 BD (USA) 사제품을사용하였다. 기타일반시약은특급시약을사용하였다. 2. 방법 1) 세포배양실험에사용된섬유아세포는피부과의원에서시술후얻어지는포피를이용하여배양하였다. 얻어진피부에서지방층을제거한후 2~4 mm 2~4 mm 크기의절편으로조각낸뒤, type Ⅰ collagenase (0.1 w/v% in phosphate buffered saline, Gibco BRL, USA) 용액을가하여 37 에서 12시간정치하였다. 이후 type Ⅰ collagenase 용액을제거한뒤, 표피를제거한후진피를수술용칼로잘게조각낸후 DMEM 배지를넣고, 75 cm 2 티슈플라스크에정치하였다. 그리고조각난티슈에서세포간피부
九蒸九炮醱酵韓藥混合物이皮膚老化에미치는影響 103 조직밖으로배출되어플라스크안에서자라면이를회수하여실험에사용하였다. 섬유아세포는 DMEM 에 10% FBS, 1% penicillin, 1% streptomycin 을가하여 37, 5% CO 2 조건에서배양하였다 14). 2) 균주배양 Saccharomyces cerevisiae KTCT1904, Lactobacillus brevis KTCT3102 를 20% glycerol에혼합하여 -72 에보관한다. Saccharomyces cerevisiae KTCT1904 1 ml stock을 YM agar 배지에서도말평판법 (Streak plate method) 을통해계대배양한후약 0.1 mg 정도를취하여 400 ml YM배지에접종하여 30, 250 rpm 조건에서 48 시간배양하였다. 그리고 Lactobacillus brevis KTCT3102 1 ml stock을 MRS agar 배지에서도말평판법을통해계대배양한후약 0.1 mg 정도를취하여 400 ml MRS 배지에접종하여 30, 250 rpm 조건에서 24시간배양하였다. 3) 九蒸九炮醱酵韓藥混合物의제조 人蔘 生地黃 何首烏및黃精을 1 mm 정도로얇게절편한후각각 10 g씩유리 petri dish에놓았다. 그후 Autoclave 를이용한고온멸균법으로약재속에들어있는상재균을제거한후, Saccharomyces cerevisiae 배양액을약재에 10 ml 정도넣고 30, 75 RH% 에서 48시간동안발효하였다. 그후발효액을전부 15 ml Falcon Tube에덜고이를 0.22 um Filter (Millipore, USA) 를이용해 Filtration 하여발효물을얻었다. 발효된약재들을 Autoclave 를이용해고온멸균하고 Lactobacillus brevis 배양액을약재에 10 ml를넣고 30, 75 RH% 에서 24시간동안발효하였다. 그후발효액을전부 15 ml Falcon Tube에덜고이를 0.2 um Filter를이용해 Filtration 하여발효물을얻었다. 이런방식으로약재를 Autoclave 를이용해찌고균주를번갈아가면서고체발효하는과정을총 9번에걸쳐실시하여각약재의발효물을얻은후동량으로섞어실험에사용하였다. 4) 자유라디칼소거능평가 자유라디칼소거능평가법은 Blois 의방법에준하여실시하였다 15). 각시료를 96 well plate 의각 well 에 100 ul 씩넣은후 0.1 mm 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH) 용액을 100 ul 씩첨가한다음 37 에서 30 분간방치한후 ELISA reader 를이용해 540 nm 에서흡광도를측정하였다. 본실험의양성대조군으로 L-ascorbic acid 를처리하였다. 자유라디칼소거능은다음공식으로계산하였다. DPPH radical scavenging activity (%) [(AB-AT)/AB 100, AB: absorbance of blank sample, AT: absorbance of tested extract. 5) 섬유아세포증식능평가 섬유아세포를 96 well plate 에 well 당 1 10 4 개로분 주하고 24 시간동안배양한후, 1.0 ug/ml 농도로각시료들을처리하여 48 시간동안배양하였다. 배양액을흡입하여제거한다음 PBS 로 1 회세척하고, MTT 용액을 0.5 mg/ml 의농도로 well 당 100 ul 씩세포에첨가하여, 4 시간동안 37, 5% CO 2 에서배양하였다. 배양액을흡입하여제거한다음 DMSO (dimethyl sulfoxide) 용액 200 ul 을첨가하고, shaker 에서 10 분간흔들어준후 ELISA reader 로 540 nm 에서의흡광도를측정하였다 16). 6) 콜라겐생합성증진능평가 (procollagen type Ⅰ C-peptide enzyme immunoassay) 배양된섬유아세포를 96 well plate에 1 10 4 cells/well 로분주하여배양한다. 24시간후세포들을 serum-free DMEM으로 3회세척하고각시료들을농도별로녹인 serum-free DMEM 용액으로교환하고 24시간배양한다. 배양액으로부터새로생성된 Procollagen type Ⅰ C-peptide 를 PICP EIA Kit를이용하여분광광도계를이용해 450 nm 에서의흡광도를측정하였다 17). 7) 세포생존율평가 섬유아세포를 96 well plate 에 well 당 1 10 4 개로분주하고 24 시간동안배양한후, 0.001, 0.01, 0.1, 1.0 및 10.0 ug/ml 농도로각시료들을처리하여 48 시간동안배양하였다. 배양액을흡입하여제거한다음 PBS 로 1 회세척하고, MTT 용액을 0.5 mg/ml 의농도로 well 당 100 ul 씩세포에첨가하여, 4 시간동안 37, 5% CO 2 에서배양하였다. 배양액을흡입하여제거한다음 DMSO (dimethyl sulfoxide) 용액 200 ul 을첨가하고, shaker 에서 10 분간흔들어준후 ELISA reader 로 540 nm 에서의흡광도를측정하였다 16). 세포독성평가는다음과같이계산하였다. Cell viability (%) [AC/AT 100, AC: absorbance of control, AT: absorbance of tested extract. 8) 통계처리 실험은 3 회이상실시하여그평균값을기초로 Mean ± S.D. 로나타내었으며, t-test 를시행하여 p<0.05 인경우유의성이있는것으로판단하였다. 결과 1. 자유라디칼소거능평가 九蒸九炮醱酵韓藥混合物에대하여 DPPH 를이용한자유라디칼소거능을측정한결과는 Fig. 1 과같다. 九蒸九炮醱酵韓藥混合物을 0.25 w/v% 에서자유라디칼소거능을평가한결과 4 차발효부터서서히증가되어 7 차발효시 0.26, 9 차발효시 0.08 등의효과를보였다. 이는 L-ascorbic acid 와유사한자유라디칼소거능을보인것으로, 발효횟수가증가할수록자유라디칼소거효과도
104 大韓本草學會誌 Vol. 24, No. 4, 2009 100 700 80 600 * * * 500 DPPH scavenging activity (%) 60 40 20 PCIP(ng/mL) 400 300 200 100 0 0차 1차 2차 3차 4차 5차 6차 7차 8차 9차 ascorbic acid 0 con A 0.01 A 0.1 B 0.01 B 0.1-20 발효횟수 Fig. 1. Effects of 9 repetitive steaming and fermenting herbal composition extracts on free radical scavenging activity against DPPH for 30 min The results represents the mean ± S.D. of 3 experiments. Fig. 3 Collagen synthesis (%) increased after 9 repetitive steaming and fermenting herbal composition extract compared with herbal composition extracts The results represents the mean ± S.D. of 3 experiments (* : p < 0.05). A: Herbal composition extract. B: 9 Repetitive steaming and fermenting herbal composition extract. 점점높은경향을나타내었다. 2. 섬유아세포증식능에미치는영향 섬유아세포의증식능에미치는九蒸九炮醱酵韓藥混合物의발효횟수별효과를측정한결과는 Fig. 2 와같다. 九蒸九炮醱酵韓藥混合物을 1.0 w/v% 에서섬유아세포의증식능을평가한결과발효횟수가거듭될수록높아졌으나, 3 차이후에는경향성이없었다. 5 차발효시 34.5%, 7 차발효시 33.8% 의섬유아세포증식효과를보였으며 9 차발효시 36.3% 의유의성있는섬유아세포증식효과를보였을뿐만아니라 1% FBS 보다높은섬유아세포증식효과를보였다. 50 농도에서대조군보다 14.3~16.3% 정도의대조군보다높은유의성있는콜라겐생합성촉진효과를보였으며혼합추출물에비해서도높은효과를보였다. 4. 세포독성평가 九蒸九炮醱酵韓藥混合物이사람의정상섬유아세포의세포독성을확인하기위해 MTT assay 를통해 Fig. 4 에그결과를나타내었다. 혈청이첨가되지않은배지를사용하여배양하였을때세포독성이나타나지않아사람의정상피부세포에대한활성저해는일어나지않을것으로판단된다. 그리고 0.001~10.0 w/v% 농도의九蒸九炮醱酵韓藥混合物은사람의정상섬유아세포에대해독성이나타나지않아매우안전한것으로평가된다. 40 * 120.0 cell proliferation (%) 30 20 10 cell viability (%) 100.0 80.0 60.0 40.0 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 FBS 1% 발효횟수 20.0 Fig. 2 9 Repetitive steaming and fermenting herbal composition extracts on human dermal fibroblast cell proliferation The results represents the mean ± S.D. of 3 experiments (* : p < 0.05). 3. 콜라겐생합성증진효과 九蒸九炮醱酵韓藥混合物의콜라겐생합성증진효과를실험해본결과는 Fig. 3 과같다. 발효하지않은혼합추출물의경우 0.01 및 0.1 w/v% 의농도에서대조군보다 6.9~11.3% 정도의콜라겐생합성촉진효과를보였고, 九蒸九炮醱酵韓藥混合物의경우 0.01 및 0.1 w/v% 의 0.0 0 0.001 0.01 0.1 1.0 10.0 concentration (ug/ml) Fig 4 The effect of cell growth according to each concentration of 9 repetitive steaming and fermenting herbal composition extract in normal human dermal fibroblasts The results represents the mean ± S.D of 3 experiments using MTT assay against primarily cultured normal human dermal fibroblasts. 고찰및결론 人蔘은五加科에속한多年生草本인人蔘의根으로大補元氣, 補脾益氣, 生津止渴, 寧神益智등의효능이있어
九蒸九炮醱酵韓藥混合物이皮膚老化에미치는影響 105 一切虛損, 自汗暴脫, 脈微慾絶, 脾氣虧虛, 肺虛喘促, 氣津兩傷의消渴, 口渴, 驚悸, 健忘, 眩暈, 頭痛, 小兒慢驚, 久虛不復등의병증을치료한다 18). 또한人蔘의성분중하나인 Ginsenoside Rg3는노화로인한주름개선효과가있다 19). 生地黃은玄蔘科에속한多年生草本인지황또는중국의회경지황의신선한塊根으로黃酒를고르게뿌려九蒸九炮한것을熟地黃이라하여補血滋陰, 補精益膸의효능이있어月經不調, 崩漏, 肝腎陰虧, 消渴, 精血虧虛, 腎虛喘咳등의병증을치료한다 18). 또한生地黃은항산화및콜라겐생합성및분해억제효과가있어노화로주름을억제하는데효과가있다 20). 何首烏는蓼科에속한多年生草本인何首烏의塊根으로黑豆와黃酒를이용하여九蒸九炮시補肝腎, 益精血등의효능이있어頭暈眼花, 鬚髮早白, 腰痠脚軟, 遺精등의병증을치료한다 17). 黃精은百合科에속한多年生草本인죽대둥굴레및동속근연식물의根莖으로酒蒸하여쓰며補中益氣, 滋陰潤肺, 生津止渴등의효능이있어脾胃虛弱, 病後虛損, 食慾不振, 筋骨衰弱, 風濕疼痛, 消渴등의병증을치료한다 18). 그리고何首烏및黃精은항산화및미백효과가높아노화와멜라닌으로인한기미등의개선에효과적이다 21). 따라서이 4종의韓藥材는피부노화방지에매우효과적임을알수있으나, 그효능이화학적으로합성된피부효능원료에비해못미친다. 본연구에서는韓藥의효능을더욱증진시키고자炮製法중蒸製法과현대발효공학의고체발효법과혼합발효법을결합한九蒸九炮발효법을개발하였는데, 고체발효는일반배지대신약재만을그대로발효키는것으로배지가혼합되지않은고유한발효된한약만을얻을수있는장점이있다. 또한효모와유산균을혼합발효시泥醉가낮아지며항균력이증가하여보존성이높아지고, 다당류의저분자화로단당류및각종아미노산들이다량으로나와豐味및관능이현저히개선되는등의각종이점이있어이들을결합한새로운발효법을개발하였다 22). 본연구에서는人蔘 生地黃 何首烏및黃精을배합하여酵母의일종인 Saccharomyces cerevisiae 및乳酸菌의일종인 Lactobacillus brevis를발효균주로삼아차례대로 9번번갈아찌고고체발효하는과정을통해醱酵物을얻었다. 수득한醱酵物의피부노화에대한효능 / 효과를규명하기위해, 발효전韓藥混合추출물및 Ascorbic acid 등과비교하여九蒸九炮醱酵韓藥混合物의자유라디칼소거능평가, 세포활성및독성평가, 콜라겐생합성촉진효과등을측정하였다. 九蒸九炮발효법에사용한균주인 Saccharomyces cerevisiae는내열성이고, 비병원성酵母의일종으로풍부한단백질과비타민 B군의영양공급원등그외수많은우리몸에매우유용한효능이밝혀지고있는酵母이며 23), 乳酸菌의일종인 Lactobacillus brevis는통상혐기성으로증식하는그람양성세균으로자연계에널리분포되어있을뿐아니라, 인체소화기관에서도생육되고있다. 또한 소화관내에서세균증식을억제하고변비를예방한다고알려져사람이나동물의프로바이오틱 (probiotic) 으로이용가치가매우높다 24). 본연구결과에따르면, 九蒸九炮醱酵韓藥混合物의경우발효횟수가증가할수록자유라디칼소거능이높아졌으며특히 9 차에는기존의 Ascorbic acid 와유사한효과가있음을증명함에따라노화방지에우수한물질임을확인할수있었으며세포독성도적음을확인하였다. 또한배양한섬유아세포에서세포증식능은초기에는단계적으로높아지는경향이그후에는증진되지는않았다. 하지만 9 차발효시 1% FBS 에비해유의성있게높은세포증식효과를보임에따라, 노화된피부세포의활성화를가져와노화방지에우수한효능을줄수있는물질임을확인할수있었으며세포활성능이완화하여피부세포가癌화될가능성도매우희박하므로피부에독성이매우적으면서더욱친화적인물질이될가능성을확인할수있었다. 콜라겐생합성을증진시키는효과는韓藥混合추출물보다九蒸九炮醱酵韓藥混合物이더욱우수한효능을보임에따라내인성노화가진행되면서얇아지고변성된피부를다시재생시킬수있는우수한醱酵韓藥處方임을확인할수있었다. 이상의연구결과를종합해볼때, 酵母와乳酸菌을이용해 9 번번갈아고체배양한九蒸九炮醱酵韓藥混合物은추출물에비해피부에대한효능이뛰어났으며, 기존항산화제로널리쓰이던 Ascorbic acid 와비슷한자유라디칼소거능을보였다. 또한피부안전성또한매우우수하여노화된피부에대한효과를더욱극대화할수있는醱酵韓方化粧品원료로서매우유용할것으로판단된다. 또한향후다른韓方處方및적합한발효미생물과의조합을통하여더욱우수한효능을갖는원료를개발할수있는가능성을열었다는점에서큰의의를가진다. 참고문헌 1. Gilchrest BA. Skin aging and photoaging: an overview. J Am Acad Dermatol. 1989 ; 21 : 610-13. 2. Bernstein EF, Chen YQ, Tamai K, Shepley KJ, Resnik KS, Zhang H, Tuan R, Mauviel A, Uitto J. Enhanced elastin and fibrillin gene expression in chronically photodamaged skin. J Invest Dermatol. 1994 ; 103(2) : 182-6. 3. 宋兆友. 皮膚病中藥外用製劑. 北京 : 人民衛生出版社. 2000 : 5-6. 4. 原安微中醫學院編. 中醫臨床手冊. 서울 : 成輔社. 1983 : 4-5. 5. 葉定江, 長世臣主編. 中藥炮制學. 北京 : 人民衛生出 版社. 1997 : 71.
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