연구논문韓資植誌 25(2) : 271~276(2012) Korean J. Plant Res. 육의감비탕 ( 肉薏減肥湯 ) 의항비만효능및유효성분규명 왕사한, 송효남 *, 최원익, 박종혁 1, 정용준 1, 강세찬 1, 고성권, 방대혁 2 세명대학교한방식품영양학부, 1 가천대학교바이오나노대학, 2 ( 주 ) 씨알푸드 Identification of Anti-obesity Constituents from Yukeuigambitang Wang Shian, Hyo-Nam Song*, Won-Ik Choi, Jong-Hyuk Park 1, Youg-Joon Jeong 1, Se Chan Kang 1, Sung Kwon Ko and Dae-Hyuk Bhang 2 Department of Oriental Medical Food and Nutrition, Semyung University, Jecheon 390-711, Korea 1 College of Bionano Technology, Gachon University, Seongnam 461-701, Korea 2 Ssial Food Inc., Jecheon 390-250, Korea Abstract - To develop antiobese food materials from medicinal plants, isolation of antiobese active compounds in Yukeuigambitang of which activity was already proved in the previous study by animal experiments was performed. Antiobese effect of stepwise solvent fractions from 70% ethanol extract of Yukeuigambitang was determined by the differentiation inhibition activity on 3T3-L1 preadipocytes. CH2Cl2 fraction had significant antiobese activity, and n-hexane and EtOAc fractions were the next. Three phenolic compounds from CH 2Cl 2 fraction were identified by GC/MS analysis and one compound was finally isolated by HPLC. It was revealed as a new compound presumed to be one of the derivatives produced from the medicinal plants mixture in Yukeuigambitang. Key words - Antiobese activity, Yukeuigambitang, 3T3-L1 preadipocytes, Phenolic compounds 서언 비만이란신체에지방조직이과잉축적된상태로, 남은열량이지방으로전환되어인체내피하조직이나복부장간막에축적되는현상으로서, 체중이정상인의표준체중보다 25% 이상초과되거나신체질량지수 (body mass index, BMI) 가 27 이상일때를말한다 (Stenaland and Margoils, 1982). 체중에비하여과도한지방조직이축적된비만은유전적, 영양적, 환경적및사회적요인등다양한원인들이관여하는복잡한증후군으로서 (Chua and Leibel, 1997), 최근서구적인식생활패턴과생활의편리화로인하여즉석식품의섭취증가및운동부족을야기하여비만인구가증가하고있다 (Hill et al., 2007). 그러나지속적인운동또한어려운다수의현대인들은결과적으로비만억제효과를갖는약물과보조식품의섭취에의존하고있어관련시장 * 교신저자 (E-mail) : hnsong@semyung.ac.kr 규모또한해마다증가하고있는추세이다. 최근들어더욱난무하는비만억제용식 의약품등의장기복용은여러가지부작용을초래할수있어안전한천연물유래의항비만식품소재개발이더욱절실하게요구되고있으며최근에는생약자원으로부터항비만에유용한식품소재를탐색하는연구도활발하게이루어지고있다. 항비만소재를탐색하기위한 in vitro 연구에서는약 30여년전 Green 박사가소개한 3T3-L1 세포를많이사용하며 (Green and Kehinde, 1974), 이세포는분화배지를첨가하면지방세포로분화하는성질을지녀전지방세포 (preadipycyte) 로부터지방세포 (adipocyte) 로의분화를억제하고지방생성을저해하는소재의효능및기전을연구하는데유용하다 (Kim et al., 2011). 항비만의효과를지닌대표적인한약재로는마황, 산사육, 대황등이있으며, 다양한연구자들에의하여항비만약재들은, 거담화탁 ( 祛痰化濁 ) 및이습강지류 ( 利濕降脂類 ) 로서생대황, 호장근, 창출, 택사, 인진호, 초결명, 반하, -271-
韓資植誌 Korean J. Plant Res. 25(2) : 271~276(2012) 번사엽, 원총, 대산, 잠용, 괴미, 금은화, 강황, 모근, 하엽, 의이인등이해당되고, 활혈거어 ( 活血祛瘀 ) 및비만거지류 ( 抗肥滿祛脂類 ) 에는충울자, 단삼, 적작약, 익모초, 삼칠근, 생산사육, 향부자, 삼릉, 아출, 계혈등, 우슬, 당귀, 작약등이효과적이며, 자음양혈 ( 滋陰養血 ) 및항비만강지류 ( 抗肥滿降脂類 ) 는한련초, 여정자, 하수오, 생지황, 국화, 상기생, 영지등이해당되는것으로보고된바있다 (Song et al., 2011). 대황편, 마우편, 구기자, 의이인, 하엽등은단미제항비만한약으로많이보고되고있으며 (Kim et al., 2006), 또한동일한연구자에의하여효과적인항비만효과를가진소재개발을위하여 155종의생약추출물을대상으로 pancreatic lipase 에대한억제효과를탐색한결과, 정향, 대복피, 백자인, 계피, 강황, 향유, 감초, 오배자및복분자의에탄올추출물이유의성있는억제효과를나타냄이보고된바있으며, 특히대복피와계피가대표적인항비만양약치료제인 orlistat의 pancreatic lipase 억제효과대비 80% 와 89% 를나타낼정도로유사한억제효과를나타내었다고보고하였다. 한편, 식품공전에는식품의원료로사용가능또는사용불가능한한약재의종류가수재되어있는바, 비교적항비만효과가뛰어난한약재대부분은식품의원료로사용될수없는것으로분류되어있어허용가능한범위내의한약재로서항비만식품소재를선발하고처방을구성하는것은매우어려운실정이다. 선행연구에서는항비만효과를지닌식사대용식품을개발하기위한소재탐색의전단계로서식품으로사용가능한생약으로구성된항비만처방을개발하였으며전임상시험을통해그효능을검증하였다. 즉, 기존에보고된연구에서항비만효과가있는한약재들을다수검토한후그중건비위 활혈화어를위주로하면서청열이습 소간이담을겸하는한의학에서의비만치료원칙에따라한의학전문가의자문에따라새로운처방 3종을개발하였다. 이들처방을투여한동물실험에서육의감비탕만이유의적인항비만효과를나타낸바있다 (Song et al., 2011). 이에본연구에서는개발된항비만처방생약으로부터비만세포에서지방세포분화억제에대한유효성분을규명하고자한다. 재료및방법실험재료본실험에서사용한처방은육계 ( 베트남산, 2009), 의이인 ( 충북청원산, 2010), 복령 ( 경북영천산, 2009), 홍화 ( 중국산, 2009), 감초 ( 충북제천산, 2009), 의五味로구성하여육의감비탕 ( 肉薏減肥湯 ) 이라명명하였으며, 해당약재는 ( 주 ) 에이치엠에이엑스 ( 충북, 제천 ) 에서시판품을구입하여사용하였으며, 세명대학교한방식품영양학부표본실에보관하였다. 시약및기기항비만활성시험에사용한 3T3-L1 전지방세포주는 American Type Culture Collection (ATCC, USA) 에서구입하였고, 10% calf serum(invitrogen, USA), 1% penicillin/ streptomycin(sigma, USA) 및 Dulbecco's modified eagle's medium (Gibco, USA) 은시판품을구입하여사용하였다. 추출, 분획, MPLC, TLC 및 column chromatography 용용매는 1급시약을사용하였으며, HPLC 에는 HPLC 급용매와 3차증류수를사용하였다. 역상 column 과 gel-filtration column chromatography용으로는각각 LiChroprep RP- 18(40-63 μm) 과 Sephadex LH-20(bead size 25-100 μm, Sigma) 를사용하였으며, TLC plate 는 Kieselgel 60 F254 (layer thickness 0.25 mm, Merck) 와 RP-18 F254 S(layer thickness 0.25 mm, Merck) 를사용하여, 발색시약은 10%-H 2SO 4 시약과 anisaldehyde-h 2SO 4 시약으로전개된물질의발색에이용하였다. 분취에사용된 MPLC 은 Teledyne ISCO 사에 combiflash Rf와 UV detector(254 nm) 를사용하였으며 column 은동사에 redisep normal-phase flash column(40 g) 을이용하여분취하였다. 정제에사용된 HPLC system 은 Thermo series로 autosampler(spectra system AS3000), pump(spectra system P4000), degasser(spectra system SCM1000), UV detector (Spectra system UV2000) 를사용하였으며, HPLC column 은 YMC사의 ODS(ID : 250 10 nm, 5 μm) column 을사용하였다. 화합물동정에사용되어진GC-mass 는 Agilent 사에 7890A GC & 5975C MSD와 HP-5MS (30 m 0.25 mm 0.25 μm) column 으로분석한후화합물사전을이용하여동정하였다. -272-
육의감비탕 ( 肉薏減肥湯 ) 의항비만효능및유효성분규명 추출및분획시료육계 60 g, 의이인 60 g, 백복령 30 g, 감초 20 g, 홍화 20 g을 70% ethanol로가열추출하였다. 추출액은 Whatman No. 2 로여과후회전감압농축기 (Eyela, N- 1000, Tokyo, Japan) 로감압농축한후 800 ml의증류수에현탁시키고계통학적분획방법에따라동량의 n-hexane, CH 2Cl 2, EtOAc, n-buoh 로각각 3회씩추출하여분획한후감압농축하였다 (Scheme 1). Compound의분리 CH 2 Cl 2 분획을 MPLC(UV 254 nm) 와 redisep normalphase flash column(40 g) 에주입한후에전개용매 CH 2Cl 2 : MeOH 를 50 : 1부터 1 : 1까지순차적으로전개하여각각 C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10의 10개분획으로구분하였으며, 이중 C6 분획물을 open column chromatography에 normal-phase silica gel을 packing 한후에 CH 2 Cl 2 : MeOH ( 50 : 1 ) 을전개용매로전개하여각각 C6A, C6B, C6C, C6D, C6E, C6F 의 6개의분획으로구분하여나누웠다. C6E 분획물은 open column chromatography 에 sephadex LH-20 resin을 packing 한후에 70% MeOH 로전개한후에 C6E1~5 의 5개의소분획으로나누웠다. 소분획 C6E4를 GC-MS 와 HP-5MS(30 m 0.25 mm 0.25 μm) 으로분석후화합물사전을검색한결과 3개의화합물이단리된것을확인하였으며, HPLC system(uv 254 nm) 과 semi-prep column(ods, 250 10 mm, 5 μm) 에 50% MeOH 용매를전개하여 1종에화합물을분리, 정제하였다 (Scheme 2). 3T3-L1 지방세포분화억제시험및측정 3T3-L1 전지방세포주는 10% calf serum, 1% penicillin/ streptomycin 이첨가된 Dulbecco's modified eagle's medium 으로 37, 5% CO 2 가유지되는 CO 2 배양기에서배양하였다. 배양된 3T3-L1 세포주를 96 well plate(nunc, USA) 에 1 10 4 cells/well 농도로부유시켰고, 세포가 100% confluent 상태가되면 0.5 mm 3-isobutyl-1- methylxanthine(sigma, USA), 1 μm dexamethasone (Sigma, USA), 10 μg/ml insulin(sigma, USA) 이함유된 10% FBS-DMEM(MDI배지 ) 으로배양하였다 (0 day). 각각의시료들의지방세포분화억제효과를확인하기위해 MDI배지와함께시료를농도별로처리하였으며, 48시간 후 10 μg/ml insulin이함유된 10% FBS-DMEM 배지로교체해주었다. 분화 4일째에 10% FBS 만함유된 DMEM 으로배지를교체하였고, 분화유도시작일로부터총 8일동안실험을진행하였다. 분화된 3T3-L1 세포는현미경으로세포내의지방과립이형성된것을관찰한후 3% formaldehyde (Sigma, USA) 를처리하여 5시간동안실온에서고정시켰다. 고정시킨세포는 PBS로두번세척한다음지방에특이적으로반응하는 AdipoRed TM Assay Reagent (Lonza, USA) 를처리하고, 10분후 fluorometer (Bio-Tek, USA, excitation 485 nm; emission 535 nm) 로측정하였다. 지방세포분화억제효능 결과및고찰 3T3-L1 전지방세포는 in vitro에서 adipogenesis를포함한다양한지방대사와관련된연구의모델로널리사용되고있다 (Green and Meuth, 1974). 전지방세포에서지방세포로의분화는분화를유도하거나억제하는다양한인자들의조절에의해서이루어지며, 이를응용하여유효물질의효능을측정할수있다. 이에본시험에서는육의감비탕의지방세포분화억제효능을확인하기위해분획물을농도별로처리하였고, 분화 8일후에 AdipoRed TM Assay Reagent 로측정하여이의효능을 EC 50 값으로나타내었다 (Table 1). 그결과육의감비탕의분획물중 CH 2 Cl 2 분획물에서가장우수한효능이관찰되었고 (EC 50=69.9 μg/ml), n-hexane 분획물과 EtOAc 분획물에서도약한지방세포분화억제효능이관찰되었다 ( 각각, 232.1 μg/ml, 421.4 μg/ml). 또한 CH 2 Cl 2 분획물을 MPLC 를이용하여 10개의분획으로분획하였으며, 10개의분획을다시 3T3-L1 cell culture 시험을시행하 Table 1. Inhibition of adipocyte differentiation of solvent fractions from Yukeuigambitang (unit: μg/ml) Solvent fraction EC 50 n-hexane 232.1 ± 2.71 CH 2 Cl 2 69.9 ± 2.11 EtOAc 421.4 ± 13.85 n-butanol > 500 H 2 O > 500-273-
韓資植誌 Korean J. Plant Res. 25(2) : 271~276(2012) Table 2. Inhibition of adipocyte differentiation of ten fractions from CH 2 Cl 2 (unit: μg/ml) Solvent fraction EC 50 C1 >100 C2 >100 C3 >100 C4 >100 C5 68.4±11.5 C6 103±5.3 C7 101±3.3 C8 >100 C9 >100 C10 >100 여이중 C5 분획에서가장효과가컸으며 C6과 C7 분획에서도항비만효과가비교적우수한것으로나타났다 (Table 2). 꾸지뽕잎에탄올추출물의경우 50% 의지방축적을나타내는농도는 5 mg/ml(do et al., 2011) 였고, 포도씨탈지박추출물은 200 μg/ml 의농도에서 11% 의지방축적을보여준것 (Cho et al., 2010) 으로보고된것과비교하면육의감비탕 CH 2Cl 2 분획물의지방세포분화억제능은매우우수한것으로사료된다. Compound의확인소분획 C6E4은 UV 254 nm와 TLC 발색시약발색시에단일화합물로보여졌으나, gas chromatogrphy - mass 분석을통한연구에서기존의화합물사전검색결과 4,4'- Dimethoxy-3'-methoxycarbonylmethoxy-6,6'-dimet Fig. 1. GC/MS profile and identified 3-compound structure of Yukeuigambitang. -274-
육의감비탕 ( 肉薏減肥湯 ) 의항비만효능및유효성분규명 hy-lbiphenyl-3-yloxy (Compound A), 2,2-Di(3,4- dimethoxyphenyl)indane-1,3-dione (Compound B), 8-hydroxy-p-menth-1-en-7-al (Compound C) 3종의화합물이존재하는것을확인하였다 (Fig. 1). 이중함량이높은 Compound A는 HPLC 를이용하여단일화합물로분리정제하였다 (Fig. 2). 본연구에서사용한육의감비탕에사용되어지는생약중육계의지표성분은주로cinnamic acid를이용하고있으며함량및효능면에서는 cinnamic aldehyde 가주된유효성분으로알려져있다 (Kim, 1993). 홍화로부터분리된성분은 flavonoid 류와 quinochalcone 계의색소성분 (Chung et al., 2008), polyacetylenic glycoside 류이며 (Choi et al., 2011), 백복령의자실체에서는 triterpenoid 성분이다수보고되어있고 (Moon and Min, 1987), 감초에서는 glycyrrhizin, liquiritin 등 (Lee et al., 2010), 이주성분으로밝혀져있다. 이처럼육의감비탕은 5종의생약으로배합되어져있으며, 각각의생약이포함하는생리활성성분또한매우다양하여생약을열을이용하여추출하는과정에서본생약에포함되어져있지는않지만새롭게생성되는화합물또한다양하게존재할수있을것으로판단되어지며각각의단일화합물에대한식물학적성분및생리활성에관한부분도활발하게연구될것으로사료된다. 따라서향후육의감비탕의다양한항비만성분들에대한개별적인구조와활성관계및항비만기전에관한심도있는연구가이루어진다면안전한기능성식품소재로활용가능할것으로기대된다. 적요식품의원료로사용가능한안전한생약자원유래의항비만소재개발을위하여추출물단계에서 3T3-L1 전지방세포의지방세포로의분화억제활성효과를나타낸육의감비탕의생리활성성분을규명하고자하였다. 70% EtOH 로가열추출후계통학적인용매분획법에의해분획한분획물을대상으로 3T3-L1 세포의지방분해억제시험을실시한결과 CH 2 Cl 2 분획물에서가장우수한활성이나타났으며, n-hexane 분획물과 EtOAc 분획물에서도약한지방세포분화억제효능이관찰되었다. 이중 CH 2Cl 2 분획물로부터각종 chromatography 기법을통하여분석한결과 3종의 phenol 류화합물을 GC-mass 화합물사전검색을통해동정할수있었으며이중 1종의화합물을 HPLC 를이용하여단리하였다. 단리된화합물은육의감비탕을열추출하는과정에서구성하고있는생약중육계로부터유래된유도체인것으로추측되며따라서, 육의감비탕에포함되어있는육계로부터육의감비탕조제시생성되는물질로판단된다. 육의감비탕은선행연구에서처음으로개발된처방으로본연구를통해단리된화합물외에도항비만효과를지닌유사한화합물들이존재할것으로사료되어향후기능성식품의소재로서안전하게사용할수있을것으로기대된다. 사사본연구는중소기업청의 2009년기술혁신개발산업투자연계사업의 S1066573 과제에의해수행된결과의일부로서이에감사드립니다. Fig. 2. HPLC spectrum(uv 254nm) of compound A from Yukeuigambitang. -275-
韓資植誌 Korean J. Plant Res. 25(2) : 271~276(2012) 인용문헌 Cho, Y., Lee, S.M., Kim, Y., Jeon, G., Sung, J., H.S. Jeong and J. Lee. 2010. Defatted grape seed extracts suppress adipogenesis in 3T3-L1 preadipocytes. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 39:927-931. Choi, H.G., Jiang, Yanfu., Park, S.H., Son, A.R., M.K. Na and S.H. Lee. 2011. Constituents of flowers of Carthamus tinctorius L. and their antioxidant activity. Korean J. Pharmacogn. 42: 110-116. Chua, S and R.L. Leibel. 1997. Obesity genes : molecular and metabolic mechanism. Diabetes Rev. 5:2-7. Chung, S.H., Moon, Y.J., Kim, S.G., Kim, K.Y., Lee, K.T., H.K. Kim and W.K. Whang. 2008. Isolation of flavonoids from Carthanmi flos and their antioxidative activity. Yakhak Hoeji. 52:241-251. Do, G.P., Lee, H.J., J.R. Do and H.K. Kim. 2011. Inhibition of adipogenesis in 3T3-L1 adipocytes with water and ethanol extracts of Cudrania tricuspidata leaves. Korean J. Food Preserv. 18:244-249. Green, H and O. Kehinde. 1974. Sublines of mouse 3T3 ells that accumulate lipid. Cell. 1:113-116. Green, H and M. Meuth. 1974. An established pre-adipose cell line and its differentiation in culture. Cell 3:127-133. Hill, J.O., J.C. Peters and H.R. Wyatt. 2007. The role of public policy in treating the epidemic of global obesity. Clin Pharmacol Ther. 81:772-775. Kim, D.J., Jung, J.H., Kim, S.G., H.K. Lee and S.K. Lee. 2011. Antioxidnats and anti-obesity activities of hot water and ethanolic extracts from Cheonnyuncho (Opuntis humifusa). Korean J. Food Preserv. 18:366-373. Kim, N.M., J.W. Yang and W.J. Kim. 1993. Effect of ethanol concentration on index components and physicochemical characteristics of cinnamon extracts. Korean J. Food Sci. Technol. 25:282-287. Kim, Y.J., Kim, B.H., Lee, S.Y., Kim, M.S., Park, C.S., Lee, M.S., K.H. Lee and D.S. Kim. 2006. Screening of medicinal plants for development of functional food ingredients with anti-obesity. J. Korean Soc. Appl. Biol. Chem. 49: 221-226. Lee, J.R., Jo, M.J., Park, S.M., S.C. Kim and S.J. Park. 2010. Establishment of UPLC method for analysis of liquiritigenin and studies on the processing of licorice for enhancement of liquiritigenin content. Korean J. Oriental Meical Prescription. 18:145-154. Moon, S.K and T.J. Min. 1987. Study on the isolation and structure determination of the triterpenoids from Korean white Poria cocos(schw.) wolf. Korean Biochem. J. 20:178-184. Stenaland, S.H and S. Margoils. 1982. Simplifying the calculation of body mass index for quick reference. J. American Diet Assoc. 90:856. Song, H.N., H.H. Lee and J.B. Kim. 2011. Antiobese effects of Yukeuigambitang on the high fat diet induced obese mice. Korean J. Oriental Physiol. Pathol. 25: 1026-1031. ( 접수일 2012.1.4; 수정일 2012.4.2; 채택일 2012.4.23) -276-