1) 사상체질의학회지 2008;20(2):98-110 J of Sasang Constitutional Medicine Vol. 20, No. 2, 2008:98-110 http://www.esasang.com 十二味寬中湯의老化억제효과에대한實驗的硏究 손덕칭ㆍ안택원 Abstract 대전대학교한의과대학사상체질과 Anti-aging Effects of Sipyimigwanjung-tang in Aged Rats Sun Teh-Cheng, Ahn Taek-Won Dept. of Sasang Constitutional Medicine, College of Oriental Medicine, Daejeon Univ. 1. Objectives The purpose of this study is to prove the anti-aging effects of Sipyimigwanjung-tang. 2. Methods The SD rats used in this experiment were 6, 18 and 36 weeks old. A part of the 36weeks was grown to 52 and 68 weeks at labarotary. Each age group was again divided into three groups. These 15 groups consisted of 6 rats each. One group was given no treatment, another group was dosed 200 μl of normal saline daily, and the last group was dosed 200 μl of 1% Sipyimigwanjung-tang(SYG) and saline mixture. At the conclusion of the experiment, the age groups were relabelled accordingly(,,, and ). After 4 weeks, the tissue of liver, heart, spleen, lung, kidney and brain was biopsied in order to measure the SOD, GSH, MDA. 3. Results and Conclusions In liver, the activity of the SOD of -SYG was significantly increased than that of, and -SYG, the level of the GSH of -SYG was significantly increased than that of the normal group, the activity of the catalase of -SYG was significantly increased than that of the normal and control group, the level of the MDA of -SYG and -SYG was significantly decreased than that of the normal and control groups. In heart, the level of the GSH of -SYG was significantly increased than that of the normal and control group. In spleen, the level of the GSH of -SYG was significantly increased than that of the normal and control group. In lung, the level of the GSH of -SYG was significantly increased than that of the normal group and the level of -SYG was significantly increased than that of the normal and control group. In kidney, the level of the GSH of -SYG was significantly increased than that of the normal group. In brain, the level of the GSH of -SYG was significantly increased than that of the normal and control group. The SYG inhibited the histology degeneration of brain tissue. These results suggest that oral administration of SYG (Sipyimigwanjung-tang) decoction has anti-aging effects in aged rats. Key Words : Sipyimigwanjung-tang, Anti-aging Effect, SOD, GSH. 접수일 2008 년 06 월 26 일 ; 승인일 2008 년 07 월 13 일 교신저자 : 안택원충남천안시두정동 621 번지대전대천안한방병원사상체질과 Tel : +82-41-521-7538 Fax : +82-41-521-7377 E-mail : twahn@dju.ac.kr
손덕칭외사상체질의학회지 2008;20(2):98-110 99 I. 緖論 Ⅱ. 硏究方法 우리나라는 1960년도에는 65세이상노인인구가전인구의 2.9% 에불과했으나, 2000년에는 7.2% 를넘어고령화시대로접어들었으며 2018년에는그비율이 14.3% 가되어 고령사회 에도달할것으로전망되고있다 1,2. 한의학에서는노화에대하여 ꡔ 靈樞 榮衛生會篇 ꡕ 3 에서 老者之氣血衰其肌肉枯氣道澁五臟之氣相搏其營氣衰少而衛氣內伐 이라하여氣血의衰退로肌肉이점차약해지는것을노화로보았고, 노화로인한신체변화에대해서는 ꡔ 素問 陰陽應象大論 ꡕ 4 에는 年四十而陰氣自半也起居衰矣, 年五十體重耳目不聰明矣, 年六十陰痿氣大衰九竅不利 라하여신체기능과생식능력의저하가나타난다고하였다. 李濟馬 (1837-1900) 는 ꡔ 東醫壽世保元 ꡕ 廣濟說 5 에서 四十九歲至六十四歲曰老 라하여 50 대에들어노인의단계로접어든다고하였으며, 壽命의長短을결정짓는요인은각체질에따른保命之主의유지와知行, 恭敬, 調養, 調病등을통한체질적양생을의미한다고하였다 6,7. 十二味寬中湯은赤白何烏寬中湯의변방으로脾를補하고和하는藥物과溫中시키는藥物로構成되어少陰人裏病의四體倦怠小便不快陽道不興장차浮腫으로진행될경우에사용되어 8 노화에대한억제효과가기대되었다. 이에저자는十二味寬中湯의항산화와관련된抗老化효과를입증하고자 6주령, 18주령, 36 주령, 48주령및 64주령백서를성장기, 성숙기, 초기노화기, 노화기, 말기노화기로설정하고 4주간매일 1% 의十二味寬中湯 200μl를경구투여한후, 실험이종료된 10주령, 22주령, 40주령, 52주령및 68주령백서의각장기조직을분획한후조직내의항산화효소인 SOD(Superoxide Dismutase) 및 catalase 활성도, 항산화물질인 glutathione 의함량, 자유라디칼인 NO(nitric oxide) 의농도및산화적손상물인 MDA(malondialdehyde) 변화를측정한결과유의한성적을얻었기에이에보고하는바이다. 1. 재료 1) 동물동물은 6주령, 18주령, 36주령의웅성 SD rat (Sprague-Dawley rat) 을 ( 주 ) 중앙실험동물 ( 경기도, 한국 ) 에서공급받아, 6주령과 18주령및 36주령의일부는 1주일간실험실환경에적응시킨후실험에사용하였으며, 36주령의나머지는 52주령과 68주령이될때까지실험실에서사육하여실험에사용하였다. 실험에사용된동물은실험당일까지고형사료 ( 삼양사료, 한국 ) 와물을충분히공급하고, 실험실은실온 (22±2 ) 을유지하였다. 2) 약재본실험에사용된十二味寬中湯 (SYG) 은 D대학교한방병원약제실의검수를받아구입하여이용하였다 (Table 1). 2. 실험방법 1) 실험군설정실험동물은각각 10주령, 22주령, 40주령, 52 주령, 68주령의 SD rat으로, 각주령마다정상군 (normal group), 대조군 (saline group), 실험군 (SYG group) 으로나누어모두 15군으로분류하였고, 각실험군에는실험동물을 6마리씩배정하였다. 각실험군에대한처치는다음과같다. (1) 10주령, 22주령, 40주령, 52주령및 68주령정상군 (Normal group): 6주령, 18주령, 36주령, 48주령및 64주령의정상 SD rat을 4주간아무처치하지않은군. (2) 10주령, 22주령, 40주령, 52주령및 68주령대조군 (Saline group): 6주령, 18주령, 36주령, 48주령및 64주령의 SD rat에매일 200 μl의 Saline을 4주간경구투여한군
100 사상체질의학회지 2008;20(2):98-110 손덕칭외 Table 1. The Compositions of Sipyimigwanjung-tang(SYG) Herbs Sceintific name Amount(g) 白何首烏 Polygoni Multiflori Radix 4 赤何首烏 Polygoni Multiflori Radix 4 良薑 Alpiniae Officinarum Rhizoma 4 乾薑 Zingiberis Rhizoma 4 陳皮 Citri Pericarpium 4 靑皮 Citri Reticulatae Viride Pericarpium 4 香附子 Cyperi Rhizoma 4 益智仁 Alpiniae Oxyphyllae Fructus 4 厚朴 Magnoliae Cortex 2 枳實 Aurantii Immaturus Fructus 2 木香 Aucklandiae Radix 2 大腹皮 Arecae Pericarpium 2 大棗 Jujubae Fructus 2 Total amount 42 (3) 10 주령, 22 주령, 40 주령, 52 주령및 68 주령 실험군 (SYG group): 6주령, 18주령, 36주령, 48주령및 64주령의 SD rat에매일 1% 의十二味寬中湯 200 μl를 4주간경구투여한군. 2) 장기내항산화효과측정 (1) 조직적출및분획생리식염수로관류하여혈액을제거한후간과심장, 비장, 폐, 신장, 및뇌조직의일부를적출하여여지로혈액및이물질을제거하고 Bansal 등의방법 19) 에의해조직 1g에 4 배의 150mM 의 KCl 을가하여 homogeniger를이용하여균질화하였다. 균질화한조직을 600 g에서 10분간원심분리하여균질화되지않은조직등을제거한후, 상등액을 1000 g에서 30분간원심분리하여상등액을취하여, 10,000 g 에서 1시간원심분리하여 mitochondrial fraction을얻었다. 이상등액을 105,000 g에서 1 시간원심분리하여 cytosolic fraction 을얻었다. 그침전물에동일한양의 0.1 M potassium phosphate buffer를가하여현탁시켜 microsomal fraction을얻었다. microsomal fraction에서 glutathione 의함량과 MDA 의함량을측정하였고, cytosolic fraction을이용하 여 SOD 활성도를측정하였으며, mitochondrial fraction에서 catalase의활성을측정하였다. (2) SOD activity 간과심장, 비장, 폐, 신장및뇌조직의 SOD 활성도는 cytosilic fraction을 sample 로하여 SOD assay kit(dojindo, Japan) 을이용하여측정하였다. Sample solution 을 96 well plate에각 well과 blank 2에 20μl씩분주한다. Blank 1과 blank 3에 D.W. 를분주한뒤, WST working solution을 200μl /well으로모든 well에첨가한다. Blank 2과 blank 3 well 에 dilution buffer를 20μl씩분주하고, enzyme working solution을각 sample well과 blank 1에 20μl /well 으로분주한다. 20분동안 37 에서 incubating을실시하고 450nm에서흡광도를측정하고 SOD 활성도를환산하였다. (3) Glutathione assay 간과심장, 비장, 폐, 신장및뇌조직내 glutathione 함량은 glutathione assay kit(dojindo, Japan) 를이용하여 405 nm에서흡광도를측정해서결과를얻었다.
손덕칭외사상체질의학회지 2008;20(2):98-110 101 (4) Catalase activity 간조직의 catalase 활성은 catalase assay kit(oxford Biomedical Research, USA) 를이용하여측정하였으며, 520 nm에서흡광도를측정하여계산하였다. (5) Lipid peroxidation assay 간조직의 lipid peroxidation 함량은 lipid peroxidation assay kit(oxford Biomedical Research. USA) 을이용하여측정하였고 586 nm에서흡광도를측정한후 MDA를계산하였다. 3) Histology 분석뇌조직을취하여 cryotome 을이용하여절편한후, hematoxylin and eosin염색을하고, 200배율로현미경에서관찰을하였으며, 사진촬영을실시 하였다. 4) 통계처리실험결과는평균 ± 표준편차로표시하였으며, SPSS 통계프로그램 (14.0 KO) 의일원분산배치 (ANO VA) 통계법을사용하여유의성을검증하였다. 각실험군의결과값을비교하여신뢰도 95% 이상 (p<0.05) 일때유의수준으로판정하였다. Ⅲ. 硏究結果 1. 장기에서의항산화효과 1) 간실험동물의간조직에서 SOD 활성, GSH 농도, Table 2. Effect of SYG on Various Antioxidants and Oxidants in Rat Liver Para meter Age Normal Saline SYG SOD activity (%) 91.65±8.85 95.59±5.99 100.24±9.47 105.72±7.49 98.19±6.22 88.34±6.57 102.8±4.58 88.01±8.58 110.10±12.42 92.22±4.70 85.61±11.39 87.68±2.01 84.46±9.68 116.82±6.61 93.72±1.25 GSH Conc. (umol/l) 141.89±10.73 128.79±6.88 102.57±4.24 60.10±14.87 67.21±11.00 133.43±3.11 124.31±14.21 125.10±4.70 34.71±1.92 70.72±7.10 152.68±0.55 150.05±9.73 123.66±10.61 39.91±4.04 80.53±30.05 Catalase activity (%) 164.77±0.08 164.81±0.23 164.71±0.70 165.54±2.62 158.53±1.39 164.87±0.15 164.81±0.35 164.40±0.70 166.32±1.05 145.23±2.62 164.81±0.31 164.61±0.53 164.00±0.96 168.36±1.01 168.01±3.00 MDA Conc. (umol/l) 0.37±0.01 0.36±0.01 0.37±0.01 0.90±0.18 1.90±0.24 0.37±0.01 0.39±0.01 0.39±0.01 0.95±0.11 1.63±0.12 0.38±0.01 0.38±0.01 0.38±0.01 0.27±0.01 0.58±0.09 Rats in the saline group and SYG group were treated with saline and SYG decoction respectively, once a day for 4 weeks. The animals were decapitated 24 hr after the last administration of saline or SYG decoction. Liver was removed and the levels of various oxidants and antioxidants in liver tissue were analysed by ELISA. Values represent mean±sd (n=3) Normal : normal SD rat Saline : SD rat treated with saline daily for 4 weeks SYG : SD rat orally administerd with SYG decoction daily for 4 weeks
102 사상체질의학회지 2008;20(2):98-110 손덕칭외 Table 3. Effect of SYG on SOD Activity and GSH Conc. in Rat Heart Para meter Age Normal Saline SYG SOD activity (%) 97.74±4.92 94.38±0.34 95.44±9.97 113.28±1.60 109.79±2.73 93.22±4.23 77.83±5.61 84.08±8.38 119.71±4.23 104.25±4.98 82.35±11.31 78.75±5.87 85.59±3.72 112.93±8.81 95.70±9.97 GSH Conc. (umol/l) 158.92±2.64 169.23±3.57 118.03±30.49 52.05±14.05 73.56±11.65 183.54±6.91 165.52±3.51 162.59±21.15 49.66±12.13 52.11±22.77 161.86±11.11 186.40±0.50 143.00±7.73 46.32±7.97 71.20±16.95 Rats in the saline group and SYG group were treated with saline and SYG decoction respectively, once a day for 4 weeks. The animals were decapitated 24 hr after the last administration of saline or SYG decoction. Rat heart was removed, and SOD and GSH concentration in heart tissue was measured. Values represent mean±sd (n=3). Normal : normal SD rat Saline : SD rat treated with saline daily for 4 weeks SYG : SD rat orally administerd with SYG decoction daily for 4 weeks Table 4. Effect of SYG on SOD Activity and GSH Conc. in Rat Spleen Para meter Age Normal Saline SYG SOD Activity (%) 84.71±8.76 107.81±4.03 114.05±6.63 94.34±9.29 82.42±12.91 91.73±7.66 110.00±4.19 103.63±12.33 85.37±14.09 84.48±1.67 93.30±9.11 99.42±2.71 113.05±4.19 118.76±7.34 70.04±12.25 GSH Conc. (umol/l) 138.30±32.07 117.53±22.14 84.13±11.50 46.20±0.69 63.73±4.85 118.55±21.23 90.55±16.64 77.30±6.91 54.97±23.48 72.61±3.82 114.44±6.59 99.99±16.49 62.56±5.81 88.86±3.21 67.44±2.64 Rats in the saline group and SYG group were treated with saline and SYG decoction respectively, once a day for 4 weeks. The animals were decapitated 24 hr after the last administration of saline or SYG decoction. Rat spleen was removed, and SOD and GSH concentration in spleen tissue was measured. Values represent mean ± SD (n=3). Normal : normal SD rat Saline : SD rat treated with saline daily for 4 weeks SYG : SD rat orally administerd with SYG decoction daily for 4 weeks Catalase 활성및 MDA 농도를확인하였다 (Table 2). 2) 심장실험동물의심장조직에서 SOD 활성과 GSH 농도를확인하였다 (Table 3). 3) 비장실험동물의비장조직에서 SOD 활성과 GSH 농도를확인하였다 (Table 4). 4) 폐실험동물의폐조직에서 SOD 활성과 GSH
손덕칭외사상체질의학회지 2008;20(2):98-110 103 Table 5. Effect of SYG on SOD Activity and GSH Conc. in Rat Lung Para meter Age Normal Saline SYG SOD activity (%) 94.22±6.18 103.90±6.38 106.91±4.72 134.24±1.64 106.05±6.27 107.00±2.82 94.05±3.00 97.11±8.89 110.74±5.58 100.17±11.75 103.58±3.17 97.23±2.17 108.14±3.36 98.09±9.67 101.41±1.27 GSH Conc. (umol/l) 117.46±15.08 86.96±23.78 68.38±8.02 38.53±15.96 19.46±2.97 89.63±7.23 121.81±9.45 97.45±13.43 125.91±13.71 26.29±11.47 96.68±3.16 112.24±5.19 70.39±10.00 108.69±23.70 63.04±9.14 Rats in the saline group and SYG group were treated with saline and SYG decoction respectively, once a day for 4 weeks. The animals were decapitated 24 hr after the last administration of saline or SYG decoction. Rat lung was removed, and SOD and GSH concentration in lung tissue was measured. Values represent mean ± SD (n=3). Normal : normal SD rat Saline : SD rat treated with saline daily for 4 weeks SYG : SD rat orally administerd with SYG decoction daily for 4 weeks. Table 6. Effect of SYG on SOD Activity and GSH Conc. in Rat Kidney Para meter Age Normal Saline SYG SOD activity (%) 108.14±1.34 96.78±0.77 101.18±2.83 69.75±16.61 80.83±8.21 105.33±1.76 103.74±2.98 95.23±4.92 95.19±8.27 71.89±8.18 106.87±2.42 102.93±2.54 100.89±3.70 89.39±19.30 83.02±2.85 GSH Conc. (umol/l) 84.52±0.97 138.68±5.53 91.03±15.65 238.52±1.62 82.79±29.24 102.83±5.20 115.79±8.82 127.97±15.96 135.06±26.55 78.16±9.29 98.93±2.19 122.13±10.10 99.64±11.19 123.13±57.95 65.53±6.47 Rats in the saline group and SYG group were treated with saline and SYG decoction respectively, once a day for 4 weeks. The animals were decapitated 24 hr after the last administration of saline or SYG decoction. Rat kidneys were removed, and SOD and GSH concentration in kidney tissue was measured. Values represent mean ± SD (n=3). Normal : normal SD rat Saline : SD rat treated with saline daily for 4 weeks SYG : SD rat orally administerd with SYG decoction daily for 4 weeks 농도를확인하였다 (Table 5). 5) 신장실험동물의신장조직에서 SOD 활성과 GSH 농도를확인하였다 (Table 6). 6) 뇌실험동물의뇌조직에서 SOD 활성과 GSH 농도를확인하였다 (Table 7).
104 사상체질의학회지 2008;20(2):98-110 손덕칭외 Table 7. Effect of SYG on SOD Activity and GSH Conc. in Rat Brain Para meter Age Normal Saline SYG SOD activity (%) GSH Conc. (umol/l) 113.80±0.87 127.76±2.51 121.15±2.30 119.78±17.15 112.67±1.37 69.57±7.59 94.56±8.90 60.80±8.01 99.21±15.61 26.90±6.22 110.82±3.47 122.23±3.47 115.95±1.22 120.84±14.50 115.04±2.48 70.01±8.03 112.59±13.74 69.11±3.31 41.61±1.59 27.93±4.07 116.11±1.62 123.05±0.89 120.82±2.16 112.36±12.84 99.26±5.24 67.44±7.38 106.07±20.24 73.27±3.48 64.70±13.11 55.32±13.82 Rats in the saline group and SYG group were treated with saline and SYG decoction respectively, once a day for 4 weeks. The animals were decapitated 24 hr after the last administration of saline or SYG decoction. Rat brain was removed, and SOD and GSH concentration in brain tissue was measured. Values represent mean ± SD (n=3). Normal : normal SD rat Saline : SD rat treated with saline daily for 4 weeks SYG : SD rat orally administerd with SYG decoction daily for 4 weeks Fig. 1. Effect of SYG on rat brain histology. Rats in the saline group and SYG group were treated with saline and GHD decoction respectively, once a day for 4 weeks. The animals were decapitated 24 hr after the last administration of saline or SYG decoction. Rat brain was removed and the tissue was stained as described in the experimental methods(optical microscope, 40). 2. 조직학적분석 실험동물의뇌조직을취하여 H&E 염색을하였다. 주령이증가할수록대뇌피질의아래쪽과립 층이거칠고성긴상태를나타내었다. 실험군에서는대조군에비하여뇌조직의상태가조밀하게유지되었다 (Fig. 1).
손덕칭외사상체질의학회지 2008;20(2):98-110 105 Ⅳ. 考察 최근우리나라는급격한경제성장과함께의료및보건기술의발전으로국민영양상태가크게개선되어인간의평균수명이계속증가되고있는추세이다 9. UN에따르면총인구에서 65세이상고령인구비율이 7% 를넘으면고령화사회 (aging society), 14% 를넘으면고령사회 (aged society) 로분리된다. 우리나라는고령인구비율이 2000년에 7.2% 에이르러이미고령화사회가되었고, 2018년에는그비율이 14.3% 가되어 고령사회 로, 2026년에는다시 20.8% 가되어 초고령사회 에도달할것으로예측되고있다 1. 고령사회로접어들면필연적으로여러가지만성퇴행성질환과난치성질환자가급증하므로 9,10 노화나이들질환의예방과치료에대한대책이필요하다. 노화는시간이경과함에따라생체내여러가지생리적기능이저하되는현상을말하며아울러외부로부터오는스트레스를감당하지못하게되는상태를의미한다 11. 한의학에서는 ꡔ 素問 上古天眞論 ꡕ 14 에남녀의나이를먹음에따라腎氣와生殖能力의盛衰에따라노화가진행되고사람의외모및動態가바뀌는것을설명하였고, ꡔ 靈樞 榮衛生會篇 ꡕ 3 에서는노화로인하여氣血의衰退로肌肉이점차약해진다고하였다. 이는사람이성장하면서절로腎氣가盛하고天癸가至하였다가늙으면서腎氣가衰하고天癸가竭하여누구나일정나이가되면노화되어죽는다는것과연령이증가하면서氣血이衰하고任衝脈이虛해져퇴행적인쇠퇴가일어난다는노화의두가지측면을설명한것이라할수있다. 또한 ꡔ 素問 上古天眞論 ꡕ 14 에養生에따라至人, 眞人, 賢人, 聖人으로구별하여生生不息하는이상향을論하기도하여노화를극복하고수명을연장하려는노력을보이기도하였다. 李濟馬는ꡔ 東醫壽世保元 ꡕ 5 에서 四十九歲至六十四歲曰老 라하여 50대에들어노인의단계로접어든다고하였으며 ꡔ 東醫壽世保元四象草藁 ꡕ 病變 第二統 15 에서 太陽人肝臟十 分圖全而與肺相敵者極完境人也, 一半虧缺而與肺讓倍者極壞境人也過此則死, 以此推之太陽人肝臟部一半爲命脈實數他臟倣此 라하여생명을유지하는偏小之臟의기운의정도를命脈實數라정의하고이命脈實數가반이하가되면죽는다고하여질병과건강의상태뿐아니라수명까지도命脈實數에따라달라질수있다고설명하였다. 최근한의학계에서도노화에대한文獻硏究 16-20 및抗酸化效能에관한實驗硏究보고 21-23 가있었다. 그중노화의原因으로가장중요시되는腎虛를보할목적으로이루어진方劑인六味地黃湯 16, 瓊玉膏 17,18, 延年益壽不虎丹 19, 鹿參地黃湯 20 등의抗老化에대한연구보고가있었으며, 拘杞子 21, 兎絲子 22, 覆盆子 23 등의抗酸化能에관한연구보고가있었다. 그러나아직노화된백서의각장기에있어서十二味寬中湯의항산화및항노화에관한구체적인연구는없는실정이다. 이에저자는十二味寬中湯의抗老化효과를활성산소의산화능을억제하는抗酸化효과를통하여간접적으로입증하고자 6주령, 18주령, 36주령, 48주령및 64주령백서에 4주간매일 1% 의十二味寬中湯 200 μl를경구투여한후, 실험이종료된 10주령, 22주령, 40주령, 52주령및 68주령백서의각장기조직을분획, 항산화효소인 SOD 및 catalase 활성도, 항산화물질인 glutathione의함량및산화적손상물인 MDA 함량변화를측정하였다. SD rat은출생후약 8주까지는체중이급속도로증가하고약 16주령까지는체중증가정도가급속도로둔화되며그이후 32주까지는미미한정도의체중증가만이나타난다는관찰을토대로장 24 등은평균 7주령까지를성장기군으로나누고 28주까지를성숙기로분류하여흰쥐에서연령이골격근의당대사에미치는영향에대한연구를수행하였으며, 박 25 등의한약물의치매치료에관한실험적연구에서도쥐의연령이 12개월 ( 약 54 주 ) 이상이되면서여러감각운동기능이저하된다는 Murphy 26 등의연구를기초로이시기가 SD
106 사상체질의학회지 2008;20(2):98-110 손덕칭외 rat의노화기에해당한다고판단하였다. 따라서본연구에서는실험용 SD rat을 6주령, 18주령, 36주령, 48주령및 64주령으로구분하여성장기, 성숙기, 초기노화기, 노화기, 말기노화기로설정하고연구를진행하였다. 노화의발생은체내산화적손상을일으키는활성산소종과관련되어있는것으로밝혀지고있는데 12,13 활성산소종은화학물질뿐만아니라정상적인신체대사과정중에생성된한개이상의비공유전자를가진불안정한상태의이온으로체내항산화체계는이러한활성산소종의공격으로부터신체를보호하기위한것으로라디칼연쇄반응을정지시켜라디칼의반응성을제거한다. 체내항산화체계와관련된주요효소로는 superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSHpx), catalase (CAT) 등이있으며주요비효소물질로는 glutathione, tocopherols, carotenoids, ascorbic acid 등이있다 27. SOD는활성산소를기질로하여과산화수소와산소를만드는효소이다. 반응성이큰활성산소는일단 SOD에의해과산화수소가된후 catalase에의해물로되어무독화된다. 본실험에서간조직내 SOD 활성도는정상군및대조군에서주령증가에따른유의성은없었다. 실험군은 52주령에서는 SOD 활성도가증가되었다가, 68주령에서는다시 SOD 활성도가감소되었다. 十二味寬中湯의투여에따른간장내 SOD 활성도는통계적으로유의한변화를보이지않았다. 조직에서 glutathione 은자체적으로항산화제로이용되거나또는다른항산화제의환원상태유지에관여하고또한 GSHpx와같은항산화효소의 cofactor로작용하여, 조직내에서수용성항산화방어체계의근간을이루는중요한물질이라할수있다 28. 본실험에서항산화물질인산화형 GSH 농도는정상군, 대조군, 실험군모두 10주령에비해 52 주령에서농도가현저히감소되었다. 十二味寬中湯의투여에따른肝臟내 GSH 농도는초기노화상태로설정한 40주령의실험군에서정상군에비 하여유의적으로증가되었다. 과산화수소및유기과산화물을물로무독화시킴으로써과산화적손상을방지하는 catalase 활성도는정상군및대조군모두 10주령, 22주령및 40 주령에비해 68주령에서농도가현저히감소되었다. 실험군에서는주령에따른 catalase 활성의변화가없었다. 十二味寬中湯의투여에따른肝臟내 catalase 활성은말기노화기로설정한 68주령의실험군에서정상군및대조군에비하여유의적으로증가되었다. 생체내지질성분특히세포막성분인불포화지방산이과산화를받아생성된물질및분해이차산물을과산화지질이라한다. 불포화지방산의변형이일어나면막의유동성이변화되고막결합효소가불활성화되어생체막기능이소실되고세포의구조적, 기능적장해를일으켜신체에다양한변화를초래하게된다. 간조직내 MDA 함량은정상군, 대조군및실험군에서노화기이후인 52 주령과 68주령에서 MDA 농도가유의하게증가되었으나, 실험군은증가의정도가정상군및대조군에비하여완만하였다. 52주령및 68주령의실험군에서는 MDA 농도가정상군및대조군에비하여유의적으로감소되었다. 十二味寬中湯의프리라디칼소거효과와지질과산화억제효과는약제중 galangin 등 29 의성분들이 hydroxyl 및 peroxy radical 들을소거하고, Fe이온들을빼앗아 fenton reaction 을억제하는것으로판단되나향후기전에대한연구가필요할것으로사료된다. 심장조직에서는정상군, 대조군및실험군모두 52주령에서 SOD 활성이유의적으로증가되었으나심장내 SOD 활성의유의적인차이는없었다. 심장내 GSH 농도는정상군, 대조군및실험군모두주령의증가에따라감소되었다. 22주령의실험군의경우정상군및대조군에비하여 GSH 농도가유의적으로증가되었다. 비장의경우, 정상군에서초기노화기인 40주령까지 SOD 활성이증가되었으나이후감소되었으며, 실험군에서는 52주령까지 SOD 활성이증가되었으나 68주령에는유의적으로감소되었다.
손덕칭외사상체질의학회지 2008;20(2):98-110 107 十二味寬中湯투여에따른비장내 SOD 활성도변화는나타나지않았다. 정상군, 대조군, 실험군모두주령이증가함에따라비장내 GSH 농도가감소되었으나, 52주령에서는실험군에서의 GSH 농도가정상군및대조군에비하여유의적으로증가되었다. 폐조직내 SOD 농도는주령의증가나十二味寬中湯의투여에따른통계적으로유의적인차이는없었다. 폐내 GSH 농도는정상군의경우주령의증가에따라감소되었으며폐내 GSH 농도는 52주령에서정상군에비하여유의적으로증가되었고, 68주령에서는정상군및대조군에비하여유의적으로증가되었다. 신장조직의주령의증가에따른 SOD 활성은정상군및대조군모두 10주령에비하여 68주령에서유의적으로감소되었으나, 실험군의경우주령에따른 SOD 활성의유의적인차이는없었다. 그러나 22주령의실험군에서의 SOD 농도는정상군에비하여유의적으로감소되었다. 정상군의신장내 GSH 농도는주령에따른기복이심하였으나, 실험군의경우주령증가에따른 GSH 농도의유의적인차이는없었다. 10주령의실험군의경우정상군에비하여신장내 glutathione 농도가유의하게증가되었으나, 52주령의실험군에서는정상군에비하여유의하게감소되었다. 뇌조직내 SOD 활성은정상군및대조군의경우주령의증가에따른유의적인차이가없었으나, 실험군의경우 68주령에서정상군및대조군에비하여유의적으로감소되었다. 十二味寬中湯투여에따른뇌조직내 GSH 농도는 68주령에서정상군및대조군보다유의적으로증가되었다. 실험결과 SOD 활성도및 GSH 농도의주령에따른변화는각장기마다차이가있었으며, 정상군의경우비장및신장조직에서 52주령때 SOD 활성도가감소되었으나, 실험군은유의적인변화가없었다. SOD의활성이변화가없는것은十二味寬中湯이조직에서 free radical 생성의감소로인한세포막의산화적손상이억제되므로서이들효소활성의최적조건을유지시켜주기때문인것으로사료되어진다. 또한, 十二味寬中湯을투 여한백서의간, 심, 비장, 폐및뇌조직의 GSH 농도가각각 40주령, 22주령, 52주령, 52와 62주령및 68주령에서정상군에비해유의적으로증가됨으로써, 十二味寬中湯의항산화효과를확인할수있었다. 이와같이간, 심, 비, 폐, 신, 뇌등에서나타난 GSH 활성화로인해補脾和胃溫中시키는十二味寬中湯이전신각조직의항산화물질을증가시키고, 稟賦한眞氣의不足을補하여少陰人노화에활용할수있을것으로사료된다. 十二味寬中湯에이용된약제들의노화관련항산화효능에대한연구로조 30 는적하수오에탄올추출물에서 E-2, 3, 5, 4 -tetrahydroxystibene- 2-O-β -D-glucopyranoside, catechin을분리동정하여 DPPH free radical 소거활성이우수함을보고하였고, Rapta 등 31 은良薑의 galangin 성분이 low oxidation potential(1.5v) 를갖고있어지질과산화억제효과가강하다고보고하였다. 김등 32 은 CCl4-olive oil 을투여하여간독성을유발시킨쥐에서향부자의 BuOH 및 Water fraction의유의성있는지질과산화억제효과를보고하였다. 또한, 나 33 는백하수오성분중의하나로보고되어진 CynandioneA(Biacetophenone) 를사염화탄소로산화스트레스를가한쥐의간세포에처리시지질과산화물의형성을저해함으로서사염화탄소에의한간손상보호효과와라디칼소거능이보고된바있다. 한편, 사염화탄소로간독성을유발한쥐에백하수오추출물과적하수오추출물을각각투여시손상된간기능의회복효과를볼수있었으며여기서간독성완화효과는백화수오가더효과적이라고보고되기도하였다 34. 郭 35 은肝과赤血球의抗酸化酵素에대한實驗에있어서도首烏延壽丹투여군은적혈구에서의항산화효소인 SOD, GSH-px 활성이대조군에비하여유의성있는증가를나타내었으며, 간에서도항산화효소인 SOD, GSH활성이대조군에비하여유의성있는증가를나타내었다고보고하였다. 그러므로首烏延壽丹과이처방의君藥인赤何首烏가활성산소의생성과노화물질의축적을막아노화억제에유효한것으로추정되어, 노화예방을위한중요한방법으로제시
108 사상체질의학회지 2008;20(2):98-110 손덕칭외 될수있음을확인하였다. 그러나기존의실험들이노화병태모델에있어같은환경에서여러주령의실험군에대하여전반적인체중이나각장부조직의抗酸化효소활성변화를관찰한것이아니라특정장부에대한세포수준의연구였음을감안하면다른실험들과본실험에활용된약물을비교하여약물의유의성을판단하기는어렵다고사료된다. 또한본연구에서약물의항산화와관련된항노화효과를입증하고자 6주령, 18주령, 36주령, 48주령및 64 주령백서를성장기, 성숙기, 초기노화기, 노화기및말기노화기로설정하고실험한것은일정부분가치가있을것으로사료된다. 노화에따른실험동물뇌의조직학적구조의변성과十二味寬中湯의뇌세포에대한항노화효과를알아보기위하여, 실험동물의뇌조직을취하여신경세포가모여있는뇌의회백질부분을확인하였다. 주령이증가할수록대뇌피질의아래쪽과립층이거칠고성긴상태를나타내었다. 실험군에서는대조군에비하여뇌조직의상태가조밀하게유지되었다 (Fig. 1). 이상과같이 6주령, 18주령, 36주령, 48주령및 64주령의백서를성장기, 성숙기, 초기노화기, 노화기및말기노화기로설정하여 4주간매일 1% 의十二味寬中湯 200 μl를경구투여한결과 52 주령초기노화백서의체중증가를지연시켰으며간, 심장, 비장, 폐, 신장, 뇌조직의 SOD 활성과 GSH 농도및간조직의 catalase 활성, MDA 함량을측정한결과간조직의 SOD가 52주령에서활성화되었고, 간조직의 GSH는 40주령, 심조직의 GSH는 22주령, 비조직의 GSH는 52주령, 폐조직의 GSH 는 52 및 68주령, 신조직의 GSH는 10주령, 뇌조직의 GSH는 68주령에서농도가증가되었다. 또한 68주령에서간조직의 catalase 활성을증가시키고, 52주령및 68주령에서지질과산화물인 MDA의농도를감소시키는등항산화효과가있는것으로나타났다. Ⅴ. 結論 十二味寬中湯의抗老化및抗酸化작용을실험적으로살펴보고자 6주령, 18주령, 36주령, 48주령및 64주령백서를성장기, 성숙기, 초기노화기, 노화기및말기노화기로설정하여 4주간매일 1% 의十二味寬中湯 200 μl를경구투여한후체중증가를측정하였고, 肝, 心, 脾, 肺, 腎藏과腦조직에서 SOD 활성, GSH 농도및간조직에서 catalase 활성, MDA 의함량변화를측정한결과다음과같은결론을얻었다. 1. 간조직에서十二味寬中湯은 SOD 활성을 52 주령백서에서 10주령, 22주령및 40주령에비해유의하게증가시켰고, glutatione 농도를 40주령백서에서정상군에비해유의하게증가시켰으며, catalase 활성을 68주령백서에서정상군및대조군에비해유의하게증가시켰고, MDA 농도를 52 주령및 68주령백서에서정상및대조군에비해유의하게감소시켰다. 2. 심장조직에서十二味寬中湯은 glutatione 농도를 22주령백서에서정상군및대조군에비해유의하게증가시켰다. 3. 비장조직에서十二味寬中湯은 glutathione 농도를 52주령백서에서정상군및대조군에비해유의하게증가시켰다. 4. 폐조직에서十二味寬中湯은 glutathione 농도를 52주령백서에서는정상군에비해유의하게증가시켰고, 68주령에서는정상군및대조군에비해유의하게증가시켰다. 5. 신장조직에서十二味寬中湯은 glutathione 농도를 10주령백서에서는정상군에비해유의하게증가시켰다. 6. 뇌조직에서十二味寬中湯은 glutathione 농도를 68주령백서에서정상군및대조군에비하여유의하게증가시켰다. 7. 十二味寬中湯은주령에따른백서대뇌과립층의조직학적퇴행을억제시켰다.
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