Kor. J. Hort. Sci. Technol. 29(2):130-134, 2011 파프리카시판품종에대한유전자적웅성불임성의대립성및분자표지의유용성검정 이준대 1 ㆍ도재왕 1 ㆍ한정헌 1 ㆍ안철근 2 ㆍ권오열 3 ㆍ김용권 3 ㆍ윤재복 1* 1 ( 주 ) 고추와육종기업부설연구소, 2 경남농업기술원수출농식품연구과, 3 농협 NH 종묘개발센터 Allelism and Molecular Marker Tests for Genic Male Sterility in Paprika Cultivars Jundae Lee 1, Jae Wahng Do 1, Jung-Heon Han 1, Chul-Geon An 2, Oh Yoel Kweon 3, Yong Kwon Kim 3, and Jae Bok Yoon 1* 1 Research and Development Unit, Pepper and Breeding Institute, Business Incubator, Seoul National University, Suwon 441-853, Korea 2 Division of Exportable Crops and Foods Science, Research and Development Bureau, Gyeongsangnam-do Agricultural Research & Extension Sevices, Jinju 660-360, Korea 3 NH Seed Research & Development Center, National Agricultural Cooperative Federation, Anseong 456-824, Korea Abstract. Paprika (Capsicum annuum L.), a colored bell-type sweet pepper, is one of the most important money making vegetable crops in Korea. The cultivation area, total production, and exports of paprika are gradually getting increased, but the paprika cultivars used in Korea are all imported. It was well-known that the genic male sterility (GMS) is the main way to produce paprika hybrid seeds. However, it is little known that how many and what kinds of ms genes are used for breeding of paprika F 1 varieties. In this study, eight paprika cultivars ( Special, Debla, Plenty, Fiero, Boogie, Fiesta, Derby, and Minibell ), popularly cultivated in Korea and three different genic male sterile lines ( GMSP, GMS3, and GMSK ) were used. For allelism test among the F 1 cultivars, half diallel crosses were performed. The result demonstrated that the most of the GMS in paprika cultivars except for Minibell were same allele. To identify which GMS gene(s) were used for paprika F 1 cultivars, top crosses between previously known GMS lines and the F 1 cultivars were performed. As a result, we found that the ms k and the ms p genes were alleles for the GMS of Minibell and for the other cultivars, respectively. We also confirmed that the GMS gene identification using GMSK-CAPS marker linked to the ms k gene and the PmsM1-CAPS marker linked to the ms p gene in F 2 progenies of Minibell and Fiesta and Derby cultivars, respectively. In addition, we developed the PmsM2-CAPS marker for Plenty, Fiero, and Boogie cultivars. We expect that these markers will be very useful for breeding new maternal (male sterile) line of paprika. Additional key words: allelism test, GMS, molecular breeding, sweet pepper 서언파프리카 (paprika) 는원래유럽지역에서모든고추를지칭하는용어로사용되지만우리나라와일본에서는착색단고추를지칭하는용어로한정되어사용되고있다. 우리나라의파프리카재배는 1994년 0.1ha의소규모로처음도입되 었고, 재배가본격화된것은 1995년 1ha규모의유리온실에서일본수출용으로재배된이후이며 (Song et al., 2009), 2008 년에는총생산액이 1,013억원 (85,341천 $) 에달하고, 생산지수 (2004년에서 2006년까지총생산액의평균을 100으로산정 ) 가 139.8로꾸준한증가추세에있다고보고되었다 (Korean Ministry for Food, Agriculture, Forestry and Fisheries, 2009). *Corresponding author: yoonjb2@snu.ac.kr Received 9 August 2010; Accepted 10 March 2011. 본연구는농림수산식품부농림수산식품기술기획평가원에서수행하는파프리카연구사업단 ( 과제번호 : 607004-05) 의지원에의해이루어진것임. 130 Kor. J. Hort. Sci. Technol. 29(2), April 2011
파프리카생산량의상당부분이일본으로수출되고있기때문에생산농가에게고소득을보장하고있어재배면적과생산량이지속적으로늘어나고있는추세이며국내시장에서의소비또한꾸준한증가를보이고있다. 그럼에도불구하고국내에서재배되고있는파프리카종자는전량수입에의존하고있는실정이다. 따라서최근농림수산식품부와일부국내종묘회사에서는파프리카품종의국산화에적극적인투자와노력을기울이고있다. 농가에서재배하고있는파프리카종자는잡종강세 (heterosis) 를이용한일대잡종 (F 1 hybrid seed) 으로서교잡육종에의해만들어지고있으며 F 1 종자의생산은주로유전자적웅성불임성 (genic male sterility, GMS) 을이용하지만아직도일부품종에있어서는제웅교배를통하여종자를생산하고있다. 고추에서유전자적웅성불임성은우리나라에서가장많이사용하고있는 ms k 를비롯하여지금까지 20여종류가보고되고있는데 (Shifriss, 1997; Wang, 2006), 파프리카육종에는정확히어떤소재가사용되고있는지알려져있지않다. 최근본연구팀은네덜란드로부터수입되고있는일부파프리카의상용품종을분리하여유전자적웅성불임성에대한유전분석을수행하여그결과를바탕으로웅성불임유전자와연관된분자표지 (PmsM1-CAPS) 를개발하였고그웅성불임유전자를 ms p 로표기하였으며, 개발된분자표지는새로운파프리카모계 ( 웅성불임계통 ) 를육성하는데사용할 수있음을밝혔다 (Lee et al., 2010b). 본연구는우리나라에서재배되고있는다양한파프리카품종에사용된유전자적웅성불임 (ms) 유전자가서로같은지다른지를확인하는한편, 파프리카유전자적웅성불임성이어떤 ms 유전자에의한것인지를밝히고자대립유전자검정 (allelism test) 을수행하였다. 또한기개발된분자표지를이용하여대립성검정결과를확인하는한편, 개발된분자표지를적용할수없는파프리카품종에이용할수있는새로운분자표지를탐색하고자수행되었다. 재료및방법식물재료및대립유전자검정우리나라에재배되고있는국내 외종묘회사의파프리카품종에사용된 ms 유전자가같은지다른지를확인하기위하여유전자적웅성불임성을사용한파프리카품종 8개 ( Special, Debla, Plenty, Fiero, Boogie, Fiesta, Derby 및 Minibell ) 를이용하여이들사이에제웅을하고반이면교잡 (half diallel cross) 을수행하였다 (Tables 1 and 2). 또한파프리카품종에사용된 ms 유전자가어떤것인지를확인하기위하여서로다른세개의 ms 계통 [GMS3(ms 3 ms 3, Lee 등, 2010a), GMSP(ms p ms p, Lee et al., 2010b) 및 GMSK (ms kms k, Lee et al., 2010c)] 에파프리카품종 5개 ( Debla, Table 1. Plant materials used in this study and summary of this work. Cultivar Company Fruit color ms gene ms-linked marker Marker reference Special Enza Zaden Red ms p None - Debla Rijk Zwaan Red ms p None - Boogie Rijk Zwaan Orange ms p PmsM2-CAPS In this study Fiesta Enza Zaden Yellow ms p PmsM1-CAPS Lee et al., 2010b Derby De Ruiter Seeds Yellow ms p PmsM1-CAPS Lee et al., 2010b Minibell Samsung Seeds Yellow ms k GMSK-CAPS Lee et al., 2010c Table 2. Allelism tests for genic male sterility genes in eight commercial F 1 paprika cultivars using half diallel crosses. Number of plants (male fertile: male sterile) in the crossed progeny Maternal parent Paternal parent (heterozygous male fertile, Msms) Debla F 1 Plenty F 1 Fiero F 1 Boogie F 1 Fiesta F 1 Derby F 1 Minibell F 1 Special F 1 20 : 1 11 : 3 14 : 5 14 : 2 NA z 9 : 2 14 : 0 Debla F 1-10 : 6 17 : 5 7 : 6 10 : 4 NA 14 : 0 Plenty F 1 - - 15 : 5 NA NA NA NA Fiero F 1 - - - 7: 3 NA NA NA Boogie F 1 - - - - 7 : 7 10 : 2 13 : 0 Fiesta F 1 - - - - - 6 : 4 15 : 0 Derby F 1 - - - - - - 14 : 0 z NA, not analyzed. Kor. J. Hort. Sci. Technol. 29(2), April 2011 131
Table 3. Allelism tests for genic male sterility genes in three male sterile lines and five commercial F 1 paprika cultivars. Number of plants (male fertile: male sterile) in the crossed progeny Maternal parent (genotype) Paternal parent (heterozygous male fertile, Msms) Debla F 1 Fiero F 1 Fiesta F 1 Derby F 1 Minibell F 1 GMS3 (ms 3/ms 3) NA z NA 11 : 0 10 : 0 15 : 0 GMSP (ms p/ms p) 4 : 5 2 : 5 4 : 3 7 : 9 NA GMSK (ms k/ms k) NA 21 : 0 11 : 0 13 : 0 8 : 6 z NA, not analyzed. Fiero, Fiesta, Derby 및 Minibell ) 를각각교배하여대립유전자검정을수행하였다 (Table 3). 웅성불임조사 2009년서울대학교농생명과학대학부속농장의유리온실에서교잡후대종자를각각 18개또는 24개씩파종하였고, 웅성불임성은꽃이핀후개체당 3개의꽃을육안으로관찰하여화분의존재유무에따라가임과불임으로판별하였다. 분자표지분석각개체의어린잎으로부터 genomic DNA 추출은 Prince 등 (1997) 의방법을이용하였고추출된 DNA는 1.5% 아가로스젤에서확인후 10ng μl -1 농도로맞추어사용하였다. 고추 ms k 유전자와연관된분자표지인 GMSK-CAPS 분석방법은 Lee et al.(2010c) 의방법에따라수행되었고, ms p 유전자와연관된분자표지인 PmsM1-CAPS 분석방법은 Lee et al.(2010b) 의방법대로수행되었다. PmsM2-CAPS 분석은다음과같이수행되었다. PCR 반응액은 genomic DNA 10ng, 10 PCR 버퍼 2μL(CoreBio, Korea), 10mM dntp mixture 1μL(CoreBio), 0.5 unit Top-Taq polymerase(corebio), 각각의 10pmole μl -1 프라이머 (Forward, 5 -CCTTGTCTTGGTTGCCTGTATC-3 ; Reverse, 5 - AC GCTCTACTCGCTTAATCATTTTC-3 ) 1μL, 그리고멸균된삼차증류수로총 20μL로맞추었다. PCR 반응은 T1 thermal cycler(biometra Co., Germany) 모델을이용하여 95 에서 3분간초기변성 (denaturation) 을수행한뒤, 95 에서 30초간변성 (denaturation), 55 에서 30초간가열냉각 (annealing), 72 에서 1분간길이확장 (extension) 과정을 35회반복하였다. 마지막으로 72 에서 5분동안완전한길이확장 (full extension) 반응을시켰다. PCR 산물은 CviQI 제한효소 (New England Biolabs Inc., USA) 로 37 에서 2시간동안반응한후, EtBr을포함한 1.5% 아가로스젤상에서 250V로 1시간전기영동을실시한후, 자외선투과기 (UV transilluminator) 를이용하여다형성밴드를구별하였다. 결과및고찰파프리카시판품종간유전자적웅성불임성의대립유전자검정본실험의가정은다음과같다. 두개의서로다른파프리카품종이같은 ms 유전자를사용하였다면교잡후대에서웅성불임개체가 25% 나타나고, 서로다른 ms 유전자를사용하였다면후대에서모두가임개체가나타난다. 그이유는유전자적웅성불임성을사용한파프리카품종은모두 ms 유전자좌에대해이형접합형 (Msms) 이기때문에, 같은유전자일경우 MsMs, Msms 및 msms 분리비가 1:2:1이되어 25% 는웅성불임이되는반면에다른유전자일경우 A품종 (Ms 1ms 1, Ms 2 Ms 2 ) 과 B품종 (Ms 1 Ms 1, Ms 2 ms 2 ) 의교잡이되기때문에후대에서불임이나타나지않게된다. 이론적으로가임과불임이 3:1로분리가되는집단 (200개종자 ) 에서 15, 20 및 25개의종자를선발하였을경우, 모두가임이나타날확률은각각 1.11%, 0.23% 및 0.04% 이다. 이는실제로불임이나타나는집단을불임이나타나지않는집단으로평가할에러율이다. 즉, 15, 20 및 25개의종자를심어모두가임으로나타났다면각각 98.89%, 99.77% 및 99.96% 의확률로모두가임인집단으로평가할수있다. 5개의서로다른회사 (Enza Zaden, Rijk Zwaan, De Ruiter Seeds, Syngenta 및 Samsung Seeds; Table 1) 에서개발된 8개의파프리카품종 ( Special, Debla, Plenty, Fiero, Boogie, Fiesta, Derby 및 Minibell ; Table 1) 에사용된유전자적웅성불임 (ms) 유전자가서로같은지다른지를확인하기위하여반이면교잡 (half diallel cross) 을수행하였다 (Table 2). 그결과, Special 은 Debla, Plenty, Fiero, Boogie 및 Derby 와의교잡후대에서웅성불임개체가나타난반면 Minibell 과의교잡후대에서는웅성불임개체가전혀나타나지않았다 (Table 2). 이결과는 Special 은 Debla, Plenty, Fiero, Boogie 및 Derby 와같은 ms 유전자를사용하였고, Minibell 과는다른 ms 유전자를사용하였다는것을의미한다. Debla 도마찬가지로 Plenty, Fiero, Boogie, Fiesta 와는같은 ms 유전자를사용하였고, Minibell 과는 132 Kor. J. Hort. Sci. Technol. 29(2), April 2011
다른 ms 유전자를사용하였다는것을알수있다. 이와같은방법으로모든결과를정리해보면 Special, Debla, Plenty, Fiero, Boogie, Fiesta 및 Derby 는모두같은 ms 유전자를사용하고있고, Minibell 만다른 ms 유전자를사용하고있는것을알수있다 (Table 2). 파프리카시판품종의유전자적웅성불임유전자동정본연구기관에서는대립유전자검정을통해확인된세가지서로다른유전자적웅성불임계통 (GMS3, GMSP 및 GMSK) 을보유하고있는데, 파프리카품종의 ms 유전자가이셋과서로같은것인지, 아니면전혀다른 ms 유전자인지를확인하기위하여 Table 3과같이대립유전자검정을수행하였다. 그결과, GMSP에 Debla, Fiero, Fiesta 및 Derby 를교배한후대에서웅성불임개체가나타났고, Minibell 은 GMSK에교배한후대에서웅성불임개체가나타났다 (Table 3). 이는 Minibell 의유전자적웅성불임유전자는 ms k 이고, Minibell 을제외한나머지 7개의품종은 ms p 유전자임을의미한다 (Table 1). 파프리카유전자적웅성불임성에연관된분자표지위의결과를바탕으로 Minibell 품종의 F 2 분리집단에서 GMSK-CAPS 분자표지 (Lee et al., 2010c) 를적용하여보았다 (Fig. 1). 총 48개체를분석하였는데표현형과마커형이모두일치하는결과를얻었다 (Fig. 1). 이는 Minibell 품종의후대분리육종에있어서 GMSK-CAPS 분자표지를이용할수있다는것을의미한다 (Table 1). 나머지 7개의품종 ( Special, Debla, Plenty, Fiero, Boogie, Fiesta 및 Derby ) 은모두 ms p 유전자를사용하였기때문에이들 F 1 품종에대해 PmsM1-CAPS 분자표지를적용하여보았다. 그결과, Fiesta 와 Derby 에서만이 형접합형 (heterozygous) 으로나타났고, 각각의 F 2 분리집단 72개체를분석하였을때재조환체 (recombinant) 가각각 2개씩만나타났다 (data not shown). Lee 등 (2010b) 의연구에서도 Fiesta 품종에 PmsM1-CAPS 분자표지를사용할수있다고하였고, 본연구에서사용된재료는아니지만 Mirage 와 Helsinky 품종에대해서도 PmsM1-CAPS 분자표지를이용할수있다고하였다. 나머지 5개의품종 ( Special, Debla, Plenty, Fiero 및 Boogie ) 에서는 PmsM1-CAPS 분자표지에대해모두 ms p 에연관된마커형으로고정되어있어 PmsM1-CAPS 분자표지를이용할수없었다. 따라서 PmsM1-CAPS 분자표지와연관거리가약 5cM 정도떨어져있는 PmsM2-CAPS 분자표지를나머지 5개의품종에적용하여본결과, 3개의품종 ( Plenty, Fiero 및 Boogie ) 에서이형접합형으로나타났고 (Table 1), 후대분리집단에서표현형과마커형이연관되어있는것을확인하였으며, 약 5-6% 정도일치하지않는결과를얻었다 (Fig. 2). 이들세품종후대분리육종에서는 PmsM2-CAPS 분자표지를이용할수있을것으로판단하였다. 본연구에서는파프리카품종에사용된웅성불임성의대립유전자검정을통해 ms 유전자의동일성여부를알아내어 (Tables 2 and 3), 기개발된분자표지의이용가능성을알아보았고 (Table 1), 기개발된분자표지를사용할수없었던파프리카품종에대하여적용할수있는새로운분자표지를개발하였다 (Fig. 2). 이들결과는현재전량외국으로부터수입되고있는파프리카품종의국산화를위한새로운계통및품종육성과정에있어서세대단축을통한육종효율증진에크게기여할수있다고판단된다. 그러나기개발된마커들은현재까지일부품종에국한하여사용할수있으며 Special 과 Debla 품종에적용할수있는분자표지를본연구에서는찾지못하였다 (Table 1). 이는기개발된마커가실제웅성불임유전자와아주가깝게연관되어있지않음에 Fig. 1. Analysis of GMSK marker in F 2 progeny of a commercial cultivar Minibell. F in phenotype, male-fertile plants; S in phenotype, male-sterile plants; F in markertype, Ms kms k; H in markertype, Ms kms k; S in markertype, ms kms k. Kor. J. Hort. Sci. Technol. 29(2), April 2011 133
Fig. 2. Analysis of PmsM2 marker in F 2 progeny of a commercial cultivar Plenty. F in phenotype, male-fertile plants; S in phenotype, male-sterile plants; F in markertype, Ms pms p; H in markertype, Ms pms p; S in markertype, ms pms p; *, recombinant plants. 따른재조환현상의결과라고판단되는바, 본연구에서더나아가 ms p 유전자를사용한파프리카품종에모두적용할수있는분자표지를개발하는연구가앞으로진행되어야할것으로생각된다. 초록우리나라에서파프리카 ( 착색단고추 ) 는재배면적, 생산량및수출량이해마다증가하는추세에있어농가소득에매우중요한채소작물의하나이지만재배되고있는파프리카종자는전량외국종자회사에서개발된일대잡종종자를수입하고있다. 최근파프리카품종의국산화를위하여정부의지원을받아국내종묘회사에서파프리카품종개발에힘쓰고있다. 파프리카일대잡종종자의생산은주로유전자적웅성불임성을이용한다. 하지만파프리카품종에사용된유전자적웅성불임성이어떤종류인지몇가지종류가사용되고있는지잘알려져있지않다. 따라서본연구에서는시판되고있는 8개의파프리카품종 ( Special, Debla, Plenty, Fiero, Boogie, Fiesta, Derby 및 Minibell ) 을사용하여이들의유전자적웅성불임유전자가같은것인지다른것인지를확인하기위하여반이면교잡 (half diallel cross) 를수행하였는데, Minibell 을제외한나머지 7개의파프리카품종은같은유전자적웅성불임을사용하였다는것을알아냈다. 또한어떤종류의유전자적웅성불임유전자인지를확인하기위하여세종류의유전자적웅성불임계통 (GMS3, GMSP 및 GMSK) 에교배하여대립유전자검정을수행하였는데, Minibell 은 ms k 유전자를사용하였고, 나머지 7개의품종은 ms p 유전자를사용하였다는것을알아냈다. 따라서, Minibell 품종에서는기개발된 GMSK-CAPS 분자표지를사용할수있음을확인하였고, Fiesta 및 Derby 품종에서 는 PmsM1-CAPS 분자표지가사용될수있음을확인하였다. 또한 Plenty, Fiero 및 Boogie 품종등에사용할수있는새로운분자표지 PmsM2-CAPS를개발하였다. 이들분자표지는새로운파프리카웅성불임 ( 모계 ) 계통및품종개발에큰도움이될것으로판단된다. 추가주요어 : 대립성검정, 유전자적웅성불임성, 분자육종, 단고추 인용문헌 Korean Ministry for Food, Agriculture, Forestry and Fisheries. 2009. Statistics of Food, Agriculture, Forestry and Fisheries for 2009. Ministry Food Agr. For. Fisheries, Gwacheon, p. 82. Lee, J., J.B. Yoon, J.H. Han, W.P. Lee, S.H. Kim, and H.G. Park. 2010a. Three AFLP markers tightly linked to the genic male sterility ms 3 gene in chili pepper (Capsicum annuum L.) and conversion to a CAPS marker. Euphytica 173:55-61. Lee, J., J.H. Han, C.G. An, W.P. Lee, and J.B. Yoon. 2010b. A CAPS marker linked to a genic male-sterile gene in the colored sweet pepper, Paprika (Capsicum annuum L.). Breed. Sci. 60:93-98. Lee, J., W.P. Lee, J.H. Han, and J.B. Yoon. 2010c. Development of molecular marker linked to a genic male-sterile gene, ms k in chili pepper. Kor. J. Hort. Sci. Technol. 28:270-274. Prince, J.P., Y. Zhang, E.R. Radwanski, and M.M. Kyle. 1997. A versatile and high-yielding protocol for the preparation of genomic DNA from Capsicum spp. (pepper). Hortscience 32:937-939. Shifriss, C. 1997. Male sterility in pepper (Capsicum annuum L.). Euphytica 93:83-88. Song, J.Y., I. Sivanesan, C.G. An, and B.R. Jeong. 2009. Micropropagation of paprika (Capsicum annuum) and its subsequent performance in greenhouse cultivation. Kor. J. Hort. Sci. Technol. 27:293-298. Wang, D. 2006. The genes of Capsicum. Hortscience 41:1169-1187. 134 Kor. J. Hort. Sci. Technol. 29(2), April 2011