J Korean Soc Food Sci Nutr 한국식품영양과학회지 43(11), 1635~1641(2014) http://dx.doi.org/10.3746/jkfn.2014.43.11.1635 고욤 (Diospyros lotus) 잎유래 Ethyl cetate 분획물의항산화및항가려움활성 전인화 1 강현주 1 김상준 2 정승일 2 이현서 3 장선일 1,3 1 ( 주 ) 아토큐앤에이 2 ( 재 ) 전주생물소재연구소 3 전주대학교보건관리학과 ntioxidant and ntipruritic ctivities of Ethyl cetate Fraction from Diospyros lotus Leaves In Hwa Jeon 1, Hyun Ju Kang 1, Sang Jun Kim 2, Seung Il Jeong 2, Hyun-Seo Lee 3, and Seon Il Jang 1,3 1 to Q& Incoperation 2 Jeonju iomaterials Institute 3 Department of Healthcare & Science, Jeonju University STRCT Diospyros lotus has been cultivated for its edible fruits, which are considered to have medicinal importance. The aim of this study was to evaluate the antioxidant and antipruritic activities of water-soluble, methanol extract, and ethyl acetate (E) fractions from D. lotus leaves. The E fraction showed the lowest IC 50 vale (DPPH: 5.3 μg/ml, TS: 53.8 μg/ml). Therefore, we further investigated anti-inflammatory and antipruritic effects of the E fraction. TNF-α production increased by PM plus 23187 treatment was significantly inhibited by the E fraction in a dose-dependent manner. The E fraction also inhibited histamine release from rat peritoneal mast cells stimulated by compound 48/80, which promotes histamine release. Furthermore, E fraction had inhibitory effects on scratching behavior induced by compound 48/80 in alb/c mice. These results suggest that the E fraction from D. lotus leaves has potential as ameliorative agent against oxidative stress and pruritus-related disease. Key words: Diospyros lotus leaf, ethyl acetate fraction, antioxidant, mast cells, antipruritus 서 아토피피부염 (atopic dermatitis) 은만성피부염증과함께심한가려움증 (pruritus) 을동반한다 (1,2). 긁고싶은감정을불러일으키는가려움증은히스타민과같은가려움매개물질에의해서유도되는데, 정상인의경우긁으면그증상이쉽게완화되지만아토피환자의경우긁으면긁을수록더욱긁고싶은감정이형성되어심하게긁게된다 (3). 그러므로아토피환자의경우긁는행동으로인해피부장벽이붕괴되면서 2차감염을유발하여염증이더욱악화된다 (1-3). 아토피피부염은일시적으로완화될수있지만환경및식품등자극원에의해서재발되어악화되며악화와완화가반복되는현상으로그원인은아직까지명확하게알려지지않았다 (2). 이와같이아토피피부염에동반되는염증은과도한면역세포작용으로인해서 tumor necrosis-α(tnfα) 와 interleukin-1β(il-1β) 등의염증성사이토카인과하 Received 29 pril 2014; ccepted 26 September 2014 Corresponding author: Seon Il Jang, Department of Healthcare & Science, Jeonju University, Jeonbuk 560-759, Korea E-mail: sonjjang@jj.ac.kr, Phone: +82-63-220-3124 론 이드록시라디칼 ( OH), 슈퍼옥사이드라디칼 ( O - 2 ), 과산화수소 (H 2O 2) 등의활성산소류 (reactive oxygen species, ROS) 를대량생산하기때문에주변조직의손상을야기한다 (4,5). 그러므로아토피피부염과같은피부질환을개선하기위해서는가려움증을완화시키고 ROS를효과적으로제거할수있는소재가필요하다 (6). 고욤나무 (Diospyros lotus L.) 는우리나라와중국을비롯한아시아에분포하는낙엽성식물로성숙한과일을고욤이라하여직접섭취할수있다. 고욤은전통의학에서진정제 (sedative), 수렴제 (astringent), 항암 (anti-tumor), 항당뇨 (anti-diabetic), 해열제 (febrifuge) 및변비완화제 (laxative) 등으로사용되어왔다 (7). 최근에는고욤에함유된지방산, 당, 플라보노이드및비휘발성성분이알려지면서항응고, 뇌세포보호작용, 항산화및항암에대한효과가보고되었다 (8-10). 또한최근에저자들은고욤잎수용성추출물을대상으로항산화및항알레르기효과에대해서보고한바있다 (11,12). 본연구는고욤잎으로부터수용성추출물과메탄올추출물을얻고메탄올추출물에서 ethyl acetate(e) 분획물을얻어 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) 및 2,2'-
1636 전인화 강현주 김상준 정승일 이현서 장선일 azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)(ts) 라디칼소거활성을조사하였다. 그후각추출물및분획물을대상으로 phorbol 12-myristate 13-acetate(PM) 와 calcium ionophore 23187(23187) 로활성화된랫트복강비만세포 (rat peritoneal mast cells, RPMCs) 에서 TNFα 생성및히스타민방출량을조사한후 compound 48/80으로유도한가려움증억제를조사한결과매우유의한결과를얻었기에보고하는바이다. 재료및방법시약 TNF-α 및 histamine ELIS kit는 R&D Systems Inc. (Minneapolis, MN, US) 에서구입하였으며, percoll, compound 48/80, phorbol 12-myristate 13-acetate (PM), calcium ionophore 23187(23187), penicillin/ streptomycin, methysergide maleate(mm), butylated hydroxytoluene(ht), 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)(ts), potassium persulfate, sodium bicarbonate, azelastine, lipopolysaccharide(lps), methysergide, (±)-6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane- 2-carboxylic acid(trolox) 및기타시약은 reagent grade 로 Sigma-ldrich Co.(Louis, MO, US) 로부터구입하였다. 31.25, 62.5, 125, 250, 500 및 1,000 μg/ml가되도록정량하여 96 well plate에각시료를 100 μl 주입하고, 동시에 0.3 mm DPPH 100 μl를넣어총량이 200 μl가되도록하였다. 실온에서 30분간반응시킨후 ELIS reader (Tecan Group Ltd., Mannedorf, Switzerland) 로 540 nm 파장에서흡광도를측정하였다. DPPH 라디칼소거활성은시료용액의첨가군과무첨가군사이의흡광도의차이를백분율로나타내었다. DPPH 라디칼소거활성 (%) = (1- 시료첨가군흡광도시료무첨가군흡광도 ) 100 TS 라디칼소거활성측정 TS 라디칼소거능은 Re 등 (14) 의방법에의하여측정하였다. TS 7.4 mm과 potassium persulfate 2.6 mm을혼합한후빛이차단된실온에서 24시간동안방치하여 radical을형성한다음 TS 용액을실험직전에 732 nm 에서흡광도가 0.70±0.03이되도록메탄올로희석하여사용하였다. 각추출물과 Trolox의최종농도가 3.91, 7.81, 15.63, 31.25, 62.5, 125, 250, 500 및 1,000 μg/ml가되도록정량하여 50 μl에준비된 TS 용액 950 μl를첨가하여암소에서 30분간반응시킨후 732 nm에서흡광도를측정하였다. TS 라디칼소거활성은시료용액의첨가군과무첨가군사이의흡광도의차이를백분율로나타내었다. TS 라디칼소거활성 (%) = (1- 시료첨가군흡광도시료무첨가군흡광도 ) 100 고욤잎추출고욤잎은전라북도진안군부귀면수항리신기마을에서 2013년 7월 10일에채취한후우석대학교한의과대학본초방제학교실김홍준교수님으로부터동정을받았다. 고욤잎표본 (#2013-07-10) 은전주대학교의과학대학보건관리연구실에보관하고있다. 채취된고욤잎은즉시증류수로세척하여 5분간증기찜을한후실온에서선풍기를활용하여건조한다음최종적으로건조기에서 40 C로 12시간동안건조하였다. 건조된고욤잎은 500 g으로정량하여증류수 3,000 ml를주입하고 10분간끓인후추출물은 0.45 μm 필터를사용하여여과하고동결건조기 (FDU-2100, EYEL WORLD-Tokyo Rikakikaki, Tokyo, Japan) 에서건조하여 45.3 g을얻었다. 또한건조된고욤잎 600 g을정량하여메탄올 4,000 ml를주입하고 7일간방치한다음추출물은 0.45 μm 필터를사용하여여과하고감압에의해유기용매를제거한뒤최종적으로동결건조하여 70.3 g을얻은후 50 g을취하여 ethyl acetate 분획물을약 650 mg 얻고 -20 C에서보관하면서실험에사용하였다. DPPH 라디칼소거활성측정 DPPH 라디칼소거활성은 lois(13) 의방법으로측정하였다. 시료를 MeOH로녹여최종농도가 3.91, 7.81, 15.63, 실험동물무균환경에서사육된 7주령의수컷 alb/c 마우스와 10 주령의 Sprague Dawley 랫트는중앙실험동물 ( 주 )(Seoul, Korea) 에서구입하였고, 사료와물을충분히공급하면서 1 주일간순화시킨후실험에사용하였다. 사육환경은낮과밤의주기를 12시간씩하였고, 온도 (20 22 C) 와습도 (50 60%) 는일정하게유지하였으며, 전주대학교실험동물위원회의규정에준하여실험하였다. RPMCs 분리및분획물처리 RPMCs의분리는 Martynova 등 (15) 의방법에따라분리하였다. 즉에테르 (ether) 로마취시킨다음 calcium-free HEPES-Tyrode buffer(10 mm Hepes, 113 mm NaCl, 4.7 mm KCl, 2.13 mm MgCl 2, 0.6 mm NaH 2PO 4, 10 mm glucose, ph 7.4) 10 ml를복강에주입시켜약 90초간복강을부드럽게마사지한후복강을주의깊게열어 Pasteur pipette을사용하여세포부유액을얻어 percoll density gradient법으로 RPMCs를얻었다. 특별히본실험목적에따라충분한세포를확보하기위해서 5 10마리랫트에서얻은 RPMCs를혼합하여사용하였다. E 분획물 (25 100 μg/ml), 수용성또는 MeOH 추출물 ( 각각 100 μg/ml) 은 RPMCs(5 10 5 ) 에 10분또는 2시간동안전처리한후
고욤잎유래 E 분획물의항산화및항가려움활성 1637 compound 48/80이나 PM와 23187로자극하여히스타민과전염증성사이토카인측정에사용하였다. 세포생존율측정 RPMCs 세포생존율은 MTT assay 방법에의해측정하였다. 즉 RPMCs(5 10 5 /ml) 를 24 well plate에접종하고상기와같이 E 분획물 (25 100 μg/ml), 수용성또는 MeOH 추출물 ( 각각 100 μg/ml) 을처리한후에 PM(20 nm) 와 23187(1 μm) 을동시에자극한후 12시간후에 MTT 용액 (5 mg/ml) 을주입하고 4시간동안 37 C에서방치한후상층액을제거하고 formazan 산물을 demethyl sulfate로용해하여 96 well plate로옮겨 540 nm ELIS reader로흡광도를측정하였다. 히스타민방출량측정 RPMCs(5 10 5 cells/ml) 는각추출물 (100 μg/ml) 또는여러가지농도 (25 100 μg/ml) 의 E 분획물을 37 C 에서 10분간전처리한다음 compound 48/80(0.5 μg/ml) 으로자극하여 30분간방치한후, 반응을중지시키기위하여배양튜브를빙수에넣어충분히냉각시킨후 1,200 rpm 으로 15분간원심침전시키고상층액을얻어히스타민을측정하였다. 즉 anti-histamine antibody를활용하여상기와같이얻은상층액시료에반응시키고, anti-histamine antibody에특이적으로작용하는기질효소가부착된 2차항체를주입한후발색시켜 R&D Systems Inc. 가제공하는방법에따라 ELIS reader(molecular Devices, Sunnyvale, C, US) 로측정하였으며, 히스타민의정량은농도별로히스타민을처리하여반응시킨후표준곡선을작성하여계산하였다. TNF-α 측정 RPMCs로부터사이토카인의측정은 E 분획물 (25 100 μg/ml), 수용성또는 MeOH 추출물 ( 각각 100 μg/ml) 을 2시간동안전처리한후 PM(20 nm) 와 23187(1 μm) 로동시에자극한다음 12시간후에세포상층액으로부터 TNF-α를측정하였다. TNF-α는 anti-mouse TNF-α antibody를사용하여각각에특이적으로작용하는 ELIS kit 을사용하여 R&D Systems Inc. 가제공하는방법에준하여측정하고정량하였다. 즉세포상층액또는 5배희석혈청 100 μl를각각의항체가코팅된 plate에주입하고반응시킨후잘세척한다음 horseradish peroxidase가부착된 2차항체를주입하고반응시킨후발색기질을주입하고반응시켜 ELIS reader로측정하였으며, 각물질에대한정량은각각의물질을농도별로처리하여반응시켜표준곡선을작성하고세포상층액에함유된 TNF-α의양을계산하였다. 가려움증유도및긁는행동측정 alb/c 마우스는실험군당 5마리의마우스를각각투명 아크릴케이지 (20 26 13 cm) 에한마리씩넣고안정을위해 30분동안동일한실험환경에방치하였다. 그후대조군은생리식염수를경구투여하였고, 실험군은 E 분획물 (2.5 10 mg/kg), 수용성또는 MeOH 추출물 ( 각각 10 mg/ kg), 항가려움증약제로알려진 methysergide(10 mg/kg), azelastine(10 mg/kg) 을경구투여하고, 60분후에 compound 48/80(50 μg/site) 을 100 μl씩마우스등의양쪽어깨높이사이에피하주사하였다. 가려움증유발물질을주사한마우스는곧바로 Mihara 등 (16) 의방법을따라 micro-camera(oncctv, 서울, 대한민국 ) 를사용하여 60분동안녹화하였으며, 뒷발로가려움증유발물질이주입된부위를긁는횟수를이중맹검법으로계수하여평가하였다. 각유발물질에따른실험은각각다른날에진행되었으며매실험에사용된마우스는 1회사용되었다. 통계처리모든실험값은평균 ± 표준오차로표시하였으며, 통계분석은 NOV와 Student's t-test로처리하였으며, 유의성한계는 P<0.05로정하였다. 결과및고찰고욤잎 E 분획물의 DPPH와 TS 라디칼소거활성고욤잎유래 E 분획물의 DPPH와 TS 라디칼소거활성을알아보기위하여수용성추출물과메탄올추출물그리고합성항산화제로알려진 HT 또는 Trolox와비교하였다. 그결과 Fig. 1에서보여준바와같이고욤잎유래 E 분획물은모든농도에서수용성추출물과 MeOH 추출물뿐만아니라 HT보다 DPPH 라디칼소거활성이매우우수하였다. 수용성추출물과 MeOH 추출물의경우도 31.3 μg/ml 이하의저농도에서는 HT와 DPPH 라디칼소거활성이유사하였지만, 그이상의농도에서는 HT보다 DPPH 라디칼소거활성이우수하였다. 더불어 E 분획물의 DPPH 라디칼소거활성에대한 IC 50 은 5.3 μg/ml로수용성수출물 (37.9 μg/ml), MeOH 추출물 (41.2 μg/ml) 과 HT(50.3 μg/ ml) 보다약 5 7배낮은농도에서그활성을보여주었다. 또한 Fig. 1에서나타낸바와같이 TS 라다칼소거활성의경우에서도고욤잎유래 E 분획물은모든농도에서수용성추출물과 MeOH 추출물뿐만아니라 Trolox보다 TS 라디칼소거활성이매우우수하였다. 수용성추출물과 MeOH 추출물은 Trolox보다각농도에서 TS 라디칼농도가낮았지만농도가증가할수록그활성이증가하는효과가있었다. E 분획물의 TS 라디칼소거활성에대한 IC 50 은 53.8 μg/ml로수용성수출물 (311.2 μg/ml), MeOH 추출물 (402.5 μg/ml) 과 HT(178.6 μg/ml) 보다약 3 7 배낮은농도에서그활성을보여주었다. 이러한고욤잎유래 E 분획물의 DPPH 라디칼소거활성 (IC 50: 5.3 μg/ml) 은고욤 (D. lotus fruit) 추출물 (72.6 μg
1638 전인화 강현주 김상준 정승일 이현서 장선일 Fig. 1. Effects of E fraction from D. lotus leaf on DPPH radical and TS radical scavenging activity. : DPPH radical scavenging activity, : TS radical scavenging activity. : water soluble extract, : MeOH extract, : E fraction, : butylated hydroxytoluene or Trolox. Values are shown as mean±sd of 3 replicates. /ml) 보다높았으며 (9), 고욤씨유래 quercetin(ic 50: 5,8 μg /ml) 과유사하였고 (7), Zadra 등 (17) 이보고한가지과 (Solanaceae) 에속하는 Solanum guaraniticum(9.11 μg/ ml) 보다우수한효과를보였다. 그러므로고욤잎유래 E 분획물은강력한항산화효과를발휘할수있는소재라사료된다. 고욤잎 E 분획물이세포생존율에미치는영향고욤잎 E 분획물의농도에따른세포생존율에미치는영향을조사하기위하여, RPMCs을활성화하기위해 compound 48/80(0.5 μg/ml) 을처리하기전에고욤 E 분획물 (25 100 μg/ml), 수용성추출물또는 MeOH 추출물을 2 시간동안처리하여 MTT assay법으로세포생존율을비교조사하였다. 그결과 Fig. 2에서보여준바와같이 compound 48/80을처리한대조군은정상군에비해세포독성이있었지만, 사용된 E 분획물의모든농도에서정상군과유사한세포생존율을보였고, 더불어수용성추출물과 MeOH 추출물에서도유사한결과를얻었다 (Fig. 2). 따라서본연구에서사용한모든 E 분획물과수용성및 MeOH 추출물은세포독성이없었다. 고욤잎 E 분획물의히스타민방출억제효과한편본연구는고욤잎유래 E 분획물이가려움증유발의핵심물질인히스타민방출에대한억제효과를알아보기위하여 RPMCs를접종하고 E 분획물 (25 100 μg/ml) 을주입하고 37 C에서 10분간전처리한다음 compound 48/ 80(0.5 μg/ml) 으로자극하여히스타민의양을측정하였다. 그결과 Fig. 3과같이 RPMCs를 compound 48/80으로자극할경우히스타민방출량은 63.49±5.67 ng/ml로정상대조군 (10.17±1.40 ng/ml) 에비해서현저히증가하였다 (P<0.001). 그러나 E 분획물을처리하였을경우농도에의존적으로억제하는효과가있었다. 특히 100 μg/ml 처리군에서는히스타민방출이 31.57±1.40 ng/ml로대조군에비해서약 47.6% 가억제되는우수한효과가있었다 (P< Fig. 2. Effects of E fraction from D. lotus leaf on cell viability. RPMCs (5 10 5 /ml) were pre-treated with or without each extract and E fraction at indicated concentrations for 2 hr, and then stimulated with or without PM (20 nm) plus 23187 (1 μm) for 12 hr. Cell viability were measured by MTT assay as described in the section of Materials and Methods. : effect of a various concentration of E fraction, : effect of water soluble extract (WS), MeOH extract and E fraction at the same concentration (100 μg/ml). Values represent the means±sd of three independent experiments. # P<0.01 versus the non-treated normal group. * P<0.05 versus control group treated with PM plus 23187 alone control group.
고욤잎유래 E 분획물의항산화및항가려움활성 1639 Fig. 3. Effects of E fraction from D. lotus leaf on compound 48/80-induced histamine release in RPMCs cells. RPMCs cells (5 10 5 /ml) were pre-treated with or without each extract and E fraction at indicated concentrations for 2 hr, and then stimulated with or without compound 48/80 (0.5 μg/ml). Histamine assay was performed by ELIS method on supernatant from RPMCs. : effect of a various concentration of E fraction, : effect of water soluble extract (WS), MeOH extract and E fraction at the same concentration (100 μg/ml). Values represent the means±sd of three independent experiments. # P<0.001 versus the non-treated normal group. * P<0.05, ** P<0.01, and *** P<0.001 versus compound 48/80 alone control group. 0.001). 또한본연구는 E 분획물과고욤잎수용성및 MeOH 추출물의히스타민방출억제에대한효과를비교하기위해서 100 μg/ml 농도로고정하여실험한결과 Fig. 3에서나타낸바와같이고욤잎수용성추출물과 MeOH 추출물은각각 48.97±3.70 ng/ml와 46.87±3.54 ng/ml 로유사하게히스타민방출억제효과가있었고 (P<0.05), E 분획물은고욤잎수용성및 MeOH 추출물보다히스타민방출억제효과가우수하였다. Compound 48/80은비만세포를활성화시키는물질로알려져있는데, 활성화된비만세포는히스타민, serotonin 또는 substance P와같은가려움증매개물질을분비한다 (18). 이러한비만세포에서분비되는물질로인해유발되는가려움증은아토피피부염등알레르기성피부질환환자에서흔히발견되는가려움증과유사한증상을유발한다. 그러므로저자들은전연구에서고욤잎추출물을전처리할경우 compound 48/80으로자극하였을때히스타민을억제하는효과를규명하여보고한바있으며 (11), 본연구에서는고욤잎 E 분획물의히스타민방출억제효과에있어우수한소재임을확인하였다. 고욤잎 E 분획물의 TNF-α 생성억제효과본연구는고욤잎유래 E 분획물이활성화된 RPMCs의전염증성사이토카인인 TNF-α의생성억제에대한효과를알아보기위하여 RPMCs를접종하고 E 분획물 (25 100 μg/ml) 을 2시간전처리한다음 PM와 23187을동시에처리하고 12시간후배양액에축척된 TNF-α 양을측정하였다. 그결과 Fig. 4와같이 PM와 23187을처리한대조군은정상대조군에비해서 TNF-α의생성이 594.51± 28.99 pg/ml로현저히증가 (P<0.001) 한반면, E 분획물을처리한실험군은농도의존적으로 TNF-α 생성이억제되 Fig. 4. Effects of E fraction from D. lotus leaf on PM plus 23187-induced TNF-α production in RPMCs cells. RPMCs cells (5 10 5 /ml) were pre-treated with or without each extraction and E fraction at indicated concentrations for 2 hr, and then stimulated with or without PM (30 ng/ml) plus 23187 (10 μm) for 12 hr. Cytokine concentrations were measured in cell supernatants using the ELIS method. : effect of a various concentration of E fraction, : effect of water soluble extract (WS), MeOH extract and E fraction at the same concentration (100 μg/ml). Values represent the means±sd of three independent experiments. # P<0.001 versus the non-treated normal group. * P<0.05, ** P<0.01, and *** P<0.001 versus PM plus 23187 alone control group.
1640 전인화 강현주 김상준 정승일 이현서 장선일 Fig. 5. nti-pruritic effects of E fraction on the scratching behavior induced by compound 48/80 () in alb/c mice. E fraction (2.5~10 mg/kg), 10 mg/kg of water soluble extract (WS), MeOH extract, methysergide or azelastine was treatment 1 hr before compound 48/80 (50 μg/site) was injected into rostral back. The scratching of the injected site by the hind paw was counted for 60 min. : effect of a various concentration of E fraction, : effect of water soluble extract (WS), MeOH extract and E fraction at the same concentration (10 mg/kg). Values represent the means±se of 5 individuals. # P<0.001 versus normal group. * P<0.01 and *** P<0.001 versus C 48/80 alone control group. 었으며모든농도에서유의한효과가있었다 ( 각각 P<0.05, P<0.01, P<0.001). 더불어본연구는 E 분획물과고욤잎수용성및 MeOH 추출물의 TNF-α 생성억제에대한효과를비교하기위해서 100 μg/ml 농도로고정하여실험한결과 Fig. 4에서나타낸바와같이고욤잎수용성추출물과 MeOH 추출물은각각 430.45±31.87 ng/ml와 450.45± 27.74 ng/ml로유사하게 TNF-α 생성억제효과가있었고 (P<0.05), E 분획물은고욤잎수용성및 MeOH 추출물보다 TNF-α 생성억제효과가우수하였다 (P<0.001). TNF-α는생체의염증반응을야기하는대표적인사이토카인으로주로활성화된대식세포 (macrophages) 에서대량생산되지만, 림포이드계의세포 (lymphoid cells), 비만세포, 내피세포 (endothelial cells) 를비롯하여생체에존재하는다양한세포에서도생산된다 (18,19). 특히비만세포는 PM와 23187로동시에자극할경우 TNF-α가대량생산되는것으로잘알려져있다 (19). 그러므로염증반응을완화하기위해서는 TNF-α를효과적으로제어할수있는물질이필요한바, 본고욤잎유래 E 분획물은이러한관점에서염증반응을제어할수있는효과적인물질이라사료된다. 고욤잎 E 분획물의가려움억제효과본연구는고욤잎유래 E 분획물이피부가려움증억제에미치는영향을알아보기위하여 E 분획물 (2.5 10 mg/ kg) 과수용성및 MeOH 추출물 ( 각각 10 mg/kg) 을 alb/c 마우스에경구투여하고 1시간후에가려움유발물질을마우스등의양쪽어깨높이사이에피하주사하였다. 그결과 Fig. 5와같이 compound 48/80을피하에주입한대조군은 255.3±39.5회 /60 min으로정상대조군 (32.3±4.9회/60 min) 에비해서긁는횟수가현저히증가하였다 (P<0.001). 그러나 E 분획물을처리한실험군은 compound 48/80이유도하는가려움증을농도에의존적으로억제하는효과가 있었다. 특히고욤잎유래 E 분획물 10 mg/kg 투여군에서는 compound 48/80이유도하는가려움횟수가 120.7± 24.2/60 min으로약 53% 억제효과가있었다 (P<0.001). 항가려움증효과가우수한약물로알려진 azelastine(177.5± 55.7회 /60 min) 및 methysergide와같은농도로비교하였을때 E 분획물의효과는 azelastine보다낮았을지라도 methysergide보다는효과가높았다 (Fig. 5). zelastine는 H1 히스타민수용체에대한길항제로 (antagonist) 로알려진항가려움증약물로히스타민과 substance P뿐만아니라 compound 48/80과같은가려움유발물질로유도된가려움증을효과적으로완화하는것으로알려졌다 (20). 또한 methysergide도 compound 48/80 유도가려움증을완화시킬수있는약물로잘알려져있다 (21). 앞으로 E 분획물을대상으로가려움억제에대한분자적기전을규명할필요가있으며, 본연구결과고욤잎유래 E 분획물의우수한항가려움증효과는아토피피부질환과같은피부가려움증에사용될수있는매우우수한소재라사료된다. 요약본연구는고욤잎유래 E 분획물의항산화및항가려움활성을조사하였다. E 분획물은 DPPH 라디칼소거활성이수용성및 MeOH 추출물보다매우우수하였을뿐만아니라합성항산화제인 HT보다현저히높았다. 또한 TS 라디칼소거활성도수용성과 MeOH 추출물뿐만아니라 Trolox보다현저히높았다. 본연구에사용된 E 분획물과수용성및 MeOH 추출물은세포에대한독성이없었다. 또한 E 분획물은농도에의존적으로활성화된비만세포로부터히스타민방출억제와 TNF-α 생성억제효과가있었으며, 같은농도에서수용성및 MeOH 추출물보다억제효과
고욤잎유래 E 분획물의항산화및항가려움활성 1641 가우수하였다. 더욱이 E 분획물은농도의존적으로 compound 48/80으로유도된가려움증을효과적으로억제하는활성이있었고, 같은농도에서항가려움약제로알려진 azelastine보다는그효과가낮았지만수용성및 MeOH 추출물뿐만아니라 methysergide보다우수한항가려움효과를발휘하였다. 앞으로이러한항가려움효과에대한 E 분획물의분자적작용기전을규명해야할필요가있으며, 고욤잎유래 E 분획물은강력한항산화및항가려움활성을지닌우수한소재라사료된다. 감사의글 이논문은 2013년도지역산업기술개발사업 ( 과제번호 : R0002271) 으로산업통상자원부의지원을받아연구되었다. REFERENCES 1. Eichenfield LF, Ellis CN, Mancini J, Paller S, Simpson EL. 2012. topic dermatitis: epidemiology and pathogenesis update. Semin Cutan Med Surg 31: S3-5. 2. oguniewicz M, Leung DY. 2012. Recent insights into atopic dermatitis and implications for management of infectious complications. J llergy Clin Immunol 125: 4-13. 3. Tominaga M, Takamori K. 2014. Itch and nerve fibers with special reference to atopic dermatitis: therapeutic implications. J Dermatol 41: 205-212. 4. Hosoda M, Yamaya M, Suzuki T, Yamada N, Kamanaka M, Sekizawa K, utterfield JH, Watanabe T, Nishimura H, Sasaki H. 2002. Effects of rhinovirus infection on histamine and cytokine production by cell lines from human mast cells and basophils. J Immunol 169: 1482-1491. 5. Wiseman H. 1996. Dietary influences on membrane function: importance in protection against oxidative damage and disease. Nutr iochem 7: 2-6. 6. ouayed J, ohn T. 2010. Exogenous antioxidants-doubleedged swords in cellular redox state: Health beneficial effects at physiologic doses versus deleterious effects at high doses. Oxid Med Cell Longev 3: 228-237. 7. Moghaddam H, Nabavi SM, Nabavi SF, igdellou R, Mohammadzadeh S, Ebrahimzadeh M. 2012. ntioxidant, antihemolytic and nephroprotective activity of aqueous extract of Diospyros lotus seeds. cta Pol Pharm 69: 687-692. 8. yaz F, Kadioglu. 1999. Fatty acid compositional changes in developing persimmon (Diospyros lotus L.) fruit. N Z J Crop Hortic Sci 27: 257-261. 9. Loizzo MR, Said, Tundis R, Hawas UW, Rashed K, Menichini F, Frega NG, Menichini F. 2009. ntioxidant and antiproliferative activity of Diospyros lotus L. extract and isolated compounds. Plant Foods Hum Nutr 64: 264-270. 10. Nabavi SM, Ebrahimzadeh M, Nabavi SF, Fazelian M, Eslami. 2009. In vitro antioxidant and free radical scavenging activity of Diospyros lotus and Pyrus boissieriana growing in Iran. Pharmacogn Mag 5: 122-126. 11. Kim HS, Jeon IH, Mok JY, Kang HJ, Shin JH, Park YK, Jeong SI, Jang SI. 2013. nti-allergy and anti-pruritic effects of Diospyros lotus L. leaf extract. Kor J Pharmacogn 44: 60-69. 12. Kim HS, Kang HJ, Jeon IH, Mok JY, Park YK, Shin JH, Kim JH, Jang SI. 2012. ntioxidant activity and protective effect of leaf extract from Diospyros lotus on oxidative stress of red blood cells. Korean J Oriental Physiology & Pathology 27: 631-636. 13. lois MS. 1958. ntioxidant determinations by the use of a stable free radical. Nature 181: 1199-1200. 14. Re R, Pelligrini N, Proteggente, Pannala, Yang M, Rice-Evans C. 1999. ntioxidant activity applying an improved TS radical cation decolorization assay. Free Radic iol Med 26: 1231-1237. 15. Martynova MG, ystrova O, Moiseeva OM, Evdonin L, Kondratov K, Medvedeva ND. 2005. The presence of NP in rat peritoneal mast cells. Cell Res 15: 811-816. 16. Mihara K, Kuratani K, Matsui T, Nakamura M, Yokota K. 2004. Vital role of the itch-scratch response in development of spontaneous dermatitis in NC/Nga mice. r J Dermatol 151: 335-345. 17. Zadra M, Piana M, rum TF, oligon, Freitas R, Machado MM, Stefanello ST, Soares F, thayde ML. 2012. ntioxidant activity and phytochemical composition of the leaves of Solanum guaraniticum. St.-Hil. Molecules 17: 12560-12574. 18. enyon RC, Robinson C, Church MK. 1989. Differential release of histamine and eicosanoids from human skin mast cells activated by IgE-dependent and non-immunological stimuli. r J Pharmacol 97: 898-904. 19. Walsh LJ, Trinchieri G, Waldorf H, Whitaker D, Murphy GF. 1991. Human dermal mast cells contain and release tumor necrosis factor alpha, which induces endothelial leukocyte adhesion molecule 1. Proc Natl cad Sci US 88: 4220-4224. 20. ndoh T, Zhang Q, Yamamoto T, Tayama M, Hattori M, Tanaka K, Kuraishi Y. 2010. Inhibitory effects of the methanol extract of Ganoderma lucidum on mosquito allergy-induced itch-associated responses in mice. J Pharmacol Sci 114: 292-297. 21. Takubo M, Ueda Y, Yatsuzuka R, Jiang S, Fujii Y, Kamei C. 2006. Characteristics of scratching behavior induced by some chemical mediators in hairless mice. J Pharmacol Sci 100: 285-288.