약학회지제 41 권제 4 호 456~461(1997) Yakhak Hoeji Vol. 41. No. 4 고등식물로부터퍼부엘라닌생성에관여하는티로시나제활성억제물질의탐색 이승호 * 박지수 김소영 김진준 정시련 영남대학교약학대학 (Received Ju ly 15, 1997) T h e S c r e e n i n g o f t h e I n h i b i t o r y C o m p o u n d s o n T y r o s i n a s e A c t i v i t y f r o m t h e N a t u r a l P r o d u c t Seung-Ho Lee. Ji Soo Park, So Young Kim, Jin Joon Kim and See Ryun Chung College o f Pharmacy, Yeungnam University, Kyongsan 712-749, Korea Abstract Tyrosinase is k n o w n to accelerate the m e lan in polym er biosynthesis in m elanocyte, so tyros in a s e in h ib ito rs h in d e r th e m e la n in p o ly m e r b io s y n th e s is a n d are u s e fu l n o t o n ly for th e m ate rial u s e d in cosm etics a s skin-a vhitening a g e n ts b u t also a s th e re m e d y for d is tu rb a n c e s in p ig m e n tatio n. D u r in g o u r se a rc h for n e w m e la n in b io s y n th e s is in h ib ito rs from n a tu r a l sources, 130 h ig h e r p la n ts w ere tested for th e in h ib ito ry effect a g a in s t ty ro s in ase activity b y th e m u s h r o o m ty ro s in ase assay. A m o n g th e m. Carex humilis (ICso. 10 v g /m /), Sophora flavescence (IC50. 20-^50 M-g/m;) a n d S ty ra x ja p o n ic a (IC50. 10 in h ib ite d th e ty ro s in a se activity strongly. Keywords T y rosin a Styrax japonica inhibitor, m e la n in polym er, pigm entation. Carex humilis, Sophora flavescence, 기미. 주근깨등피부에생기는색소첨착은표피내에서의 melanin색소외증가에기인하고있고. melanin색소는표괴기저층에존재하는 melanocyte라고불리는색소세포내의 melanosome에서생합성된다. 자연적으로생성되는 melanin은 alkali 난용성의폭색 melanin (eumelanin) 과 alkali 가용성의황색내지는적색 melanin (phaeomelanin) 외혼합물이다^*. 일반적으로 melanin polymer라고하면 eumelanin을지청할때가많으며. 최근 Prota^\ PaveP 등의연구에의해 eumelanin은이제껏생각되어왔던 5.6-dihydroxy indole 뿐만아니라. 별개의 melanin monomer인 5.6-dihydroxyindole-2-carboxylic 3 cid나. 각중 melanin 중간대사산물로부터도생성된다는것을알았다. 그러나아직까지도 melanin의주된생성과정 * 본논문에관한문의는이저자에게로 { 전화 ) 053-810-2818 ( 팩스 ) 053-811-3871 은 tyrosine이효소 tyrosinase에외해산화되어 dopa. dopaquinone이되고이것이다시 dopachrome, 5.6-dihydroxy indole, indole 5.6-quinone을형성하고최종적으로중합에외하여 melanin polymer를생성하는것으로되어있다. Melanin 색소생산에관여하는인자로는 tyrosinase 이외에도 dopachrome conversion factor. prostaglandin(pg), interferon(ifn) 또는 melanocyte stimulating hormone (MSH). Vit D3. histamine 등이보고되고었다결 \ 드S 읽등은 melanin 생성억제물질은크게두가지 type으로분류하고있다. 그하나는 melanin 생성의 key enzyme인 tyrosinase 효소자체를직접억제하는 type이다. 또하나는세포로부터분리한 tyrosinase에대해서는직접적인억제를나타내지않지만피부색소세포내에있어서외 melanin 생성을억제하는 type이다. 후자는 tyrosinase의합성억제 ( 소외태반주즐물 ) \ 유산^*, escu- 456
천연물로부터티로시나제활성억제물질외탐색 457 lin \ tyrosinase 당쇄수식에의한성숙과정의저해 (glucosamin, tunicamycin) 이. 세포득성 (hydroquinone 등각종 phenol, catechol 유도체 ) 파^작용으로대별된다. 이처럼 melanin 생성 mechanism이복잠하고다원적이기때문에 i각에서 tyrosinase 활성억제실험결과만으로 melanin 생성억제를말하기에는불충분하다. 그러나 in vitro 방법인 tyrosine 저해실험과배양색소세포를이용한실험은신규 melanin 생성억제물질을효율적으로 screening하는수단으로서. 또실험물질의 melanin 생성억제역가와작용기전을이해하는데펄수적이다. 저자등은피부내에서 melanin생성에 key enzyme으로알려져있는 tyrosinase에대하여활성을억제하는물질을고둥식물로부터탐색할목적으로본연구를실시하였다. 실험재료및방법실험재료 - 본초강목등한방서적에서옛날부터을목표로사용되어온것으로소개되는전통생약과전국각지에서무작위로채집한고등식물을 130 종확보하였다. 확보된시료식물은층복대약대이경순교수로부터감정을받아사용하였다. 시료식물 ( 약 300g) 을 MeOH로추출하고추출액은감압하에서완전히농측하여 MeOH Ex를만들었다. MeOH Ex를물에현탁시킨후동량의 CH2CI2로 3회반복진탕추출하여 CH 2 C12 fr. 을얻었다. 물층은다시동량외 EtOAc로 3회반복추출하여 EtOAc fr. 을얻고나머지를 H 2O fr. 으로하였다. 시약및기기 - Buffer (50 mm sodium phosphate buffer. ph 6.8 ), tyrosinase (sigma, 60U/ m l buffer), L-tyrosine (sigma. 1.5 mm/buffer), L-dopa (sigma. 0.6 mm/buffer). UV/VIS spectrophotometer Tyrosinase 활성억제실험 - tyrosinase는두가지기능 (tyrosine hydroxylase, dopa oxidase) 이있으므로 assay 방법도두가지가있다. 그러나 tyrosine hydroxylase의 assay는 ^H-labled tyrosine을이용하므로실험에제약이따르기때문에본연구에서는 dopa oxidase외방범을채텍하였다조오 \Dopaoxidase 의활성측정은 dopa롤기질로하여 tyrosinase에의하여생성되는반응산물인 dopachrome이 475nm에서 흡광도를나타내는점을이용하여시행한다. 즉. 일정한반응조건에서생성된 dopachrome의양을 A475로정량해서 tyrosinase의활성을측정하며시료외첨가에의한 activity의변화를관찰하여효소활성저해정도를평가하였다. 구체적으로는반응액에 L-tyrosine 900 i/. L- dopa 90 냐Z, 시료용액 (0, 10, 20. 50. 100, 200 g/m / 을가한다. Sample은 Me0 H-H2 0 ( l :l ) 에용해시키고 MeOH에의한 enzyme 저해효과를보정하기위하여즉정하고자하는 sample용액의 volume에해당하는 Me0 H-H2 0 ( l :l ) 용액을가하여 contr이로한다. 각반응액은전체 volume이 1890 (X/ 가되도록 buffer를가하고 tyrosinase 90(Hi/ 를가한다. 이때 blank에는 enzyme용액대신 buffer 90(HiZ 를넣어준다. 반응액을 37 C water bath에서 10분간반응시킨후 ice bath내에서 enzyme의반응을정지시키고 spectrophotometer를이용하여 475 이자에서흡광도를측정한다. 저해율은아태와같이계산하고. enzyme외활성을 50% 저해하는농도를내삼에의하여구하고. 이를 IC 50 value로한다. 저해율 = Contr 이의시료용액이첨가된것외 A4 75 Control 외 A4 7 5 결과및고찰피부기저층에있는 melanosome에서 melanin polymer 생성에 key enzyme으로작용하고있는 tyrosinase에대하여억제효과를나타내는고등식물을탐색할목적으로본실험을실시하였다. 현재천연물에서얻어진 kojic acid, arbutin, ascobin 산의유도체둘이 tyrosimase외활성을억제하고. 햇벌에의한검버섯, 주근깨외방지의목적으로의약부외품및기능성화장품첨가제로서사용되고있다 ". 그밖에천연물로서 tyrosinase에활성억제효과를나타내는것으로는. 신농본초경의상품에수재되어있고, 항염증, 항궤양, 해득작용이있어광범위하게이용되고있는감초의 ethyl acetate 분획으로부터단리된 formononetin. glabren, glabridin, glabrol. 상백퍼로부터분리된 oxyresveratrol이알려져있다 /^^ 등은중국한방의학의고전중 * 가^6 후및 * 후훈을선정하여그 Vol. 41, No. 4, 1997
이승호 박지수 김소영 김진준 정시련 안에기재되어있는처방에주목하고, 사용되는생약에대하여사용번도가높은것으로부터것으로부터 33중을선정. tyrosinase활성억제작용에대하여검토하여. 계피, 오매. 만형자. 산수유. 하고초에강한활성이있옴을보고하였다.""^ 저자동은이처럼문헌에서이미소개하고있는생약은물론전국각지에서무작위로채집한고등식물 130 중을 methan이로추출. 얻어진 MeOH Ex를 CHz CI2, EtOAc, H 2O 등으로순차적으로분획하여 390 증외시료를확보하고확보된시료에대하여 in iniro에서외 tyrosinase활성을검토하여그결과를 Table I에나타내었다. Table에서보는바와같이실험에사용된 130 종의식물중 18종의식물추출물에서 Uig/m/ 이하의농도에서 tyrosinase활성을 50% 억제하는효과를나타냈다. 그중상백피, 감초등은이미 tyrosinase 활성저해물질이분러되어보고된바있는식물 Table 1-1 Inhibitory activities of solvent partitions of some higher plants on the tyrosinase in vitro No. 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 산거울 Carex humilis, Cyperaceae 오수유 Evodia officinalis, Rutaceae 죽대 Polygomtum lasianthum var. coreanum, Liliaceae 붉은토끼풀 Trifolium pratense, Leguminosae 산겨롭니 ~ 무 " Acer tegmentosum, Aceraceae 사철쑥 capillaris, Compositae 킬 : 잎용담 Gentiana uchiyama, Gentianaceae 청가시덩굴 Stnilax sieboldii, Liliaceae 터러풀 Filipendula glaherrima, Rosaceae 뽑나무 Morws alba, Moraceae Plants 왜개싱아 Aconogonum divaricatum, Polygonaceae 부게꽃나무 Acer ukurunduense, Aceraceae 흑느릅나무 Ulmus davidiana for suberosa, Ulmaceae 엉경퀴 Cirsium japonicum, Compositae 털게요등 Paederia scandens var. velutina, Rubiaceae 층층이꽃 Clinopodium chinense var. parviflorum, Labiatae 사람주나무열매 Sapium japonicum, Euphorbiaceae 누리장나무 Clerodendron trichotomum, Verbenaceae 천궁 Cnidium officinale, Umbelliferae 신이 Magnolia kobus, Magnoliaceae 치자 Gardenia jasminoides, Rubiaceae 황기 Astragalus memebranaceus. Leguminosae 백출 Atractylodes japonica., Compositae 향부자 Cyperus rotundus, Cyperaceae 맥문동 Liriope plat}/ph]/lla, Liliaceae 현초 Geranium thungergii, Geraniaceae 황백 Phellodendron amurense, Rutaceae 현호색 Corydalis ternata, Papaveraceae 목단피 Paeonia suffruticosa, Paeoniaceae 황금 Scutellaria baicalensis, Labiatae 후박 Magnolia officinalis, Magnoliaceae 옴양곽 Epimedium koreanum, Berberidaceae 지모 Anemarrhena asphodeloides, Liliaceae 용담 Ocfttimm scabra, Gentianaceae 천마 Gastrodia elata, Orchidaceae Crataegus pinnatifida, Rosaceae 고삼 Sophora flavescens, Leguminosae 2222ooooooo/\o/\o/\i 2.o/\o200 o2o22ooooo^2os /'s / o/\2o1o/\o2i 100--200 50-100 100-200 IC 50 (M-g/m/) Value* E 10 _ ** 2(H50 50-100 <10 100*-200 50" 사 00 00 100< 100-200 <10 20-50 W Pharm. Soc. Korea
천연물로부터티로시나제활성억제물질의탐색 Table I-l -- Continue No. Plants ICso, (M-g/m/) Value* C E W 38 Akebia quinata, Lardizabalaceae - - 39 산수유 CornMS officinalis, Cornaceae 200( 40 진괴 Citrus unshiu, Rutaceae 41 승마 Cimicifuga heracleifolia, Ranuculaceae 42 같근 Pueraria thunbergiana. Leguminosae 43 연교 Forsythia viridissima, Oleaceae - - 44 오미자 Schizandra chinensis, Schizandraceae - 45 당귀 모e/icfl gigas, Umbelliferae - 46 해동피 Kalopanax pictus, Araliaceae - 47 석창포 Acorus gramines, Araceae - - - 48 시호 Bupleurum falcatum, Umbelliferae 49 고련피 Aielia azedarach, Meliaceae 200( 50 길경 Platycodon grandiflorum, Campanulaceae 51 세신 sieboldii, Aristolochiaceae 52 백지 /In 묘 dahurica, Umbelliferae 53 방기 Sinomenium acutum, Menispermaceae 54 산조인 Zizyphus jujuha, Rhamnaceae 55 토복령 Smilax china, Liliaceae 200( 56 천초 Fagar a mandschrica, Rutaceae 57 우슬 Achyranthes japonica, Amaranthaceae - 58 구기지 *Lycicum chinense, Solanaceae 59 천문동 Asparagus cochinchinensis. Liliaceae 60 차전자 Plantago asiatica, Plantaginaceae - - 61 소엽 Perilla sikokiam, Labiatae - - - 62 신 약Dioscorea japonica. Dioscoreaceae - 63 흑측 Pharhitis nil, Convolvulaceae - - 64 익모초 Leonurus sibiricus, Labiatae 65 하고초 PtuHdla vulgaris, Labiatae 66 금 ' 은 : 화 Lonicera japonica, Caprifoliaceae - 67 감초 Glycyrrhiza glabra, Leguminosae 20-50 20--50 68 백 잠 Bombyx mow. Bombycidae 50--100 69 망초 Erigeron canadensis, Compositae 70 적작약 Paeonia albiflora, Ranunculaceae 200 50 71 ^ 겨1Cinnamomum cassia, Lauraceae 72 돼지풀 Ambrosia artemisiifolia, Compositae 73 다래 arguta, Actinidiaceae 74 괄루인 Trichosanthes kirilowii, Cucurbitaceae 200( - 75 인진 j^rfemisia capillaris, Compositae - - 76 상백피 Morws alba, Moraceae 20-50 <10 20-50 77 오배자 Rhus chinensis, Anacardiaceae 20-50 78 백복령 Poria cocos, Polyporaceae - 79 황련 Coptis japonica, Ranumculaceae 80 지실 Poncirus trifoliata, Rutaceae - 81 하수오 Polygonum multiflorum, Polygonaceae 82 담쟁이 Parthenocissus tricuspidata, Vitaceae - 83 흘아비꽃대 Chloranthus japonicus, Chloranthaceae - - 84 쪽동백 Styrax ohassia, Styracaceae 85 걸명자 Cassia obtusifolia, Leguminosae 200( 86 노란물봉선 Impatiens noli-tangere, Balsaminaceae - Vol. 41, No. 4, 1997
이승호 박지수 김소영 김진준 정시련 Table 1-1 Continue No. Plants C IC 50 (M-g/m/) Value* 87 딱총국 + 무 Sambucus williamsii, Caprifoliaceae - 88 사리 Lycopus luciduss, Labiatae - 89 생강나무 Lindera obtusiloba. Lauraceae 90 지유 Sanguisorba ojficinalis. Rosaceae 200 100"-200 91 애기똥풀 Chelidonium majus, papaveraceae - 92 같매나무 Rhamnus dahurica, Rhamnaceae 10 0^2 00 93 f-] Pueraria thunbergiana, Leguminosae - 200 94 개암나무 Corylus heterophylla var. japonica, Betulaceae - (1 0 0 ) - (200) 95 스코폴러아 Scopolia japonica, Solanaceae 96 새삼 Cuscuta japonica, Convolvuraceae 97 유카러엽 Eucalyptus globulus, Myrtaceae 98 으아러 Clematis mandshurica, Ranunculaceae 99 붉나무 Rhus javanica, Anacardiaceae - (5 0 ) X 100 작살나무 CalUcarpa japonica. Verbenaceae - 2 0-5 0 - (150) 101 부자 Aconitum carmichaeli, Ranunculaceae 102 쇠물푸레 Fraxinws sieboldiana, Oleaceae 100 50 103 소태나무 Picrasrm quassioides, Simaroubaceae 200 200 104 비목 uf 무 Lindera erythrocarpa. Lauraceae 105 산딸나무 Comus kousa, Cornaceae 50-10 0 106 가래나무 Juglans mandshurica, Juglandaceae 107 자주개나러 Medicago sativa, Leguminosae 108 망개니 ~ 무 " Berchemia herchemiaefolia, Rhamnaceae 109 바디나물 Angelica decursiva, Umbelliferae 110 노박덩글 Celastrus orhiculatus, Celastraceae - - 111 퍼나무 Tilia amurensis, Tiliaceae 112 말채나무 Comus zmlteri, Cornaceae 113 조록싸리 Lespedeza ntaximowiczii. Leguminosae 1 0 0 ^ 2 0 0 114 Aristolochia tnanshuriensis, Aristolochiaceae - 115 활량나무 Lathyrus davidii, Leguminosae 116 오가피나무 Acanthopanax sessiliflorum, Araliaceae <200 117 득활 Aralia continentalis, Araliaceae 118 방풍 Ledehouriella seseloides. Umbelliferae 119 강활 Ostericum koreanum, Umbelliferae 2CXK 120 고본모 e///cfl tenuissima. Umbelliferae 121 만형자은 ex rotundifolia, Verbenaceae 122 겟메꽃 Calj/stegia soldanella, Convolvulaceae 123 5-^1] Prunus mume, Rosaceae - 200 124 좀껏잎나무 Boehmeria spicata, Urticaceae 125 털머위 Farfugium japonicum, Compositae 2100< 126 달맞이꽃 Oenoi/tera odorata, Onagraceae 127 때죽나무 Sh/rax japonica. Styracaceae 10 128 ^ ^ 1 4 ^ Comus controversa, Cornaceae 100 129 유채 Brassica campestris. Cruciferae 130 사상자 Torilis japonica, Umbelliferae *IC5o v a lu e s in d ic a te th e c o n c e n tr a tio n t h a t in h ib it s th e 50% o f ty ro s in a s e a c tiv ity C :C H 2C I 2 la y e r, E :E to A c la y er. W :w a te r layer. no reaction E W 로본실험에서도매우강한억제효과를나타내었다. 칼 잎용담 (Genhflnfl uchiyama) 은 CH2CI2. EtOAc 분획에 서비교적강한억제효과를나타내고있으나동속식물 인용담 (G. scabra) 에서는거의활성을나타내지않고 Pharm. Soc. Korea
천연물로부터티로시나제활성억제물질외탐색 461 있어활성물절의규명은식물분류학적으로홍미있으리라사료된다. 또개암나무. 붉나무의경우는오히려 tyrosinase의활성을증가시키고있으며특히작살나무의 EtOAC 및 water 분획은각각 tyrosinase의활성을중가. 억제시키는걸과를나타내고있어적어도서로상반된활성을가지는성분이 2개이상존재함을알수있다. 앞에서언급했듯이피부세포내에서의 melanin polymer외생성은생합성과정에서의 key enzyme인 tyrosinase의활성에의해많이좌우되기도하지만, 또하나는 tyrosinase의활성과는관계없이 melanocyte내에서복합적인요인에의하여 melanin polymer가생성되는경우가있으므로 melanoma cell에대한 cytotoxicity에의하여도 melanin polymer의생성이억제됨을알수있다. 따라서실제활성물질을분러하고자할때시료식물의선정에있어서이점을고려하여야할것이다 (Table I). 문헌 1) 드A 를 : m 15#. 수UJ#/ p. 3 (1983). 2) Prota. G. Recent advances in the chemistry of melanogenesis in mammals, / Invest. Dermatol 75. 122 (1980) 3) Pavel, S.. Muskiet, F. A. :Eumelanin (precursor) metabolites as markers for pigmented malignant melanoma, a preliminary report. Cancer Detection and Prevention 6, 31 i (1983). 4) and Hearing, V. J. : Fragrance Journal, 1990(6), 24 (1990). 5) Mishima, Y.. Hatta. S.. Ohyama. Y. and Inazu, M. :Induction of melanogenesis suppression Cellular pharmacology and mode of differential action, Pigment Cell Res. 1, 367 (1988). 6) 드 s 뿔 :! 그냈 i^m, 1990(6). 105 (1990). 7) Ando, S.. Ando. O., Suemoto. Y. and Mishima. Y. Tyrosinase gene transcription and its control by melanogenetic inhibitor. J. Invest Dermatol. 100. 150 (1993). 8) ^첸一헤. ^m m r- Esculin^ melanogenesis 출 104. 1367 (1994). 9) Imokawa, G. and Mishima. Y. :Loss of melano- genic properties in tyrosinase induced by glyco- silation inhibitors within malignant melanoma cells. Cancer Res. 42. 1994 (1982). 10) S. Hamata 18. 249 (1976). 11) Hearing. V. J. and Ekei, T. M. -A comparison of tyrosin hydroxylation and melanin formation, Biochem. J. 157. 549 (1976). 12) : 서 Llj 황드 6 뿔 : 3 r y t v u 13) 1990(6). 53 (1990). 1990(6), 59 (1990). 14) m A m, l 43(2). 142 (1989). Vol. 4h No. 4, 1997