Korean Chem. Eng. Res., 55(1), 74-79 (2017) https://doi.org/10.9713/kcer.2017.55.1.74 PISSN 0304-128X, EISSN 2233-9558 Chlorella saccharophila 배양최적화및유용물질의생산 김아람 박미라 김효선 김성구 정귀택 부경대학교생물공학과 48513 부산광역시남구용소로 45 (2016 년 8 월 12 일접수, 2016 년 10 월 17 일수정본접수, 2016 년 10 월 25 일채택 ) Optimization of Chlorella saccharophila Cultivation and Useful Materials Production A-Ram Kim, Mi-Ra Park, Hyo Seon Kim, Sung-Koo Kim and Gwi-Taek Jeong Department of Biotechnology, Pukyong National University, 45, Yongso-ro, Nam-gu, Busan, 48513, Korea (Received 12 August 2016; Received in revised form 17 October 2016; accepted 25 October 2016) 요 약 본연구에서는 Chlorella saccharophila 의배양을통하여바이오에너지자원을대량으로확보하고자배지최적화실험을진행하였다. 최적화인자로는배양형태, 초기접종량, 탄소원종류및농도, 질소원종류및농도, 배양시간이다. 실험결과, 배양형태는광원과외부탄소원을모두공급하는 mixotrophic 배양이적절하였다. 초기접종량은 3% (v/v), 탄소원은 glucose 30 g/l, 질소원은 NaNO 3 0.95 g/l 를첨가하는것이우수하였다. 최적배지조건으로배양한결과, oil 의함량은 12 일에서가장높았으나, 회수되는 C. saccharophila 의 biomass 양과 chlorophyll 의양은 10 일에서가장높았다. 위의결과는미세조류의배지최적화를통하여대량배양을위한기초자료로사용될수있으리라판단된다. Abstract In this study, the optimization of several factors for Chlorella saccharophila cultivation was investigated. The studied factors were medium type, culture type, inoculum size, sugar/nitrogen source type and concentrations. As a result, the optimized conditions for C. saccharophila cultivation were found to be the best at 3% (v/v) inoculum, 30 g/l glucose and 0.95 g/l NaNO 3 under mixotrophic culture. Under the optimized condition, the content of oil was high at 12 day, whereas, the amount of biomass and chlorophyll were high at 10 day. Key words: Microalgae, Chlorella saccharophila, Optimization, Oil, Chlorophyll 1. 서론 현대사회에서재생에너지의개발과이용에대한관심이증가하면서재생가능한자원으로부터바이오연료와화학제품등을생산하고자기존의육지자원에서벗어나해양자원을선별, 그리고증식연구와더불어이를이용한열화학적또는생물학적공정연구가이슈가되고있다 [1-4]. 해조류는광합성을하는엽록소를가지는독립영양생물로성장이빠르고, 토지를필요로하는육지식물과는다르게물에서자라므로 3차원적인경작이가능하다 [5,6]. 이로인해생산성이우수하며더나아가해조류를식량으로이용하는국가는동아시아일부에국한되어있으므로, 식량경쟁에서도비교적자유롭다. 해조류는미 To whom correspondence should be addressed. E-mail: gtjeong@pknu.ac.kr This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/bync/3.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. 세조류와해조류로나뉘며, 이들은탄수화물및지질함량과구성및특성이매우다양하여바이오매스로서이용가능성이뛰어나다고알려져있다 [5-8]. 미세조류는염양염류의제거 [9,10], 이산화탄소고정화 [11], 중금속흡착 [12] 등의특성을이용하는연구와미세조류로부터바이오디젤을추출하고이를위한배양최적화연구역시더불어진행되고있다 [13-16]. Chlorella는오랜기간연구되어건강식품등에사용되고있는미세조류이다. 최근에는클로렐라유래의지질을통하여바이오에너지를생산하고자하는연구가이루어지고있다 [15-17]. 경제성을확보하기위하여저렴한탄소원을이용하거나배양방법, 배양조건등을다양하게조절함으로써생산성을증가시키고자하는연구가진행되고있다 [10,13,15,18]. 본연구에서사용한 Chlorella saccharophila는해양에서분리되었으며, glycerol을섭취하는능력이있다고알려져있고, lipid를축적하여바이오디젤생산에새로운가능성을제시하고있다 [17]. 일부문헌에의하면 C. saccharophila는배양방법에따라 10~47% 의 lipid 함량을가지며, 저농도의 glucose와 non-aerated 일때 lipid 함 74
Chlorella saccharophila 배양최적화및유용물질의생산 75 량이증가한다고알려져있다 [18]. 본연구에서는유용물질을생산하기위해녹조류단세포의일종인 Chlorella saccharophila를대량으로배양하고자클로렐라배양배지조건의최적화와유용물질의생산가능성을알아보고자하였다. 그리고 glucose이다. 그리고초기접종량은 3% 로하여 12일간배양하였다. 그리고 glucose의농도에따른클로렐라배양영향을알아보기위해 glucose를 10~40 g/l 포함하는 PG 배지에초기접종량을 3% 로하여 8일간배양하였다. 2. 재료및방법 2-1. 미세조류본연구에사용한클로렐라는 Chlorella saccharophila (Kruger) Migula KMMCC-195이며, 한국해양미세조류은행에서분양받아사용하였다. 2-2. 배양조건본실험은동일한 shaking incubator (Vision Scientific Co. Ltd, Korea) 에서진행하였으며, 배양온도 25 o C, 교반속도 120 rpm으로고정하였다. 모든배양은조건마다 2회반복배양하였고, 일정시간마다샘플을취하여분석하였다. 2-3. 배지및배양조건의최적화 2-3-1. 배지종류의영향배양배지종류의영향을알아보고자 PG 배지 (mg/l; KNO 3 (1900), CaCl 2 2H 2 O (440), MgSO 4 7H 2 O (370), KH 2 PO 4 (170), MnSO 4 H 2 O (16.9), ZnSO 4 7H 2 O (8.6), H 3 BO 3 (6.2), KI (0.83), Na 2 MoO 4 2H 2 O (0.25), CuSO 4 5H 2 O (0.25), CoCl 2 6H 2 O (0.25), FeSO 4 7H 2 O (37.3), EDTA-Na 2 (27.8), Myo-inositol (10), Glycine (0.2), Nicotinic acid (0.05), Pyridoxine HCl (0.05), Thiamine HCl (0.1)), JM(Jaworski s Medium with fresh water [19]), JMS(Jaworski s Medium with Sea water [19]), BG-11(Sigma-Aldrich, Co. Ltd.), f/2(guillard s f/2 medium [20]) 에대하여탄소원으로 glucose를 10 g/l 첨가하여 10일간배양하였다. 2-3-2. 배양방법의영향클로렐라의배양형태를결정하기위해위실험에서선택된 PG 배지에광원과탄소원을선택적으로제공하였다. 먼저광합성에따른성장을보기위해탄소원을제공하지않고광원만제공한 autotroph, 빛이없는환경에서탄소원을소비하는호흡에대한성장을알아보기위한 heterotroph, 그리고광원과탄소원모두제공한 mixotroph의 3가지배양방법으로배양하였다. Autotroph과 mixotroph 배양조건은형광등광원을이용하여약 100 µmol/m 2 /s의광량과주간 16시간, 야간 8시간의간격으로빛을조사하면서배양하였다. 모든미세조류의배양은 shaking incubator를이용하였으며, 배양온도는 25 o C, 교반속도 120 rpm으로고정하여배양하였다. 2-3-3. 접종량의영향초기접종량에따른영향을알아보기위해초기접종량을배지의 1~6% (v/v) (OD 660 0.166~0.676) 로설정하여 mixotrophic으로배양하였다. 2-3-4. 탄소원종류및농도의영향탄소원의종류에따른클로렐라배양영향을알아보기위해 PG 배지에 8가지의탄소원을 10 g/l 첨가하여배양하였다. 사용된탄소원은 fructose, mannose, lactose, sucrose, xylose, galactose, glycerol 2-3-5. 질소원종류및농도의영향질소원의종류에따른영향을알아보기위해질소원을 1.90 g/l 포함하는 PG 배지를제작하였으며, 탄소원으로 30 g/l의 glucose를첨가하였다. 사용한질소원으로는 NH 4 NO 3, urea (NH 4 ) 2 SO 4, casein, yeast extract, peptone, corn steep solid, KNO 3 그리고 NaNO 3 이다. 초기접종량은 3% 로하여접종후 8일간배양하였다. 그리고질소원의농도에따른영향을알아보기위해질소원종류실험결과를토대로선택된 NaNO 3 을 0.475 g/l, 0.950 g/l, 1.425 g/l로설정하였으며, glucose 30 g/l를첨가하였다. 초기접종량은 3% 로하여접종후 10일간배양하였다. 2-4. 분석방법 2-4-1. 클로렐라수확배양한클로렐라를수확하기위해 4,000 rpm에서 15분간원심분리하여배지와클로렐라를분리한다음증류수를사용하여수확한클로렐라에남아있는배지를제거하는세척과정을 2회반복하였다. 세척을마친클로렐라는동결건조한후분쇄하여암소에서냉장보관하면서분석에사용하였다 [21]. 2-4-2. Cell density 측정클로렐라의성장을측정하기위해일정간격으로채취한시료를분광광도계 (SPEKOL 1300, Analytik Jena) 를사용해흡광도를 660 nm에서측정하여표준곡선을이용하여건조세포농도로환산하여나타내었다. y = 0.5351x 0.016 (R 2 =0.995). 이때, x는측정된흡광도값 (OD 660 ) 이며, y는 cell density (g/l) 이다 [21]. 2-4-3. 오일추출및함량측정오일추출방법은 Bligh and Dyer method [22] 를변형하여사용하였다. 동결건조된클로렐라 10 mg에 5 ml의증류수를첨가하여초음파파쇄기를사용하여 cell을파쇄하였다. 파쇄된 cell에 chloroform과 methanol을 1:2 비율로첨가한다음 5분간 vortexing 하고 5000 rpm으로 10분간원심분리하여 cell debris를제거하였다. 이후 chloroform과증류수를 1:1 비율로첨가하여 5분간 vortexing 후다시 2000 rpm에서 10분간원심분리하여층분리를하였다. 추출된 oil은아래의 chloroform 층을회수하여열을가하여 chloroform을제거한후시료를건조하여 oil의무게를측정하였다. 측정된 chloroform 층의무게 (oil 량 ) 는추출에사용한바이오매스의초기무게와비교하여 % of dcw ( 오일무게 / 건조중량 *100) 을계산하였다 [21]. 2-4-4. 클로로필추출및함량측정색소함량을분석하기위해 10 ml의 methanol에동결건조한클로렐라를 10 mg을첨가한다음균일하게혼합하였다. 60 o C에서 30분간용출시킨후 666 nm와 653 nm에서흡광도를측정하여다음과같은식을사용하여색소의양을계산하였다 [23]. Chlorophyll (mg/l) = 25.5*A 653 +4*A 666. 이때, A는 absorbance로흡광도이고, 653과 666은 spectrophotometer에서사용한각각의파장이다. Chlorophyll의
76 김아람 박미라 김효선 김성구 정귀택 함량 (%) 은측정된 chlorophyll의농도 (mg/l) 를분석에사용한바이오매스의초기농도와비교하여 % of dcw (chlorophyll 농도 / 초기바이오매스농도 *100) 을계산하였다 [21]. 3. 결과및고찰 3-1. 배지종류의영향배지종류에따른클로렐라의성장을알아보기위해 5가지배지를사용해배양하였으며, Fig. 1에그결과를나타내었다. 배양결과 PG 배지에서가장높은 cell density (1.99±0.13 g/l) 를보였다. 이는기존의 C. saccharophila 배지인 f/2배지 (1.68±0.10 g/l) 보다높은 cell density를보이는것이다. 그러나 cell growth rate를고려하였을때, PG 배지에서 1.35±0.09 day -1 이고, f/2에서 1.16±0.07 day -1 인데반해, cell density가낮은 JM 배지에서 1.35±0.06 day -1 의높은 cell growth rate를보였다. 그렇지만대량배양및 product의생산을고려할때이실험에서 cell growth rate가큰영향을주지않을것이라고판단하였다. 따라서본실험이후에서는 C. saccharophila의배양실험에 PG 배지를선택하였다. 3-2. 배양방법의영향배양방법에따른 C. saccharophila의성장정도를알아보기위해 3가지의배양방법 (autotroph, heterotroph 그리고 mixotroph) 으 로배양하였다 (Fig. 2). 광원을사용한 autotroph에서다른두배양형태보다현저히낮았고 (0.22±0.00 g/l), 초기접종량과비교했을때미량증가한 cell density를확인할수있었다. 이는 C. saccharophila가자가영양생물이며, 탄소원이없는환경에서광합성만으로성장은가능함을보여주는것이다. 그러나 autotroph에서원하는농도까지배양하는시간과광원에대한효율을고려했을때, 대량생산을하기위한배지조성연구에적합한방법이아니라고판단되었다. 광원을제공하지않고탄소원만을제공한 heterotroph에서는어느정도높은 cell density (3.79±1.19 g/l) 를확인할수있었다. 이는앞의 autotroph과비교했을때빛보다는탄소원의제공이클로렐라배양에조금더중요한것이라고판단되는부분이다. 그리고빛과외부탄소원을모두제공한 mixotroph에서 (5.83±0.66 g/l) 의높은 cell density를확인할수있었다. 3가지배양결과를비교했을때, C. saccharophila 배양에는광원이나탄소원을단편적으로제공하는것보다모두제공할때 cell 성장의효율이가장높은것으로판단되었다. Cell growth rate 또한 (4.53±0.72 day -1 ) 향상되는것을확인하였다. Liang 등 [24] 에의하면 C. vulgaris의배양에있어서 autotroph 조건에서는 heterotroph에비하여세포성장과 lipid 생산성이낮았고, glucose를탄소원으로사용한경우에서 14배증가한 lipid 생산성을보고하였다. 또한빛과탄소원이공존하는 mixotroph 조건에서빛에의해영향을받는다고보고하였다. 3-3. 접종량의영향초기접종량에따른 C. saccharophila의성장을알아보기위해 PG 배지에서접종량을배지의 1~6% (v/v) 를접종하여 mixotroph 으로배양한결과를 Fig. 3에나타내었다. 각각의초기접종량은분광광도계를사용하여 660 nm 파장에서흡광도를측정하였을때 1% 에서 0.166, 2% 에서 0.270, 3% 에서 0.390, 4% 에서 0.467, 그리고 6% 에서 0.676 이었다. 배양결과초기접종량이증가함에따라성장역시증가하는것으로나타났다. 그러나 1% (3.80±0.62 g/l) 를접종한경우와 2% (5.82±0.66 g/l) 를접종한경우를비교했을때약 50% 의성장차이를보였으나, 3% (6.46±0.31 g/l) 를접종한경우와 6% (7.35±0.01 g/l) 를접종한경우를비교할때약 14% 의성장을차이를보여 6% 를접종한경우의성장률은접종량에비해효율이현저히낮음을보였다. 이는 C. saccharophila 배양에초기접 Fig. 1. Effect of medium kind of the growth of C. saccharophila. Fig. 2. Effect of culture type on the growth of C. saccharophila. Fig. 3. Effect of inoculum size on the growth of C. saccharophila in mixotrophic culture.
Chlorella saccharophila 배양최적화및유용물질의생산 77 종량이성장에영향을미치며일정농도이상의초기접종량은 cell growth 수율이떨어지는것으로판단된다. 특히 3% (6.46±0.31 g/l) 를접종한배지와 4% (6.50±0.35 g/l) 를접종한배지에서는성장의차이가거의나타나지않는것으로나타났다. 마찬가지로 cell growth rate가접종량이증가함에따라오히려감소하는것을확인할수있었다. 접종량을 2~4% (v/v) 로하여 heterotroph 조건에서 10일간배양한결과, heterotroph에서는 mixotroph과는반대로접종량이증가할수록성장이감소하는것으로나타났다 (data not shown). Productivity 또한감소하는것으로나타났다. 이는 heterotroph 에서한정된탄소원만제공될때필요이상의초기접종량은오히려비효율적이었다. 따라서본실험에서 mixotroph이이상적인배양형태임이확인되었으며, 이러한점들을기초로하여이후실험의초기접종량의기준을배지의 3% (v/v) 로결정하였다. Heidari 등 [25] 은 C. vulgaris의 hybrid cultivation system에서접종대상미세조류의나이및농도를연구한결과, 영양분고갈 4일째되는미세조류를 66 mg/l의농도로접종하였을때최대의 lipid 생산성을얻었다고보고하였다. 이는접종하고자하는미세조류의나이와성장상태, 그리고접종농도가차후의미세조류성장과 lipid 생산성에영향을미친다는보고이다. 3-4. 탄소원종류및농도탄소원의종류에따른 C. saccharophila의성장에미치는영향을알아보기위해 PG 배지에 8가지의탄소원을 10 g/l가되도록첨가하여, 초기접종량을 3% 로 12일간배양하여얻은결과를 Fig. 4에나타내었다. 실험에사용한탄소원은 fructose, mannose, lactose, sucrose, xylose, galactose, glycerol 그리고 glucose이다. 배양결과 fructose (6.35±011 g/l) 에서가장높은 cell density를보였으며, 그다음으로 glucose (5.48 g/l) 가높은 cell density를보였다. 이는 C. saccharophila가 glucose보다 fructose를선호하는것으로판단된다. 또한대부분의탄소원에서 12일정도에성장이감소하였다. 그러나본실험에서는경제적인면과 C. saccharophila의성장등을고려하여 fructose가아닌 glucose를탄소원으로선택하였다. 이와유사한결과로는 Liang 등 [24] 은 C. vulgaris 배양의 mixotroph 조건에서는 acetate, glucose, or glycerol을대상으로배양한결과, glucose를 Fig. 4. Effect of sugar kind on the growth of C. saccharophila. Fig. 5. Effect of glucose concentration on the growth of C. saccharophila. 사용한경우에가장높은세포성장과 lipid 생산성을얻었다. 탄소원의농도에따른 C. saccharophila의성장에미치는영향을알아보기위해탄소원으로 glucose를 10~40 g/l가되도록첨가하여, 초기접종량을 3% 로접종하여 12일간배양한결과를 Fig. 5에나타내었다. 대체적으로 glucose의농도가증가할수록성장률역시증가하였다. 그러나가장높은농도인 40 g/l (7.74±0.74 g/l) 에서는오히려 30 g/l (8.89±0.87 g/l) 보다 cell density가낮은것을확인할수있었다. 또한 cell growth rate에서도 20 g/l의경우에는 1.83 day -1, 30 g/l의경우에서는 4.63 day -1, 40 g/l의경우에서는 3.89 day -1 로나타났다. 이는 C. saccharophila 배양시높은농도의 glucose가기질저해를일으키는것으로판단된다. Liang 등 [24] C. vulgaris 배양의 mixotroph 조건에서는낮은농도의 glucose (1~2%) 에서고농도의 glucose (5~10%) 에비하여높은세포성장을보고하였다. 따라서본실험에서는가장높은성장을보여준 30 g/l의 glucose 농도에서다음실험을수행하였다. 3-5. 질소원종류및농도질소원의종류와농도에따른 C. saccharophila의성장에미치는영향을알아보기위해 9가지의질소원 (NH 4 NO 3, urea, (NH 4 ) 2 SO 4, casein, yeast extract, peptone, corn steep solid, KNO 3 그리고 NaNO 3 ) 과 glucose (30 g/l) 를포함하는배지를조제하여초기접종량 3% 로접종하여 8일간배양하였다 (Fig. 6). 배양결과 NaNO 3 를 0.95 g/l 첨가한배지 (8.45 g/l) 에서 C. saccharophila의 cell density가가장높았다. Cell growth rate 역시 7.30 day -1 으로가장높았다. KNO 3 와 NaNO 3 에서높은농도인 1.90 g/l (1.91±0.24 g/l와 2.19±0.01 g/l) 에서오히려성장이감소하는것으로보아탄소원과유사하게기질저해작용을하는것으로보인다. 또한 1.90 g/l를첨가한다른질소원실험보다 NaNO 3 에서수율이좋으므로질소원의종류를 NaNO 3 로결정하였다. 0.475~1.475 g/l 농도의 NaNO 3 배지를이용하여 10일간배양하여얻은결과, 0.475, 0.950, 1.425 g/l의 NaNO 3 에서각각 5.34±0.13, 7.34±0.06, 5.29±0.22 g/l의 cell density를나타내어 0.950 g/l NaNO 3 에서 cell density가가장높음을알수있으며, cell growth rate 면에서도우수한것을확인하였다. 본실험의결과를바탕으로클로
78 김아람 박미라 김효선 김성구 정귀택 Fig. 7. Effect of optimized medium on the growth of C. saccharophila. (a) Cell density, (b) Products. Fig. 6. Effect of nitrogen source kind and concentration on the growth of C. saccharophila. (a) Nitrogen source, (b) NaNO 3 concentration. 렐라배양시질소원은 0.950 g/l의 NaNO 3 가적절하다고판단하였다. 반면에 Nigam 등 [26] 은 C. pyrenoidosa의 autotroph 배양에서 0~0.4 g/l KNO 3 의질소원에서미세조류의성장과 lipid 함량을연구한결과, nitrate의농도가감소함에따라미세조류세포량도감소하였으나, lipid 함량은증가하였다고보고하였다. 또한 0.05 g/l의 KNO 3 농도에서높은 lipid 축적을보고하였다. 3-6. 최적조건에서 C. saccharophila 배양위의실험결과를종합하여최적조건의배지를조성하였으며, 이로부터 C. saccharophila를 mixotrophic 배양조건에서 12일간배양하여그결과를 Fig. 7에나타냈다. 실험결과시간이경과함에따라 C. saccharophila의 cell density와 productivity는증가하는추세였으나, 10일이후감소하였다. 그러나 oil 함량의경우에는 12일까지증가하는것을확인할수있다. 이러한사실은 10일이후배지의영양성분이대부분고갈되면서발생하는환경적스트레스 ( 질소원고갈, 빛파장변화 ) 에기인해 oil의함량이오히려증가한것으로보인다 [14,25,27]. 일반적으로미세조류의배양에있어서배양후기에질소원의고갈되고이로인하여미세조류의지질합성과축적이증가한다는연구결과들이알려져있다 [14,26,27]. 4. 결론 C. saccharophila의대량배양을위한배지최적화실험을진행하였다. 실험결과기본배지는 PG 배지가적합하였으며, 배양형태는광원과외부탄소원을모두공급하는 mixotrophic 배양이적절하였다. 초기접종량역시회수되는클로렐라양을고려할때배지의 3% 내외로접종하는것이효율적이다. 배지에첨가되는질소원과탄소원의경우탄소원은 glucose를 30 g/l를첨가하고질소원은 NaNO 3 으로 0.95 g/l를첨가하는것이우수하였으며, 이를초과할경우영양원에의한기질저해가발생하는것으로판단되었다. 최적배지조건으로배양한결과 oil의함량은 12일에서가장높았으나, 회수되는 C. saccharophila의 biomass양과 chlorophyll 의양은 10일에서가장높았다. 따라서보다많은 lipid를회수하기위해서 C. saccharophila의배양일을 12일로하되, chlorophyll의회수를위한다면배양일을 10일로하는것이적절하다고판단된다. 감사이연구는 2015년한국연구재단과한국여성과학기술인지원센터의지원을받아연구되었습니다. 또한, WISET 프로그램에참여한김주예, 민혜원, 최소영, 선지원, 윤지현님께감사합니다.
Chlorella saccharophila 배양최적화및유용물질의생산 79 References 1. Demibras, A., Progress and Recent Trends in Biofuels, Prog. Energy Combust, Sci., 33, 1-18(2007). 2. Kamm, B., Gruber, P. R. and Kamm, M., Biorefineries : Industrial Processes and Products, WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim(2008). 3. Werpy, T. and Petersen, G., Top Value Added Chemicals from Biomass, volume I : Results of Screening for Potential Candidates from Sugars and Synthesis Gas, The Pacific Northwest National Laboratory (PNNL) and the National Renewable Energy Laboratory (NREL)(2004). 4. Jeong, G. T., Production of Total Reducing Sugar and Levulinic acid from Brown Macro-algae Sargassum fulvellum, Microbiol. Biotechnol. Lett., 42, 177-183(2014). 5. Hamasaki, A., Shioji, N., Ikuta, Y., Hukuda, Y., Makita, T., Hirayama, K., Matuzaki, H., Tukamoto, T. and sasaki, S., Carbon Dioxide Fixation by Microalgae Photosynthesis using Actual Flue Gas from a Power Plant, Biochem Biotechnol., 45, 799-809(1994). 6. Park, J. I., Woo, H. C. and Lee, J. H. Production of Bio-energy from Marine Algae: Status and Perspectives, Korean Chem. Eng. Res., 46(5), 833-844(2008). 7. Kang, S., Kim, S., Lee, J., Optimization of Cross Flow Filtration System for Dunaliella tertiolecta and Tetraselmis sp. Microalgae Harvest, Korean J. Chem. Eng., 32(7), 1377-1380(2015). 8. Choi, K., Lee, J., Jo, J., Shin, S., Kim, J. W., Optimization of Hot-water Extraction Conditions of Polyphenolic Compounds from Lipid Extracted Microalgae, Korean Chem. Eng. Res., 54(3), 310-314(2016). 9. Hashumoto, S. and Furukawa, K., Nurtient Removal from Secondary Effluent by Filamentous Algae, J. Fermt. Bioeng., 67, 62-69(1989). 10. Banat, J., Puskas, K., Esen, I. and Al-Dahar, R., Wastewater Treatment and Algal Productivity in an Intergrated Ponding System, Biol. Wastes., 32, 265-275(1990). 11. Wilde, E. W. and Benemann, J. R., Bioremoval of Heavy Metals by the Use of Microalgae, Biotechnol. adv., 11, 781-812(1993). 12. Kandah, M., Abu Al-Rub F.A. and Al-Dabaydeh, N., The Aqueous Adsorption of Copper and Cadmium Ions on Sheep Manure, Adsorption Science Technol., 21, 501-509(2003). 13. Lee, J. Y., Fatty Acids Production from Chlorella sp. KR-1 using Bubble-column Photobioreactors, KSBB J., 4, 183-183(2010). 14. Ra, C. H., Kang, C. H., Jung, J. H., Jeong, G. T. and Kim, S. K., Effects of Light-Emitting Diodes (LEDs) on the Accumulation of Lipid Content using a Two-phase Culture Process with Three Microalgae, Bioresour. Technol., 212, 254-261(2016). 15. Cho, S. J., Lee, D. H., Luong, T. T., Park, S. R., Oh, Y. K. and Lee, T. H., Effects of Carbon and Nitrogen Sources on Fatty Acid Contents and Composition in the Green Microalga, Chlorella sp. 227, J. Microbiol. Biotechnol., 21, 1073-1080(2011). 16. Lee, H. S., Jeon, S. G., Oh, Y. K., Kim, K. H., Chung, S. H., Na, J. G. and Yeo, S. D., Recovery of Lipid from Chlorella sp. KR- 1 via Pyrolysis and Characteristics Pyrolysis Oil, Korean Chem. Eng. Res., 50(4), 672-677(2012). 17. Singh, D., Puri, M., Wilkens, S., Mathur, S. A., Tuli, K. D. and Barrow, J. C., Characterization of a New Zeaxanthin Producing Strain of Chlorella saccharophila Isolated from New Zealand Marine Waters, Bioresour. Technol., 143, 308-314(2013). 18. Tan, K. C. and Johns, R. M., Fatty Acid Production by Heterotrophic Chlorella saccharophila, Hydrobiologia., 215, 13-19(1991). 19. Tompkins, J., Deville, M. M., Day, J. G., Turner, M. F., The Culture Collection of Algae and Protozoa. Ambleside, Institute of Freshwater Ecology, 204(1995). 20. Andersen, R. A., Berges, J. A., Harrison, J. P., Watanabe, M.M., in R. A. Andersen (Ed.), Algal culturing techniques, Burlington Elsevier San Diego and London, Academic Press, 429-532(2005). 21. Kim, A. R., Kim, H. S., Park, M. R., Kim, S. K. and Jeong, G. T., Application of Lignocellulosic and Macro-algae Hydrolysates for Culture of Chlorella Saccharophila, Microbiol. Biotechnol. Lett., 44, 522-528(2016). 22. Folch, J., Lees, M. and Sloane-Stanley, G. H., A Simple Method for the Isolation and Purification of Total Lipid from Animal Tissues, J Biochem., 226, 497-502(1957). 23. Kim, J. K., Park, H. J., Kim, Y. H., Joo, H., Lee, S. H. and Lee, J. H., UV-induced Mutagenesis of Nannochloropsis oculata for the Increase of Lipid Accumulation and Its Characterization, J. Korean Ind. Eng. Chem., 24, 155-160(2013). 24. Liang, Y., Sarkany, N., Cui, Y., Biomass and Lipid Productivities of Chlorella vulgaris under Autotrophic, Heterotrophic and Mixotrophic Growth Conditions, Biotechnol. Lett., 31, 1043-1049(2009). 25. Heidari, M., Kariminia, H., Shayegan, J., Effect of Culture Age and Initial Inoculum Size on Lipid Accumulation and Productivity in a Hybrid Cultivation System of Chlorella Vulgaris, Process Saf. Environ. Prot., 104, 111-122(2016). 26. Nigam, S., Rai, M. P., Sharma, R., Effect of Nitrogen on Growth and Lipid Content of Chlorella Pyrenoidosa, Am. J. Biochem. Biotechnol., 7(3), 124-129(2011). 27. Ra, C. H., Kang, C. H., Jung, J. H., Jeong, G. T., Kim, S. K., Enhanced Biomass Production and Lipid Accumulation of Picochlorum atomus using Light-Emitting Diodes (LEDs), Bioresour. Technol., 218, 1279-1283(2016).