大韓本草學會誌제 28 권제 6 호 (2013 년 11 월 ) Kor. J. Herbology 2013;28(6):95-100 ISSN 1229-1765 http://dx.doi.org/10.6116/kjh.2013.28.6.95. 황칠나무, 산수유, 구기자복합초임계유체추출물의항산화및항노화효과 신동철 1#, 김귀철 2, 송시영 1, 김희진 2, 양재찬 3, 김보애 3* 1 : ( 주 ) 엔에스텍부설중앙연구소, 2 : 전라남도생물산업진흥재단나노바이오연구센터, 3 : 목원대학교테크노과학대학생의약화장품학부 Antioxidant and Antiaging Activities of Complex Supercritical Fluid Extracts from Dendropanax morbifera, Corni fructus and Lycii Fructus Dong-Chul Shin 1#, Gwui-Cheol Kim 2, Si-Young Song 1, Hee-Jin Kim 2, Jae-Chan Yang 3, Bo-Ae Kim 3* 1 : Nstech R&D Center, 270 Beon-Gil 28, Namdongseo-Ro, Namdong-Gu, Incheon, 2 : Jeonnam Nano Bio Reserch Center, San 109, Samtae-Ri, Nam-myun, Jangseong-Gun, Jeollanam-Do, 515-893, 3 : Mokwon University, College of Sciences & Technology, Division of Biomedicinal & Cosmetics Doanbuk-ro 88, Seo-gu, Daejeon 302-729, Korea ABSTRACT Objectives : The purpose of this study was to investigate antiaging and antioxidant effects on cultured human skin fibroblast with supercritical fluid extracts of Dendropanax morbifera, Corni fructus and Lycii Fructus. Methods : Supercritical fluid extraction (SFE) technique was applied to extract from three medicinal plants including stem of Dendropanax morbifera, Corni fructus and Lycii Fructus. Antioxidant activity of extract was evaluated by two different assays as 2,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging and super oxide dismutase (SOD) like activities. These extracts were tested for cell viability on HS68 skin fibroblast by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT) assay. We investigated the effects of Ultraviolet-B irradiation on cytotoxicity, type 1 collagen, elastin level and oxidative damage in cultured human skin fibroblast (HS68). Recently, many studies have reported that elastin is also involved in inhibiting or repairing wrinkle formation, although collagen is a major factor in the skin wrinkle formation. Results : The extracts obtained dose-dependently increased the scavenging activity on DPPH radical scavenging activity and SOD like activity. The supercritical fluid extracts of complex herbal medicine showed low cytotoxicity as more than 100% cell viability in 100ppm/ml concentration. HS68 fibroblasts were survived 70% at 120 mj/cm 2 UVB irradiation and treated tumor necrosis factor (TNF)-alpha. The levels of aging factors and cytotoxicity were decreased by supercritical fluid extract of complex herbal medicine. Conclusions : These results suggest that supercritical fluid extracts may have value as the potential antioxidant and antiaging medicinal plant. Key words : Dendropanax morbifera, Corni fructus, Lycii Fructus, supercritical fluid extracts, antioxidant, antiaging 서론 1) 피부는신체의최외각층으로서외부로부터내부기관을보호 하고장벽기능을하는인체의가장큰장기이며수분과전해질의손실을막는등의 1차적보호역할을수행한다. 그러나환경적유해요소인각종산화물질, 중금속, 자외선 (ultraviolet * 교신저자 : 김보애, 대전광역시서구도안북로 88, 목원대학교테크노과학대학생의약화장품학부 Tel : 042-829-7569 E-mail : kba@mokwon.ac.kr # 제 1 저자 : 신동철, 인천광역시남동구논현동 429-1 21B 2L ( 주 ) 엔에스텍 Tel : 032-812-0806 E-mail : shin-dc@hanmail.net 접수 :2013 년 10 월 23 일 수정 :2013 년 11 월 12 일 채택 :2013 년 11 월 15 일
96 大韓本草學會誌 Vol. 28 No. 6, 2013 radiation, UV) 등에항상노출되어있어손상받기쉬운조건에있다 1). 특히자외선은그파장대에따라 UVA, UVB, UVC로나뉘며 UVB는진피에근접하여일광화상이나홍반, 심하면일련의염증반응을일으키며급격한피부장벽기능의소실로병원성미생물에의한 2차감염에노출되기도되는데홍방형성능력이 UVB에비해 1000배정도강한것으로알려져있다 2,3). 미용적측면에서는멜라닌 (melanin) 생성을촉진시켜과색소침착 (hyperpigmentation) 을유발하고, 진피층을구성하고있는콜라겐 (collagen) 과엘라스틴 (elastin) 의결합을약화시켜피부표면에주름이형성되므로미용적측면에서도크게고려되어야할인자이다 4,5). 또한과량의 UVB는활성산소종 (Oxidative Reactive Species, ROS) 을다량으로생성하여진피결합조직의손실과함께피부항상성을붕괴시켜노화를촉진시키며 6), 장기간노출시심각한피부질병으로이어져피부세포사멸및피부암의발생으로까지이어진다 7). 최근자외선으로부터피부방어에효과적인천연소재발굴에관심이높아지고있는추세이며 8) 그범위는내륙식물에서부터해양동식물까지광범위하게포함된다. 천연에서유래한성분을합성자외선차단제로완벽하게대체할수는없겠으나많은천연소재가항염과항산화효능을포함하고있으므로자외선차단화장품에활용될시자외선으로부터야기되는피부손상방지효과에더욱적합하다고사료된다. 황칠나무 (Dendropanax morbifera) 는두릅나무과황칠나무속으로동아시아, 말레이반도, 중앙및남아메리카등에약 75종이분포되어있으며우리나라에는 1종이분포되어있다. 현재까지황칠나무에대하여연구된바로는자연의금색을나타내는공예품에사용하는도료의원료와황칠나무잎추출물분획에서항암, 항산화, 간세포재생, 당뇨치료효과, 경조직세포재생등과방향성분의신경계에대한진정작용과강장작용이있으며, 황칠로부터얻은추출물에서멜라닌을생성하는티로시아나제의활성억제기능으로미백효과에도움을준다고알려져있다 9). 이러한황칠은신약개발및기능성소재등새로운치료제로서의가능성을높여주고있다. 산수유 (Corni fructus) 는층층나무과에속하는산수유나무 (Cornus officinalis) 의과육으로, 가을에성숙한붉은색열매의씨를제거하고건조한과육을산수유라하며, 예로부터우리나라를비롯하여중국과일본등에서중요한한약재로많이사용되고있다 10). 산수유에대한연구로는산수유열매의렉틴성분, 영양성분, 산수유종자의항당뇨효과, 물추출물의힝히스타민효과, 부종억제효과, 납에의한조직손상억제에미치는효과, 항균효과, 티로시나아제저해작용, 항산화및항암효과등이보고되고있으나 11,12) 이에대한체계적인연구가미흡한실정으로산업적활용연구가많이진행되어야할것으로사료된다. 구기자는구기자나무 (Lycium chinense Miller) 또는영하구기 ( 寧夏枸杞, Lycium barbarum Linne) 의열매로서예로부터민간치료제로사용해왔으며항산화효과, 항균효과, 면역증진, 항암효과, 모발성장촉진등의다양한연구가보고되고있다 13). 대표적으로한약재구기자의주성분중대한약전에서는구기자의정량기준을베타인 (betaine) 의함량으로설정하고있다. 따라서본연구에서는한방소재인황칠나무, 산수유, 구기 자를이용하여항산화및항노화효능이있는기능성화장품소재를위한초임계유체추출법적용과다양한 in vitro 실험을적용하였으며긍정적인결과를얻었기에보고하는바이다. 재료및방법 1. 재료 1) 약재및시약전라남도신안군흑산면에서자생하는황칠나무의줄기, 전라남도구례군산동면에서자생하는산수유, 전라남도진도군의신면에서자생하는구기자를산지에서구입하여건조한후분쇄기 (HMF-502, 한일전기 ) 로분쇄한다음분말을 14mesh 분체를통과한것만을실험재료로사용하였다. 실험에사용한시약은일급시약을사용하였다. 2) 초임계유체추출분쇄한황칠나무, 산수유, 구기자를초임계유체추출법으로 400bar에 50 온도에서 EtOH 3ml/60min의조건으로추출한시료를상층액 SC1과필터링후걸러진침전물 SC2 시료로구별하여실험에이용하였다. 획득한시료의일부인 SC1 시료와 SC2 시료각각 250g, 3.6g을 1차농축하고 2차로동결건조하여본연구에사용하였으며, 동결건조된시료의수득양은 SC1은 22.87g이었으며, SC2는 1.32g이었다. 동결건조하여분말화된시료를 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) 에용해하여 0.45μl필터에필터링후다시농도별로세포배양액또는 PBS 완충용액에희석하여최종시료로사용하였다. 복합소재의비율은황칠나무 : 산수유 : 구기자를 2 : 3 : 1의비율로추출하는것이가장이상적이며, 초임계유체추출조건별모니터링한결과 400bar/50 / 주정3ml/min/60min 동안운영한것에서가장좋은효능을나타냄을항산화평가예비실험을통해결정하였다. 추출물에대한추출조건과 in vitro 실험은최소 3회이상반복실험을수행하였다. 2. 방법 1) DPPH 라디칼소거활성측정 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 는그자체가매우안정한 Free radical 로서 517nm에서특정적인광흡수를나타내는진한보라색의화합물이다. 그러나 Radical 소거활성이있는항산화제에의해정량적으로탈색됨으로항산화활성을쉽게측정할수있다. 이 Radical 에의한소거활성은지질과산화억제활성을비롯한항산화활성과상관관계를보이므로항산화제검색에널리이용되고있다. 추출물의항산화활성측정 (Electron donating abilities, EDA) 은 Blois 의방법을변형하여측정하게되는데, 각시료용액 2.0 ml에 0.2 mm의 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 0.5 ml를넣고교반한후 30분간방치한다음 517 nm 에서흡광도를측정한다. 2) Superoxide dismutase (SOD) 유사활성측정추출물의 SOD 효소활성은 SOD assay Kit-WST 를이용하여
황칠나무, 산수유, 구기자복합초임계유체추출물의항산화및항노화효과 97 지시대로측정하였음. 96-well plate 에추출물을넣고 WST-1 (2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl )-2H-tetrazolium, mono-sodium salt) 과 xanthine oxidase working solution 을첨가한후 37 에서 20분간 incubation 한후 microplate reader 에서 450 nm 파장을측정한다. 3) 세포배양인간섬유아세포주인 HS68 (human skin fibroblast) 세포배양을위한 Dulbecco s modified Eagel s medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS) 및항생제 (penicillin/streptomycin) 는 Gibco사 (Grand Island, NY, USA) 제품을구입하여사용하였다. DMEM에 10% FBS, 100 U/ ml penicillin 및 100 μg / ml streptomycin을혼합한배지를사용하였고, 37, 5% CO 2 조건의 incubator 에서배양하였다. 4) 세포생존률측정 (MTT assay) 배지를제거하고 MTT solution (MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide]) 을넣고 24시간동안 37, 5% CO 2 incubator에서배양하였다. 배양후 MTT solution을제거하고생성된 formazan crystal 을 DMSO에녹여 Titertek Multiskan Automatic ELISA microplate reader로 570 nm에서흡광도를측정하였다. 5) 자외선조사자외선 B 조사로인한세포독성및산화적세포사멸에대한초임계유체추출물의항노화효과를확인하기위해서 UVB 를다음과같은조건으로처리하였다. 이때 HS68 세포를 48-well plate에 4 10 4 cells/well 로분주한다음 24시간후에 FBS를포함하지않는배지로교환하여 24시간동안배양하였다. 이후배지를제거하고 PBS로 washing 하고, 그후 PBS 200 μl를 well에분주후자외선조사장치 (Ultra-Violet Products Ltd., Upland, CA, USA) 를사용하여 UVB를 120 mj/cm 2 로조사하였다. 자외선 B 조사후에 PBS를제거하고배지로교환한후추출물을처리한다음 24시간후에변화를측정하였다. 배양기에서 24시간동안배양하였으며, 이때 MMP-1의활성을높이기위하여 TNF-α를 10 ng/ ml의농도로첨가하였다. 세포의배양액을수거하여실험에사용하였으며, Gross B. E. 의방법에따라 Matrix Metalloproteinase-1 Biotrack activity Assay Kit (Amersham Bioscience) 을이용하여 plate reader로 450 nm에서흡광도를측정하였다. 8) Elastase 저해활성측정시료의 elastase 저해활성은 James 의방법에따라측정하였음. 즉, 0.05 M Tris-HCl buffer (ph 8.2) 에기질인 0.5 mm N-succinyl-Ala-Ala-Ala-pnitroniline (Sigma) 를용해시킨후시료와효소인 elastase (1 unit/ ml, Sigma) 용액을첨가하였고, 이혼합액을 25 에서 10분간반응시킨후 ELISA reader를이용하여 415 nm에서흡광도를측정하였다. 9) 통계처리결과통계처리는평균 ± 표준편차로나타내었으며, 평균치간의유의성은 Student s test를이용한후 P값이 0.05 미만일때유의한것으로판정하였다. 결과 1. 세포생존율에미치는영향초임계유체추출물이피부섬유아세포독성에미치는영향을측정한결과 100ppm 에서세포독성을나타내지않았으며, 200ppm 이상에서는세포생존율이 80% 대로감소하였고 SC1 추출물에서이와같은양상이뚜렷하게나타났다. 또한항산화제로광범위하게사용되고있는 BHT와 vitamin C를대조군으로이용하여복합초임계유체추출물의효능을비교하고자하였으며 BHT의세포독성을 MTT assay로평가한결과 0.1ppm에서는독성을나타내지않았으며 0.3ppm부터 50% 이하의세포생존율을나타내었다. Vitamin C는 0.1ppm에서는독성을나타내지않았으며 5ppm부터 50% 이하의세포생존율을나타내었다 (Fig. 1). 6) TypeⅠcollagen 발현측정 TRIzol Reagent 를이용하여 total RNA를추출하였으며추출한 RNA로부터 cdna를합성하였으며, 효소들의유전자발현을비교측정하기위하여 PCR을수행하였다. PCR 조건은 95 에서 5분간진행한후 95 에서 30초, 53-61 에서 1분, 72 에서 1분을 40 cycle 진행한후 72 에서 5분간더반응시켰다. 각 PCR 산물들은 edithium bromide 를포함하고있는 1.5% agarose gel에서 50 V로전기영동한후 type 1 collagen 과 type 1 procollagen 노화관련유전자발현을확인하였다. 7) MMP-1 저해활성측정피부섬유아세포를 2 10 6 개 / 2 ml의세포를 6-well plate에접종한뒤각 well에추출물농도별로첨가하여 CO 2 Fig. 1. Cell viability of dependent on concentration from supercritical fluid extracts of Dendropanax morbifera, Corni fructus and Lycii Fructus, BHT and vitamin C. Data were presented as them ± S.D. **; P<0.01 compared with negative control.
98 大韓本草學會誌 Vol. 28 No. 6, 2013 2. DPPH 라디칼소거활성에미치는영향초임계유체추출물의항산화활성은 DPPH 라디칼에대한시료의환원력으로측정하였다. DPPH는보라색을띠며화학적으로안정화된자유라디칼을가지고있는수용성물질로전자를받게되면흡광도가감소하며, 환원력이있는물질과만나전자를내어주면 DPPH 라디칼이소멸되어특유의보라색이옅은노란색으로변하는것을측정한다. 이러한원리를바탕으로 DPPH 라디칼소거능을측정한결과초임계유체추출물의경우농도의존적으로 DPPH 라디칼에대한시료의환원력이증가하는것을관찰할수있었다 (Fig. 2). 콜라겐과엘라스틴등의탄력섬유에지질과산화가일어나비정상적인교차결합및사슬절단으로발생하게된다. 특히, 반복적인자외선노출로피부의 matrix metalloproteinases (MMPs) 가증가하게되면, 이는피부의콜라겐을분해하여피부주름생성을촉진하게된다. 즉, 피부의주름은콜라겐의합성과분해의불균형에기인하며특히광노화된피부의경우콜라겐합성이감소하고분해효소의활성이증가되어있는특성이나타난다. 본실험에서 HS68 세포에자외선 B를노출시킨경우 type Ⅰ collagen 및 type Ⅰ procollagen 의 mrna 합성이현저히감소되었으나, 추출물을처리하였을때 type Ⅰ collagen 및 type Ⅰ procollagen의 mrna 합성이증가한것을관찰할수있었다 (Fig. 4). 광노화에의한 collagen 의감소는깊은주름과같이피부노화징후와직접적으로연관이있고할수있다. Fig. 2. DPPH radical scavenging activity(%) of dependent on concentration from supercritical fluid extracts from three medicinal plants including stem of Dendropanax morbifera, Corni fructus and Lycii Fructus, BHT and vitamin C 3. SOD 유사활성검증 추출물의 SOD 효소활성은 SOD assay Kit-WST를이용하여지시대로측정하였으며, 그결과초임계유체추출물처리군에서농도의존적으로항산화효능을나타남을알수있었다 (Fig. 3). Fig. 4. Effect of extract from herbals complex on the mrna level of type Ⅰcollagen and type Ⅰ procollagen in HS68 human skin fibroblasts after UVB irradiation. Data were presented as them ± S.D. ** ; P<0.01 compared with negative control, ## ; P<0.01 compared with positive control, # ; P<0.05 compared with positive control. 5. MMP-1 저해활성효능 Fig. 3. SOD like activity(%) of dependent on concentration from supercritical fluid extracts from three medicinal plants including stem of Dendropanax morbifera, Corni fructus and Lycii Fructus, BHT and vitamin C 초임계유체추출물을이용하여세포독성에미치지않는 100ppm 으로세포에전처리하였으며, 비교군으로서 Vitamin C도세포독성을나타내지않는 0.1ppm으로전처리하였다. 그결과 MMP-1활성도를높이기위해처리되었던 TNF-α 를단독으로처리한군은 MMP-1 수준이현저히증가한것을관찰할수있었으며, 반면추출물을처리한군에서는 MMP-1 수준이 TNF-α 단독처리군보다 4.8% 감소되게나타났으며, 이는복합초임계유체추출물이 collagen 분해에영향을미치는 MMP-1의활성을억제함으로써피부노화억제에도움을줄수있음을의미한다 (Fig. 5). 4. UVB 로유도된섬유아세포의산화적손상에 대한항노화효능 진피중에는 collagen type I, II, IV, V의형태가가장많이존재하고이러한콜라겐은섬유아세포에의해생성되며, 엘라스틴, glycosaminoglycan, 당단백등과함께세포외기질 (extracellular matrix, ECM) 의대부분을구성하게된다. 피부노화의특성으로는피부의탄력성감소, 주름, 기미등을들수있으며, 이들은과도하게생성된활성산소종으로인하여 Fig. 5. MMP-1 activities of extracts in human dermal fibroblast from supercritical fluid extracts of Dendropanax morbifera, Corni fructus and Lycii Fructus.
황칠나무, 산수유, 구기자복합초임계유체추출물의항산화및항노화효과 99 6. Elastase 저해활성효능 본연구에서는황칠나무, 산수유, 구기자복합초임계유체추출물의주름예방효능에대해분석하기위해 elastase 저해활성을조사하였다. 그결과초임계유체추출물 100ppm/ ml에서 21.9±4.2 의저해활성을나타났으며 vitamin C보다는낮은활성을나타내었으나농도가 1000배차이나므로초임계유체추출물상층액인 SC1이농도에비례하여우수한효능을나타냄을알수있었다 (Table 1). Table 1. Elastase Inhibitory Effects from Supercritical fluid Extracts of three medicinal plants including stem of Dendropanax morbifera, Corni fructus and Lycii Fructus. Elastase inhibitory(%) Concentration (ppm/ ml ) SC1 (100) Vitamin C (0.1) 21.9±4.2 75.5±2.4 elastin의분해에관련되며, collagen 을분해할수있는비특이적가수분해효소이며, 또한조직파괴의직접적인원인이되며, 피부의주름및탄력성소실등을유발한다. 따라서, elastase 저해효능을나타내는복합초임계유체추출물은피부의주름을개선하는효과를갖게된다. 복합생물소재 3종 ( 황칠나무, 산수유, 구기자 ) 을이용한초임계유체추출물의항산화및세포독성, 항노화 (Type Ⅰ Collagen), MMP-1 저해활성, Elastase 저해활성등에대한효력시험을수행한결과전체적으로농도의존적으로활성이나타남을알수있었으며, 이는대조군인 Vitamin C보다활성은높지않으나농도비례평가하였을시우수한것으로나타난다. 추후본결과를적극적인활용을위하여식품의약품안전청의 기능성화장품의유효성평가를위한가이드라인 에따라수행되었으므로화장품원료로서의사용가치가높다고사료된다. 고찰 피부노화원인으로는자외선이가장큰요인으로대두되고있으며, 활성산소종과 DNA 손상, 사이토카인, 효소, 단백질합성, 대사활성등의광노화유발인자와자유라디칼, 호르몬, 영양, 수면, 스트레스, 생활환경등의자연노화인자라할수있다. 그중에서도노화된피부는자외선등에의한 ROS (Reactive oxygen species) 의발생에의해세포가손상되고, 항산화계효소의효소기능이저하및항산화물질 (Vitamin C, E 등 ) 의감소로외부유해환경에대한생체방어시스템이손상되거나, 피부구성하는콜라겐, 엘라스틴기능저하등이피부주름을발생시키는요인이되기도한다. 또한인체내부는활성산소로인한손상에대응하는항산화방어시스템을갖추고있어산화적스트레스에대하여대응하며손상된세포를회복하여항상성 (homeostasis) 을끊임없이유지하려고한다 14). 이러한항산화방어시스템은항산화효소에의한방어기전과비효소성항산화방어기전의두가지형태로구분된다 15,16). 특히, 효소에의한방어기전은 catalase (CAT) 와 sueproxide dismutase (SOD) 등을대표적으로들수있다. 이에본연구에서는추출물의항산화효능을검증하기위하여 DPPH 라디칼소거능과 SOD유사활성을관찰하였으며, 농도의존적으로높은항산화효능을나타내었다. 산화에의한피부손상은다양한노화징후즉기미, 주름, 건조등의증상과밀접한관련이있으므로항노화에있어서산화에적극적으로대응하는것이중요하다. 피부세포의결합조직을구성하는성분중 collagen 은피부건조중량의 90% 정도를차지하는주요구성단백질이다. 따라서 collagen 의분해는결합조직의탄력저하와주름생성등에직접적인영향을미치게된다. 체내에서생성되는수종의 MMPs 가운데 MMP-1 은 collagen 에특이적으로작용하는 protease 로서 MMP-1 의활성을억제하여 collagen 의분해를감소시키면, 피부조직의탄력을유지하고주름생성을예방할수있으므로 MMP-1 활성을저해하는황칠나무, 산수유, 구기차복합초임계유체추출물은항노화관련화장품이나건강기능성식품에적용되기에적절하다고할수있다. Elastase 는진피내피부탄력을유지하는기질단백질인 결론 본연구는황칠나무, 산수유, 구기자복합초임계유체추출물의항산화및항노화효능을조사하였고다음과같은결론을얻었다. 1. 추출물은피부섬유아세포에서높은안전성을나타내었으며, 농도의존적으로 DPPH radical scavenging activity 와 SOD-like activity가증가하는것을관찰할수있었다. 2. HS68 세포에자외선 B를노출시킨경우 type Ⅰ collagen 및 type Ⅰ procollagen 의 mrna 합성이현저히감소되었으나, 추출물을처리하였을때 type Ⅰ collagen 및 type Ⅰ procollagen 의 mrna 합성이증가한것을관찰할수있었다. 3. 추출물을처리한군에서는 MMP-1 수준이 TNF-α단독처리군보다감소되었으며, elastase 저해활성측정에서도농도에비례하여우수한효능을나타냄을알수있었다. 따라서황칠나무, 산수유, 구기자복합초임계유체추출물은대조군에비하여낮은세포독성을나타내며농도의존적으로항산화과항노화효능을나타내므로피부개선에도움을주는기능성화장품에활용할수있는좋은소재라사료된다. 감사의글 본연구는전라남도생물산업진흥재단 3G-Bio연계친환경생물소재고도화사업연구비지원으로수행되었으며, 이에감사드립니다. References 1. Lee WJ. Structure and function. J Skin Barrier
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