3) 대한한방부인과학회지 J Korean Obstet Gynecol. VOL.28 NO.1 : 029-045 (2015) http://dx.doi.org/10.15204/jkobgy.2015.28.1.029 連翹金貝煎의 Escherichia coli 에대한시험관내항균력평가 대구한의대학교한의과대학부인과교실한상겸, 김동철 ABSTRACT In Vitro Antibacterial Effects of Yeonkyokeumpae-jeon against Escherichia coli Sang-Kyum Han, Dong-Chul Kim Dept. of Korean Obstetric & Gynecology, College of Korean Medicine, Deagu Haany University Objectives: The object of this study was to observe the in vitro antibacterial effects of Yeonkyokeumpae-jeon (YKKPJ) have been used for treating various gynecological diseases including mastitis in Korea, and individual six kinds of herbal composition aqueous extracts - Forsythiae Fructus (FF), Millettiae Caulis (MC), Lonicerae Flos (LF), Fritillaria Thunbergii Bulb (FT), Taraxci Herba (TH) and Prunellae Spica (PS) against E. coli. Methods: Antibacterial activities against E. coli of YKKPJ, FF, MC, LF, FT, TH and PS aqueous extracts were detected using standard agar microdilution methods. In addition, the effects on the bacterial growth curve were also monitored at MIC and MIC 2 levels. The effects on the intracellular killing and bacterial invasion of individual test materials were also observed using Raw 264.7 and MCF-7. The results were compared with ciprofloxacin, a second generation of quinolone antibiotics in the present study. Results: MIC of YKKPJ, FF, MC, LF, FT, TH, PS aqueous extracts against E. coli were detected as 0.039±0.013 mg/ml, 0.064±0.033 mg/ml, 0.108±0.053 mg/ml, 0.078±0.027 mg/ml, 16.250±8.385 mg/ml, 15.625±9.375 mg/ml, 0.254±0.131 mg/ml, repectively. YKKPJ, FF, MC, LF, FT, TH, PS aqueous extracts showed antibacterial effects against to E. coli, except for FT and TH, which were showed negligible antibacterial effects, respectively. In addition, ciprofloxacin with YKKPJ, FF, MC, LF and PS aqueous extracts also showed marked dosage-dependent inhibition of bacterial growth, and favorable inhibitory effects on the both bacterial invasion and intracellular killing assays using MCF-7 and Raw 264.7 cells were detected in this experiment. Conclusions: The results obtained in this study suggest that traditional polyherbal formula YKKPJ aqueous extracts showed more favorable antibacterial activities as compared to individual six kinds of herbal composition aqueous extracts. The antibacterial effects of YKKPJ against E. coli considered as results of complicated synergic effects of their six kinds of herbal components rather than simple antibacterial effects of single herbal components. It means, YKKPJ aqueous extracts may show potent anti-infectious effects against E. coil for mastitis. Key Words: Yeonkyokeumpae-jeon, Escherichia coli, Mastitis, Ciprofloxacin, Raw 264.7, MCF-7 Corresponding author(dong-chul Kim) : Pohang Korean Hospital of Daegu Haany University, 907-8, Daejam-dong, Nam-gu, Pohang-si, Gyeongsangbuk-do, Korea Tel : 054-271-8002 Fax : 054-281-7464 E-mail : kdc072@dhu.ac.kr 29
連翹金貝煎의 Escherichia coli 에대한시험관내항균력평가 Ⅰ. 서론 유방염은여성의가슴부위염증으로정의되며특히산모에서는발열과함께감기와같은증상을동반한다. 근래에는수유기의유방염의치료가비교적신속하고용이하게이루어짐으로써수유기농양의빈도가현격히감소하여전체농양의 10% 이하이다. 하지만유방염은수유기여성의 10% 정도에서발생하는비교적흔한질환으로여전히산모에있어서중요한관심사중의하나라고할수있다 1,2). 유방염의증상은국소증상으로단측유방의경도증가, 발진, 불쾌감과함께전신증상으로 38.5 이상의발열감, 피로, 몸살및두통이동반된다 3). Staphylococcus aureus는유방염의가장흔한원인균으로지목되어왔다 1,4). S. aureus 이외에도드물게 Candida albicans, group A beta-hemolytic Streptococcus, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli 및 Mycobacterium tuberculosis 등다양한균에의해유방염이유발될수있는데 1,5), 여러종류의균들중에서도 E. coli는급성적으로심한유방염을일으키며특히유방상피세포내침투율이상당히좋아재발을반복하는고질적인유방염을일으킨다 6,7). 그리고균이사멸된후에도균체의지방다당체가숙주의급격한면역반응을유발하여심한염증반응을초래한다 8). Ciprofloxacin 은 2세대퀴놀론계항생제중가장대표적인약물로유방염에도빈용처방되는항생제이나최근에는퀴놀론계항생제의주요표적인 gyrase와 topoisomerase의변형을통한내성균주가출현하고있다 9,10). 따라서항생제의사용을줄이고효과가우수한대 체약물특히천연물을이용한치료제의개발이필요할것으로생각된다. 한의학에서유방염은乳房이癰腫膿瘡하는질환으로乳癰이라고한다. 乳癰의원인은肝鬱胃熱, 感染邪毒으로疏肝淸胃, 托裏透膿의치법으로치료한다 11). 連翹金貝煎은明代의張介賓이저술한 景岳全書 에최초로수록된처방으로, 유방에생긴癰腫및乳癌에熱毒이심한경우사용한다고하였다 12). 連翹金貝煎을구성하고있는 6종의약재중蒲公英을제외한連翹 13), 紅藤 14), 金銀花 15) 16), 貝母및夏枯草 17) 에대해서는항균효과가잘알려져있으나, 連翹金貝煎자체의항균효과에관한실험적연구는찾아볼수없었다. 본연구에서는 E. coli ATCC 25922 세균주를이용하여표준액체배지희석법 18) 으로최소저지농도 (MIC) 를측정하고시간대별균생장곡선 19) 에미치는영향을관찰하여유방염치료에사용되어온連翹金貝煎과개별구성약재각각의 E. coli 에대한항균력을평가하였으며, 탐식세포내사멸효과 20) 및상피세포내 E. coli 침투율 21) 을각각 murine macrophage 세포주인 Raw 264.7 세포와사람유방암상피세포유래인 MCF-7 세포를이용하여평가하였다. Ⅱ. 재료및방법 1. 재료 1) 약재및균주본실험에사용된약재는대원약업사 (Daegu, Korea) 에서매입한것을현미경하에서관능검사를통하여선정하여사용하였으며, E. coli ATCC 25922는 American 30
J Korean Obstet Gynecol Vol.28 No.1 February 2015 Type Culture Collection Center(Manassas, VA, USA) 에서동결건조상태로구입하여사용하였다. 2) 시약및기기배지및시약으로사용된 Brain-heart Infusion(BHI), Muller Hinton(MH) agar 및 broth, Dulbecco s modified Eagle s medium(dmem)/f12 medium, 말혈청 (heat inactivated horse serum), RPMI 1640 배지는 Difco(Detroit, MI, USA) 에서, agar는 Junsei(Tokyo, Japan) 에서각각구입하였고, 대조약물인 ciprofloxacin hydrochloride hydrate 는 Hangzhou Tacon Co.(Hangzhou, China) 에서구입하여사용하였다. 또한 96 well-plate 는 Greiner (Frickenhausen, Germany) 에서구입하였으며, 이외시약은 Aldrich-Sigma(St. Louise, MO, USA) 에서구입하여사용하였다. 2. 방법 1) 실험액제조본실험에사용된連翹金貝煎 1첩분량의조성은다음과같다 (Table 1). 선정된약재 0.5첩분량 (56.25 g) 을취하여정제수 600 ml로가열 추출한후 (60, 3시간, 3번 ), 흡인 여과한여과액을 rotary vacuum evaporator(eyela N-1110, Tokyo, Japan) 로감압 농축하여점조성의추출물을얻은 다음 programmable freeze dryer(operon FDB-5503, Kimpo, Korea) 를사용하여동결건조시켜갈색의연교금패전물추출물 (YKKPJ) 8.04 g( 수율 : 14.29%) 을얻어실험에사용하였다. 또한각각 50 g의連翹, 紅藤, 金銀花, 貝母, 蒲公英및夏枯草을취하여, 정제수 500 ml로가열 추출한후 (60, 3시간, 3번 ), 흡인 여과한여과액을 rotary vacuum evaporator 로감압 농축하여점조성의추출물을얻은다음 programmable freeze dryer를사용하여동결건조시켜, 연갈색의연교물추출물 (FF) 6.27 g( 수율 : 12.53%), 적갈색의홍등물추출물 (MC) 5.51 g( 수율 : 11.02%), 연갈색의금은화물추출물 (LF) 4.91 g( 수율 : 9.82%), 연갈색의패모물추출물 (FT) 5.08 g( 수율 : 10.16%), 진갈색의포공영물추출물 (TH) 6.36 g( 수율 : 12.72%) 및진갈색의하고초물추출물 (PS) 5.03 g( 수율 : 10.06%) 를얻어실험에사용하였다. 준비한 YKKPJ, FF, MC, LF, FT, TH 및 PS는 -20 의냉장고에보관한후실험에사용하였으며, 구입한 ciprofloxacin 은 4 의냉장고에보관한후사용하였다. YKKPJ, FF, MC, LF, FT, TH 및 PS는사용한용매인멸균증류수에 25 mg/ml의농도까지비교적잘용해되었고 ciprofloxacin 은 1.000 μg/ml 까지비교적잘용해되었다. Table 1. Composition of Yeonkyokeumpae-jeon Used in This Study Korean Herbs Scientific names Amounts (g) 連翹 Forsythiae Fructus Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl 37.50 紅藤 Millettiae Caulis Millettia reticulata Benth. 30.00 金銀花 Lonicerae Flos Lonicera japonica Thunb. 11.25 貝母 Fritillaria Thunbergii Bulb Fritillaria thunbergii Miq. 11.25 蒲公英 Taraxci Herba Taraxacum platycarpum H. Dahlsi 11.25 夏枯草 Prunellae Spica Prunella vulgaris var. lilacina Nakai 11.25 Total 6 types 112.50 31
連翹金貝煎의 Escherichia coli 에대한시험관내항균력평가 2) 균주, 세포주및배지 E. coli 는 modified BHI 배지에녹인후 modified BHI agar 에 2~3 회계대 배양한후사용하였다. 또한사람유방암상피세포유래인 MCF-7 세포및 murine macrophage 세포주인 Raw 264.7 세포는각각한국세포주은행 (KCLB, Seoul, Korea) 에서구입하여사용하였다. 실험에사용한 MCF-7 세포는 10% FBS가첨가된 RPMI 1640를사용하여 37, 5% CO 2 incubator에서계대 배양하여유지하였으며, Raw 264.7 세포는 DMEM에 10% FBS, 100 U/ml penicillin 및 100 μg/ml streptomycin을혼합한배지를사용하여 37, 5% CO 2 incubator 에서배양하였다. 실험과정의모든세포는 80~90% 의 confluence 에서실험하였고, 20 passages 를넘기지않은세포만선정하여실험에사용하였다. 3) 생균수의측정정확한흡광도 (Optical Density; OD) 와세균수의상관관계를알아보기위하여, 정량평판법 (Quantitative Plating Methods, Standard Plate Count) 을이용하여균수를측정하였다 22). E. coli 를 spectrophotometer (Milton Roy Spectronic 20D; Milton Roy Company, Ivyland, PA, USA) 를이용하여 600 nm(od600) 에서의흡광도를 0.5 Mcfarland standard와같은탁도로조정한다음, 균액을 10, 100, 1000 및 10000 배로단계희석하여균의농도가 1 10 4 CFU/ml이되도록만들어 MH agar 에접종하여, 37, 10% CO 2 조건에서 24시간배양한다음조직배양접시에형성된집락수를희석된순서대로 OD와비교하였다. 0.5 Mcfarland standard 탁도는 1.175% barium chloride dihydrate(bacl2 2H2O) 0.05 ml와 1% sulfuric acid(h2so4) 9.95 ml를혼합하여준비하였다 23). 4) 항균활성도 (MIC) 측정 YKKPJ, FF, MC, LF, FT, TH 및 PS의 E. coli 에대한최소저지농도를표준액체배지희석법 18) 을이용하여측정하였다. 각각의단일추출물과 YKKPJ를 25 mg/ml의농도로멸균증류수에용해시킨다음계단식으로배수희석하여 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.563, 0.782, 0.391, 0.195, 0.098, 0.049, 0.025 및 0 mg/ml 의총 12종류의농도를준비하였다. 이후각각멸균된 96 well plate 에 100 μl씩분주한다음, 여기에 E. coli 의단일집락을 MH broth 배지에접종한지 48시간후 OD600을 spectrophotometer 로측정하여, 1.5 10 6 세포가들어가도록준비한 cell suspension 100 μl를분주하였다. 이후 37 에서 48시간배양하였다. Ciprofloxacin 역시 1.000 μg/ml의농도로멸균증류수에용해시킨다음계단식으로배수희석하여 1.000, 0.500, 0.250, 0.125, 0.063, 0.031, 0.016, 0.008, 0.004 및 0 μg/ml 의총 10종류의농도로준비하고, 동일한방법으로 bacteria suspension(1.5 10 6 CFU/ml) 을첨가한다음 48시간동안 37 에배양하였다. MIC 는각각의 growth control well( 시료를첨가하지않고균만배양한 well) 과시료가함유된 well의 E. coli의성장을육안적으로비교관찰하여균의생장억제가나타나는최소농도로결정하였다 18). 모든실험은 5회반복하였다. 5) 시간대별 E. coli 생장곡선각각동결건조추출물의균생장저해능을평가하기위해 Janssen 등의방법 19) 에따라 MH broth배지에 E. coli를접종한후 OD600을 spectrophotometer 로측정하여 Mcfarland 0.5 standard(1.5 10 8 CFU/ml) 로각균의탁도를조절한다음 32
J Korean Obstet Gynecol Vol.28 No.1 February 2015 100배희석하였다. 각각 MIC 및 MIC 2 농도의 YKKPJ(0.039 및 0.078 mg/ml), FF(0.064 및 0.128 mg/ml), MC(0.108 및 0.216 mg/ml), LF(0.078 및 0.156 mg/ml), FT(16.250 및 32.500 mg/ml), TH(15.625 및 31.250 mg/ml) 및 PS(0.254 및 0.508 mg/ml) 와 ciprofloxacin(0.01 및 0.02 μg/ml) 을준비한세포현탁액과혼합한다음 37 에배양하면서 24, 48, 72, 96 및 120시간마다 OD를측정하여, 시료를첨가하지않은각각의대조군에서의균의생장과실험군에서의균생장억제를비교하였다. 모든실험은 5회반복하였다. 6) 세포내세균사멸효과 E. coli 에대한세포내세균사멸효과는 Cuffini 등의방법 21) 에따라 murine macrophage 세포주인 Raw 264.7 세포를이용하여평가하였다. 즉, 24-well plate 에 Raw 264.7 세포 (106 cells/well) 를배양한 4% 의 heatinactivated adult horse serum를포함한 DMEM/F12 배지 1 ml을분주한다음 2 10 7 CFU의 E. coli를첨가하고, 37, 5% CO 2 조건하에 30분간배양하여탐식을촉진시켰다. 이후 1/2 MIC 농도의 YKKPJ(0.020 mg/ml), FF(0.032 mg/ml), MC(0.054 mg/ml), LF(0.039 mg/ml), FT(8.125 mg/ml), TH(7.813 mg/ml) 및 PS(0.127 mg/ml) 와 ciprofloxacin(0.007 μg/ml) 을각각첨가하고, 37, 5% CO 2 조건하에 6시간배양한다음세포만수집하여 PBS로세척한다음, 5 mg/ml의 lysostaphin을처리하여세포막또는세포밖에부착된세균을사멸시키고 Raw 264.7 세포들을멸균증류수로용해시킨다음생균수를각각측정하였다. 본실험에서는추출물을처리하지않은배양 well을대조군으로사용하여세포내세 균사멸효과를평가하였다. 7) 상피세포내세균침투저해효과 E. coli의상피세포내침투저해효과를 Almeida 등의방법 20) 에따라유방암상피세포유래인 MCF-7 세포를이용하여평가하였다. 즉, 24-well plate 에 MCF-7 세포를 37, 5% CO 2 조건하에 5% 의 FBS 및 1% 항진균제 (penicillin, streptomycin 및 amphotericin B) 가포함된 DMEM/F12 배지에사용전 20시간동안배양하고, 사용시배양한 MCF-7 세포 (2 10 4 cells) 를멸균 PBS로 3회반복세척한다음 2 10 9 CFU/ml의 E. coli가포함된 DMEM/F12 배지 1 ml을첨가하고 1/2 MIC 농도의 YKKPJ(0.020 mg/ml), FF(0.032 mg/ml), MC(0.054 mg/ml), LF(0.039 mg/ml), FT (8.125 mg/ml), TH(7.813 mg/ml) 및 PS (0.127 mg/ml) 와 ciprofloxacin(0.007 μg/ml) 을각각첨가한다음, 37, 5% CO 2 조건하에서 1시간배양하고상층액을제거하였다. 이후멸균 PBS로 3회반복세척한다음 5 mg/ml의 lysostaphin을첨가하고 37, 5% CO 2 조건하에서 2시간배양하여세포외세균을제거하였다. 처리가완료된 MCF-7 세포를다시멸균 PBS로 3회반복세척한다음 0.25% trypsin 처리를하여부유시키고, 0.025% 의 Triton X-100이포함된멸균증류수로세포를용해시킨다음생균수를측정하였다. 본실험에서는 5회반복실험을실시하였으며, 추출물을처리하지않은배양 well 을대조군으로사용하여상피세포내침투저해효과를평가하였다. 8) 통계처리모든수치는 5회반복실험의평균 ± 표준편차로표시하였으며, 균생장곡선, 세포내세균사멸효과및상피세포내세균 33
連翹金貝煎의 Escherichia coli 에대한시험관내항균력평가 침투저해효과에미치는영향은다중비교검증을이용하여통계처리를실시하였고, 분산동질성을 Levene test를실시하여검증하였다 24). 등분산일경우, one way ANOVA test 를실시한다음 LSD test 로사후검증을실시하여군간의유의성을측정하였다. 비등분산일경우, 비모수검증인 Kruskal-Wallis H test 를실시하여유의성이인정된경우에는 MW test 를실시하여군간의유의성을검증하였다. 모든통계처리는 SPSS for Windows(Release 14.0K, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 를이용하였으며, p-value 가 0.05 이하인경우통계적유의성을인정하였다 25). 후보물질의효과를보다명확하게하기위하여처리군과비처리대조군과의 percent change 를아래의공식을이용하여측정하였다. EQUATION. Percentage changes as compared control(%)=((data of test material treated groups-data of control) /Data of control) 100 Ⅲ. 결과 1. 항균활성도 (MIC) YKKPJ, FF, MC, LF, FT, TH 및 PS 의 E. coli 에대한 MIC를표준액체배지희석법으로평가한결과 MIC는각각 0.039± 0.013(0.025~0.049), 0.064±0.033(0.025~0.098), 0.108±0.053(0.049~0.195), 0.078±0.027(0.049 ~0.098), 16.250±8.385(6.250~25.000), 15.625± 9.375(3.125~25.000) 및 0.254±0.131(0.098~ 0.391) mg/ml 로관찰되었고, ciprofloxacin 의 MIC는 0.013±0.011(0.004~0.031) μg/ml 로관찰되었다 (Table 2). Table 2. MIC against E. coli Detected in This Study by Agar Microdilution Method Test materials MIC Ranges Ciprofloxacin (μg/ml) 0.013±0.011 0.004~0.031 YKKPJ* (mg/ml) 0.039±0.013 0.025~0.049 FF (mg/ml) 0.064±0.033 0.025~0.098 MC (mg/ml) 0.108±0.053 0.049~0.195 LF (mg/ml) 0.078±0.027 0.049~0.098 FT (mg/ml) 16.250±8.385 6.250~25.00 TH (mg/ml) 15.625±9.375 3.125~25.00 PS** (mg/ml) 0.254±0.131 0.098~0.391 * : Yeonkyokeumpae-jeon aqueous extracts : Forsythiae Fructus aqueous extracts : Millettiae Caulis aqueous extracts : Lonicerae Flos aqueous extracts : Fritillaria Thunbergii Bulb aqueous extracts : Taraxci Herba aqueous extracts ** : Prunellae Spica aqueous extracts 2. 시간대별 E. coli의생장곡선에미치는영향 1) Ciprofloxacin의효과배양 24시간후부터대조군에비해유의성있는 (p<0.01) 용량의존적인균수의감소가인정되었다 (Fig. 1). Ciprofloxacin MIC 농도 (0.01 μg/ml) 처리군의생균수는배양 24, 48, 72, 96 및 120시간후대조군에비해각각 -57.14, -59.84, -59.14, -42.26 및 -36.80% 의변화를나타내었다. Ciprofloxacin MIC 2 농도 (0.02 μg/ml) 처리군의생균수는배양 24, 48, 72, 96 및 120시간후대조군에비해각각 -76.57, -79.52, -79.64, -74.45 및 -66.17% 의변화 34
J Korean Obstet Gynecol Vol.28 No.1 February 2015 를나타내었다. Fig. 1. Effects of ciprofloxacin on the growth of E. coli with incubation times. * : p<0.01 as compared with control by LSD test. 2) YKKPJ의효과배양 24시간후부터대조군에비해유의성있는 (p<0.01) 용량의존적인생균수의감소가인정되었다 (Fig. 2). YKKPJ의 MIC 농도 (0.039 mg/ml) 처리군의생균수는배양 24, 48, 72, 96 및 120시간후대조군에비해각각 -36.17, -36.76, -32.28, -34.33 및 -32.76% 의변화를나타내었다. YKKPJ의 MIC 2 농도 (0.078 mg/ml) 처리군의생균수는배양 24, 48, 72, 96 및 120시간후대조군에비해각각 -58.14, -58.01, -52.94, -48.88 및 -41.64% 의변화를나타내었다. Fig. 2. Effects of Yeonkyokeumpae-jeon aqueous extracts on the growth of E. coli with incubation times. * : p<0.01 as compared with control by LSD test 3) FF의효과배양 24시간후부터대조군에비해유의성있는 (p<0.01) 용량의존적인생균수의감소가인정되었다 (Fig. 3). FF의 MIC 농도 (0.064 mg/ml) 처리군의생균수는배양 24, 48, 72, 96 및 120시간후대조군에비해각각 -41.90, -46.69, -43.35, -44.30 및 -33.26% 의변화를나타내었다. FF의 MIC 2 농도 (0.128 mg/ml) 처리군의생균수는배양 24, 48, 72, 96 및 120시간후대조군에비해각각 -51.40, -55.68, -55.26, -51.82 및 -44.87% 의변화를나타내었다. 35
連翹金貝煎의 Escherichia coli 에대한시험관내항균력평가 Fig. 3. Effects of Forsythiae Fructus aqueous extracts on the growth of E. coli with incubation times. * : p<0.01 as compared with control by LSD test 4) MC의효과배양 24시간후부터대조군에비해유의성있는 (p<0.01) 용량의존적인생균수의감소가인정되었다 (Fig. 4). MC의 MIC 농도 (0.108 mg/ml) 처리군의생균수는배양 24, 48, 72, 96 및 120시간후대조군에비해각각 -47.19, -48.06, -49.26, -48.18 및 -39.35% 의변화를나타내었다. MC의 MIC 2 농도 (0.216 mg/ml) 처리군의생균수는배양 24, 48, 72, 96 및 120시간후대조군에비해각각 -54.87, -55.52, -55.06, -52.41 및 -49.33% 의변화를나타내었다. Fig. 4. Effects of Millettiae Caulis aqueous extracts on the growth of E. coli with incubation times. * : p<0.01 as compared with control by LSD test 5) LF의효과배양 24시간후부터대조군에비해유의성있는 (p<0.01) 용량의존적인생균수의감소가인정되었다 (Fig. 5). LF의 MIC 농도 (0.078 mg/ml) 처리군의생균수는배양 24, 48, 72, 96 및 120시간후대조군에비해각각 -44.00, -44.62, -44.22, -39.93 및 -34.89% 의변화를나타내었다. LF의 MIC 2 농도 (0.156 mg/ml) 처리군의생균수는배양 24, 48, 72, 96 및 120시간후대조군에비해각각 -59.45, -57.75, -59.01, -55.07 및 -51.73% 의변화를나타내었다. 36
J Korean Obstet Gynecol Vol.28 No.1 February 2015 Fig. 5. Effects of Lonicerae Flos aqueous extracts on the growth of E. coli with incubation times. * : p<0.01 as compared with control by LSD test 6) FT의효과배양 24시간및 48시간후에국한되어, 대조군에비해유의성있는 (p<0.01) 생균수의감소가각각인정되었으나, 배양 72, 96 및 120시간에서는대조군에비해유의성있는생균수의변화는인정되지않았다 (Fig. 6). FT의 MIC 농도 (16.250 mg/ml) 처리군의생균수는배양 24, 48, 72, 96 및 120시간후대조군에비해각각 -24.29, -22.80, -15.75, -4.96 및 -2.83% 의변화를나타내었다. FT의 MIC 2 농도 (32.500 mg/ml) 처리군의생균수는배양 24, 48, 72, 96 및 120시간후대조군에비해각각 -24.67, -24.37, -14.67, -7.50 및 -4.19% 의변화를나타내었다. Fig. 6. Effects of Fritillaria Thunbergii Bulb aqueous extracts on the growth of E. coli with incubation times. * : p<0.01 as compared with control by LSD test 7) TH의효과배양 24시간및 48시간후에국한되어, 대조군에비해유의성있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 생균수의감소가각각인정되었으나, 배양 72, 96 및 120시간에서는대조군에비해유의성있는생균수의변화는인정되지않았다 (Fig. 7). TH의 MIC 농도 (15.625 mg/ml) 처리군의생균수는배양 24, 48, 72, 96 및 120시간후대조군에비해각각 -16.89, -23.11, -11.82, -7.40 및 -1.40% 의변화를나타내었다. TH의 MIC 2 농도 (31.250 mg/ml) 처리군의생균수는배양 24, 48, 72, 96 및 120시간후대조군에비해각각 -21.25, -24.30, -10.91, -7.06 및 -1.29% 의변화를나타내었다. 37
連翹金貝煎의 Escherichia coli 에대한시험관내항균력평가 Fig. 7. Effects of Taraxci Herba aqueous extracts on the growth of E. coli with incubation times. (* : p<0.01, : p<0.05) as compared with control by LSD test ( : p<0.01, : p<0.05) as compared with control by MW test 8) PS의효과배양 24시간후부터대조군에비해유의성있는 (p<0.01) 용량의존적인생균수의감소가각각인정되었다 (Fig. 8). PS의 MIC 농도 (0.254 mg/ml) 처리군의생균수는배양 24, 48, 72, 96 및 120시간후대조군에비해각각 -44.44, -47.39, -43.79, -39.02 및 -30.67% 의변화를나타내었다. PS의 MIC 2 농도 (0.508 mg/ml) 처리군의생균수는배양 24, 48, 72, 96 및 120시간후대조군에비해각각 -57.41, -59.05, -59.55, -53.34 및 -46.11% 의변화를나타내었다. Fig. 8. Effects of Prunellae Spica aqueous extracts on the growth of E. coli with incubation times. * : p<0.01 as compared with control by LSD test 3. 세포내세균사멸효과 Raw 264.7 세포를이용한세포내 E. coli 에대한사멸효과를평가한결과, 1/2 MIC 농도의 YKKPJ(0.020 mg/ml), FF(0.032 mg/ml), MC(0.054 mg/ml), LF(0.039 mg/ml) 및 PS(0.127 mg/ml) 는대조군에비해유의성있는탐식세포내생균수의감소를 YKKPJ, FF, LF, MC 및 PS 순으로각각나타내었고, 1/2 MIC 농도의 ciprofloxacin 처리군에서도대조군에비해유의성있는탐식세포내생균수의감소를나타내었으나, 1/2 MIC 농도의 FT(8.125 mg/ml) 및 TH(7.813 mg/ml) 는대조군에비해유의성있는탐식세포내생균수의감소를나타내지않았다 (Fig. 9). Raw 264.7 세포내생균수는 1/2 MIC 농도의 ciprofloxacin(0.007 μg/ml) 및 YKKPJ (0.020 mg/ml), FF(0.032 mg/ml), MC (0.054 mg/ml), LF(0.039 mg/ml), FT (8.125 mg/ml), TH(7.813 mg/ml) 와 PS (0.127 mg/ml) 처리군에서대조군에비 38
J Korean Obstet Gynecol Vol.28 No.1 February 2015 해각각 -84.41, -77.45, -66.20, -40.34, -58.87, -6.58, -1.75 및 -30.99% 의변화를나타내었다. 및 TH(7.813 mg/ml) 는대조군에비해유의성있는상피세포내생균수의감소를나타내지않았다 (Fig. 10). MCF-7 세포내생균수는 1/2 MIC 농도의 ciprofloxacin(0.007 μg/ml) 및 YKKPJ (0.020 mg/ml), FF(0.032 mg/ml), MC (0.054 mg/ml), LF(0.039 mg/ml), FT (8.125 mg/ml), TH(7.813 mg/ml) 와 PS (0.127 mg/ml) 처리군에서대조군에비해각각 -81.12, -74.13, -64.05, -43.05, -49.84, -3.61, -0.32 및 -32.56% 의변화를나타내었다. Fig. 9. Results of intracellular killing assay against E. coli on murine macrophage Raw 264.7 cells. * : p<0.01 as compared with control by LSD test CP : Ciprofloxacin YKKPJ : Yeonkyokeumpae-jeon aqueous extracts FF : Forsythiae Fructus aqueous extracts MC : Millettiae Caulis aqueous extracts LF : Lonicerae Flos aqueous extracts FT : Fritillaria Thunbergii Bulb aqueous extracts TH : Taraxci Herba aqueous extracts PS : Prunellae Spica aqueous extracts 4. 상피세포내세균침투저해효과 사람유방상피암유래의 MCF-7 세포를이용하여, E. coli의상피세포침투저해효과를평가한결과, 1/2 MIC 농도의 YKKPJ(0.020 mg/ml), FF(0.032 mg/ml), MC(0.054 mg/ml), LF(0.039 mg/ml) 및 PS(0.127 mg/ml) 는대조군에비해유의성있는상피세포내생균수의감소를 YKKPJ, FF, LF, MC 및 PS 순으로각각나타내었고, 1/2 MIC 농도의 ciprofloxacin 처리군에서도대조군에비해유의성있는상피세포내생균수의감소를나타내었으나, 1/2 MIC 농도의 FT(8.125 mg/ml) Fig. 10. Results of bacterial invasion assay against E. coli on human breast carcinoma MCF-7 cells. * : p<0.01 as compared with control by MW test CP : Ciprofloxacin YKKPJ : Yeonkyokeumpae-jeon aqueous extracts FF : Forsythiae Fructus aqueous extracts MC : Millettiae Caulis aqueous extracts LF : Lonicerae Flos aqueous extracts FT : Fritillaria Thunbergii Bulb aqueous extracts TH : Taraxci Herba aqueous extracts PS : Prunellae Spica aqueous extracts Ⅳ. 고찰 유방염은유방질환중가장높은빈도 39
連翹金貝煎의 Escherichia coli 에대한시험관내항균력평가 를나타내고있으나, 산모의의식향상과항생제의사용으로그빈도가점차적으로줄어들고있다. 하지만일부연구에서는산모의 33% 에서유방염이발견되었으며 26) 946명의수유를실시하는산모중 9.5% 의유방염유병률이인정되는등 27) 유방염의유병률은수유방법과수유시기등에따라매우다양하게관찰된다. 유방염의가장흔한원인균으로는 Staphylococcus aureus 가지목되어왔다 1,4). S. aureus 이외에도다양한균에의해유방염이유발될수있다 1,5). 여러종류의균들중에서도 E. coli는 Gram 음성의간균으로급성의심한유방염을일으키는원인균으로주목받아왔다 6). 유방상피세포내침투율이상당히좋아재발을반복하는고질적인유방염을일으키기도한다 6,7). 균이사멸된뒤에도균체의지방다당체가숙주의급격한면역반응을유발하여심한염증반응을초래하기도하여항생제치료이외에도염증을제어할새로운치료제의개발이시급한실정이다 7,8). 유방염의치료에다양한항생제가사용되어왔으나이중 β-lactam 계항균제는 β-lactamase 라는효소를생산하여내성을나타내기시작하였다 28). 이후 β-lactam 계항균제를대체하기위해강력한항균력을나타내는퀴놀론계항생제가개발되었고특히, ciprofloxacin 은 1980년대말에개발된 2세대퀴놀론항생제로조직침투성이좋으며퀴놀론항생제중가장광범위한항균력을나타내는것으로알려져있고그약효에있어서탁월하고광범위하여현재세계각국에서매우유력한항생제가되었으며 29), 다양한균주에대해우수한항균력이이미잘알려져있다 30). 또한 ciprofloxacin은탐식세포에 매우빨리흡수되어고질적인문제인탐식세포내병원균의사멸능력역시현재개발된항생제중가장강력한것으로알려져있고상피세포등세포내침투성역시매우우수한것으로알려져있으나 31), 비교적독성이강한항생제로그사용및사용량이제한받고있다. 즉, 아급성심장독성 32), 광독성을포함한피부발적과신장독성 33), 미성숙동물에서의연골독성 34) 및건초염과건파열 35) 등의독성이초래되며내성균의출현 9,10) 역시우려되어사용량의조절이필요하므로부작용이적은새로운천연물을이용한대체치료제의개발이필요할것으로생각된다. 한의학에서乳房이癰腫膿瘡하는질환을乳癰이라고하여유방염으로볼수있으며內癰와外癰으로나누어진다. 乳癰은수유기에乳汁蓄積으로인해생기는外吹乳癰, 임신중에胎氣旺盛으로上衝하여발생하는內吹乳癰, 남녀노소불문하고肝氣鬱滯와陰陽之熱이합하여乳絡을阻塞시켜壅積하여발생하는非授乳期乳癰으로분류할수있다 11). 乳癰의원인에대하여 東醫寶鑑 에서는 厚味로濕熱之痰이膈間에停蓄하고乳가滯하여서로搏하여생긴다 고하였고또 兒의口氣가吹噓하여생긴다 고하였으며, 怒氣가激滯하여생긴다 고하여授乳期의산모에게잘생길수있다고하였다 36). 連翹金貝煎은明代의張介賓이저술한 景岳全書 에최초로수록된처방으로, 유방염을포함한부인과질환에사용되어온처방이다. 腫痛勢甚, 熱毒有餘者, 宜以連翹金貝煎, 先治之甚妙 라하여連翹金貝煎은熱毒이심한경우에사용하는처방이다 12). 連翹金貝煎은連翹, 紅藤, 金 40
J Korean Obstet Gynecol Vol.28 No.1 February 2015 銀花, 貝母, 蒲公英및夏枯草의 6종의약재로구성된복합처방으로, 이들을구성하고있는 6종의약재중蒲公英을제외한連翹 13), 紅藤 14), 金銀花 15), 貝母 16) 및夏枯草 17) 의다양한항균효과가잘알려져있으나連翹金貝煎자체의항균효과등실험적연구는찾아볼수없었다. 따라서본연구에서는 E. coli 세균주를이용하여표준액체배지희석법 18) 으로최소저지농도를측정하고시간대별균성장곡선 19) 에미치는영향을평가하여, 유방염을포함한부인과질환에사용되어온連翹金貝煎과개별구성약재각각의 E. coli에대한항균력을평가하였으며, 탐식세포내사멸효과 20) 및상피세포내 E. coli 침투율 21) 을각각 murine macrophage 세포주인 Raw 264.7 세포와사람유방암상피세포유래인 MCF-7 세포를이용하여평가하였다. 표준액체배지희석법에의한 MIC의측정은세균및다양한감염증에대한후보물질의항균활성을측정하는가장기본적인방법이다 18,22). E. coli 에대한 ciprofloxacin 의 MIC는대략 0.01 μg/ml 로알려져있으며 37) 본실험의결과에서도 0.013±0.011 (0.004~0.031) μg/ml로관찰되어이전의연구와유사한항균활성이표준액체배지희석법에의해인정되었다. 본실험의결과, E. coli 에대한 YKKPJ, FF, MC, LF, FT, TH 및 PS의 MIC는 0.039±0.013 (0.025~0.049), 0.064±0.033(0.025~0.098), 0.108±0.053(0.049~0.195), 0.078±0.027(0.049 ~0.098), 16.250±8.385(6.250~25.000), 15.625 ±9.375(3.125~25.000) 및 0.254±0.131(0.098 ~0.391) mg/ml로관찰되어극히미약한항균효과를나타낸 FT와 TH를제외하고 YKKPJ, FF, LF, MC 및 PS 순으로 E. coli에대한항균력을나타내었다. 한편貝 母의경우, 다양한병원균에비교적우수한항균활성이인정되는것으로알려져있으나유독 E. coli에대해서는별다른항균활성을나타내지않는것으로알려져있고본실험의결과에서도 FT의 MIC가 16.250±8.385(6.250~25.000) mg/ml이인정되어, E. coli에대해극히미약한항균효과를나타내는것으로관찰되었다. 시간대별균생장곡선에미치는영향역시세균및다양한감염증에대한후보물질의항균활성을측정하는가장기본적인방법이다 22). 본실험의결과 ciprofloxacin 은배양24시간후부터대조군에비해유의성있는용량의존적인시간대별균생장억제를나타내었고 48, 72, 96 및 120 시간후에도대조군에비해유의성있는시간대별균생장억제를 MIC 및 MIC 2 에서각각나타내었다. YKKPJ, FF, MC, LF 및 PS에서도배양 24시간후부터대조군에비해유의성있는용량의존적인시간대별균생장억제를나타내었고 48, 72, 96 및 120시간후에도대조군에비해유의성있는시간대별균생장억제를 MIC 및 MIC 2에서각각나타내었다. FT 및 TH는배양 24 및 48시간에만국한되어대조군에비해유의성있는균생장억제를나타내었으나 72, 96 및 120시간에서는대조군에비해유의성있는생균수의변화는인정되지않았다. 호중구와같은다형핵백혈구및탐식세포에의한탐식작용은혈청중보체와같은다양한성분에의해탐식작용이촉진되어탐식한병원균을파괴한다 38). 일부병원균에서는이러한탐식세포의작용에대항하기위해탐식작용자체를피하거나탐식세포내에서생존하는방편으로변화해왔으므로고질적인감염성질환을치료 41
連翹金貝煎의 Escherichia coli 에대한시험관내항균력평가 하기위해서는탐식세포내생존병원균의제어가필수적이다 31). 본실험에서 Raw 264.7 세포를이용한세포내 E. coli 에대한사멸효과를평가한결과, 1/2 MIC 농도의 ciprofloxacin 처리군에서는대조군에비해유의성있는탐식세포내생균수의감소를나타내었고 1/2 MIC 농도의 YKKPJ, FF, MC, LF 및 PS 처리군에서도대조군에비해유의성있는탐식세포내생균수의감소를 YKKPJ, FF, LF, MC 및 PS 순으로각각나타내었으나 1/2 MIC 농도의 FT 및 TH는대조군에유의성있는탐식세포내생균수의감소를나타내지않았다. 대부분의감염성세균은세포표면의부착단백질과상호작용하여상피세포에침투하며 39), 특히 fibronectin-binding proteins 을통해상피세포내로침투되는것으로알려져있다 40). E. coli 역시유방상피세포내부착및침투성이상당히우수하여숙주의면역반응을회피하여 macrophage 와같은탐식세포에의해제거되지않아급성의심한유방염을일으킨다 6,7). 따라서 E. coli 에의해유발되는세균성유방염을제어하기위해서는반드시상피세포내세균침투를억제해야하며이를통해보다명확한항균력을평가할수있다 6,7). 본실험의결과 1/2 MIC 농도의 ciprofloxacin 은우수한상피세포내 E. coli 침투율억제효과를나타내었다. YKKPJ, FF, LF, MC 및 PS도상피세포내 E. coli 침투율억제효과가 YKKPJ, FF, LF, MC 및 PS 순으로사람유방암상피세포유래인 MCF-7 세포에서관찰되었다. FT 및 TH에서는의미있는상피세포내 E. coli 침투율억제효과가인정되지않았다. 이상의결과에서, 극히미약한항균효과를나타낸 FT와 TH를제외하고, YKKPJ, FF, LF, MC 및 PS 순으로 E. coli 에대한항균력, 상피세포내 E. coli 침투율억제및탐식세포내사멸증가효과를나타내었다. 특히복합방제인連翹金貝煎이개별약재보다우수한항균력이인정되어실제임상에서유방염치료에連翹金貝煎이우수한결과를나타낼것으로기대된다. 連翹金貝煎의항균활성은구성개별약재자체의항균력뿐만아니라이들구성약재의복합적인상호작용등을통해더우수한항균활성을나타내는것으로판단되나구성약재각각수많은생리활성물질을함유하고있어향후구성약재의상호작용에의한항균활성의변화및항균력을나타내는생리활성화학성분의검색을수행해야할것이다. Ⅴ. 결론 YKKPJ와구성단미제인 FF, MC, LF, FT, TH 및 PS를이용하여 E. coli에대한항균력을알아보기위하여각각 MIC를측정하고, MIC 및 MIC 2에서시간대별균생장곡선에미치는영향을살펴보았다. 그리고 Raw 264.7 세포를이용한탐식세포내사멸효과와 MCF-7 세포를사용하여상피세포내침투율억제효과를관찰한결과다음과같은결론을얻었다. 1. E. coli에대한 YKKPJ와구성단미제인 FF, MC, LF, FT, TH 및 PS의 MIC를평과한결과극히미약한항균효과를나타낸 TH과 FT를제외하고, YKKPJ, FF, LF, MC 및 PS 순으로항균력을나타내었다. 2. 시간대별균생장곡선에미치는영향 42
J Korean Obstet Gynecol Vol.28 No.1 February 2015 역시본실험의결과, YKKPJ, FF, MC, LF 및 PS는 MIC 및 MIC 2 에서각각용량의존적인시간대별균생장억제를나타내었으나, FT 및 TH는배양 24 및 48시간에만국한되어균생장억제를나타내었다. 3. Raw 264.7 세포를이용한세포내 E. coli에대한사멸효과를평가한결과, YKKPJ, FF, LF, MC 및 PS 순으로대조군에비해유의성있는탐식세포내생균수의감소를각각나타내었고, FT 및 TH는대조군에비해유의성있는탐식세포내생균수의감소를나타내지않았다. 4. MCF-7 세포를이용하여상피세포내 E. coli 침투율억제효과를관찰한결과 YKKPJ, FF, LF, MC 및 PS 순으로상피세포내 E. coli 침투율억제효과를나타내었고, FT 및 TH에서는의미있는상피세포내 E. coli 침투율억제효과가인정되지않았다. Received : January 28, 2015 Revised : February 01, 2015 Accepted : February 07, 2015 참고문헌 1. Spencer JP. Management of mastitis in breastfeeding women. Am Fam Physician. 2008;78:727-31. 2. Korean Breast Cancer Society. The Breast. Seoul:Ilchokak. 1999:47-8. 3. Wambach KA. Lactation mastitis: a descriptive study of the experience. J Hum Lact. 2003;19:24-34. 4. Chen CY, et al. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections may not impede the success of ultrasound -guided drainage of puerperal breast abscesses. J Am Coll Surg. 2010;210 :148-54. 5. Lawrence RA, Lawrence RM. Management of the mother-infant nursing couple. In: Breastfeeding: A Guide for the Medical Profession. 6th ed. St. Louis: Mosby. 2005:255-316. 6. Zhu W, et al. β-glucan modulates the lipopolysaccharide-induced innate immune response in rat mammary epithelial cells. Int Immunopharmacol. 2013;15 :457-65. 7. Dogan B, et al. Phylogroup and lpfa influence epithelial invasion by mastitis associated Escherichia coli. Vet Microbiol. 2012;159:163-70. 8. Burvenich C, et al. Severity of E. coli mastitis is mainly determined by cow factors. Vet Res. 2003;34:521-64. 9. Ackermann G, et al. Resistant to moxifloxacin in toxigenic Clostridium difficile isolates is associated with mutations in gyra. Antimicrob Agents Chemother. 2001;45 :2348-53. 10. Bachoual R, et al. Single or double mutation alterations of gyra associated with fluoroquinolone resistance in Campylobacter jejuni and Campylobacter coli. Microb Drug Resist. 2001;7:257-61. 11. Korean Medical Obstetrics and Gynecology compilation committee. Korean Medical Obstetrics and GynecologyⅡ. Seoul: Jungdam. 2007:446-9. 43
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