합성 및 주문

Custom ligonucleotides 목차 취급및보관 Q. Fluorescent dye modified 올리고는어떻게보관해야하나요? Q. 올리고는어떻게용해시키나요? Q. 올리고용액을상온에서일주일이상방치했는데괜찮을까요? 정량및농도 Q. 올리고의.D. 값은무엇을의미하나요? Q. 합성올리고의양을.D. 값으로부터어떻게얻어내나요 Q. 다음올리고 (3G, 4C, 5A, 6T / GGGCCCCAAAAATTTTTT) 18mer 의전체.D. 값이 0.7 이었다면올리고의양은얼마나되나요? Q. 합성올리고의농도맞추는방법에대한설명 Q. 50 nmoles scale 로주문했는데합성량이그보다적은이유는? Q. 긴올리고는 Base Composition 을몰라정량하기가어려운데대략적으로알수는없을까요? Q. Molarity 와 mole 의단위변환. Q. 합성올리고의분자량 (Molecular Weight) 측정은어떻게하나요? Q. 합성 Scale 의 umole 단위를 ng 단위로변환하는방법은어떻게되나요? Q. 합성올리고의 Tm 값은어떻게계산하나요? Q. 본인이제작한올리고의 Tm 값과바이오니아에서제공한 Tm 값이차이가나는이유는무엇인가요? Q. Degenerated primer 와 universal primer 의정의에대해알고싶습니다 Modified ligo Q. Modified ligo 의종류와구조를알고싶습니다. 합성방법 Q. 합성된올리고에는 5 또는 3 위치에 phosphate 가붙어있습니까? Q. G 가여러개반복되는올리고를합성할수있을까요? Q. RA 합성도가능한가요? Q. 올리고는어떻게합성되는지알고싶습니다. Q. Standard ligo structure 1

Custom ligonucleotides 취급및보관 Q. 올리고는어떻게보관하며얼마나오래가나요 일반적으로올리고는 20 에서 1 년이상안정합니다. 특히건조한상태에서는매우안정적이며오래보관하실수있습니다. 용액상태에서도안정하지만 nuclease 등의 contamination 에의해 degradation 될수있습니다. 또한올리고는 얼렸다녹였다 를반복하게되면분해를촉진시켜품질의이상이발생될수있으므로합성올리고는받으신후에여러개로분주하여각각을보관하신뒤필요량만큼따로사용하시는것이바람직하며, 용액상태로보관할때에는멸균증류수에녹이는것보다 TE (10mM Tri-HCl (ph8.0), 0.1mM EDTA) Buffer 에녹여두시면더오래보관할수있습니다. DA 의경우는 acidic 한조건에서는 depurination 에의해 decompose 될수있으니 ph 를낮추지말아야하며 RA 의 경우는높은 ph 에서는 hydrolysis 에의해 phosphodiester bond 가깨질수있으니주의를요합니다. ligo 형상및보관방법에따른 Shelf life Storage Condition Shelf Life (Month) at RT in water 2 at 4 in water 9 at -20 in water 18 at -20 (Dry) 24 Q. Fluorescent dye modified 올리고는어떻게보관해야하나요? 빛에노출되면형광이약해질수있으므로빛이차단된용기에보관하시고저장하는장소는빛이들어오지않는장소가좋습니다. Preferred TE Buffer for Reconstitution & Storage ph for Fluorescent Probes 6-FAM, HEX, TET, RX, and TAMRA TE Buffer ph 7.5 or 8.0 Cy3, Cy3.5, Cy5, and Cy5.5 TE Buffer ph 7.0 or 7.5 Cy dyes rapidly degrade in acidic ph 2

Custom ligonucleotides Q. 올리고는어떻게용해시키나요? ligo 는일반적으로 Dry 된형태로공급됩니다. Dry 된올리고는 Aqueous solution 에잘녹지만간혹잘녹지않는경우가있습니다. 그럴때는 60~70 water bath 에 10~15 분간 incubation 시킨후 vortex 하여 centrifuge 하거나약간의 ah 용액을넣어주면더잘용해되기도합니다. 용액상태로보관할때에는멸균증류수에녹이는것보다 TE (10mM Tri-HCl (ph8.0), 0.1mM EDTA) Buffer 에녹이면더오래 보관할수있습니다. Q. 올리고용액을상온에서일주일이상방치했는데괜찮을까요? Contamination 만되지않았다면큰문제는없습니다. 3

Custom ligonucleotides 정량및농도 Q. 올리고의.D. 값은무엇을의미하나요? 합성올리고는매우미량이라어느정도의양이있는지무게를재서알아내기매우힘듭니다. 따라서올리고의빛의 흡광도를측정하여간접적으로정량을하게되는데이때빛의흡수량을.D. (ptical density) 값으로표시합니다 Q. 합성올리고의양을.D. 값으로부터어떻게얻어내나요? 합성올리고를파장 260nm 의 UV Light 에서.D. 값을측정한뒤다음과같은수식을이용하여합성된올리고의양을 얻어냅니다..D. = εc 수식에서 ε(extinction Coefficient) 은물질이빛을흡수하는정도를나타내는상수로물질에따라고유한값을가지며 C 는 올리고의농도를의미한다. 올리고의 ε 값과.D. 값을알고있다면수식에적용하여용액의 Concentration, 즉올리고의 양을알수있게된다. 올리고의 ε 값은 260nm UV Lighte 에서각 base 의 Extinction Coefficient 값의 ( 표 1) 합으로계산하는방법과 base 간의 sequence 간섭에의한차이를고려한 Extinction Coefficient 값의 ( 표 2) 합으로계산하는방법이있습니다. [Unit : L/mole.cm] ( 표1) da 15400 dc 7400 dg 11500 dt 8700 ( 표2) 5' -> 3' da dc dg dt da 27,400 21,200 25,000 22,800 dc 21,200 14,600 18,000 15,200 dg 25,200 17,600 21,600 20,000 dt 23,400 16,200 19,000 16,800 따라서전체올리고의 Extinction Coefficient 값은계산방식에따라차이가발생하게됩니다 4

Custom ligonucleotides Q. 다음올리고 (3G, 4C, 5A, 6T / GGGCCCCAAAAATTTTTT) 18mer 의전체.D. 값이 0.7 이었다면올리고의양은얼마나되나요? 올리고의양은흡광계수 (Extinction Coefficient) 를구하는방법에따라다음과같이계산됩니다. ( 표 1) 에의한흡광계수 (Extinction Coefficient) = G 의염기개수 * 11500 + C 의염기개수 * 7400 + A 의염기개수 * 15400 + T 의염기개수 * 8700 = 11500 x 3 + 7400 x 4 + 15400 x 5 + 8700 x 6 = 185900(L/mole)=185.900 (L/mmole) 따라서.D. = εc 에대입하여계산하면 C = 0.7 /185.9 = 0.003765 (mmole/l) = 3.76 (nmole/ul) 이된다. ( 표 2) 에의한흡광계수 (Extinction Coefficient) = (GG + GG + GC + CC + CC + CC + CA + AA + AA + AA + AA + AT + TT + TT + TT + TT + TT) - (G + G + C + C + C + C + A + A + A + A + A + T + T + T + T + T) = (21600 + 21600 + 17600 + 14600 + 14600 + 14600 + 21200 + 27400 + 27400 + 27400 + 27400 + 22800 + 16800 + 16800 + 16800 + 16800 + 16800) - (11500 + 11500 + 7400 + 7400 + 7400 + 7400 + 15400 + 15400 + 15400 + 15400 + 15400 + 8700 + 8700 + 8700 + 8700 + 8700) = (342200) - (173100) = 169100(L/mole)=169.100 (L/mmole) 따라서.D. = εc 에대입하여계산하면 C = 0.7 /169.1 = 0.004139562 (mole/l) = 4.14 (nmole/ul) 가된다. 자사에서는 ( 표 2) 에의한방법을도입하여적용하고있으며, 이결과는 ligo Synthesis Report 상의 'Total nmole' 수치로 나타납니다. 5

Custom ligonucleotides Q. 합성올리고의농도맞추는방법에대한설명. 우선올리고합성시트에쓰여있는 'volume for 100 pmole/ul' 라는말은 100 pmole/ul 의농도로만들기위해첨가해야할 TE buffer 나 D.W 의양을이야기합니다. 받으신리포트용지에각각 189.0 과 209.2 라고적혔다면, oligo tube 에 D.W or TE-Buffer 를 189.0 ul 와 209.2 ul 를각각첨가했을때농도가 100 pmole/ul 가된다는것입니다. 즉, 각 tube 에는 oligo 가 189.0 ul x 100 pmole/ul = 18,900 pmole = 18.9 nmole, 209.2 ul x 100 pmole/ul = 20,920 pmole = 20.92 nmole 씩들어있습니다. 사용하시는목적에따라 primer 의농도를알맞게설정하여야하지만, 일반적으로 PCR 이나 sequencing 의경우 100 pmole/ul 정도의농도로사용하실때편리하기에본사에서제공하는 sheet 에는농도를 100 pmole/ul 로만들기위한 volume 을제공하는것입니다. Q. 50 nmoles scale 로주문했는데합성량이그보다적은이유는? 50 nmole scale 합성은최종올리고의양이 50 nmole 이된다는것이아니라합성출발물질의양을 50 nmole 로하여 합성을시작한다는것을의미합니다. 따라서합성및정제된최종올리고의양은올리고의길이, 합성효율 (coupling efficiency, 보통 >98%), 염기조성등에따라변하게됩니다. Q. 긴올리고는 Base Composition 을몰라정량하기가어려운데대략적으로알수는없을까요? 대략적으로 single strand DA 는 1.D 값이 ~33 ug 이며 double strand DA 는 ~50 ug 정도가됩니다. 하지만짧은길이의 올리고는차이가많이발생하기때문에계산을통하여정확한정량을하시는것이습니다. Q. Molarity 와 mole 의단위변환. ligomer 의기본농도는 M (mole/l) 이고, 경우에따라서그앞에붙는 u (micro), n (nano), p (pico) 등의첨자들은 M 을 보조하는단위들입니다. 이단위들은다른길이, 질량등의 unit 들과도함께사용되므로이에대해서는다음을참조하시기 바랍니다. 10-1 = deci[d],10 1 = deca[da] 10-2 = centi[c],10 2 = hecto[h] 6

Custom ligonucleotides 10-3 = milli[m],10 3 = kilo [k] 10-6 = micro [u],10 6 = mega [M] 10-9 = nano[n],10 9 = giga[g] 10-12 = pico[p],10 12 = tera[t] 10-15 = femto[f],10 15 = peta[p] ----------------------------------------- 1 pmole/ul = 1x10-12 mole / 1x10-6 L = 1x10-6 mole / L = 1 umole/ L = 1 um 이므로, um 과 pmole/ul 는같은단위가됩니다. Q. 합성올리고의분자량 (Molecular Weight) 측정은어떻게하나요? 다음의수식에각 base 의수를대입하여계산합니다. M.W. =(A x 249.2) + (C x 225.2) + (G x 265.2) + (T x 240.2) + (oligolength-1) x 63.98 + 2.02 A = Total number of A C = Total number of C G = Total number of G T = Total number of T 7

Custom ligonucleotides Q. 합성 Scale 의 umole 단위를 ng 단위로변환하는방법은어떻게되나요? 일반적으로올리고의합성 scale 은 umole 단위로신청되며합성된결과도보통 nmole 단위로 report 됩니다. 하지만, 사용하고자하실때 ng 또는 ug 단위로하신다면 mole 을 g 으로환산하시면됩니다. Report 에올리고의분자량이표시되기때문에쉽게바꿀수있습니다. 분자량 M.W (g) X mole 수 (nmole) = 올리고의양 (ng) Q. 합성올리고의 Tm 값은어떻게계산하나요? Tm (melting temperature) 는 oligonucleotide 중 50% 가 duplex 형태를이루고나머지 50% 는 single-strand 형태를지닐때의 온도를말하며, 이에영향을미치는 Factor 로는 oligonucleotide 의 sequence 와반응시 oligonucleotide 의농도, salt 농도 등이있습니다. Tm 계산방법은여러가지가있으나이중바이오니아에서는 nearest-neighbor 방법 (PAS 83, 3746-50) 을이용합니다. 바이오니아에서사용하는 earest neighbor 방법의가장큰특징은 base 간의 sequence 의서열에따라 Hybridization 에 미치는영향이다르다는것을감안하여예측하는방법으로 2 개의 base 간의 hybridization 효과를모두열역학적으로 측정하여이를통해 Tm 값을예측해내고있습니다. 일예로 5'-GC-3' 인 sequence 와 5'-CG-3' 의열역학적측정치는서로다릅니다. 이와같이 2base 간이룰수있는가능한조합을모두측정하여변수로사용하고있습니다. nearest-neighbor 방법의계산식은아래와같습니다. Enthalpy (dh) X 1000 Tm = -------------------------------- - 273.15 + (12.0 X log([salt])) Entropy(dS) + (R X ln([ligo])) 여기서계산되는 Enthalpy 값과 Entropy 값은위에서미리 2base 간에측정된열역학값을이용하여해당 oligonucleotide 의 sequence 에따라결정됩니다. 이때 Salt 는반응에참여하는 monovalent cation 의농도를말하며 ligo 는반응에들어가는 ligo 의농도를의미합니다. 8

Custom ligonucleotides R 은 Gas Constant (1.987 cal K-1mole-1) 를의미합니다. 당사의 Tm 값은이같은식에의거하여 Salt 농도는 50 mm, oligo 농도는 50nM 을기준으로계산됩니다. 이상과같은방법으로바이오니아는합성유전자의 Tm 값을예측하여고객님께제공하고있습니다. 하지만 Tm 값은예측치일뿐이지절대적인값은아닙니다. 특히실험자기 Template 를준비하는과정에서생기는여러가지불순물과 salt 들은위의식에의해예측할수없기때문에실험자는 Tm 값을참고자료로실험을수행하는것이좋으며, 실험결과가나오지않을경우해당 Tm 값보다 4-5 도낮은조건으로실험에이용하는것이좋습니다. 물론기준 Tm 값에서 on-specific product 가많은경우에는 annealing temperature 를높여가면서원하는정확한 product 를얻을수있는실험조건을찾아가야합니다. Q. 본인이제작한올리고의 Tm 값과바이오니아에서제공한 Tm 값이차이가나는이유는무엇인가요? 바이오니아에서사용하는 TM calculator 는일반적으로 A, G, C, T 의갯수에일정값을곱하기하는단순한계산방식과는 다른것으로서 A, G, C, T 의배열순서에따라 Tm 값은차이가나게됩니다. 즉, 한염기의뒤에오는 sequence 가무엇이냐에따라전체염기수는같아도 Tm 은다르게되며보다정밀하다고할수 있습니다. Q. Degenerated primer 와 universal primer 의정의에대해알고싶습니다. 예를들어, A 라는종 (species) 에서 a 라는 gene 의 sequence 가 5'-gga ttc ggg ccc gag tct-3' 이고, B 라는종에서는 5'-ggc ttc ggg ccc gaa tct-3' 이라고가정한다면또다른 C 라는종에서의 a 라는 gene 의 sequence 는 5'-gg(a/c) ttc ggg ccc ga(g/a) tct-3' 이라고예측할수있습니다. ( 즉, 3 번째염기는 adenine 이나 cytosine, 15 번째염기는 guanine 이나 adenine) 이와같은경우, 이유전자에해당하는 degenerate primer 는 5'-ggM ttc ggg ccc gar tct-3' 가됩니다. ( 보통아래처럼 약속하여표기합니다.) R <- a or g Y <- c or t M <- a or c K <- g or t S <- g or c 9

Custom ligonucleotides W <- a or t V <- a, c, or g H <- a, t, or c B <- g, t, or c D <- g, a, or t <- a, c, g, or t 즉, degenerated primer 는 sequence 상의유사성을고려하여유사한 sequence 에 binding 할수있도록하나의위치에 두가지이상의 base 가있는 primer 를말합니다. 위의경우에는두위치에각각두가지의 base 가선택될수있으므로모두 4 종류의 sequence 가섞여있는 primer 를 design 할수있습니다. cloning 작업에서많이사용되는 plasmid 들은대부분 pbr322 계열을기반으로하여 M13 bacteriophage 의 sequence 를 이용하여조금씩변형된것들입니다. 따라서, 대부분의 plasmid 들이공통된 sequence 를가지고있습니다. 예를들면, T7 promoter 나 SP6 promoter, T7 terminator, 혹은 M13 forward/reverse 등입니다. 이런공통된 sequence 에 binding 할수있도록 design 된것들이 universal primer 입니다. 보통 universal primer 를이용하여 vector 에삽입된 DA fragment 를 sequencing 합니다. 10

Custom ligonucleotides Modified ligo Q. Modified ligo 의종류와구조를알고싶습니다. 올리고의다양한응용을위해서는 modified 된올리고의사용이필요하며올리고를 modification 하기위해서는여러가지 방법이응용될수있으나가장간편한것은 phosphoramidite 방법을이용하여올리고합성기를통해올리고상에 label 을 부착하게됩니다. 올리고의 5 위치에 modification 이필요한경우는정해진염기배열의올리고합성이완료된후 label phosphoramidite 를 사용하여 5 위치에결합시킴으로써올리고의 5 위치에 label 이부착됩니다. 3 -Modification 의경우는 5 -modification 보다복잡해지는데일반적으로는 label 이미리부착된고형지지체로부터 올리고의합성을수행하여 3 위치에 label 이부착된올리고를합성할수있게됩니다. Deoxyuridine base 의 5 번탄소위치에 label 을도입한 phosphoramidite 를이용하면올리고합성시원하는 sequence 에 label 을도입할수있어결과적으로 internal modified 올리고의합성이가능하게됩니다. Modification oligo 종류와구조는당사홈페이지를참고하시기바랍니다. http://www.bioneer.co.kr/products/ligo/modified-ordering.aspx 11

Custom ligonucleotides 합성방법 Q. 합성된올리고에는 5 또는 3 위치에 phosphate 가붙어있습니까? 주문하실때별도로지시하지않으면 5 과 3 위치에는 H 기가붙어있습니다. 따라서 5 phosphate 가부착된올리고를 원하시면 5 phosphorylation modification 된올리고를주문하셔야합니다. Q. G 가여러개반복되는올리고를합성할수있을까요? G 가여러개반복되는올리고는합성에상당히어려움이있습니다. G 가 4 개이상반복되면 guanie tetraplex (Poon and MacGregor (198) Biopolymers 45:427-434) 형태로 aggregation 되기 싶기때문입니다. 이때는 Inosine 을몇개의 G 대신첨가하여 aggregation 을방지할수있습니다. 저희바이오니아는오랜합성경험을통해얻은기술로 10 연속 G 가포함된올리고도큰어려움없이합성해오고 있습니다. Q. RA 합성도가능한가요? 네, 가능합니다. 원래의 RA 구조와같이 2 -H 구조의 A, C, G, U 를원하시는 sequence 로합성하실수있습니다. 또한 2 --Methyl, 2 -F RA 합성도가능하며 DA 와 RA 가섞여있는 chimeric 올리고도가능합니다. Q. 올리고는어떻게합성되는지알고싶습니다. ligonucleotide 합성기에서가장보편적으로사용되는합성방법은 Koster 에의해개발된 이용하여 DA 구조의골격을이루는 phosphodiester 결합을연결해가는 phosphite triester 방법이다. -cyanoethyl phosphoramidite 를 (ucl. Acids Res. 1984, 12, 4539 ; Tetrahedron Lett. 1983, 24,5843) 이를통해원하는 ligonucleotide 를높은효율로합성할수있으며 ( 합성효율 : >98%) 합성시사용되는 phosphoramidite monomer 는 coupling 을위해활성화되기전에는상당히안정되어있어장기보관도가능하고또한이를이용한 ligonucleotide 의합성시간도다른방법들에비해짧다는장점을지니고있다. 12

Custom ligonucleotides 합성과정은 nucleoside 가부착된고형지지체로부터시작하여 deblocking, coupling, oxidation, capping 으로이루어지는 cycle 을반복함으로써원하는길이의 ligonucleotide 를얻게된다. < 그림 1 참조 > B n H P - Final Cleavage/Deprotection B P - n-2 B 1 H DMT B 2 * P B 1 * C Deblocking H B 1 * DMT B 1 * Ac B 1 * Capping xidation B 2 * DMT P Coupling B 1 * C DMT B 2 * (ipr) 2 P (CH 2 ) 2 C Activation w/ Tetrazole < 그림 1 > (1) Deblocking 합성 cycle 의첫단계인 deblocking 과정은고형지지체로부터 DMT 기를떼어냄으로써시작되며이때산성조건이요구되어보통 3% trichloroacetic acid 를사용한다. 한편산성조건하에서는 purine 계열염기와 sugar ring 사이의결합이끊어지는 depurination 반응이일어날수있으며특히염기가 adenosine 인경우에는그경향이더심할수있다고보고되었다. Trichloroacetic acid 는매우강한산으로 (pka : ~1.5) deblocking 에사용할때 depurination 시킬가능성이있어너무오랫동안 deblocking 반응을하지않도록주의가요구된다. 상기의문제점을최소화하기위해 trichloroacetic acid 대신약한산인 dichloroacetic acid 가쓰여지기도한다. Deblocking 시고형지지체로부터떨어져나가는 DMT 양이온은진한주황색을띄는데이의흡광도를통해올리고합성시의결합효율을측정하는데에이용할수있다. (2) Coupling Deblocking 과정을통해생성된고형지지체내의 5'-hydroxyl 기는 nucleoside phosphoramidite monomer 와 coupling 반응을 통해원하는 sequence 의 ligonucleotide 를합성하게된다. 이때사용되는 nucleoside phosphoramidite monomer 는그림 2 에서보듯이염기부분의 amine 기는보통 benzoyl 기 (adenosine, cytidine 경우 ) 또는 isobutyryl 기로 (guanosine 경우 ) 13

Custom ligonucleotides 보호되어있으며모든 monomer 는 5 -hydroxyl 기가 DMT 로보호되어있어계속되는결합반응의연결부분역할을하게된다. < 그림 2 참조 > CH 3 H CH 3 H H 3 C H 3 C H P P C da-phosphoramidite C dg-phosphoramidite CH 3 H CH 3 H CH 3 H 3 C H 3 C P P C dc-phosphoramidite C T-phosphoramidite < 그림 2 > 사용되는 phosphoramidite 구조그자체로는상당히안정되어있으므로고형지지체의 5 -hydroxyl 기와결합하기위해서는 활성화과정이필요하다. 보편적으로사용되는 activator 로는 tetrazole 로서 phosphoramidite 와반응하여 nitrogen 부분을 protonation 시킨뒤 diisopropyl amino 기를치환시켜매우반응성이강한 tetrazolide 구조로변환시킨다. 결과적으로반응성이강한 tetrazolide 와고형지지체의 5 -hydroxyl 기간의결합반응을통해 ligonucleotide 의사슬이 이어지게되는데이때약간의수분이라도존재하면반응성이강한 tetrazolide 와반응하여원하지않는부산물을생성하여 합성수율을저하시키기때문에 coupling 과정에서는무수조건이필수적이다. (3) xidation Phosphoramidite 와 5 -hydroxyl 기의 coupling 과정을거쳐생성된결합구조는본래의 phosphodiester 구조가아닌 phosphite triester 구조로서더안정된 phosphate 로변환시키는과정이필요하게된다. 14

Custom ligonucleotides 이를위해서는 iodine 을사용한 oxidation 반응이사용되며결과적으로 phosphite 는 phosphate 로바뀌게된다. (4) Capping Coupling 반응은정량적으로는일어나지는않기때문에 ( 보통 >98%) coupling 후고형지지체에는반응하지않은 5'- hydroxyl 기가남아있게되며이는다음 cycle 의 coupling 과정에참여하여원하지않는염기배열을갖는 (-1)mer 를 생성하는주원인이된다. 이렇게생성된부반응물들은합성완료후원하는 ligonucleotide 의정제를어렵게만들기때문에 coupling 과정후반응하지않고남아있는고형지지체내의 5 -hydroxyl 기를 blocking, 다시말해 capping 할필요가있다. 이를위해 acetic anhydride 와 -methylimidazole 을사용하여 acetylation 시킴으로써반응하지않고남아있는고형지지체내의 5'- hydroxyl 기를 capping 시키게된다. 원하는길이의 ligonucleotide 의합성은상기의과정들을반복하여실시함으로써이루어지며합성이완료되면최종적으로 ammonia 처리를하여합성된 ligonucleotide 를고형지지체로부터떼어낸뒤정제과정을거쳐순수한 ligonucleotide 로 얻게된다. Q. Standard ligo structure 15