10 KH (이재화)( ).hwp

Appl. Chem. Eng., Vol. 28, No. 2, April 2017, 198-205 https://doi.org/10.14478/ace.2016.1131 Article Graviola (Annona muricata) 잎추출물의항산화및미백효과 조은희 김인혜 이재화 신라대학교의생명과학대학제약공학과 (2016 년 12 월 30 일접수, 2017 년 1 월 26 일심사, 2017 년 2 월 22 일채택 ) Antioxidant and Skin Whitening Effect of Graviola (Annona muricata) Leaf Extracts Eun Hee Jo, In Hae Kim, and Jae Hwa Lee Department of Pharmaceutical Engineering, College of Medical and Life Science, Silla University, Busan 46958, Korea (Received December 30, 2016; Revised January 26, 2017; Accepted February 22, 2017) 초록본연구에서는 Annona muricata 잎추출물 (graviola leaf extracts, GLE) 의항산화 (antioxidant), 항균 (antibacterial), 미백 (whitening) 및주름개선 (anti-wrinkle) 효과등을조사하였으며, 항산화 (antioxidant) 효과에대한활성은전자공여능분석을통해측정하였다. 그결과 GLE는농도의존적으로전자공여능이증가하는것으로나타났다. GLE의항균활성은 paper disc법으로측정하여나타냈으며, 표준물질인 ampicillin과비교하여메티실린내성황색포도상구균 CCARM3115 에서비교적높은항균활성을나타내었다. GLE에대한미백 (whitening) 효과역시 tyrosinase 저해활성측정을통해진행하였으며, 그결과 GLE는농도가증가함에따라 tyrosinase 활성이감소하는것으로나타났다. GLE 농도에따른 L-tyrosine을 DOPA로바꾸는데관여하는 hydroxylation 반응과관련한 mushroom tyrosinase의저해활성은표준물질인 arbutin에비해 125 250 µg/ml 농도범위에서특히높게나타났다. B16-F10 cell에대한 melanin 생합성저해능은농도의존적으로감소하는경향을보였으며, 100 µg/ml에서 76.7% 를나타났다. 주름생성과관련하여서는 elastase 저해활성측정을통해진행하였으며, 그결과동일한농도에서 GLE 및 ursolic acid는 10.5, 56.5% 로나타났다. 이러한결과를통해 Annona muricata 잎추출물 (Graviola Leaf Extracts, GLE) 이항산화및미백활성에상당한효과가있음을확인할수있었으며, 미백화장품성분으로서과색소침착치료에유용할것으로기대된다. Abstract In this study, graviola leaf extracts (GLE) was investigated for the effect of antioxidant, antibacterial, whitening, anti-wrinkle. The antioxidant effect of GLE was measured by an electron donating ability assay. As a result, GLE increased the electron donating ability in a concentration-dependent manner. The antibacterial effect of GLE was found to show the higher antibacterial effect in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus CCARM3115 compared with that of ampicillin by a paper disc method. The whitening effect of GLE was also measured by tyrosinase inhibition assay, and it was found that the tyrosinase activity of GLE decreased as the concentration increased. The inhibition activity of tyrosinase involved in hydroxylation reaction which is related to converting L-tyrosine to (DOPA) was higher than that of arbutin s at the concentration ranging from 125 to 250 µg/ml. In addition, GLE reduced melanin contents of B16-F10 melanoma cells in a dose-dependant manner and decreased to about 76.7% at a concentration of 100 µg/ml Regarding wrinkling formation of GLE, an elastase inhibition assay was performed. As a result, GLE and ursolic acid were 10.5% and 56.5%, respectively under the identical concentration. These results suggest that GLE has significant antioxidant and whitening activities, and also may be potentially used as a therapeutic agent for hyperpigmentation treatment as an ingredient of whitening cosmetics. Keywords: annona muricata, graviola, whitening, tyrosinase 1) 1. 서론 화장품법제 2 조 1 항에 인체를청결 미화하여매력을더하고, 용 Corresponding Author: Silla University, Department of Pharmaceutical Engineering, College of Medical and Life Science, Busan 46958, Korea Tel: +82-51-999-5831 e-mail: jhalee@silla.ac.kr pissn: 1225-0112 eissn: 2288-4505 @ 2017 The Korean Society of Industrial and Engineering Chemistry. All rights reserved. 모를밝게변화시키거나피부모발의건강을유지또는증진시키기위하여인체에사용되는물품으로서인체에대한작용이경미한것 으로화장품을정의하고있다. 이처럼화장품은경제성장에따른소득수준의향상과여성의사회활동증가로그사용인구가전세계적으로점차증가하고있다. 국내화장품산업의시장규모는 2014년 74 억달러로전세계시장의 29% 를차지하는매우방대한시장을형성하고있으며, 총생산규모또한전년대비 12.5% 증가하였으며이는최근 5년연평균증가율인 10.5% 를웃도는것으로비교적높은성장세를유지하고있다 [1]. 이러한화장품분야는과학의발달에따른고 198

Graviola (Annona muricata) 잎추출물의항산화및미백효과 199 령화사회진입과경제적수준의향상으로인해장기적인관점에서의대응이필요한상황이며특히높은효능의기능성화장품개발이요구되고있다. 화장품법제2조 2항에 피부의미백에도움을주는제품, 피부의주름개선에도움을주는제품, 피부를곱게태워주거나자외선으로부터피부를보호하는데도움을주는제품 으로기능성화장품을정의하고있다. 국내기능성화장품의시장규모는최근 4년간연평균 19.9% 씩성장하였으며 2014년기준약 8조 1,778억원으로, 최근소비트렌드및관련연구동향등을고려했을때아직도성장가능성이높은시장으로보여진다 [1,2]. 식품의약품안전처의기능성화장품고시품목으로는미백기능성화장품의경우나이아신아마이드, 닥나무추출물, 아스코빌글루코사이드, 알부틴, 알파-비사보롤, 에칠아스코빌에텔과유용성감초추출물이있으며, 주름개선고시품목으로는레티놀, 레티닐팔미테이트, 아데노신과폴리에톡실레이티드레틴아마이드가있다. 자외선차단고시품목으로는드로메트리졸, 디갈로일트리올리에이트외 26종이있다. 그러나이러한기존기능성화장품소재의경우피부자극을유발하는경우도있고피부안정성및안전성에문제가되는경우도있다. 그결과, 화장품산업은보다기능적으로, 자연주의적인제품을선호하는소비자의요구에부응하여고도의기술을필요로하는첨단산업으로점차자리매김하고있으며, 이에따라새로운원료개발의요구도높아지고있다. Annona muricata는포도나무과에속하며브라질을비롯한아마존일대와남미, 인도, 필리핀, 인도네시아, 북미의열대에자생하고있는 5 6 m 정도의작은상록수이다. 이들은전통적으로씨를빻아기생충을없애는데사용하였다. 또한, 열을낮추거나출산이후의모유를증가시키고설사와이질을지혈하는면역기능개선보조나면역체계강화를위해사용하였다. 특히 Annona muricata 잎은항암, 진정제, 항경련제그리고저혈압제로사용하였다 [3-5]. 선행연구에따르면여러가지 in vitro model 상에서 Annona muricata의항산화제로서의잠재성을확인하였으며이는 Annona muricata 잎의 rutin과 hyperoside와같은플라보노이드성분및항산화활성물질이풍부해신체내부의산화성손상을최소화하는것으로나타났다 [6]. 또한왁스성질의물질인 Annonaceae acetogenins는항균, 항기생충 곤충, 항종양등의작용을하며잎을비롯한 Graviola 전반에골고루분포해있는것으로나타났다 [3]. 그러나아직항산화및미백활성과관련하여화장품소재로서의 Annona muricata에대한연구보고는부족하다. 따라서본연구에서는 Annona muricata 잎추출물 (Graviola Leaf Extracts, GLE) 을이용하여화장품소재로서의가능성을조사하고자 in vitro 상에서항산화, 항균, 미백및주름개선효과등을분석하였으며, 더나아가 in vivo 상에서 B16-F10 mouse melanoma cell에대한세포생존율및 melanin 생합성억제효과를조사하여보고하고자한다. 2. 실험 2.1. 시료추출물제작본연구에서사용된그라비올라 (Annona muricata, Philippines) 는필리핀에서수입하여사용하였다. Annona muricata 잎시료를 100 g씩정량하여각각 ethanol 추출물은 10배용량의 ethanol을가하여 3일동안침지하고, 열수추출물은 10배용량의증류수를가한후고온가압추출로추출물을제조하였다. 고온가압추출은유리병에분쇄시료와증류수를혼합한후 autoclave (WAC 60, Wise Clave, Korea) 를이용하여 121 에서 4 h 동안 2회반복추출하였다. 각각의추출액은여 Figure 1. Summarization of Graviola Leaf Extracts (GLE) manufacturing procedure from the Annona muricata leaf. 과지 (Whatman No.2, Whatman Ltd., Dent, UK) 로여과한후감압농축기 (EYELA, Tokyo, Japan) 로농축하였다. 각농축물은동결건조하여분말화시킨후혼합하여실험에사용하였다. 혼합시료는 4 에보관하여각실험단계별로사용하였으며, 시료에대한명칭은 Annona muricata 잎추출물 (Graviola Leaf Extracts, GLE) 로명명하였다 (Figure 1). 2.2. DPPH radical 소거능 Free radical scavenging activity를측정하기위하여 2,2-diphenyl- 2-picrylhydrazyl (DPPH) 방법을사용하였다. DPPH 8 mg을 ethanol 100 ml에녹여 0.2 mm DPPH 용액을준비하고농도별로조제한시료용액 50 µl에 DPPH stock 용액을 500 µl 넣어 total volume이 1 ml가되도록 ethanol을첨가하여실온에서 30 min 간반응시킨후, 96 well plate에넣어 ELISA Multiscan Reader (Thermo scientific, Finland) 를이용하여 517 nm에서흡광도를측정하였다. 표준시료로는 L-Ascorbic acid (Sigma chemical Co., Louis, MO, USA) 를사용하였으며시료의최종농도는 1 mg/ml가되도록제조하였다. 각시료의항산화활성은시료첨가구와무첨가구간의흡광도차이를백분율 (%) 로나타내었다 ( 식 (1)). Radical Scavenging Activity (RSA, %) = (1) 2.3. SOD 유사활성측정 GLE의 superoxide dismutase (SOD) 유사활성측정은 Marklund & Marklund (1975) 를응용한 SOD assay kit (Dojindo Molecular Technologies, Inc., USA) 를이용하여 superoxide anion radical (O 2) 의소거활성률을측정하였다 [7]. 적정농도별로희석한시료 20 µl와 WST working solution 200 µl를첨가한후, enzyme working solution 을 20 µl 첨가하여 37, 20 min 반응후 450 nm에서흡광도를측정하여 kit의계산법에따라 SOD 활성을측정하였다 ( 식 (2)). SOD-like activity (%) = (2) 2.4. 총페놀함량및총플라보노이드함량측정 총페놀의함량은 Folin-Ciocalteu 방법 [8] 을일부변형하여측정하였다. 시료 (10 mg/ml) 100 µl에 2% Na 2CO 3 용액 2 ml를첨가후, Appl. Chem. Eng., Vol. 28, No. 2, 2017

200 조은희 김인혜 이재화 3 min 간실온에정치한다음, 50% Folin-Ciocalteu reagent (Sigma Co., St. Louis, MO, USA) 100 µl를첨가하여 30 min 반응시켰다. 이후 750 nm에서흡광도를측정하였다. 총페놀함량은 gallic acid (Sigma Co., St. Louis, MO, USA) 를이용하여검량곡선을작성하고그에대한당량으로환산하였다. 총플라보노이드함량은 Davis 방법 [9] 을일부변형하여측정하였다. 시료 (10 mg/ml) 100 µl에 diethylene glycol 용액 1 ml를첨가후, 1 N NaOH 100 µl을첨가하여 37, 1 h 반응시킨후, 420 nm에서흡광도를측정하였다. 총플라보노이드함량은 naringin (Sigma Co., St. Louis, MO, USA) 을표준시약으로검량곡선을작성하고그에대한당량으로환산하였다. 2.5. 항균측정 GLE의항균력은 disc 확장법 [10] 으로측정하였다. 측정에사용한균주는다음과같다. Gram-positive bacteria로는 Bacillus subtilis PM125을항생제내성균주로는 Methicillin Resistance Staphylococcus aureus (MRSA) CCARM3561, CCARM3115, CCARM3089 균주를항생제내성균주은행 (Culture Collection of Antimicrobial Resistant Microbes, CCARM) 에서분양받아사용하였다. 각각의 Bacillus subtilis PM125, MRSA CCARM3089, MRSA CCARM3115 그리고 MRSA CCARM3561은 37, Tryptic soy broth, TSB (Merck & Co. Inc., Darmstadt, Germany) 배지에서 mid-logarithmic phase (OD. 570 = 0.1, 5 10 7 CFU/mL) 까지배양하였다. 멸균된 TSA 배지에각각의 Bacillus subtilis PM125, MRSA CCARM3089, MRSA CCARM3115 그리고 MRSA CCARM3561 배양액 100 µl를도말한후, paper disc ( 직경 8 mm) 를 plate에놓고 500 µg/disc의농도로 disc에 50 µl씩흡수시키고 37 incubator에서 18 h 배양시켰다. 배양후 disc 주변에생성된 clear zone의크기로활성을측정하였다. 2.6. Tyrosinase 저해활성측정 Tyrosine에대한 in vitro tyrosinase 저해시험은다음과같이측정하였다 [11]. 0.1 M potassium phosphate buffer (ph 6.5) 220 µl, 시료 20 µl, mushroom tyrosinase (1500~2000 U/mL) 액 20 µl를순서대로넣는다. 이용액에 1.5 mm L-tyrosine 40 µl를혼합하여 37 에서 15 min 반응시킨후 490 nm에서흡광도를측정하였다. Tyrosinase 저해시험은시료용액의첨가구와무첨가구의흡광도감소율로나타내었다 ( 식 (3)). 시료무첨가구는시료대신 0.1 M potassium phosphate buffer (ph 6.5) 를넣었으며, 양성대조군으로는 arbutin (Sigma Co., St. Louis, MO, USA) 을사용하였다. Tyrosinase inhibition ratio (%) = 시료첨가구의흡광도 (1 - ) 100 (3) 무첨가구의흡광도 DOPA에대한 in vitro tyrosinase 저해시험은다음과같이측정하였다 [12,13]. 0.1 M potassium phosphate buffer (ph 7.0) 850 µl, 시료 50 µl, mushroom tyrosinase (1500 2000 U/mL) 50 µl를순서대로넣고 37 에서 6 min 반응시킨다. 이용액에 0.06 mm L-DOPA 50 µl을넣은다음 37 에서 1 min 반응시킨후 475 nm에서흡광도를측정하였다. Tyrosinase inhibition ratio는식 (3) 으로부터계산되었다. 2.7. 세포배양 B16-F10 mouse melanoma cell은한국세포주은행에서분양받아사용하였으며, 100 units/ml penicillin-streptomycin과 10% FBS가함유된 DMEM (Gibco, USA) 배지에서 37, 5% CO 2 incubator로배양하여실험에사용하였다. 2.8. 세포독성측정 (CCK-8 assay) GLE의농도에따른 B16-F10 mouse melanoma cell의생존율을측정하기위해 cell viability assay를실시하였다. 100 µl (5,000 cells/ well) 의세포부유액을 96 well plate에분주후, CO 2 incubator 안에서 24 h 동안전배양 (pre-incubation) 을한후, 농도별로희석한시료 10 µl를처리한후 12 h 동안배양하였다. 배양후각 well에 10 µl의 CCK-8 용액 (Enzo Life Sciences, New York, USA) 을첨가하였다. 2 h 동안 CO 2 incubator 안에서반응을시킨뒤 Microplate Reader를사용하여 450 nm 파장에서흡광도를측정하였다. 2.9. 세포내의 melanin 생성저해 B16-F10 melanoma cell을이용한멜라닌생합성저해효과를측정하기위하여 6 well plate에세포를 1 10 5 cells/well로분주하여 24 h 동안배양한후 GLE를농도별로처리하고 1 h 후에 200 nm의 α -MSH를각세포에처리하여 48 h 동안배양하였다. 배양된세포는 PBS로세척한뒤 10% DMSO가포함된 1 N NaOH (Sigma, St. Louis, USA) 용액을처리하여 60 항온수조에서 1 h 동안반응시킨후 multi-plate reader (BIOTEK, Vermont, USA) 를이용하여 490 nm에서흡광도를측정하였다. 2.10. Elastase 저해활성측정 Elastase inhibition assay는 Park 등 [14] 의방법을일부변형하여다음과같이측정하였다. 기질 50 mm N-succinyl-(Ala)3-p-nitroanilide 200 µl에추출물 20 µl와 2.5 unit elastase 20 µl를첨가하여 25 에서 15 min 동안반응시킨후 410 nm에서흡광도를측정하였다. Elastase inhibition ratio는아래의식으로부터계산되었다 ( 식 (4)). Elastase inhibition ratio(%) = 시료첨가구의흡광도 (1 - ) 100 (4) 무첨가구의흡광도 2.11. 통계분석 본연구의모든실험은 3회반복하여실시하였으며, 통계자료의값은 mean ± SD. 로표시하였다. 통계적유의성은 Student s t-test로하였으며, p 값이 0.05 미만일때통계적으로유의성이있다고판단하였다. 3.1. DPPH radical 소거능 3. 결과및고찰 유해산소와같은자유전자기는강력한산화제로화학적안정을위해타물질과결합하려는성질이있다. 이러한자유전자기가피부내세포조직과무분별한결합을함으로써피부의노화를촉진하는데이러한피부노화의주범인자유전자기의활동을방해하는것이항산화제의역할이다. 또한, 피부색소형성의주요원인인자외선에의해발생한활성산소가피부색소형성을촉진한다는메커니즘이밝혀지면서이들활성산소를소거하는것이 melanin 색소형성억제에효과적 공업화학, 제 28 권제 2 호, 2017

Graviola (Annona muricata) 잎추출물의항산화및미백효과 201 Table 1. Superoxide Dismutase (SOD) Like Activity of Graviola Leaf Extracts (GLE) conc. (µg/ml) 8 40 200 500 1000 Graviola Leaf Extracts (GLE) 11.14 ± 1.11 30.11 ± 0.86 38.49 ± 1.49 42.48 ± 0.21 67.47 ± 0.10 *Each value is expressed a means ± SD. of triplicate determinations. Table 2. Concentration of Total Poly Phenol and Total Flavonoid in Graviola Leaf Extracts (GLE) Graviola Leaf Extracts (GLE) Total poly phenol (mg/g) Total flavonoid (mg/g) 117 ± 0.4 254 ± 1.3 *mg/g, base on dry weight. Each value is expressed a means ± SD. of triplicate determinations. Figure 2. DPPH radical scavenging effect of Graviola Leaf Extracts (GLE). Results are expressed as mean ± SD. of data obtained from three independent experiments (p < 0.05). 이라는연구보고가있다 [15,16]. GLE의전자공여능을측정하기위해 DPPH 라디칼소거활성측정을수행하였다. GLE의라디칼소거능은농도의존적으로증가하였으며, 각각의농도별 7.8, 15.6, 31.3, 62.5, 125, 250, 500, 1000 µg/ml에서 7.73, 12.78, 15.82, 20.3, 27.25, 33.7, 55.33% 의라디칼소거능을나타내었으며, 대조군인 Ascorbic acid의 1000 µg/ml의 87.19% 보다는낮았지만 Ascorbic acid의 5.56, 12.15% 보다는높은활성도를나타내었다 (Figure 2). 3.2. SOD 유사활성측정 Gupta 등 [17] 의연구에따르면 Superoxide dismutase (SOD) 는생체내에서 superoxide radical을산소로산화시킴으로써활성산소를안정한물질로전환시켜신소상해로부터생체를보호하는작용을나타내는효소이고이러한효소의작용으로인해산화방지는물론노화억제와도밀접한관계가있다고알려져있다. 농도에따른 GLE의 SOD 유사활성능을측정한결과, 각추출물의모든농도에서 SOD 유사활성능이있었으며농도에비례하여높게나타났다 (Table 1). 8 µg/ml의농도에서 11.14%, 40 µg/ml에서 30.11%, 200 µg/ml에서 38.49%, 500 µg/ml에서 42.48%, 그리고 1000 µg/ml에서 67.47% 의순으로나타났다. 이는총페놀함량및항산화효과에대한연구로서 Lim 등 [18] 의 SOD유사활성에관한원추리잎의물, 에탄올추출물 500 µg/ml에서 6.05 ± 2.70, 12.98 ± 2.00% 인것에비해각각 7, 3배가량의높은 SOD 유사활성도를나타내었고, Choi 등 [19] 의메꽃잎열수추출물과에탄올추출물의 1000 µg/ml에서 12.66 ± 1.37%, 18.88 ± 1.26% 로또한각각 5배, 3배높은 SOD 유사활성도를나타내었으며, Park 등 [20] 의소리쟁이잎에탄올추출물및 Ascorbic acid 500 µg/ml에서 33.23, 52.93% 의활성을보고하고있으며이와비교하여 GLE는 1.3배가량의높은 SOD 활성과표준물질인 Ascorbic acid와비교하여 1.2배정도낮은활성을나타내었다. 이는 Kwon 등 [21] 과 Lee 등 [22] 이발표한폴리페놀의함량이높을수록 SOD 유사활성또한높다는연구결과와일치한다. 그러므로 GLE는 SOD를저해하는데효과적인천연폴리페놀항산화제를포함한화장품기능성소재로서충분한이용가치가있다고여겨진다. Table 3. Comparison of Inhibition Zone of Ampicillin and Graviola Leaf Extracts (GLE) Against Bacillus subtilis PM125, MRSA CCARM3089, MRSA CCARM3115 and MRSA CCARM3561 Ampicillin Graviola Leaf Extracts (GLE) Bacillus subtilis PM125 37 20 MRSA CCARM3089 18 - MRSA CCARM3115 36 30 MRSA CCARM3561 40 26 3.3. 총폴리페놀및총플라보노이드함량측정 식물은강한햇볕으로부터자신을보호하기위해자외선을직접받는열매의껍질이나잎사귀등에보호막을생성해낸다. 이러한보호막은강력한항산화물질로이루어져활성산소로인한파괴를막아내는역할을하는데, 폴리페놀성분이이에속한다 [23]. Table 2에서와같이 GLE에함유된총폴리페놀함량은건조시료 g당 gallic acid의등량값 (GAE) 으로나타낼때 117 ± 0.4 mg GAE/g로나타났다. 이는 Kim 등 [24] 의토마토잎추출물의폴리페놀함량이 30.6 mg GAE/g, Lim 등 [25] 의아사이베리, 블루베리, 산수유, 오디에탄올추출물의폴리페놀함량이각각 83.8 ± 2.6 mg GAE/g, 12.1 ± 0.8 mg GAE/g, 37.9 ± 1.0 mg GAE/g, 19.2 ± 3.5 mg GAE/g인것과비교하여적게는 1.4배많게는 9.7배 GLE의페놀성물질함량이높은것으로분석된다. 또한플라보노이드는폴리페놀에속하는수용성식물색소로역시노화를방지하는항산화작용을비롯한여러생리활성기능이있는것으로알려져있다 [26,27]. Table 2에서와같이 GLE에함유된총플라보노이드함량은 naringin을표준시료로하여등량값 (GAE) 으로나타낼때 254 ± 1.3 mg로나타났다. 이는자생식물과생약자원추출물의플라보노이드함량에관한연구로서 Kim 등 [28] 의비수리 (90.15 mg/g), 비쑥 (77.65 mg/g), 가귀리 (71.60 mg/g), 각시둥글레 (65.56 mg/g), 개구리밥 (63.27 mg/g) 등과비교하여매우높은것으로분석되었다. 본실험결과에따라 GLE의폴리페놀항산화효능을입증하는것으로천연항산화제화장품소재로서이용가치가있을것으로판단된다. 3.4. 항균활성 표준물질인 ampicillin (Sigma Co., St. Louis, MO, USA) 과 GLE의항균활성을 paper disc법으로측정하여 clear zone의크기를비교한결과는 Table 3에나타내었다. 그결과를살펴보면 Gram-positive인 B. Appl. Chem. Eng., Vol. 28, No. 2, 2017

조은희 김인혜 이재화 202 Figure 3. Comparison of inhibition zone of (1) ampicillin and (2) Graviola Leaf Extracts (GLE) against (A) Bacillus subtilis PM125 (B) MRSA CCARM3089, (C) MRSA CCARM3115 and (D) MRSA CCARM3561. A 50 µl aliquots of GLE was applied to filter paper and the paper placed on a streaked plate media. Sample concentration was 500 µg/ml. 나타내었다. 따라서 clear zone의 크기는 MRSA CCARM3115 > MRSA CCARM3561 > B. subtilis PM125의 순으로 보여주었다(Figure 3). 이러한 결과는 Annona muricata의 잎, 줄기 그리고 씨앗 추출물이 수많은 병원균에 대해서 항균 작용을 한다는 연구 결과와 유사하며, 이는 Annonaceae acetogenins 성분에서 기인하는 것으로 알려져 있다 [3,29]. 3.5. Tyrosinase 저해 활성 측정 (a) (b) Figure 4. Inhibitory effect of Graviola Leaf Extracts (GLE) against mushroom tyrosinase activity. (a) The activity of mushroom tyrosinase which is involved hydroxylation reaction from L-tyrosine to DOPA was measured by the change in absorption at 490 nm after incubation with various concentration of GLE. (b) The activity of mushroom tyrosinase which is involved oxylation reaction from DOPA to DOPA quinone was measured by the change in absorption at 490 nm after incubation with various concentration of GLE. Results are expressed as percentages of control and data are presented as mean ± SD. for independent triplicate experiments (p < 0.05). subtilis PM125에 대하여 항균 활성을 나타내었고 이들은 ampicillin에 서 37 mm, GLE에서 20 mm clear zone을 나타내었다. 항생제 내성균 주인 MRSA CCARM3089에 대해서 GLE는 항균 활성을 보이지 않았 으며, MRSA CCARM3115, CCARM3561에 대해서는 항균 활성을 나 타내었다. 이들은 500 µg/ml의 GLE에서 각각 30, 26 mm의 clear zone을 나타내어 표준물질인 ampicillin과 비교하여 높은 항균 활성을 공업화학, 제 28 권 제 2 호, 2017 GLE에 의한 tyrosinase inhibition 효과를 측정하기 위하여 mushroom tyrosinase에 의한 L-tyrosine의 산화 정도를 측정하였다. Melanin 의 생성은 melanocyte로부터 melanosome의 형태로 세포로부터 분비 되어 표피를 구성하는 주변의 각질 세포(keratinocyte)로 이동하여 들 어가게 된다[30,31]. Melanin 생합성(melanogenesis)은 melanocyte의 특이적으로 발현되는 tyrosinase, TYRP1 (tyrosinase-related protein-1), TRP-2 (tyrosinase-related protein-2, dopachrome tautomerase)에 의해 조절되는 복잡한 생리적 작용을 통해 발생한다[32]. 이 중 tyrosinase 는 L-tyrosine을 3,4-dihydroxy-phenylalanine (DOPA)로 바꾸는 hydroxylation 반응과 DOPA를 다시 DOPA quinone으로 바꾸는 oxylation 반응에서 작용한다[33]. 실험 결과 L-tyrosine을 DOPA로 바꾸는 데 관여하는 tyrosinase의 활성에 해당하는 결과는 Figure 4(a)와 같다. GLE와 표준물질인 arbutin의 tyrosinase 저해 활성은 농도 의존적으로 활성을 억제하는 경향 을 나타내었다. 농도별 tyrosinase 활성 결과는 GLE 100, 125, 200, 250 µg/ml에서 각각 95.1 ± 2.1%, 85.5 ± 1.1%, 71.5 ± 2.0%, 68.7 ± 1.4%의 효소활성을 나타내었다. 특히 GLE 125 250 µg/ml 농도에 서의 효소 활성 억제는 대조군인 arbutin보다 더 큰 활성 억제를 나타 냄을 확인할 수 있었다. DOPA를 DOPA quinone으로 바꾸는 oxylation 반응에 관여하는 tyrosinase의 활성에 해당하는 결과는 Figure 4(b)와 같다. 농도별 결과 는 GLE 100 µg/ml에서 11.5%, 200 µg/ml에서 23.4%로 나타내었고, 농도 의존적으로 활성을 억제하는 것을 확인하였다. 결과적으로 GLE 는 기질로서 L-DOPA가 관여하는 반응보다 L-tyrosine 관여 반응에서 효소 활성 억제 능력을 더 크게 보여주었으며, 이는 melanin 생성에 있어 초기 속도결정 단계를 늦추는 것으로 알려져 있는 L-tyrosine을 DOPA로 바꾸는 반응에서 크게 작용함을 확인할 수 있었다.

Graviola (Annona muricata) 잎추출물의항산화및미백효과 203 Figure 5. Effect of the Graviola Leaf Extracts (GLE) on cell viability of mouse B16-F10 melanoma cell. After incubation of B16-F10 melanoma cells with various concentration of the GLE in a 96 well plate for 24 h, cell viability was determined by WST assay. Results are expressed as mean ± SD. of data obtained from three independent experiments (p < 0.05). Figure 7. Inhibitory effect of Graviola Leaf Extracts (GLE) against elastase activity. Ursolic acid concentration was 50 μg/ml. Results are expressed as percentages of control and data are presented as mean ± SD. for independent triplicate experiments (p < 0.05). 영향을미치는가를알아보기위해, B16-F10 melanoma cell에 GLE 추출물을 0, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 µg/ml의농도별로 48 h 처리한후, 세포내에생성된 melanin의함량을측정하였다 (Figure 6). 그결과 GLE는농도의존적으로 melanin 생합성억제효과를나타내었으며, 세포독성을보이지않는최고농도 100 µg/ml에서 76.7% 의 melanin 억제효과를확인하였다. Figure 6. Inhibitory effect of Graviola Leaf Extracts (GLE) on α -MSH-stimulated melanogenesis of mouse B16-F10 melanoma cells. Melanin content in GLE-treated B16-F10 cells at day 2. Cells were cultured at 37 for 48 h in DMEM supplemented with α-msh (200 nm) with the extract in a concentration dependent manner. Results are expressed as mean ± SD. of data obtained from three independent experiments (p < 0.05). 3.6. 세포독성측정 (CCK-8 assay) GLE의 B16-F10 melanoma cell에서의세포생존능력을발색측정으로정량화하기위해 WST [2-(4-lodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4- disulfophenyl)-2h-tetrazolium, monosodium salt] 분석을통한 CCK-8 assay를시행하였다. WST 분석은 tetrazolium 성분을배양액에첨가한후발색을정량화하여세포의수, 증식정도등을알수있는데, 이는 tetrazolium 성분이세포내의미토콘드리아가가진탈수소효소에의해특정색으로변하게되어발색정도에따라서세포내의미토콘드리아의활성도를알수있다 [34]. GLE의농도변화에따른세포의생존율을확인한결과, 100 µg/ml 의농도까지는 94.7% 이상의세포생존율을확인하였으나그이상의농도에서세포독성을보임을확인하였다 (Figure 5). 반면 200 µg/ml 의농도에서 74.9%, 500 µg/ml의농도에서 44.5% 까지감소하여세포에독성을보이므로, 세포를이용한이후추가실험에서는 GLE가독성을보이지않는 100 µg/ml 이하의농도에서실험을진행하는것이옳은것으로사료된다. 3.7. 세포내의 melanin 생성저해 Tyrosinase 활성억제효과가있는 GLE 가 melanin 생성에어떠한 3.8. Elastase 저해활성측정피부는자외선에의해노화가진행되면 melanin 증식이항시적으로일어나게되고그결과기미를생성한다 [35]. 이러한노화가진행될수록피부구성물질인 collagen, elastin 등의구조단백질을생성하는능력이감소하고, type-1 collagenase의생합성이증가하면서기질단백질분해를유도하여피부탄력저하및주름생성을야기한다 [36]. GLE의 elastase 저해효과를살펴보면 200 µg/ml의농도에서 38.8 ± 1.1%, 100 µg/ml의농도에서는 14.6 ± 1.36%, 50 µg/ml의농도에서는 10.5 ± 1.87% 그리고 25 µg/ml의농도에서는 9.5 ± 0.99% 의활성을나타내었다. 표준시료인 ursolic acid는 50 µg/ml의농도에서실험을진행하였다 (Figure 7). GLE와표준시료인 ursolic acid 경우같은농도인 50 µg/ml의농도에서각각 10.5 ± 1.87%, 56.5 ± 0.7% 저해활성을나타냈으며, 표준시료인 ursolic acid에비해비교적낮은저해활성결과를나타냈지만, 미백과함께주름개선효과에영향을미치는좋은소재임을확인할수있었다. 4. 결론 본연구에서는 Annona muricata 잎추출물 (Graviola Leaf Extracts, GLE) 을이용하여화장품소재로서의가능성을조사하고자 in vitro 상에서항산화, 항균, 미백및주름개선효과등을실시하였으며, 더나아가 in vivo 상에서 B16-F10 mouse melanoma cell에대한세포생존율및 melanin 생합성억제효과를조사하여살펴보았다. 항산화능력에대한측정은 DPPH 분석및 SOD 유사활성측정을통해나타냈으며, 그결과 GLE는 DPPH 저해활성및 SOD 유사활성에있어서농도의존적으로활성이증가하였으며또한총페놀및플라보노이드함량에서는각각 117 ± 0.4 mg, 254 ± 1.3 mg로나타났다. 이러한결과를바탕으로기존의다른연구에서제시된물질들과의비교를통해천연항산화제를포함한기능성소재로서충분한이용가치가있음을확인할수있었다. Appl. Chem. Eng., Vol. 28, No. 2, 2017

204 조은희 김인혜 이재화 표준물질인 ampicillin과 GLE의항균활성은 paper disc법으로측정하여나타냈으며, 이때사용된균주는 Gram-positive인 B. subtilis PM125, 항생제내성균주인 MRSA CCARM3089, MRSA CCARM3115 그리고 MRSA CCARM3561과같다. MRSA CCARM3089에대해서는항균활성을보이지않았으며, 나머지에대해서는 MRSA CCARM3115 > MRSA CCARM3561 > B. subtilis PM125의순으로활성을나타내었다. 미백효과역시 tyrosinase 저해활성측정을통해진행하였으며, 그결과시료의농도가증가함에따라 tyrosinase 활성이감소하는것으로나타났다. 시료의농도에따른 L-tyrosine을 DOPA로바꾸는데관여하는 hydroxylation 반응과관련한 mushroom tyrosinase의저해활성은표준물질인 arbutin에비해 125 250 µg/ml 농도범위에서특히억제효과를높게나타내었다. 주름생성과관련하여서는 elastase 저해활성측정을통해진행하였으며, 그결과동일한농도에서 GLE 및표준시료 ursolic acid는 10.5, 56.5% 로나타났다. 더나아가 in vivo 상에서 B16-F10 mouse melanoma cell에대한세포생존율을조사한결과, 200 µg/ml의농도에서 74.9%, 500 µg/ml의농도에서 44.5% 로세포독성을나타냈으며, 세포를이용한향후추가실험에서는 GLE 가독성을보이지않는 100 µg/ml 이하의농도에서실험을진행하는것이적절하다고판단하였다. Melanin 생합성저해능은농도가증가함에따라감소하는경향을보였으며, 세포독성을보이지않는최대농도인 100 µg/ml에서 76.7% 의저해능을나타내었다. 이러한실험결과를바탕으로 Annona muricata 잎추출물 (Graviola Leaf Extracts, GLE) 이항산화및미백활성에상당한효과가있음을확인할수있었으며, 미백화장품성분으로서과색소침착치료에유용할것으로기대된다. 감 이논문은 2015년도부산광역시의재원으로지원을받아수행된 Brain Busan 21 (BB21, 과제번호 : 2016-04-002) 사업의연구비로수행되었습니다. 사 References 1. K. S. Seo, J. S. Park, M. Y. Go, S. W. Hwang, and J. E. Jang, 2015 Cosmetics Industry Analysis Report, 6-7, Hanhak Munhak, Seoul, Korea (2016). 2. E. H. Kim, A study of whitening cosmetics from natural products, Korean J. Aesthet. Cosmetol., 4, 195-203 (2006). 3. S. S. Yuan, H. L. Chang, H. W. Chen, Y. T. Yeh, Y. H. Kao, K. H. Lin, Y. C. Wu, and J. H. Su, Annonacin, a mono-tetrahydrofuran acetogenin, arrests cancer cells at the G1 phase and causes cytotoxicity in a Bax- and caspase-3-related pathway, Life Sci., 72, 2853-2861 (2003). 4. P. N Gouemo, B. Koudogbo, H. Tchivounda, C. Nguema, and M. 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