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J Korean Med Ophthalmol Otolaryngol Dermatol 2015;28(1):68-84 pissn 1738-6640 eissn 2234-4020 http://www.ood.or.kr http://dx.doi.org/10.6114/jkood.2015.28.1.068 Original Article / 원저급성아토피피부염마우스모델에서한약조합약물의 염증반응진정효과 정재훈 김경준 가천대학교한의과대학한방안이비인후피부과 Anti-inflammatory effects of herbal medicines(rubus coreanus, Rehmanniae Radix, Houttuynia cordata, Betulae cortex) EtOH extract on acute atopic dermatitis mice Jae-Hoon Jung Gyung-Jun Kim Department of Ophthalmology, Otolaryngology and Dermatology, College of Korean Medicine, Gachon University Abstract Object : The object of this study was effected of composed of 4 herbal medicines(rubus coreanus, Rehmanniae Radix, Houttuynia cordata, Betulae cortex) on acute atopic dermatitis mice. Methods : BALB/c mice were divided 4 groups ; normal group, negative control group of acute atopic dermatitis mice induced by DNCB, treated apply to the back skin with the herbal medicine group, and treated orally with herbal medicine group. Treated with herbal medicine and DNCB during 2 weeks. After treated, measured WBCs, RBCs, and platelet in the blood, and analysed mrna expression of spleen. Result : Composed herbal medicines could reduce WBCs, lymphocytes, monocytes, neutrophils, and eosinophils in the mouse blood. And, could down TNF-α levels in spleen. In the skin tissue histology results, herbal medicines reduce the cells and T cells. Conclusion : Composed herbal medicines help to another inflammatory disease because they reduce the cells and T cells in the skin tissues. And they have inhibitory effects of TNF-α mrna expression, and Th 2 immune responses. Therefore herbal medicines use for an acute atopic dermatitis treatment. Key words : atopic dermatitis; Rubus coreanus; Rehmanniae Radix; Houttuynia cordata; Betulae cortex c 2015 the Society of Korean Medicine Ophthalmology & Otolaryngology & Dermatology This is an Open Access journal distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/license/by-nc/3.0/) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. 68

정재훈외 1 인 : 급성아토피피부염마우스모델에서한약조합약물의염증반응진정효과 Ⅰ. 서론 아토피피부염은대부분유아기나소아때호발하 여호전과악화를반복하는만성재발성피부염으로, 진단기준으로는소양감, 특징적인형태와분포, 만성 피부염, 아토피질환의병력이나가족력등이제시되 고있다 1). 국내에서유병률은꾸준히증가하고있는 중으로, 소아에서는 10-20 %, 성인에서는 2-4 % 의 유병률을보이며, 대기오염, 주거환경변화로인한항 원에대한노출의증가, 모유수유감소, 소아기감염 질환의감소, 생활방식의서구화, 정신적스트레스 등이증가의원인으로추측된다 2). 아토피피부염의면역학적특성으로는혈중 IgE 항 체의양이증가하고, IL-4 등의발현이증가되는반 면, IFN-γ 의발현은저하되어제 2 형 helper T 세 포가제 1 형 helper T 세포보다우세되어제 2 형반 응의편향화가나타난다 3). 그치료는염증과소양감의조절, 2 차병변발생의 방지를목적으로스테로이드나항생제등을주로사용 하지만만족도가높지못하고그부작용도상당하기 때문에한약을비롯한각종생약이나자연치유에대 한관심이날로증가하고있다 4). 한의학에서는胎癬, 浸淫瘡, 胎斂瘡, 濕斂瘡등의범 주에해당하며, 이들의발병원인을血熱, 濕熱, 血燥 등으로보고淸熱, 解毒, 除濕, 祛風, 養血등의치법 을주로이용하고있다 5). 복분자 (Rubus Coreanus Miquel) 는장미과에속한 낙엽관목인복분자딸기및동속근연식물의미성숙 한과실을말하며, 오표자라고불려지기도한다 6). 항 산화작용 7) 과항염증작용 8) 등의생리활성효능을지니 는것으로보고되었다. 생지황 (Rehmannia glutinosa Corresponding Author : Gyung-Jun Kim, Gachon University Oriental Medicine Hospital Gil Medical Center, 12, Dokjeom-ro 29beon-gil, Namdong-gu, Incheon, Korea(Tel : 032-468-0330, Fax : 032-468-4033, E-mail : kkjo215@gachon.ac.kr) Recieved 2015/1/7 Revised 2015/1/28 Accepted 2015/2/4 Libschitz var. purpurea Makino) 은현삼과에속한다년생초목인지황의신선한뿌리를말한다 9). 항산화작용 10), 항염증작용 11,12) 을가지는것으로보고되었다. 어성초 (Houttuynia cordata thunb) 는삼백초과에속한다년생초본인약모밀의꽃필때의지상부를채취하여건조시킨것 13) 으로, 어성초추출물에항균작용, 항암작용, 항염증작용및항알레르기성작용등이있다고보고되었다 14,15). 화피 (Betulae cortex) 는자작나무과에속한落葉喬木인자작나무의樹皮를건조한것으로 16), 항산화, 항암효과를가지고있는것으로보고되었다 17). 마우스에아토피피부염을유발시키는방법은여러가지가있는데, 화학물질을이용하거나항원을이용하는방법, 식이유도, 환경유도, 그리고오발부민을이용한방법들이있다. 화학물질을이용한경우는 DNCB(2,4-dinitrochloro benzene) 등을용매에녹여마우스의제모부위에적당량을도포하여아토피피부염을유발시키게된다. DNCB 도포후발생한피부병변은엄밀히말해아토피피부염과유사한접촉성과민반응이나, IgE 및 Th2 사이토카인의증가등아토피피부염의면역반응이유발되는것으로미루어인간에서의아토피피부염과유사한병변으로볼수있다 18). 또한, 집먼지진드기항원의도포와달리 tape-stripping 이필요없고화학약품이므로치료약제와의상호작용이적을것으로사료되어본실험의아토피피부염유발물질로사용하였다. 연구자는아토피피부염에대한생약특히한약에대한효능을확인하고자, 최근연구결과를통해항산화, 항염증효과가입증되어염증에대한진정효과가우수할것으로추정되는네가지한약 ( 복분자, 생지황, 어성초, 화피 ) 을균등하게혼합한후, DNCB 로급성적으로아토피피부염이유발된마우스를대상으로, 그효과를혈액및조직학적분석과사이토카인분석을통하여알아보고자한다. 69

Ⅱ. 재료및방법 1. 재료 1) 약재복분자, 생지황, 어성초, 화피각약재는옴니허브 (Korea) 에서구입하여에탄올추출법으로추출하였다. 우선각각의약재를믹서기를이용하여고운분말로분쇄시킨후분말화된시료 100 g을정량후 1 L 의 80 % 에탄올을가하여 30분간 Ultrasonicator 를이용하여 sonication 하였다. 추출된액은여과지 (WhatmanR, UK) 를이용하여여과시킨다. 여과후남은약재를다시 1 L의 80 % 에탄올을가하여 30분간 sonication 한다. 추출액을감압농축기를이용하여 45 에서농축시키고, 그농축액을동결건조하였다. 각약재의수출율은복분자 16.6 %, 어성초 5.5 %, 화피 7.7 %, 생지황 16.8 % 이었다. 동결건조후약재를막자사발을이용해곱게갈아분말상태로만든다. 분말상태인각약재를식염수에넣고균질기를사용하여녹여준후실험에사용하였다. 분말상태의약재는냉동보관하여필요시마다사용하였다. 각약재의양은복분자, 생지황, 어성초, 화피각각동일한양을혼합하여실험약물을만들었다. 2) 동물실험동물은생후 6주령이된수컷 Balb/c 마우스 12마리를오리엔트 (Korea) 으로부터공급받았다. 일주일간온도 (24±2 ), 습도 (40~60 %) 와밤낮주기 (12시간씩 ) 가일정하게조절되는환경인경희대한의과대학동물사육실에서고형사료와물을섭취시켜환경에적응시켰다. 각 cage마다 3마리씩배정하여총 4cage 에나누었다. 2. 방법 1) 실험군분류및아토피유발실험실환경에서 1주간적응시킨 Balb/c 마우스를 각세마리씩정상군 (Normal), 대조군 (Control), 피부도포군 (DAHM), 경구투여군 (OAHM) 의네개군으로분류한후마우스등의털을이발기와면도기를사용하여제모한다음 DNCB 를처리하여급성아토피피부염을유발시켰다. 단, 정상군은 DNCB 를녹일때사용한용매인아세톤을 DNCB 대신에도포하였다. DNCB 의감작은일주일에 2회시행하였다. 우선첫번째주에는 2 % 의 DNCB 를사용하였다. 그다음일주일의휴지기를보낸후세번째주에 0.2 % DNCB 를일주일동안에 2번처리하여급성아토피피부염을유발하였다. 그후다시일주일의휴지기를보낸후약물을처방하는동안일주일에 2번씩 DNCB 를처리하여아토피피부염증상을유지시켰다. 2) 약물처리급성아토피피부염을유발시킨마우스의실험군에 2일간격으로 2주동안약물을처방하였다. 피부도포군은약재추출물을 200 mg / ml의농도로 200 μl을피부도포하였고, 경구투여군은 50 mg/kg 의농도로경구투여하였다. 이기간동안아토피피부염의증상유지를위해지속적으로일주일에 2번씩대조군과피부도포군, 경구투여군에 0.2 % DNCB 를도포하였고, 정상군에아세톤을도포하였다. 3) 혈액및장기적출 2주동안의약재투여실험이끝난마우스들을 zoletil 과 rompun 을 1:2로섞어식염수에희석시킨마취제를각마우스에약 150~200 μl복강주사하여마취시켰다. 마취가된것을확인한후개복하여심장에서혈액을채취한후균등질이되도록잘흔든다음 1500 rpm에서 10분간원심분리를하여상등액인혈장을얻어분석전까지 -70 에서보관하였다. 심장에서채혈한후비장을적출하여생리식염수로씻은후마른거즈로물기를제거하고, 액체질소에바로 70

정재훈외 1 인 : 급성아토피피부염마우스모델에서한약조합약물의염증반응진정효과 동결시켜차후실험시까지 -70 에서보관하였다. 4) 혈액분석심장에서채혈한혈액은동물전용전자동혈액분석기 (HEMAVET 950, Drew Scientific., LTD. UK) 를사용하여 RBC, WBC, platelet, lymphocyte, monocyte, neutrophil, eosinophil 를검사하고측정하였다. 5) 조직절편제조마우스의등피부조직을분리하여 4 % PFA로 2 시간동안고정시킨후, PBS solution 에세척한후물기를제거하고동결조직포매제인 Optical cutting temperature(o.c.t) compound(sakura, 미국 ) 에고정시켜동결조직 block 을만들었으며 -70 에서보관하였다. 간조직은 30 μm두께로 microtome 으로잘랐으며, 피부조직절편을슬라이드에신속히붙인후실온에서 1시간가량건조후 -70 에서슬라이드를보관하였다. 6) 피부조직염색피부조직절편을실온에서 30분 ~1시간가량건조후 H&E(hematoxylin and eosin) 과 CD3로염색하였다. H&E 염색은우선피부조직을붙여놓은슬라이드를 100 % 메탄올에 1~3분가량담가 OCT compound 를녹여주고, 조직을고정시켰다. 그후물로 1분가량씻어준다음 hematoxylin 용액에담가약 3분동안세포핵을염색시켰다. 다시물로 2~3회씻어준다음 1 % 염산의 70 % 에탄올에 4회동안빠르게담갔다가뺐다. 다시물로씻어준후 0.2 % 의암모니아수에앞에서했던것과마찬가지로 4회동안빠르게담갔다가빼주었다. 물로 5~10 분가량씻어준다음 eosin에 30초가량담궈세포질을염색시켰다. 그후물로씻어준후다시에탄올로씻은다음건조시켰다. 건조시킨후조직위에 permount 를올린후 cover glass를덮고현미경으로관찰하였다. CD3 면역염색은 1시간가량건조시킨슬라이드를파라포름알데히드에약 20분가량담궈조직을고정시켰다. 고정시킨조직을인산염완충생리식염수 (PBS) 에 3회반복으로 5분가량담궈씻었다. 조직을 3 % 과산화수소에 30분가량담궈둔후물과인산염완충생리식염수로씻어준후 5 % 의혈청알부민생리식염수에 1시간가량담궈주었다. 그다음 primery antibody 를 1:200 으로희석하여 4 에서조직과반응시켰다. Antibody 와반응시킨조직을인산염완충생리식염수로 5분동안각 3회씻어준후 second antibody 를 1:500 으로희석하여 1시간동안반응시켰다. 다시인산염완충생리식염수로씻어준다음 Vector laboratories 에서구입한 ABC kit와 DAB substrate 를이용하여발색시켰다. 그후 hematoxylin 으로 2분가량염색후물로씻어준다음건조시켜 permount 를올린후 cover glass를덮고현미경으로관찰하였다. 7) 혈중 IgE 농도분석마우스심장에서얻은혈액의혈장에서혈중 IgE의농도를샌드위치 ELISA 방법을통하여확인할수있다. Mouse IgE ELISA set(bd bioscience, USA) 을구입후샌드위치 ELISA용 plate에 capture antibody 를코팅시켰다. 하루동안 capture antibody 를코팅시킨후 0.05 % 의 Tween-20 PBS를이용하여씻어준후 plate를 10 % FBS의 PBS를이용하여 blocking 시켰다. 그후다시씻어준다음 standard IgE와적당히희석시킨마우스의혈장을각 well에넣었다. 2 시간가량방치후 plate 를씻어준후에 detection antibody 용액을넣고 1시간동안반응시켰다. 다시씻어준후 substrate solution 을넣어준다음어두운곳에서반응시키면서발색을확인하고적당히발색되었을때에 1M의인산또는 2N의황산을넣어반응을중지시켰다. 반응을중지시킨후 ELISA 를이용하여 450 nm에서의흡광도를측정하여 IgE의농도를확인하였다. 71

8) 비장조직 cdna 합성 -70 에보관해두었던비장조직의 50 mg을균질기로분쇄하여 RNA purification Kit(Qiagen, USA) 를이용하여 mrna 를추출하였다. 우선조직에 1 ml의 lysis reagent 를가한후균질기로조직을잘게갈았다. 5분정도실온에서반응시킨후 0.2 ml 의클로로포름을첨가하여 15초간완전히섞은뒤상온에서 2~3분동안반응시켰다. 그다음 4, 12,000 rpm에서 15분동안원심분리하였다. 상층액을새로운튜브에옮기고, 70 % 에탄올 1 ml을넣고섞었다. 이샘플을컬럼에옮겨준후실온, 10,000 rpm에서 15초간원심분리하였다. 한번더원심분리한후 RW1 버퍼 0.7 ml을첨가하여 10,000 rpm에서 15초간원심분리하였다. RPE 버퍼 0.5 ml을넣고 10,000 rpm으로 2분간원심분리했다. 그리고 1 분간원심분리를한번더하였다. 0.05 ml의 elution 버퍼를넣고 10,000 rpm에서 1분동안원심분리하여 total RNA를추출했다. 분리정제된 2 μg의 RNA를 cdna synthesis kit(takara, Japan) 을이용하여 cdna 로합성하였다. 이 cdna 를실험시까지 -20 에서보관하였다. 9) 비장의 cytokine 발현분석마우스의비장에서얻은 total mrna 를분리하고얻은 cdna를 reverse transcription PCR을이용하고, 전기영동을통해 mrna 의발현정도를측정할수있다. 이실험에서는 maxime PCR PreMix Kit(iNtRON, Korea) 를사용하여측정하였다. mrna 2 μl와 cdna 프라이머를각 1 μl씩키트튜브에넣었다. 여기에 DW 17 μl를넣어주고거품이생기지않도록주의하면서충분히섞었다. 그후 spin-down 을해준다음 RT PCR을하였다. Denature 95 45초, annealing 55 45초, extention 은 72 45초로하여 30 cycle로 PCR을수행하였다. 이때각프라이머는 table 1과같이코스모진텍 (Korea) 에의뢰제작하여사용하였다. RT-PCR 을통해얻은 cdna 5 μl를 1 % agar gel 에 loading STAR 1 μl와섞어서 loading 하고, 마커또한 loading 하여전기영동을하였다. 전기영동을한후에 agar gel에 UV를쪼여서각 cdna 를확인하였다. 이 cdna 를프로그램을이용해수치화하여분석하였다. Table 1. The Sequence of PCR Primers. IL-4 IL-6 TNF-α IFN-γ GAPDH Forward Reverse Forward Reverse Forward Reverse Forward Reverse Forward Reverse Sequences 5'-AAG AAC ACC ACA GAG AGT GAG CTC-3' 5'-TTT CAG TGA TGT GGA CTT GGA CTC-3' 5'-CAA GAG ACT TCC ATC CAG TTG C-3' 5'-TTG CCG AGT AGA TCT CAA AGT GAC-3' 5'-ATG AGC ACA GAA AGC ATG ATC-3' 5'-TAC AGG CTT GTC ACT GGA ATT-3' 5'-GCC ATC AGC AAC AAC ATA AGC GTC-3' 5'-CCA CTC GGA TGA GCT CAT TGA ATG-3' 5'-GAG GGG CCA TCC ACA GTC TTC-3' 5'-CAT CAC CAT CTT CCA GGA GCG-3' 72

정재훈외 1 인 : 급성아토피피부염마우스모델에서한약조합약물의염증반응진정효과 10) 통계처리실험결과의통계처리는 SPSS 프로그램을사용하였으며, 모든측정값은평균 ± 표준오차 (Mean±SEM) 로표시하였고, 분석에대한유의성은 Student's t-test 로검증하였으며, p-value < 0.05 에서유의성이있는것으로인정하였다. 1) 적혈구에미치는영향혈액분석결과정상군과대조군에서적혈구양이차이점을보이지않는것을보아 DNCB 에의한급성아토피피부염증상유발은적혈구의양에영향을주지않았다. 또한약물을처리한그룹에서도적혈구의양에큰차이가없었다 (Fig. 2). Ⅲ. 결과 16 Red blood cells 14 1. 실험동물의체중에미치는영향약물에의한몸무게변화를측정하여동물에미치는영향이있는경우를확인하기위하여몸무게의변 Red blood cells(m/ μl ) 12 10 8 6 4 화를관찰하였다. 실험재료는마우스의체중변화에 2 영향을주지않았다 (Fig. 1). 0 Nor Con DAHM OAHM 30 Body weight Normal Fig. 2. Effects of herbal mixture on levels of blood RBCs in acute atopic dermatitis induced mice. Body weight(g) 29 28 27 26 Control DAHM OAHM Each bar represents the mean±sd of RBCs levels in blood. Non-treated normal group is Normal, non-treated control group is Control, herbal mixture apply to the back skin group is DAHM, and oral administration group is OAHM. 25 24 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Days Fig.1.A variation of acute atopic dermatitis induced mice body weight. Each value represents the mean±sd. 2. 혈액분석결과 2주의실험기간이지난후마우스의심장에서채취한혈액을혈액분석기를이용하여분석해마우스의적혈구, 혈소판, 백혈구, 림프구, 단핵백혈구, 호중구, 호산구등의변화를관찰하였다. Fig. 3. Effects of herbal mixture on levels of blood platelets in acute atopic dermatitis induced mice. Each bar represents the mean±sd of platelets levels in blood(** : p<0.01, *** : p<0.001 vs negative control group). 73

2) 혈소판에미치는영향혈소판수치를보면대조군에서감소되어있는것을확인할수있다. 그러나약물을처리해준두그룹에서모두대조군에비해유의성있게증가하는것이관찰되었다 (Fig. 3). 3) 백혈구에미치는영향 백혈구의수치를살펴보면대조군에서는정상범위를벗어나서백혈구의수가증가하여있는것을확인할수있다. 이에반해약물을처리한그룹에서는백혈구의수가정상범위로유의성있게줄어들어있는것을확인할수있다 (Fig. 4). Fig. 5. Effects of herbal mixture on levels of blood lymphocytes in acute atopic dermatitis induced mice. Each bar represents the mean±sd of lymphocytes levels in blood(** : p<0.01 vs negative control group). 5) 단핵백혈구에미치는영향정상군보다단핵백혈구숫자가증가한대조군에비해, 약물을처리한두그룹에서단핵백혈구의숫자가유의성있게감소하는것을확인할수있다 (Fig. 6). Fig. 4. Effects of herbal mixture on levels of blood white blood cells in acute atopic dermatitis induced mice. Each bar represents the mean±sd of WBCs levels in blood(** : p<0.01 vs negative control group). 4) 림프구에미치는영향대조군은정상군에비해림프구숫자가증가하였으나, 약물을처리한그룹에서는림프구의양이대조군에비해유의성있게억제되어있는것을볼수있다 (Fig. 5). Fig. 6. Effects of herbal mixture on levels of blood monocytes in acute atopic dermatitis induced mice. Each bar represents the mean±sd of monocytes levels in blood(*** : p<0.001 vs negative control group). 74

정재훈외 1 인 : 급성아토피피부염마우스모델에서한약조합약물의염증반응진정효과 6) 호중구에미치는영향약물을처리한두그룹에서호중구의수치도대조군에비해유의성있게줄어들어정상치를보이고있는것을알수있다 (Fig. 7). 7) 호산구에미치는영향대조군에서호산구의증가가관찰되었으나약물을처리한그룹에서는호산구의양이유의성있게줄어들어있는것을확인할수있다 (Fig. 8). 3. 피부조직에미치는영향 1) 조직학적특성에미치는영향 Fig. 7. Effects of herbal mixture on levels of blood neutrophils in acute atopic dermatitis induced mice. Each bar represents the mean±sd of neutrophils levels in blood(** : p<0.01 vs negative control group). 피부조직을 H&E 염색법을통해염색해본결과표피가매우얇아선처럼보이는정상군에비해대조군에서는표피와진피가두꺼워져있는것을볼수있다 (Fig. 9). 또한피부층에 hematoxylin 에의해염색되어있는세포가대조군에서많이보이는데, 약물을처방한그룹에서는그수가줄어있는것을볼수있다 (Fig. 10). 진피에 hematoxylin 에의해염색된세포의수를세어본결과대조군에서는다른군의마우스보다약 4 배가량세포의수가높게측정되었다. 그에반해피부도포군에서는약 3배, 경구투여군에서는약 2배가량정상군에비해높게나타났다 (Fig. 11). 2) T 세포에미치는영향면역염색법을통해 T 세포의수용체인 CD3를염색하여 T 세포의양을확인해보았다 (Fig. 12). 면역염색확인결과대조군에서는외피와진피부분에진하게염색되어있는반면, 다른그룹에서는대조군에비해연하게염색되어있는것을확인할수있다. 4. 혈액내 IgE 분석결과 Fig. 8. Effects of herbal mixture on levels of blood eosinophils in acute atopic dermatitis induced mice. Each bar represents the mean±sd of eosinophils levels in blood(*** : p<0.001 vs negative control group). 정상군에비해대조군에서혈중 IgE의양이증가되어있는것을확인할수있다. 경구투여군에서는대조군에비해그감소가유의성이없었으나, 피부도포군에서는유의성있게감소하였다 (Fig. 13). 75

Fig. 9. Comparison of the histological feature of hematoxylin and eosin-stained dorsal skin sections in acute atopic dermatitis mice. group is Control, herbal mixture apply to the back skin Fig. 10. Comparison of the hematoxylin-stained cells in acute atopic dermatitis mice. group is Control, herbal mixture apply to the back skin 76

정재훈외 1 인 : 급성아토피피부염마우스모델에서한약조합약물의염증반응진정효과 Fig. 11. Comparison of hematoxylin-stained cell count in the lesional skin of acute atopic dermatitis mice(** : p<0.01 vs negative control group). group is DAHM, and oral administration group is OAHM. Fig. 13. Effects of herbal mixture on levels of blood IgE in acute atopy dermatitis induced mice. Fig. 12. Comparison of the histological feature of CD3 immunostained dorsal skin sections in acute atopic dermatitis mice. group is Control, herbal mixture apply to the back skin 77

5. 비장의사이토카인발현에미치는영향 1) IL-4 발현에미치는영향 IL-4 의 mrna 발현이정상군에비해줄었으나대조군에비해유의성있는감소는보이지않는다 (Fig. 14). 2) IL-6 발현에미치는영향피부도포군과경구투여군이대조군에비해 IL-6의발현이감소되었으나유의성은없는것으로보인다 (Fig. 15). 3) TNF-α 발현에미치는영향 경구투여군에서 TNF-α 가대조군에비해유의성있게감소하는것을확인할수있으며, 피부도포군에서는 TNF-α 가대조군에비해감소되었으나유의성은없는것으로보인다 (Fig. 16). Fig. 14. The levels of IL-4 mrna in spleen from mice. Fig. 16. The levels of TNF-α mrna in spleen from mice(** : p<0.01 vs negative control group). 4) IFN-γ 발현에미치는영향 Fig. 15. The levels of IL-6 mrna in spleen from mice. 경구투여군을제외한다른그룹들에서유의성있는차이가없는것을확인할수있다 (Fig. 17). 그러나 TNF-α 와 IFN-γ 의비율을구해본결과약물을처방한실험군모두에서 TNF-α 보다 IFN-γ 의비율이유의성있게증가한것을확인해볼수있다 (Fig. 18). 78

정재훈외 1 인 : 급성아토피피부염마우스모델에서한약조합약물의염증반응진정효과 Fig. 17. The levels of IFN-γ mrna in spleen from mice. % of normal group 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 IFN-γ / TNF-α Nor Con DAHM OAHM Fig. 18. The levels of IFN-γ/TNF-α mrna in spleen from mice. Ⅳ. 고찰 아토피피부염은천식과함께대표적인알러지성 질환으로, 항원에의해면역반응이과도하게일어나 서발생하게된다 2). 아토피는일반적으로면역유전자 질환으로가족력을보이지만, 피부의세라마이드가감소하는등의여러원인에의해서도발병이된다 19). 아토피피부염은 Th 2 면역반응과연관을보이는데, IL-4, IL-5, IL-13 의분비가증가되는것을볼수있고, 환자의진피와외피에호산구, 비만세포, 수지상세포등이많이증가되고침윤되는것을볼수있다 3,20). 염증과소양감의조절, 2차병변발생방지를위해스테로이드나항생제, 항히스타민제등을사용하는기존의치료는만족도가높지못하고그부작용도상당하기때문에한약을비롯한각종생약이나자연치유에대한관심이날로증가하고있다 4). 한의학에서는胎癬, 浸淫瘡, 胎斂瘡, 濕斂瘡등의범주에해당하며, 이들의발병원인을血熱, 濕熱, 血燥등으로보고淸熱, 解毒, 除濕, 祛風, 養血등의치법을주로이용하고있다 5). 본연구에서는아토피피부염에대한생약, 특히한약에대한효능을확인하고자, 최근연구결과를통해항산화, 항염증효과가입증되어염증에대한진정효과가우수할것으로추정되는네가지한약 ( 복분자, 생지황, 어성초, 화피 ) 을균등하게혼합한후, DNCB 로급성적으로아토피피부염이유발된마우스를대상으로그효과를혈액학적분석과피부조직관찰및사이토카인분석등을통하여알아보고자하였다. 실험약재의경우아토피피부염치료의효과에대한직접적인연구는없었지만, 항산화작용과항염증작용등에대해여러연구가이루어져있다. 복분자 (Rubus Coreanus Miquel) 는장미과에속한낙엽관목인복분자딸기및동속근연식물의미성숙한과실을말하며, 오표자라고불려지기도한다 6). 복분자는항산화작용 7) 과항염증작용 8) 등의생리활성효능을지니는것으로보고되었다. 최근연구결과토종복분자에탄올추출물이 macrophage 에의해생성되는염증반응의매개물질인 NO, PGE, 염증성 cytokine 등의생성을억제함으로염증반응을완화시켜주는것으로확인하였다 21). 생지황 (Rehmannia glutinosa Libschitz var. 79

purpurea Makino) 은현삼과에속한다년생초목인지황의신선한뿌리를말한다 9). 항산화작용 10), 항염증작용을가지는것으로보고되었다 11,12). 최근항염증효과에대한연구를통해, 신생혈관신생인자중하나인 HIF-1α 단백질발현감소를통해 VEGF 단백질발현을감소시켜신생혈관을억제하고, PI3K-Akt, COX-2 를통한세포생존및염증관련단백질의발현도조절하여신생혈관억제에관여하며 11), NO생성저해능을통한항염효과를가지고있는것으로보고되었다 12). 또한 TNF-α 의생산을억제하고 IL-10 생산을증가시켜소염효과를지닐것으로사료되며, IL-2 및 INF-γ 의생산을촉진하여세포성면역반응을증진시킬것으로기대되지만고용량에서는염증반응항진및세포성면역능저하를유도하는것으로보고된결과도있다 22). 어성초 (Houttuynia cordata thunb) 는삼백초과에속한다년생초본인약모밀의꽃필때의지상부를채취하여건조시킨것으로 13), 어성초추출물에항균작용, 항암작용, 항염증작용및항알레르기성작용등이있다고보고되었다 14,15). 특히항염증효과에대한최근의연구로는어성초가비만세포매개염증반응에미치는영향 14), 발효어성초물추출물의마우스대식세포항염활성연구 23) 등이있어, 어성초가염증매개인자억제를통한항염증효과를가지는것으로보고되었다. 화피 (Betulae cortex) 는자작나무과에속한落葉喬木인자작나무의樹皮를건조한것으로 16), 항산화, 항암효과를가지고있는것으로알려져있다 17). 최근항염증효과에대한연구로 NO와 PGE2 의분비를억제하고, inos 와 COX-2 의발현을감소시키며, NF-κB 의활성을억제하는것으로보고되었다 24). 아토피피부염에서의혈액학적변화는염증반응에의해면역관련세포들이대부분증가하게된다. 혈소판은면역반응에서내재면역에관여하는세포로알러젠등에의해활성화되어서염증반응을유도하는역할을한다 25). 백혈구는외부로부터침입한세균이나이물질을분해하는역할을지니는데, 염증이발현되 면백혈구의수가증가하게된다 4). 면역세포는생성후일정기간이지나면자연스럽게세포사멸에의해소멸되어야하는데아토피환자에게서는사이토카인등에의해면역세포의세포사멸이억제되어서림프구가증가되어아토피피부염등의질환이일어나게된다 26). 단핵백혈구는내재면역과적응면역모두에서중요한역할을하는세포로대식세포와항원제시세포를분화하는역할을하지만 27), 단핵백혈구가과도하게되면심한염증을유발시킬수있다. 호중구는혈액에가장많이존재하는과립성백혈구로항균, 항박테리아의중요한역할을지니고있지만, 류마티스관절염같은염증성질병에서조직파괴를매개하기도하므로 28), 호중구의양이과할경우염증반응을유발하여아토피피부염증상이더욱악화될수있다. 마지막으로호산구는기생충등의면역에주로작용하는과립성백혈구로일반적으로아토피성질병과비만세포와함께연관되어있으며, MBP(major basic protein) 을포함하고있는데, 높은 MBP는조직에독성을보이고아토피피부염에서현저하게관찰된다 29). 혈액분석을통한실험결과대조군에서는적혈구를제외한모든항목에서정상범위를벗어났다. 혈소판은정상군에비해감소하였으며, 백혈구, 림프구, 단핵백혈구, 호중구, 호산구는증가하였다. 혼합한약물을처방한피부도포군과경구투여군에서는혈소판이대조군에비해유의성있게증가되었고, 그외과발현된면역세포들은유의성있게감소되었다. 이는아토피피부염에의한염증반응들이실험약물을통해억제되었음을의미한다. 아토피피부염의병리조직학적소견은병변의단계에따라다르지만대체로만성이되면표피의증식이관찰되고, 진피에염증세포중림프구가주로침윤된다 3). 실험약물이아토피피부염마우스의피부조직에미치는영향을알아보기위해 H&E 염색과 CD3염색을시행하였다. 표피의증식은 H&E 염색법을통하여확인할수있는데, 동물조직학에서일반적으로많이사용하는방법으로 hematoxylin 에의해조직에서인 80

정재훈외 1 인 : 급성아토피피부염마우스모델에서한약조합약물의염증반응진정효과 산기가많이들어있는세포핵이염색되고, 세포안팎에널리분포하고있는단백질의아미노기에 eosin이염색되어서대부분의세포질을확인할수있다. 림프구의침윤정도는 T 세포의수용체인 CD3를염색하여 T 세포의양을확인하는 CD3염색법을통하여확인할수있다. H&E로염색실험결과대조군과경구투여군, 피부도포군에서정상군에비해진피와외피의두께가증가되어있는것을확인할수있었다. 그러나 hematoxylin 에의해염색되어있는세포의수를비교한결과, 피부도포군과경구투여군에서는피부에침윤되어있는세포들이대조군에비해감소되어있음을확인할수가있다. 실험결과로보아약물을처방한그룹에서대조군에비해아토피증상이호전되어있다는것을확인할수있고, 피부도포군보다경구투여군이효과가더좋다는것을확인할수있었다. CD3 염색실험결과대조군에서는외피와진피부분에진하게염색되어있는반면, 다른그룹에서는대조군에비해연하게염색되어있는것을확인할수있다. 즉, 대조군에비해다른그룹에서는총 T 세포의양이더적은것으로약물에의해과도한 T 세포의생성이억제될수있음을알수있다. 한편, CD3 염색에서는 H&E 염색과다르게약물을경구투여군보다피부도포군에서의 T 세포생성억제효과가더뛰어나보였다. 이와같은 H&E 염색과 CD3염색을통한실험결과는경구투여군이나피부도포군모두에서조직, 병리학적개선효과가확연히드러남을의미하며, 급성아토피피부염치료에있어서큰효과를거둘수있을것으로기대된다. 한편, IgE 항체는비만세포의표면수용체와강력하게결합하여기생충을축출하고파괴하는역할을한다. 그러나 IgE가비만세포와결합할경우강한염증반응을촉발하므로알러지반응을일으키게된다 30). 실험결과, 정상군에비해대조군에서혈중 IgE의양이증가되어있는것을확인할수있으며, 피부도포군 에서는유의성있게감소하였다. 하지만경구투여군에서는대조군에비해감소하기는하였으나유의성은없었다. 좀더확실히알아보기위해각그룹마우스의비장세포에서총 mrna 를추출하여 Th 2 면역반응에주요한사이토카인인 IL-4와 TNF-α, 그리고염증반응에큰관련이있는 IL-6와 Th 1 면역반응의사이토카인인 IFN-γ 의 mrna 발현수치를비교분석해보았다. Th1과 Th2 세포는상호작용을통해면역균형을유지하는데, IL-4는 Th1형반응을억제하고 IFN-γ 는 Th2형반응을억제한다. 아토피피부염환자들의 T세포는 IFN-γ 를생산하는능력이저하되어있고, IL-4에강한반응성을보여아토피피부염에서는 Th2 형세포에의한면역반응이주된것으로생각된다 3). 이외에도 IL-5, IL-13 등다양한사이토카인이아토피피부염을유발시키는데관여하는데이들에의해상피과형성, GM-CSF(granulocytes macrophage colony stimulating factor) 의발현등이촉진된다 31). 그중 IL-4는 Th2 세포의활성화에주요한역할을하며, IgE의생성을촉진한다 32). IL-6는대식세포에의해분비되는전염증사이토카인이다 33). 상처나감염이있을경우빠르게발현되어그역할을수행하지만, 과도하게발현이되면염증반응을촉진, 지속시켜염증질환을가져오게된다 34). TNF-α 는여러사이토카인의생성, 세포의성장과분화등에작용하여아토피피부염에영향을미친다 35). 비만세포에서분비되는 TNF-α 는 Th1 세포의증식을억제한다고알려져있어비만세포의탈과립물질이아토피피부염의면역반응이 Th2형반응으로기울도록하는데역할을할것으로생각하고있으며, 실제로아토피피부염환자의혈청에는 TNF-α 가증가되어있고혈청의히스타민증가와일치한다 3). 또한, IL-4, IL-10 등이과도하게분비되면서 Th2 면역반응이주도적으로일어나게되므로 IFN-γ 의분비가감소되고 Th1 면역반응이억제된다 35). 81

본실험결과, IL-4, IL-6가대조군에비해피부도포군, 경구투여군에서모두감소하였으나유의성은없었고 TNF-α 의경우경구투여군에서는유의성있게감소하였으나피부도포군에서는유의성이없었다. 그러나 TNF-α 와 IFN-γ 의비율을구해본결과피부도포군과경구투여군모두에서 TNF-α보다 IFN-γ 의비율이유의성있는증가를보였다. 이는실험약물이 Th 2 면역반응을억제하고있음을의미하며, 이를통해아토피피부염의염증반응이진정되고있다고판단되어진다. 혈액및조직학적검사결과로보아본실험에서사용한혼합한약재가급성아토피피부염의염증반응진정효과가있다고기대가되며, IgE와각종사이토카인 mrna 의발현정도를분석해본결과 Th 2 면역반응을억제하고있다고사료된다. 하지만, 사이토카인발현변화정도가혈액및조직학적변화에비해유의성이낮으므로본실험에서확인해본면역물질이외에다른방법이나경로에의한혼합한약재의효과가있을것으로추정되며이에대해향후지속적인연구가필요할것으로사료된다. Ⅴ. 결론본실험은 BALB/c 마우스에 DNCB 를등에도포하여유발시킨급성아토피피부염에서복분자, 생지황, 어성초, 화피의혼합한약재처방에따른효과를확인하기위해 6주령의 BALB/c 마우스를정상군, 대조군, 피부도포군, 경구투여군총 4 그룹으로나누어실험하였다. 실험약물의아토피치료기전을규명하고자, 실험동물의혈액및조직학적검사와사이토카인분석을통하여관찰하였던바, 다음과같은결론을얻었다. 1. 혈액학적분석결과대조군에서증가한백혈구, 림프구, 단핵백혈구, 호중구, 호산구의양이피부도 포군과경구투여군에서유의하게감소하였다. 2. 조직학적분석결과대조군에비해피부도포군과경구투여군에서진피세포의수가적고 T세포의양도유의하게감소하였다. 3. 혈액내 IgE 분석결과대조군에비해피부도포군에서유의하게감소하였다. 4. 비장의사이토카인분석결과대조군에비해경구투여군에서 TNF-α가유의하게감소되었다. 이상의결과로복분자, 생지황, 어성초, 화피의복합약물은아토피피부염이나기타염증질환에효과가있을것으로기대되며향후지속적인연구가필요할것으로사료된다. 감사의글이논문은 2015년도가천대학교교내연구비지원에의한결과임. References 1. Kang WH. Atlas of Skin Disease. Seoul: Hanmi medical publishing co. 2003:71-2. 2. Korean Dermatological Association Dermatology Textbook Editing Board. Textbook of Dermatology 5th edit. Seoul:Ryomoongak.. 2008:170-8. 3. Eun HC. Immunodermatology. Seoul university publisher. 1999:27-34. 4. Lee GS, Pena ID, Choi JY, Yoon SY, Choi SH, Kang TJ, Oh SK, Cheong JH. Effect of SPZZC, a composotion of herb extracts, on atopic dermatitis in BALB/c and NC/Nga mouse. Yakhak Hoeji. 2008;52(3):232-9. 5. Korea Food & Drug Administration. Clinical 82

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