보안과제( ), 일반과제( o ) 2000010010000013000014 21C 프론티어연구개발사업 인간전분화능줄기세포확립및세포주은행운영 Establishment of pluripotent human embryonic stem cells and operation of Stem Cell Bank 서울대학교 연구성과실용화진흥원
제출문 과학기술부장관귀하 본보고서를과학기술부 21 세기프론티어연구개발사업중과학기술부가지원하는세포응용연구사업 단 인간전분화능줄기세포확립및세포주은행운영 과제 ( 세부과제 인간전분화능줄기세포확 립및세포주은행운영 ) 의 1 단계보고서로제출합니다. 2005. 5. 주관연구기관명 : 서울대학교 주관연구책임자 : 문신용 연 구 원 : 오선경 : 최영민 : 김석현 : 구승엽 : 김재상 : 성노현 : 김희선 : 설혜원외 35 명 위탁연구기관명 위탁연구책임자 : 주 ) 메디포스트 : 양윤선, 진창현 - 1 -
보고서초록 과제관리번호 연구사업명 연구과제명 SC11011 중사업명 세부사업명 해당단계연구기간 21 세기프론티어연구개발사업 세포응용연구사업 2002.7.1-2005.3.31 단계구분 (1 단계 ) / (3 단계 ) 인간전분화능줄기세포확립및세포주은행운영 연구책임자문신용 연구기관명및소속부서명 해당단계참여연구원수 총 : 43 명 내부 : 30 명 외부 : 13 명 해당단계연구비 서울대학교의학연구원참여기업명주 ) 메디포스트 국제공동연구상대국명 : 상대국연구기관명 : 위탁연구연구기관명 : 주 ) 메디포스트연구책임자 : 양윤선 요약 ( 연구결과를중심으로개조식 500 자이내 ) 정부 : 기업 : 계 : 보고서면수 2,413,000 천원 60,000 천원 2,473,000 천원 222 쪽 인간전분화능줄기세포주 11종확립하였고, 줄기세포주은행을통하여 24개연구팀에게 hes 22,146 colony, 3,810 EBs를분양및 25개기관 29명의연구자 Training을실시하였다. 인간배아줄기세포주로부터신경과상피세포쪽으로의분화능을비교하고성숙한신경세포로의분화를유도하였다. 심근세포로의분화는인간배아줄기세포주로배아체를형성하고 30일동안 suspension culture 한후배양접시로옮긴후에 20일이상배양하여beating cluster의형성을확인하였다. 유전적변형방법들이효율적으로적용되기위한수단으로단백질도입기술을적용하여 TAT PTD를매개로하는단백질도입이인간배아줄기세포에서효율적으로작용함을알수있었다. 따라서분화를유도하거나세포의특성을변화시키는단백질을인간배아줄기세포에전달해주는경우특정세포로의분화를통한세포치료또는분화과정에관여하는유전자의기능연구나새로운유전자의동정등에응용될수있다. 이러한연구결과를국내외논문20여편으로발표하였으며특허 1건, 학술대회 42건과중국, 영국등의국제협력과여러국가에서의강의실적이있으며특히복제된인간배아줄기세포주를확립하여국내외에서도인정받는연구결과를창출하였다. 색인어 ( 각 5 개이상 ) 한글인간배아줄기세포주확립, 인간배아줄기세포주은행, 인간배아줄기세포주분화 Establishment of human embryonic stem cell (hesc) lines, Human 영어 embryonic stem cell bank, Differentiation of hes cell - 2 -
요약문 Ⅰ. 제목 인간전분화능줄기세포확립및세포주은행운영 Ⅱ. 연구개발의목적및필요성 본연구는세포응용연구사업단의연구목표를달성하기위해기반이되는인간전분화능줄기세포주를확립하여줄기세포주은행의운영과세포주의분배를목표로하여, 인간전분화능세포주를분리하고확립하며, 각세포주의특성을규명하고, 이를토대로인체에이식가능한인간전분화능줄기세포주의확립을위한새로운배양체계를구축하고자하였다. 확립된인간전분화능세포주는세포주은행의설립및운영을통하여세포응용연구사업단연구진에분배및보급되도록하고인간전분화능세포주분배시세포주에대한교육및홍보를통하여연구진의연구성과를증대시키고자하였다. 생명공학회사들은배아줄기세포를이용하여세 포치료기술을포함한최신기술개발에연구역량을집중하고있다. 그러나인간 전분화능줄기세포주는현재전세계적으로도절대수가부족한상황이며이를생산할수있는기술인력또한많지않은실정으로이에많은투자가이루어진다면이분야에있어서앞서나갈수있다. 인간전분화능줄기세포주를활용한인공조직및장기개발, 분화관련유전자및단백체의발굴과기능해석을통한유용물질개발및신약개발등에활용된다면이로부터파생되는부가가치는현재로서예측하기어려울정도로막대할것으로보여진다. 인간전분화능줄기세포주는난치성질환의치료에이용되는치료제로서활용될수있을것이며, 따라서현재치료가매우어렵거나불가능한 5,000여종의질환에대한치료제로서의인간전분화능줄기세포를공익적차원에서세포주은행화하고이를통한다양한연구개발이이루어질수있다면많은고통을받는환자에게질병의치료뿐만아니라삶의질향상에도그게기여할수있을것이다. 더나아가인간전분화능줄기세포주연구는궁극적으로는국민건강복지향상에크게기여할수있다고사료된다. - 3 -
Ⅲ. 연구개발의내용 인간전분화능줄기세포의확립을위하여 1 단계 3 차년동안 11 주의인간전분화능 줄기세포주를확립하고확립된줄기세포주의특성규명및정도관리를시행하고인체 이식가능한인간전분화능줄기세포주의확립과새로운배양체계를구축한다. 확립된 인간 전분화능줄기세포주는세포주은행의설립및운영을통하여세포응용연구사 업단연구진에분배및보급되도록한다. 인간전분화능세포주분배시세포주에 대한교육및홍보를통하여연구진의연구성과를증대시키고자하였다. Ⅳ. 연구개발결과 인간전분화능줄기세포주 11종확립하였으며이들 Cell line 의특성분석을완료하였거나시행중에있다. 줄기세포주은행을통하여 24 개연구팀에분양하는등활발한은행운영을하였으며, 또한세포주의배양과정에대한교육과정을시행하여분양된세포주의이용에도움이되도록하여세포응용연구사업단과제참여연구팀이훌륭한성과를낼수있도록하였다. Ⅴ. 연구개발결과의활용계획 인간전분화능줄기세포주의확립은향후엄청난부가가치가예상되는세포치료술개발을위한가장근간이되는기반기술의단계로세포주의보유자체가원천기술및산업재산으로활용될수있다고예상되어진다. 따라서연구진들의 Training program 을통하여인간배아줄기세포를배양할수있게하여확립된인간배아줄기세포주를분배받은연구진들이다양한조직으로의초기분화를연구할수있다. 이를바탕으로한지속적인연구개발로배아줄기세포를여러질병의세포치료에활용가능할것으로기대한다. - 4 -
S U M M A R Y 1. Title of Project Cell Bank Establishment of pluripotent human embryonic stem cells and operation of Stem 2. Objectives and Demands of Project This project aims at the establishment of pluripotent human embryonic stem cell lines and the operation of the Stem Cell Bank for distribution of the established cell lines, which is the basis of achieving the project objectives of the 21st Century Frontier Research and Development Program of the Stem Research Center. Specifically, this project attempts to separate and derive pluripotent human embryonic stem cell lines, to characterize each established cell line, and to set up a new culture system that is able to establish the transplantable cell lines. The established cell lines have been distributed to the research teams of the Stem Cell Research Center through the Stem Cell Bank. Numerous biotechnology corporations are focusing their researches on the development of new technologies including cell therapies using embryonic stem cells. However, the number of pluripotent human embryonic cell lines is quite low and the research personnels with expertise are not many worldwide. Therefore, it is highly probable that the Stem Cell Research Center and its research teams can take an initiative in the relevant research fields if significant financial investments and administrative supports are accompanied. Tremendous economic benefits are expected if the human embryonic cells from the present project can be used for the development of artificial tissues and organs, and for the application to material and pharmacologic industries through the search for differentiation-associated genes and proteoms followed by functional analysis and interpretation. Ultimately, pluripotent human embyonic stem cells can be utilized for the cell therapies of 5,000 intractable or incurable diseases. Taken together, a successful proceeding of this project will contribute to the - 5 -
therapeutics for the patients, the enhancement of nation' s health and welfare, and the improvement of well-being of people. 3. Contents of Project The establishment of 11 human embyronic stem cell lines has been proceeded. Characterization and quality assurance of the established cell lines have been performed. Pluripotent human embryonic stem cells that are clinically applicable are to be established with development of new culture systems. The established cells have been and will be distributed to the researchers after being deposited at the Stem Cell Bank that has been established and administered by the 21st Century Frontier Research and Development Program of the Stem Cell Research Center. Training, education and publicity activities have been executed when the cell lines are distributed in order to maximize the achievements of the project. 4. Achievements Eleven lines of pluripotent human embryonic stem cells have been and are to be established and characterized. The Stem Cell Bank has been established and administered under the regulation by the 21st Century Frontier Research and Development Program of the Stem Cell Research Center. The established human embryonic stem cells have been deposited into the Stem Cell Bank and actively distributed to the investigators of 24 research teams. The practical training program for handling and manipulation of human embryonic stem cells will be given to the researchers prior to distribution of the cells in order to improve the progress of researches administered by this center. 5. Plans for Application of Project Achievements Pluripotent human embryonic stem cells are to be used as an important and fundamental basis for the development of cell therapy, a high value-added technology. Accordingly, the establishment and maintenance of human embryonic stem cells can be utilized as a source of various applied technology and industrial property. For instance, lots of research teams can perform the diverse investigations on the early - 6 -
developments of distributed human embryonic stem cells into various tissues through qualified training program operated by the Stem Cell Research Center. It is more than highly expected that continuous further investigations on the human embryonic stem cells can make an advanced leap into the clinical application of cell therapy. - 7 -
C O N T E N T S Chapter 1. Overview of project ------------------------------------------------------------------ 10 Chapter 2. Status of technology development: domestic and overseas ------------- 13 Chapter 3. Details in contents and results of project ------------------------------------- 17 Chapter 4. Achievements and contribution to relevant fields --------------------------- 94 Chapter 5. Plans for application of project achievements ------------------------------- 100 Chapter 6. Acquired information on science and technology overseas -------------- 101 Chapter 7. Reference ------------------------------------------------------------------------------- 123 Chapter 8. Management of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell bank ----------------------------------------------------- 128 Appendix Ⅰ~ Ⅳ ------------------------------------------------------------------------------------ 164-8 -
목 차 제 1 장연구개발과제의개요 --------------------------------------------------------------------------- 10 제 2 장국내외기술개발현황 ------------------------------------------------------------------------- 13 제 3 장연구개발수행내용및결과 ----------------------------------------------------------------- 17 제 4 장목표달성도및관련분야에의기여도 ----------------------------------------------------- 94 제 5 장연구개발결과의활용계획 -------------------------------------------------------------------- 100 제 6 장연구개발과정에서수집한해외과학기술정보 ---------------------------------------- 101 제 7 장참고문헌 ----------------------------------------------------------------------------------------- 123 제 8 장인간제대혈유래줄기세포은행운영 ( 위탁연구 ) ----------------------------------- 128 부록 Ⅰ ~ Ⅳ --------------------------------------------------------------------------------------------- 164-9 -
제 1 장연구개발과제의개요 1 절연구개발의목적 인간배아줄기세포분리 세포주확립은 1998년 Thomson 등에의하여최초로보고되었으며, Shamblott 등 (1998) 에의한유산태아생식선유래인간배아생식세포분리및인간배아줄기세포주의체외분화능확인등의연구성과를토대로발전되어져왔다. 2001년 8월미국행정부는전세계연구기관이보유한 72 개의배아줄기세포주를대상으로한연구를허가하였으며, 이를계기로첨단의료기술개발연구가진행되기시작하였다. 세계생명공학회사들은배아줄기세포를이용하여세포치료기술을포함한최신기술개발에연구역량을집중하고있다. 인간전분화능줄기세포주의확립은향후엄청난부가가치가예상되는세포치료술개발을위한가장기본적재료로서활용될예정에있어세포주의보유자체가원천기술및산업재산으로활용될수있다고예상된다. 따라서본연구에서계획하는인간전분화능줄기세포주의확립과이에따른세포주은행의운영은곧바로세포치료및유전자치료기술개발을획기적으로향상시킬수있는기초로활용될수있을뿐만아니라궁극적으로는난치병환자의치료세포로활용될수있다. 따라서보다많은난치병환자의치료또는발생과정의이해및신약개발등의응용을위해서는보다다양한종류의인간전분화능줄기세포주를확립하기위한전세계적노력이치열하게전개될전망이다. 국내의경우도세포응용연구사업단을중심으로하는치료용인간전분화능줄기세포주의확립과세포주은행의운영은범국가적차원에서지원되어야할것으로사료된다. - 10 -
2 절연구개발의필요성 배아줄기세포는생체내모든조직으로분화가능한전분화능 (pluripotency) 을가지고있다. 전분화능분석을통한분화제어연구는 2000년 Itskovitz-Eldor 등이인간배아줄기세포를심근및조혈모세포로분화시키는데성공함으로서기틀이확립되었다. 이어 Shundiner 등 (2000) 이배아줄기세포를뇌, 피부, 간, 췌장, 근육, 뼈, 심근및조혈모세포들로분화시킬수있다고보고하였으며, Rumelsky (2001) 는생쥐배아줄기세포를인슐린생산췌도및췌도유사세포, 근육, 혈구, 그리고신경세포로분화시키는데성공하였다. 한편, Assady 등 (2001) 은배아줄기세포를췌장 β-세포로분화시켰으며, Kahat 등 (2001) 은상이한방법을이용하여심근세포, Kaufmann 등은조혈모세포, 그리고 Reubinoff 등 (2001) 은신경세포들로분화유도시킬수있다고발표하였다. Geron 사의경우 Affymetrix 사와함께대량으로배아줄기세포유전자발현분석을수행중이며, 이를통하여줄기세포분화및역분화기전을규명하고있다. 이러한연구동향으로볼때인간전분화능줄기세포주의잠재력은무한하다고판단되며특히향후각종세포치료법의개발에따른치료제로서의줄기세포로서활용될가치가충분하다고인정된다. 따라서다양한연구활동을위한재료로서뿐만아니라세포치료제로서의인간전분화능줄기세포주의개발을필수적이라고판단된다. 현재까지인간전분화능줄기세포주의확립은향후엄청난부가가치가예상되는세포치료술개발을위한가장기본적재료로서활용될예정에있어세포주의보유자체가원천기술및산업재산으로활용될수있다고예상된다. 따라서본연구에서계획하는인간전분화능줄기세포주의확립과이에따른세포주은행의운영은곧바로세포치료및유전자치료기술개발을획기적으로향상시킬수있는기초로활용될수있을뿐만아니라궁극적으로는난치병환자의치료세포로활용될수있다. 따라서보다많은난치병환자의치료또는발생과정의이해및신약개발등의응용을위해서는보다다양한종류의인간전분화능줄기세포주를확립하기위한전세계적노력이치열하게전개될전망이다. 국내의경우도세포응용연구사업단을중심으로하는치료용인간전분화능줄기세포주의확립과세포주은행의운영은범국가적차원에서지원되어야할것으로사료된다. 또한인간전분화능줄기세포내로유전자나단백질을전달하는기술은발생연구나 - 11 -
분화유도에있어개발되어야할필수불가결한것으로서, 많은연구자들이기술개발에참여하고있으므로빠른시간에해결될것으로판단되며, 개발된기술을바탕으로인간전분화능줄기세포에서높은효율로분화를유도하는것이가능해질것이다. - 12 -
제 2 장국내외기술개발현황 본연구과제와관련된배아줄기세포의국내외기술개발현황은크게배아줄기세포 의확립및배양에관한기술과난치성질환의세포치료를위한특정세포로의분화유 도에관한기술로나누어볼수있다. 1 절배아줄기세포의확립및배양에관한기술현황 1. 국외 1998년 Thomson 등이인간배아줄기세포를최초로확립한이후미국국립보건원은전세계적으로 2001년 8월이전에확립된인간배아줄기세포에대한등록제를실시하여등록된인간배아줄기세포에대한정보를제공하고연구자들이등록된인간배아줄기세포를사용할수있도록분양정보를구축하였으며 (http://stemcells.nih.gov /registry), 많은국가들이인간배아줄기세포의확립및배양에관한연구를활발히진행하고있다. 특히배아줄기세포의배양에관한연구로는인간배아줄기세포를세포치료제로서임상에적용하기위한인간배아줄기세포의배양방법을개발하는것으로, 현재배아줄기세포의배양체제는생쥐의배아섬유세포를영양세포층 (feeder layer) 로사용하여순수분리한배아줄기세포를함께배양하는것인데, 이는이종간배양체제로서종간동물병원체의감염위험성이매우높을뿐더러인간배아줄기세포의순수분리를어렵게하는문제점을가지고있다. 따라서인간배아줄기세포의배양에있어서이종간배양체제가아닌동종간의배양체제를확립하여야만한다. 최근 feeder layer로생쥐배아섬유세포대신인간유래섬유세포 (human-derived fibroblast) 를사용하여이종간의감염위험성을배제시킨배양방법에관한연구가많이이루어지고있는데, Xu 등 (2001) 은영양세포층이없이다양한세포외기질과영양세포층의배양액만을이용하여인간배아줄기세포를성공적으로배양하였으며, Richards 등 (2002) 은인간유래세포를처음으로영양세포로이용하여인간배아줄기세포의배양에성공하였고, 그이후로인간성체골수세포 (Cheng et al., 2003), 인간포피세포 (Amit et al., 2003; Hovatta et al., 2003) 를이용하여이종세포의사용을배제하고자하는노력이지속되고있다. - 13 -
이러한인간유래세포를영양세포로사용하고자하는연구와더불어feeder-free 조건에서인간배아줄기세포의미분화특성을유지시키는인자들의탐색에관한연구도활발히이루어지고있다 (Amit et al., 2004; James et al., 2005; Beattie et al., 2005). 또한이런배양기술을바탕으로 Inzunza 등 (2005) 은기존의인간배아줄기세포와는달리인간영양세포와serum replacement를사용하여종간동물병원체의감염위험성을배제한세포이식에적합한인간배아줄기세포주를확립하였다. 2. 국내 본연구에참여하는서울대, 미즈메디병원및포천중문의대는 2001년전세계에존재하는 72종의배아줄기세포중에서 3개의세포주를미국국립보건원 (NIH) 에정식으로등록하여세포주로서인정을받았으며또한등록된세포주외에도새로운인간배아줄기세포주를 20종이상보유하고있어국내연구진들에게분양할수있는제반준비를갖추고있다 (Park et al., 2003; Oh et al., 2005). 본연구팀은세포응용사업단출범과동시에인간배아줄기세포주은행을운영하고있으며, 그동안세포주은행을유지하면서축적된인간배아줄기세포주확립및배양기술을발표하였다 (Oh et al., 2005; Kim et al., 2005). 특히 2004년 Hwang 등은체세포핵치환술을이용한인간복제배아줄기세포를세계최초로확립하였고책임저자로참여하였다. 또한국내연구자들에의해서인간배아줄기세포의가장효과적인동결보존방법이개발되었고 (Kim et al., 2004; Ha et al., 2005), 배아줄기세포의자가증식 (self-renewal) 에관여하는신호전달체제 (Kim et al., 2005) 및인간유래세포를이용한영양세포층의개발 (Lee et al., 2004), 그리고이종동물유래물질을최대한으로배제한상태에서세포이식에적합한인간배아줄기세포주를확립 (Lee et al., 2005) 하는등인간배아줄기세포의확립과배양에관하여선진외국과비교하여거의거의대등하거나앞서는기술을보유하고있다. - 14 -
2 절배아줄기세포의분화유도에관한기술현황 1. 국외 배아줄기세포의분화에관한연구는현재세포치료제로서의활용가능성때문에가장활발히연구되고있는분야이다. 이들연구는주로생쥐배아줄기세포를가지고이루어졌지만, 최근이러한실험에서얻은지식을토대로인간배아줄기세포에서의분화연구가활발히이루어지고있다. 분화실험의방법은분화유도인자의처리, 유전자조작을통한분화, 공배양 (coculture) 을통한분화등이있는데, 분화실험의기본골격은미분화상태의배아줄기세포배양시미분화조건을제거한후에초기배아의분화단계인배양체 (embryoid body) 를형성하고, 적절한분화유도인자들을처리함으로써특정세포로의분화를유도하는것이다. 분화유도인자를처리하여배아줄기세포의분화를유도한연구로는 1996년 Okabe등은생쥐배아줄기세포로부터성장인자인 basic fibroblast growth factor(bfgf) 가첨가된배지에서신경전구세포군을만들었고, bfgf를제거해줌으로써뇌, 신경세포로분화를유도할수있었다. 2001년 Zhang등도 bfgf를이용하여인간배아줄기세포로부터신경전구세포군을얻을수있었으며, 이들로부터최종분화된신경세포를유도했으며, 생쥐의뇌에이식했을때고르게분포하고각각의위치에서특정신경세포로분화하여존재하는것을확인하였으며, Guan등 (2001) 은 bfgf 외에비타민 A 유도체인 retinoic acid를이용하여생쥐의배아줄기세포로부터신경계세포의분화를유도하였다. 또한 Li등 (2001) 은원숭이배아줄기세포를분화시키는과정에서 bone morphogenic protein-4(bmp-4) 를사용함으로써보다효율적으로혈액전구세포들로의분화를유도하였다고발표하였으며, Kramer등 (2000) 은 BMP-2, 4를이용하여연골세포분화를유도하였다. 적절한분화유도인자를이용한배아줄기세포의분화는가장보편적인방법으로배양액에첨가된분화유도인자는배아줄기세포의특정유전자를발현시켜성장, 분화조건을바꾸어특정세포로의분화를촉진시킨다. Soria등 (2000) 은 neomycin 유전자를인슐린 promoter에의해조절되도록재조합하여생쥐의배아줄기세포로이입시킨후분화시켜 neomycin 유도체를넣어줌으로써인슐린을분비하는세포만을선별할수있었으며, 당뇨병을가진쥐에이식후치료효과가있음을보고하였다. 이처럼 - 15 -
유전자조작을통한배아줄기세포의분화는가장효과적이고확실한방법이라할 수있으나, 삽입된유전자가 유전체에무작위로삽입되기때문에삽입에의한유 전자변이가문제가될수있을뿐아니라항생제를이용한무리한유도선택을통하여세포의변이를유도할가능성이있다. 공배양을통한분화연구로는 Buttery등 (2001) 이생쥐의골세포와배아줄기세포를함께배양함으로써배아줄기세포로부터골세포로의분화를유도하였고, Kawasaki 등 (2000) 은 PA6 기질세포와함께배아줄기세포를배양함으로써도파민성신경세포로분화를유도하였다. 2. 국내 인간배아줄기세포를이용한분화에관한국내연구는아직초기단계로실적이많 이보고되고있지는않다. 그러나세포응용연구사업단출범이후인간배아줄기세포 를이용한분화연구실적이최근보고되고있는실정이다. 한양대학교이상훈교수연 구팀은인간배아줄기세포로부터도파민을분비하는신경세포로의분화연구를보고하 였다 (Park et al, 2005; Ko et al., 2005). - 16 -
제 3 장연구개발수행내용및결과 1 절연구개발수행내용 1. 이론적접근방법 본과제는세포응용연구사업단의정책지정과제로서사업단운영에필요로하는전분화능줄기세포주를다량으로확립하고이를세포주은행화하여참여연구진에게분배하여동시에난치병환자의치료를위한연구의기틀이되고자한다. 가. 인간배아줄기세포주의확립 본과제에서이용한인간배아는불임시술과정에서냉동보존된배아가존재하고환자자신이더이상냉동보관을원하지않으며불임치료개발또는인간배아줄기세포연구에기증할의사가있는경우동의서를받아배아줄기세포확립에이용하였다. 나. 인간배아줄기세포주은행의운영및교육 새로운인간배아줄기세포주의확립과확립된새로운세포주의특성분석과초기분화연구를수행하여각세포주의분양시각각분화연구및인간배아줄기세포주연구에적합한세포주를분양한다. 또한, 인간배아줄기세포관련교육프로그램을운영하고관련연구진에게 세포를분배한다. 인간배아줄기세포는연구에적합한상태로의계대유지와 Colony 증식이매우까다로우므로지속적인교육을통해효율적인연구가이루어 지도록한다. - 17 -
이때사업단에서정한 MTA(Material Transfer Act) 를분배받고자하는연 구팀과작성한다. 다. 인간배아줄기세포주의분화연구 인간배아줄기세포가특정한세포종류로의분화를유도하는조건하에서 원하는종류의세포로분화유도가가능하기때문에세포치료의적절한재료로간 주되고있다. 이와같은특징을바탕으로파키슨병, 당뇨병, 심혈관계질환등의 난치병치료의한방법이될수있을것으로기대되고있다. 이러한배아줄기세포 의특성에따라현재줄기세포를특정한세포종류로분화유도시키기위한다양 한연구가진행되고있다. (1) 심근세포로의분화 인간의심근세포는출생후완전히분화되어, 일단심장조직이손상을입을경우다시재생되지않는다고알려져있다. 일부줄기세포들이손상을입었을경우이동하기도하지만심근의병리학적인환경을변화시키기는미약하다. 손상된심근의기능을회복시키기위한방법의하나로세포치료가시도될수있다. 그러나이러한세포치료에사용될수있는공급원은매우한정적이다. 또한이식후면역거부반응, 세포괴사등을비롯한부작용등으로인해크게효과를나타내지는못하고있다. 그러므로많은양의세포를이식하거나이식후 survival을높이는연구가필요한상태이다. 1998년 Thomson 등에의해처음으로보고된인간배아줄기세포는인체를구성하는모든종류의세포로분화할수있는능력을가진세포로이러한인간배아줄기세포의특성때문에심근세포로분화시킬경우세포치료에적합한공급원이될것으로기대되고있다. (2) 신경세포로의분화 질병이나상해에의한뇌또는신경조직의손상은자연적으로는재생이힘 - 18 -
들고이에따라치유가어렵거나불가능한경우가많으며그만큼대부분인체에 치명적이다. 이에따라이전부터연구되어진분화인자나분화조절기작들을이용하 여배아줄기세포로부터뇌세포나신경세포를생산하여이를뇌, 신경질환에의한 손상에적용하고자하는연구들이활발히진행되고있다. 더욱이배아줄기세포는 단계별로신경전구세포나더욱분화된신경세포로분화단계를조절할수있기때 문에경우에따라목적에맞게사용할수있다. (3) 단백질도입기술 인간배아줄기세포에적용된 genetic modification 기술의현황을보면 plasmid transfection의경우 5% 미만의효율로전달되며, retroviral transduction 의경우 gene silencing이일어나전달된유전자의발현이억제되는것으로알려져있으며, 가장높은효율로전달된다고보고된 lentiviral transduction의경우도효율이 7% 에머물러있다. 따라서유전자전달기술이인간배아줄기세포관련연구에큰제한요소로작용하고있다. 본연구에서는유전자의산물인단백질을단백질도입기술을이용하여높은효율로인간배아세포에전달하는기술을개발하여그러한기술적난점을극복하고인간배아발생과분화유도에관련된연구의활성화를도모하고자한다. 본연구를통하여인간배아줄기세포에단백질을도입하는것이가능해지면, 심근세포나신경세포, 췌장베타세포등의발생에관여하는주요전사인자들을이용하여각세포로분화를유도할수있고, 이를통해허혈성심장질환이나신경퇴행성질환, 당뇨병환자의세포치료에적용될수있으므로경제산업적으로큰파급효과가예상된다. (4) 거핵세포로의분화 인간전분화능줄기세포로부터거핵세포와혈소판의분화유도는몇가지중 요한가치를가진다고생각된다. 첫째, 응고기능저하의치료에쓰여질수있다 는점이다. 인간전분화능줄기세포에서만들어진혈소판은현재쓰여지고있는 헌혈된혈청보다훨씬더안전할것으로생각된다. 또한줄기세포의증식력을 - 19 -
고려할때조혈모세포에서혈소판을유도하는것보다훨씬더경제적일수있다고 생각된다. 둘째, 동맥경화증치료신약개발에필요한시험관내 system 으로쓰 여질수있다는점이다. 심혈관계질환은우리나라에서도이미중요한사망원인 으로자리잡고있으며혈소판기능조절을통한합병증치료개발이시급한상황 이다. 혈소판의활성과응집에는 thrombin 과 vasopressin 을포함한여러물질에 의하여조절받는다양한신호전달체계가관여되어있으며이들은혈소판특이적 인 integrin 이라는수용기를활성화시킴으로써그효과를나타낸다. 신약개발은 혈소판활성화조절에관한연구를통하여이루어질수있으며동질성을가진혈 소판의안정적공급은중요한전제조건이다. 우리나라의경쟁력중의하나가인 간전분화능줄기세포의다량공급가능에있다는것을고려할때 이와같은연구 는그경쟁력을최대한으로활용하여바로임상치료와신약개발로연장될수있 는연구라는점에서그의미가돋보인다고생각된다. - 20 -
2. 실험적접근방법및내용 가. 인간배아줄기세포주의확립 냉동보존된전핵시기의배아를융해후배반포 (blastocyst) 까지배양하였다. 배반포에서내세포괴 (ICM) 을분리하기위하여기존에많이쓰이던 immunosurgery 방법외에내세포괴와영양세포 (trophoblast) 의일부분만을절개하여배양하는부분배아의배양방법 (partial embryo culture method) 그리고전체배아의배양방법 (whole embryo culture method) 을이용하였다. 이세가지방법은각각배반포의상태에따라서적절하게이용할수있다. 나. 인간배아줄기세포주은행의운영및교육 확립된인간배아줄기세포주는초기상태에냉동보존하여두고필요한시기에융해하여배양한다. 모든연구진을상대로전체 workshop을시행하거나원하는경우개별 training course를시행한다. 개별 training course에는인간배아줄기세포배양방법, 배양액만드는법, 영양세포층배양방법등의과정으로진행하며분양을원하는경우 MTA 작성후시행한다. 다. 인간배아줄기세포주의분화연구 (1) 심근세포로의분화 인간배아줄기세포로부터심근세포로의분화유도는현재까지크게자연적 인분화유도 (spontaneously differentiation) 와성장인자의처리를통한분화유도 (induced differentiation) 의두가지로분류될수있다. 본연구에서는 SNUHES3 인간배아줄기세포주를이용하여심근세포로의분화를유도하고나아가이들을임상 적모델에적용하려고한다. - 21 -
(2) 신경세포로의분화 3개의인간배아줄기세포주 (SNUhES1, SNUhES2, and SNUhES3) 로부터신경과상피세포쪽으로의분화능을비교하고성숙한신경세포로의분화를유도하였다. (3) 단백질도입기술 인간배아줄기세포의경우유전자변형기술의효율이낮아서연구에장애점이되고있다. 본연구에서는이러한유전자변형의낮은효율에따른연구의어려움을해결하는대안으로인간배아줄기세포에서단백질도입기술을적용해보고자한다. 대부분의단백질은지질막을통과하지못하므로세포내로전달이안되지만, HIV-1 TAT 단백질의경우세포막을통과하여바이러스프로모터를활성화시 킬수있다는것이발견되었다. 본연구에서는인간배아줄기세포에서 TAT PTD 에의해단백질이세포내로전달되는지의여부와심근세포에특이적인유전자의 발현이유도되는지를조사하였다. (4) 거핵세포로의분화 인간배아줄기세포 (human ES Cells) 로부터거핵구와혈소판의분화유도는이제까지거핵구와혈소판연구에사용된다양한 sources인골수 (bone marrow), 말초혈액 (peripheral blood), 그리고제대혈 (cord blood) 세포에서의분화에비해괄목할만한장점을갖고있다. 첫째, 인간줄기배아세포의증식력은무제한적이어서현재까지사용되어온제한적인조혈모세포에서혈소판을유도하는것보다훨씬경제적일것이다. 둘째, 수혈을통한혈소판공급은현재AIDS와같은질병으로인한오염의큰위험부담을안고있는데반해인간배아줄기세포에서유도된혈소판공급은매우안전할것으로사료된다. 셋째, 동맥경화증치료신약개발에필요한시험관내 system을구축할수있다. 심혈관계질환은우리나라에서도이미주요한사망원인으로나타나고있으며혈소판기능조절을통한합병증치료개발이시급한현실이다. 혈소판의활성과응집에는 thrombin, ADP, VWF, Epinephrine등을포함한여러가지물질에의해조절받는다양 - 22 -
한신호전달체계가관여하고있으며이들은혈소판특이적인 integrin 이라는수용기를 활성화함으로써그효과를보인다. 신약개발은혈소판활성화조절에관한연구를통하 여이루어질수있으며동질성을가진혈소판의공급은중요한전제조건이다. - 23 -
2 절연구결과 1. 대표연구성과 세계최초인간복제배아줄기세포확립가. 연구내용및주요결과 1) 2004년 2월 12일미국시애틀에서개최된미국국가과학진흥회 (American Association for the Advanced Science : AAAS) 연례회의에서한국의황우석, 문신용교수를대표로하는공동연구진은체세포를복제한배아를이용하여인간복제배아줄기세포를세계최초로확립하였다고보고하였음 2) 복제배아줄기세포에서유래한세포를체세포공여자본인에게이식할경우면역거부반응을일으키지않아이제까지치료가불가능하였던난치병을근본적으로치료하는데이용할수있음 3) 연구진은세포응용연구사업단및세계각국의윤리규정을참고하여인간개체복제를사전에방지할수있는연구방침을정하였고, 한양대학교임상시험윤리위원회에서연구계획을승인받았으며, 십여명의자발적난자공여자로부터총 242개의정상난자를제공받아연구에이용함 4) 자발적으로참여한여성의난자및체세포를채취한후난자의투명대에구멍을만든후핵을제거하여용이하게탈핵난자를만듬, 난자제공자와동일인의난구세포를탈핵된난자에주입하여핵이식난자를만든후, 전기자극을가해세포융합을유도하였으며, 연구팀고유의탈핵방법, 난자제공자와동일인의난구세포를핵이식용체세포로이용한점이본연구성공의가장중요한요인으로평가됨 5) 핵이식난자의활성화를촉진시키기위하여화학물질인칼슘아이노포어 (A23187) 를적절히적용하여핵이식난자의배발육을촉진하였고, 총 30개의배반포를얻어내세포괴를배양한결과이중한개의복제배아줄기세포가확립됨 6) 확립된복제배아줄기세포는 DNA 지문분석방법으로체세포공여자와복제배아줄기세포의유전자가일치하며 ( 오차확률은 8.8x10-16), 일곱가지의표식인자확인및염색체분석을통하여정상적인배아줄기세포로서의특성을지니고있음을확인 - 24 -
7) 배상체형성과실험동물생체내이식실험결과전분화능을지니고있으며, 체외배 양과정을통하여이들세포가신경세포로분화하는것도확인하였음 나. 연구성과와관련된이미지 1) 연구성과 세계최초로확립된 인간복제배아줄기세포 핵이제거된난자내로체세포핵을 이식하는과정의사진 - 25 -
2. 인간배아줄기세포주의확립 가장널리이용되는 antibody( 항체 ) 와 complement( 보체 ) 를이용한 immunosurgery 방법 ( 그림 1) 으로 6개의세포주를확립하였고부분배아의배양방법 ( 그림 2) 으로 4개의세포주를확립하였다. 또한전체배아의배양방법 ( 그림 3) 으로 1개의세포주를확립하였다. 그림 1. Immunosurgery 를이용한내세포괴의분리 - 26 -
그림 2. 부분배아배양방법에의한내세포괴의분리 그림 3. 전체배아배양방법에의한내세포괴의분리 - 27 -
이렇게얻어진배아줄기세포가미분화상태인가를확인하기위하여다음과같은특성분석을실시하였다. 먼저형태학적으로판단하기위해위상차현미경하에서인간배아줄기세포를관찰하여세포의대부분을핵이차지하는미분화상태임을확인하였다 ( 그림 4와 5). 그림 4. 확립된미분화배아줄기세포를계대유지하기위해유리피펫을이용하여잘라주는모습 그림 5. 확립된배아줄기세포중분화세포가있는경우그부위를제외하고계대유지하는모습 - 28 -
또한 Alkaline Phosphatase 활성도가나타났고줄기세포에서발현되는 Oct-4가확인되었다 ( 그림 6). 미분화표식인자인 SSEA-3 & 4, TRA-1-60와 TRA-1-81이발현되었고생쥐배아줄기세포에서발현되는 SSEA-1은발현되지않았다 ( 그림 7). 이들을장기간배양하였을때 Telomerase 활성도가계속존재함을확인할수있었다. 그림 6. Alkaline phosphatse 와 Oct-4 그림 7. SSEA-4, TRA-1-60 와 TRA-1-81 - 29 -
확립된배아줄기세포가정상적인핵형을가지는가를확인하였고 ( 그림 8) 각세포주가각각의다른배아에서기원한것임을판단하기위해 DNA finger printing 을또한시행하여기원이다른배아임을확인할수있었다. 확립된세포 주의분화능을알아보기위해 SCID mice 에인간배아줄기세포를주입하여 teratoma 를형성시켰으며이들을조직검사한결과삼배엽기원의세포를만들수 있음을확인할수있었다 ( 그림 9). 그림 8. 핵형분석결과 그림 9. SCID mice 에미분화배아줄기세포를주입한후획득한 teratoma - 30 -
3. 인간배아줄기세포주은행의운영및교육 각연구진을상대로 workshop을개최하여 25명의연구자가참여한가운데인간배아줄기세포의이해를증진시키고자하였으며또한각실무연구자들을상대로 training program을실시하여총 25개기관 29명의연구자들이이수하였다. 이러한결과로각연구진들이인간배아줄기세포에대한실험을보다용이하게할수있도록하였다. 또한이러한 workshop과 training을바탕으로인간배아줄기세포에대한연구바탕이확립된연구진에게본연구팀이확립한인간배아줄기세포를 21개연구진에게분양하여이를이용한인간배아줄기세포의특성과분화에미치는영향에관한연구를할수있게하였다. 가. Workshop 개최실적 제 1 차세포응용연구사업단배아줄기세포워크숍 The 1st Embryonic Stem Cell Workshop 일시 : 2002 년 10 월 24 일 ( 목 ) 13:00-17:00 장 소 : 세포응용연구사업단 서울대학교의과대학의학연구원 2 층회의실, 3 층실험실 주 대 최 : 세포응용연구사업단정책지정과제연구팀 상 : 21 세기프론티어세포응용연구배아줄기세포분야연구협약팀을대상 으로각과제별 2 명이내로선별하여 20 명으로제한함 참가인원 : 25 명 * 참고 : 부록 Ⅰ [ 첨부 1 ] 워크숍유인물 ( 별지첨부 ) [ 첨부 2 ] 워크숍참가자명단 ( 별지첨부 ) - 31 -
나. 연구자 Training 실적 인간배아줄기세포배양기술교육 (1-3 차년도 ) 대상 : 인간배아줄기세포를이용한실험수행을목적으로배양기술을습득하고자 하는연구원을대상으로한다. 교육기간 : 교육기관의상황과일정에맞춰논의한후결정한다. 기본적인교육기간은 3 일간으로하며여건에따라기간조정가능하다. 교육내용 1) review about hesc culture proccess 1 일 2) preperation of hesc medium and STO medium 3) expansion of feeder cells(sto) 4) preperation of subculture dish 2 일 3 일 5) hesc transfer 6) STO freezing 7) hesc media change and culture 8) Hand-out checking * 참고 : 부록 Ⅱ [ 첨부 1] : 인간배아줄기세포주분양및배양기술교육에관한공지문 [ 첨부 2 ] : 배양기술교육의구체적내용 [ 첨부 3 ] : 1-3 차년도교육생명단 - 32 -
다. 세포주분양실적 총 24 개연구팀 - hes : 22146 colony 이상 - hes EB : 3810 EBs 이상분양함 * 참고 : 부록 Ⅲ - 33 -
4. 인간배아줄기세포주의분화연구 가. 심근세포로의분화 hesc로부터 cardiomyocyte로의분화를유도하였다. Undifferentiated ESC를 collagenase type Ⅳ(2mg/ml) 를처리하여분리한후, EB를 formation 하였다 ( 그림 10). 형성된 EB를 30일동안 suspension culture 한후 culture dish로옮긴후에 20일또는그이상부착한상태에서배양하였다. 부착된상태에서배양후 beating cluster의형성을확인할수있었다 ( 그림 11). A SNUhES1 SNUhES2 SNUhES3 B 그림 10. 다양한세포주와배양날짜에따른 EB 의형태변화 A ; 3 일째 EB. B ; 21 일째 EB - 34 -
100 μm 그림 11. 배양후형성된 beating cluster 의모습 beating 은 in vitro 상에서 30 일이상지속. DAPI ctn I α MHC DAPI/cTn I/α MHC 100 μm 100 μm 100 μm 100 μm 50 μm 50 μm 50 μm 50 μm 그림 12. 심근특이적인표지자의발현양상 분화된세포에서 cardiomyocyte specific marker 들의발현은 immunostaining 과 RT-PCR 방법을이용하여확인하였다 ( 그림 12). cardiac muscle contraction에중요한역할을하는 troponin complex의 subunit인 ctni, cardiomyocyte motor protein의 subunit 인 ámhc, á actinin 등이 cardiomyocyte로분화유도된세포에서발현되었으며, 중배엽성세포로의분화과정에서발현되는 transcription factor인 GATA4, Nkx2.5, cardiomyocyte에서분비 - 35 -
되는호르몬의한종류인 ANF, cardiac actinin 등의발현을 RT-PCR 방법으로확인하였다 ( 그림 13). 또한 growth factor 중중배엽성분화과정에관여하는것으로알려진 BMP2와 FGF2를처리한결과 cardiac specific marker 들의발현양이증가하는것을확인하였다 ( 그림 14 ~ 21). Expression of β- actin in each cell lines (200 bp) ES 1 2 3 4 5 6 7 9 11 13 15 17 19 21 N SNUhES1 SNUhES2 SNUhES3 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 ES D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D9 D11 D13 D15 D17 D19 D21 hes3 hes2 hes1 그림 13. 각각의세포주에서배양날짜별로발현되는 β- actin mrna 양의비교 (200 bp) - 36 -
Endoderm Amylase (490 bp) ES 1 2 3 4 5 6 7 9 11 13 15 17 19 21 N SNUhES1 SNUhES2 SNUhES3 350 300 250 200 150 100 50 0 ES D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D9 D11 D13 D15 D17 D19 D21 hes 3 hes 2 hes1 그림 14. 각각의세포주에서배양날짜별로발현되는 endoderm marker 인 Amylase (490bp) 의 mrna 양변화 - 37 -
Albumin (450 bp) ES 1 2 3 4 5 6 7 9 11 13 15 17 19 21 N SNUhES1 SNUhES2 SNUhES3 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 hes 3 hes 2 hes 1 ES D2 D4 D6 D9 D13 D17 D21 그림 15. 각각의세포주에서배양날짜별로발현되는 endoderm marker 인 Albumin (450bp) 의 mrna 양변화 - 38 -
Ectoderm Keratin (780 bp) ES 1 2 3 4 5 6 7 9 11 13 15 17 19 21 N SNUhES1 SNUhES2 SNUhES3 250 200 150 100 hes3 hes2 hes1 50 0 ES D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D9 D11 D13 D15 D17 D19 D21 그림 16. 각각의세포주에서배양날짜별로발현되는 ectoderm marker 인 Keratin (780bp) 의 mrna 양변화 - 39 -
Neuro Filament Heavychain (400 bp) ES 1 2 3 4 5 6 7 9 11 13 15 17 19 21 N SNUhES1 SNUhES2 SNUhES3 300 250 200 150 100 hes3 hes2 hes1 50 0 ES D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D9 D11 D13 D15 D17 D19 D21 그림 17. 각각의세포주에서배양날짜별로발현되는 ectoderm marker 인 Neuro Filament Heavychain (400bp) 의 mrna 양변화 - 40 -
Mesoderm Cartilage Matrix Protein (620 bp) ES 1 2 3 4 5 6 7 9 11 13 15 17 19 21 N SNUhES1 SNUhES2 SNUhES3 250 200 150 100 hes3 hes2 hes1 50 0 ES D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D9 D11 D13 D15 D17 D19 D21 그림 18. 각각의세포주에서배양날짜별로발현되는 mesoderm marker 인 Cartilage Matrix Protein(620bp) 의 mrna 양변화 - 41 -
Enolase (490 bp) ES 1 2 3 4 5 6 7 9 11 13 15 17 19 21 N SNUhES1 SNUhES2 SNUhES3 350 300 250 200 150 hes3 hes2 hes1 100 50 0 ES D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D9 D11 D13 D15 D17 D19 D21 그림 19. 각각의세포주에서배양날짜별로발현되는 mesoderm marker 인 Enolase (490bp) 의 mrna 양변화 - 42 -
GAPDH (302bp) ANF (190bp) cact (620bp) ctn I (200bp) hes EBs N GATA4 (475bp) Nkx2.5 (233bp) 그림 20. 인간배아줄기세포와배아체에서자연분화때의심근특이적으로발현되는 유전자의변화 APDH(302bp) ANF (190bp) cact (620bp) ctn I (200bp) hes EBs N GATA4 (475bp) Nkx2.5 (233bp) 그림 21. 인간배아줄기세포와배아체에서유도분화때의심근특이적으로발현되는 유전자의변화 - 43 -
나. 신경세포로의분화 세개의인간배아줄기세포주 (SNUhES1, SNUhES2, and SNUhES3) 로부터신경과상피세포쪽으로의분화능을비교하고성숙한신경세포로의분화를유도하였다. 배상체를형성한후 N2 supplement와 bfgf가첨가된배지에서신경모세포로분화를유도한결과배양 7일째에신경모세포의표식자인 nestin mrna의발현이최고점에달했으며 ( 그림22) 그림 22. 인간배아줄기세포를부착배양때배양기간에따른 Nestin 의발현양상 이때의세포들에서신경모세포로의분화때특이적으로보여지는신경모세포들의신경망형성을비교했을때유의한차이가나타남을볼수있었다. 사용한세포주중 SNUhES1은가장많은형성률 (~36%) 을갖는것으로나타났으며 SNUhES2에서는거의신경망형성을볼수없었다 (<2%)( 그림 23). - 44 -
Cell line Frequnency SNUhES1 36.2 ± 5.8% (26/88, 26/65, 23/59) SNUhES2 < 2% (1/66, 0/57, 1/55) SNUhES3 18.9 ± 1.7% (14/79, 20/96, 16/88) 그림 23. 인간배아줄기세포를신경으로분화시킬때세포주에따른신경망 형성율비교 유세포분석을통해 nestin 발현세포의비율을비교한결과 70% 정도로 큰 차이가없게나타나는데실제로이들을면역조직학적분석을해보면 nestin 을발 현하는세포들이신경모세포의형태가아닌것을알수있었다 ( 그림 24). 그림 24. 배양조건과세포주에따른신경모세포형성율 - 45 -
SNUhES1 SNUhES2 SNUhES3 Suspension cultured EB Attachment cultured EB 그림 25. 각각의인간배아줄기세포주로만든 EB 를부착배양할때나타나는 신경전구체및신경망형성 이러한결과는 nestin 을발현하는세포들이모두신경모세포는아닌것으로 보여지며분화를더욱진행시켜성숙한신경세포를만들었을때도 SNUhES2 는 거의신경세포가나타나지않는것으로볼때 SNUhES2 는같은조건아래서는신 - 46 -
경세포로의분화가이루어지지않는것으로보인다. 반면에 SNUhES1의경우분화를진행시키면대부분의세포군에서성숙한신경세포의표식자인 betaiii-tubulin 과 neurofilament heavy chain을발현하는세포들이나타나며 retinoic acid를처리할경우대부분의세포가 (>80%) 상피세포의표식자중하나인 pancytokeratin을발현하는것을볼수있으며, 반면에 SNUhES1과 SNUhES3에서는일부만이 (<20%) 이와같은세포들로분화하는것을볼수있었다 ( 그림 25 ~ 26). NF-H)/βIII tubulin a Pancytokeratin (d)/myosin/gfap(f) d b e c f 그림 26. 세포주에따른분화양상의차이 SNUhES1 (a, e, f), SNUhES2 (b, d), SNUhES3 (c) cell line on spontaneous (e), RA (d), β-ngf (a,b,c), PDGF treatment culture (f). - 47 -
βiii-tubulin A2B5 그림 27. 배아줄기세포로부터분화된신경세포및신경세포특이적표지자의 발현양상 이러한결과로볼때각각다른배아줄기세포주들은그분화능에있어서차이를보이며원하는실험과얻고자하는목표세포로의분화를위해서는세포주의선택이하나의관건이될수있으며경우에따라서는세포주에따라각각다른방법들이사용되어져야할것으로사료된다. - 48 -
다. 단백질도입기술 인간배아줄기세포에서는여러가지유전적변형방법들이효율적으로적용 되지않고있어연구에제한점이많다. 이를해결하는수단으로세포막을통과시 켜단백질을세포내로직접전달해주는방법인단백질도입기술을적용해보았다. 본연구에서는 HIV-1 TAT 단백질에서 47 ~ 57 번까지 11 개의아미노산으로이 루어진부위로서세포막을통과하는활성을가지는 TAT protein transduction domain (PTD) 이인간배아줄기세포에서작용하는지를조사하여보았다. TAT 펩타이드에형광색소인 FITC를융합시켜인간배아줄기세포에처리했을때대부분의세포에서형광이나타났으며, 배아체 (embryonic body) 를 TAT-FITC로처리한후 flow cytometry로분석한결과 70% 이상의세포에서형광이나타났다 ( 그림 28 ~ 29). FITC TAT-FITC ES 400 um EB 그림 28. 형광표지된단백질을도입한세포를형광현미경으로관찰한모습 위 : ES, 아래 : EB, 좌 : FITC control, 우 : TAT-FITC - 49 -
또한췌장의발생에필수적인역할을하는 Pdx1 단백질을 TAT PTD에융합시켜인간배아줄기세포에처리해보았다. 그결과 TAT-Pdx1 단백질이세포내로전달됨을확인할수있었고단백질도입이 1 시간내에일어나는빠른과정이었다. 세포내로전달된 TAT-Pdx1 단백질이활성을가지는지알아보기위해 EB를 TAT-Pdx1으로처리한후 Pdx1 전사인자가췌장발생과정에서그발현을조절하는것으로알려진 insulin, Pdx1, somatostatin, glucokinase 등의하위표적유전자 (downstream target gene) 들에대해서 RT-PCR을수행해보았다. 그림 29. 배아체 (embryonic body) 를 TAT-FITC 로처리한후 flow cytometry 로분석한결과. 그결과 insulin과 Pdx1의 mrna 수준이증가하는것으로조사되었다. insulin에대한항체로배아체를염색해본결과인슐린단백질발현의증가를관찰할수있었다. 이상의결과로 TAT PTD를매개로하는단백질도입이인간배아줄기세포에서효율적으로작용함을알수있었다. 따라서단백질도입기술은다른여러종류의단백질에대해서도적용할수있을것이며특히분화를유도하거나세포의특성을변화시키는단백질을인간배아줄기세포에전달해주는경우특정세포로의분화를통한세포치료 (cell-based therapy) 또는분화과정에관여하는유전자의기능연구나새로운유전자의동정등에응용될수있는유용한연구수단을제공할것이다. - 50 -
라. 거핵세포로의분화 본연구팀은인간배아줄기세포 (SNUhES3) 에서거핵구로의분화능을유체분석기 (FACS) 를이용하여시간에따른연구결과 ( 그림 30) 를얻었다. CD41 CD42bα 그림 30. 시간에따른거핵구의분화양상 Megakaryocytic Differentiation (Time Dependent) - 51 -
또한거핵구분화시수반되는 polyploidization 을인간배아줄기세포에서분화된세 포들 (30, 40 일 ) 을 DAPI staining 하여다음과같은결과 ( 그림 31) 를얻을수있었다. d.30 d.40 d. 그림 31. 인간배아줄기세포로부터분화된거핵구의형태학적특징 ( 200, DAPI Staining) Morphologies of Differentiated hes ( 200, DAPI Staining) 이러한연구결과를바탕으로거핵구분화시발현되는유전자동정, 단백질동정및 polyploidization시나타나는핵의다양성을 PI staining을통해살펴볼예정이다. 또한혈소판으로의분화를 OP9 cells에서유도하여혈소판이상증상으로인한질병에이상적인대체임상치료에사용할계획이다. 이와같은연구는인간배아줄기세포의다량공급이가능한그경쟁력을최대한으로활용하여임상치료와신약개발로연장될수있다는점에서그의미가혁신적이라사료된다. - 52 -
마. 인간배아줄기세포로부터췌장내분비세포의분화유도기술개발 미분화된 ES cell을췌장세포로분화시키는방법을개발하고자, embryoid body 형성및배양기간과 adhesion culture 시배양기간에따른 gene expression 을관찰하여, 유도분화에적절한시기를선택하고자하였다. 자연분화시전반적인 EB의모양은 simple EB로단순한 cell 덩어리를이룬것이대부분이었으며, 배양 2주부터, EB내에 cyst를형성한 cystic EB가형성되기시작하였다. 배양기간에따라미분화 marker인 oct-4 와 nanog의 expression 을관찰해보면, 전배양기간중모든시기에발현이되나, EB 배양기간이길어짐에따라감소하는경향을나타내었다. Endoderm marker의발현은주로 EB 배양 2, 3주경가장많이발현되나, 그발현양상은각 marker에따라다른양상을보여준다 ( 그림 32). EB: 0d 4d 1wk 2wk 3wk 4wk 6wk NC Oct-4 (219 bp) Nanog (380 bp) Nestin (495 bp) AFP (676 bp) Amylase (490 bp) Ngn3 (948 bp) Pdx-1 (262 bp) GAPDH (302 bp) 그림 32. EB 배양기간에따른유전자의발현양상관찰 (RT-PCR) 1) Undifferentiated M arker expression: Oct-4, Nanog 2) Endoderm M arker: AFP, Amylase, Albumin 3) Pancreatic endocrine progenitor cell marker: Pdx-1, ngn 3 4) Internal control marker: GAPDH - 53 -
AFP의경우는발생초기에는 extraembryonic endoderm marker (visceralendoderm marker) 이지만, 시간이지남에따라 liver의 specific marker로사용되는데, EB배양기간에따른발현은배양 2주경부터나타나기시작하여 3주경에 peak을이루고이후서서히감소하는경향을나타낸다. Albumin은 liver 발생의 specific marker 인데, 배양전과정에서발현이되지않았다. Amylase는 pancreatic exocrine cell marker로서전기간에걸쳐발현되나, 역시배양 2, 3주경 가장많이발현되는양상을보인다. Pancreatic endocrine progenitor cell marker 인 Pdx-1은 insulin producing cell의분화초기에 expression되다가사라진후 insulin producing cell maturation 시기에많이발현되는 gene으로배양중인 EB에서는배양 2주부터서서히나타나기시작하여점점증가되는양상을보인다. ngn3 는 pdx-1 발현이후, 나타나는 gene인데, 본실험결과는배양전과정에서발현되는것으로나타났다 ( 그림 33). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Nanog (380 bp) Oct-4 (219 bp) GAPDH (302 bp) Lane 1: EB 3wk (simple), Lane 2: EB 3wk (cystic), Lane 3: EB 3wk+ AD 2 day, Lane 4: EB 3wk + AD 4 day, Lane 5: EB 3wk + AD 7 day, Lane 6: EB 3wk + AD 14 day, Lane 7: Undifferentiated ESC, Lane 8: ES w/o feeder 2 day, Lane 9: ES w/o feeder 4 day, Lane 10: ES w/o feeder 7 day, Lane 11: Blank(w/o RT) 그림 33. 부착된 EB 의분화기간에따른 gene expression 조사 EB 배양 1, 2, 3, 4주후 adhesive culture를하여 1주일간 ITS-X media로배양한다음 4주간 N2+B27+10mM Nicotineamide로배양하여 HNF3β와 insulin의발현을 ICC로관찰하였다. EB 3주에서 insulin의경우 1주및 2주, 4주에는거의발현되지않은반면에, HNF3β는모든경우고루발현됨을관찰하였다 ( 그림 34 ~ 37). - 54 -
<HNF3β> <Insulin> <DAPI staining> <Merge> 그림 34. 인간배아줄기세포로부터분화된세포들중에서나타나는 Pancreatic β-cell marker. HNF3β: early endodermal cell lineage marker hes2 P11-128 EB Differentiation Phase contrast MS Image HNF3β HNF3β + DAPI staining 그림 35. SNUhES2 세포주로부터분화된세포들중에서나타나는 Pancreatic β-cell marker. HNF3β: early endodermal cell lineage marker - 55 -
H-E staining of hes3 EB 8 wks Morphology of Whole EBs Ductal epithelia and glandular cell Endothelial cells Morphology of neuroepithelia or neural tubes 그림 36. 인간배아줄기세포로부터만들어진 EB 를자연분화시킬때나타나는 각종분화된세포들의형태학적특징 hes2 P11-128 EB Differentiation Phase contrast MS Image HNF 3 β Cytokeratin 19 Merge (w/ DAPI) 그림 37. SNUhES2 세포주로부터분화된세포들중에서나타나는 Pancreatic β-cell marker. Cytokeratin 19: epithelial marker, HNF3β: early endodermal cell lineage marker - 56 -
유도분화의또다른조건으로 RA를사용하였다. RA 7day sample을 cytokeratin19과 HNF3β로 ICC staining 한결과대부분의 cell들이 cytokeratin 19 에 positive 하고, 극히일부의 cell 만이 HNF3β에 positive한결과를보였다. 유도분화때 mrna 수준에서차이를보기위해 RT-PCR을진행하였으며자연분화와의차이점을비교하였다 ( 그림 38). mrna expression during the inducing culture Pdx-1 (? bp) HNF3β (199 bp) Amylase (490 bp) Oct-4 (219 bp) GAPDH (302 bp) Lane 1: Undifferentiated hesc Lane 2: EB 7 days Lane 3: EB + AD culture 7days, Lane 4: RA treatment 7days, Lane 5: N2+B27+bFGF 7days, Lane 6: N2+B27+nicotinamide, Lane 7: Blank, 그림 38. 유도분화에따른 Endoderm-related gene 의발현양상 Endoderm-related gene expression in the inducing culture - 57 -
RA를이용한췌장세포로유도를확인하기위해 RA 1일간처리, bfgf 및 nicotinamide처리후 cell morphology를관찰하고 dithizone staining을하였다. hes3에서극히일부가 dithizone에 staining 되었다. 이부분에서인슐린이생성되는지보기위해인슐린과 c-peptide의항체를이용하여조직형광염색을수행한결과일부에서 positive한결과를얻을수있었다 ( 그림 39 ~ 42). RA 1+ bfgf 3d RA 1+bFG F 6d RA 1+bFGF 7+N IC 4 RA 1+bFG F 7+NIC 6d 그림 39. RA 1 일간처리후 bfgf 및 nicotinamide 처리후나타난 cell 의모양 그림 40. 인간배아줄기세포로부터분화된세포중 Dithizone staining 에염색된세포군 - 58 -
그림 41. Immunocytochemical staining: Insulin(Red)+C-peptide(G) 그림 42. w/o RA + bfgf 7 일처리한 sample: HNF3β(Red) + Nestin (Green) - 59 -
바. 배양기간에따른인간배아줄기세포의특성변화 인간배아줄기세포를계대배양하는동안 passage에따라변화를발견할수있는데이러한관찰을토대로계대배양동안세포의증식및분화능에어떠한차이가나타나는지를정량화하고 further study에도움을주고자본연구를수행하였다. 각 group에서 day 2일부터 day 6일까지 linear 상태이기때문에 day 2일을기준으로 doubling time을계산한결과 50계대 (middle) 이후에는세포증식이빨라지는것을관찰할수있었다. Early hes cell, 20계대 : 2.31 day (55.44 hours); Mid hes cell, 70계대 : 0.81 day (19.44 hours); Late hes cell, 120계대 : 1.04 day (24.96 hours) ( 그림 43 ~ 45) Colony Size(Area) 60 50 ADU 40 30 20 10 P16-12 P22-58 P11-108 0 1 2 3 4 5 6 7 Day Early Mid Late Day 2 2.483333 1.966667 2.083333 Day 3 1.483333 2.333333 4.366667 Day 4 5.2 5.5 7.85 Day 5 5.983333 7.316667 12.03333 Day 6 5.9 9.65 16.2 Early Mid Late hes Day 2 1 1 1 Day 3 0.597315 1.186441 2.096 Day 4 2.09396 2.79661 3.768 Day 5 2.409396 3.720339 5.776 Day 6 2.375839 4.90678 7.776 그림 43. 배양기간에따른배아줄기세포군의면적변화 - 60 -
그림 44. 배양기간에따른배아줄기세포군의수적변화 그림 45. 회귀분석적용을통한 3 차모형에적용. - 61 -
hes cell을장기간배양하며실험하였을때, passage가지남에따라 EB의형성및 adhesive culture( 즉 differentiation) 가잘되지않는현상이나타남을관찰하였다. 또한 hesc가 passage가지남에따라분화능이떨어지며, 미분화상태를유지하려는경향이있는것으로관찰되었다. EB 배양기간에따른유전자발현양상관찰에서미분화 marker인 Oct-4, Nanog 등은 EB 배양기간에관계없이 expression되었으나 EB형성후 EB의만들어진상태에따라서는변화가관찰되었다. 미분화및분화 marker의 gene expression은 real-time PCR을이용하여정량적분석을하고, adhesive culture 동안 surface marker의발현을 IHC로관찰하였다 ( 그림 46 ~ 48). Oct-4 Expression Pattern Nanog Expression Pattern A rbitrary Un i 700.00 600.00 500.00 400.00 300.00 200.00 100.00 0.00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Samples A r b it r a r y U n it ( A U 14.00 12.00 10.00 8.00 6.00 4.00 2.00 0.00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Samples 그림 46. Real time PCR 결과 1, 미분화 hesc (early passage, P26); 2, 미분화 hesc (middle passage, P78); 3, 미분화 hesc (late passage, P117); 4, 3주째 EBs(early passage, P21, simple EBs); 5, 3주째 EBs(early passage, P21, cystic EBs); 6, 3주째 EBs(middle passage, P73, simple EBs); 7, 3주째 EBs(middle passage, P73, cystic EBs); 8, 3 주째 EBs(late passage, P112, simple EBs); 9, 3주 EB+2 주부착배양 (early passage, P21); 10, 3주 EB+2 주부착배양 (middle passage, P73); 11, 3주 EB+2 주부착배양 (late passage, P73) - 62 -
Early Passag e(p21) M iddle passag e(p73) L ate passag e(p112) 그림 47. 3 주째 EB 의부착배양에따른형태적특징 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Oct-4 (219 bp) Nanog (380 bp) Nestin (495 bp) GAPDH (302 bp) Lane 1:un-hESC (Early), Lane 2: un-hesc (Middle), Lane 3: un-hesc ( Late), Lane 4: EB 3wk (Early, simple), Lane 5: EB 3wk (Early, cystic), Lane 6: EB 3wk (middle, simple) Lane 7: EB 3wk (middle, cystic), Lane 8: EB 3wk (Late, simple), Lane 9: EB 3wk + AD 2 week (Early) Lane 10: EB 3wk + AD 2 week (Middle), Lane 11: EB 3wk + AD 2 week (Late) 그림 48. Conventional RT-PCR 결과 - 63 -
사. 인간배아줄기세포의 3 차원배양에서 alginate hydrogel 의역할및효과 인간배아줄기세포의분화에영향을주는요인들은너무나도많지만대부분의연구들은주로특정유전자나분화인자에치우쳐있다하지만실제로생체내에서분화에관련된환경에는이러한요소들만이아니라세포들이위치하고있는 3차원적환경또한중요한역할을할것으로여겨지고있다. 이에본실험에서는생체내의환경과꼭같지는않지만 alginate를이용하여인위적으로 3차원적환경을만들어줌으로써새로운분화요인을찾아보고자하였다. ESC Culture Using Various Materials cell line matrix treatment differentiation 1.6% alginate gel lens-shaped colonies Magyar et al. (2001) R1(mouse ESC) 1.1% alginate gel spontaneously beating areas 1.1% alginate gel RA smooth muscle actinα, calponin monolayer culture epithelial cell dominant Chen et al. (2003) R366.4(monkey ESC) collagen gel coculture with HPI.1 NCAM(45%)ChromograninA(20 %) NCAM(65%)ChromograninA(45 %) Vimentin(40%)FactorⅧ(15%) collagen sponge coculture with HPI.1 Vimentin(80%)FactorⅧ(25%) RA cytokeratin positive areas Levenberg et al. (2003) H9(human ESC) PLGA50%,PLLA50% TGF-β activin-a secreting GAG producing AFP, albumin, PDX-1 IGF producing AFP and albumin - 64 -
Alginate hydrogel 안에서 EB를배양할경우일반적인 EB 보다크기가작고 compact 해지는것을관찰하였다. 이때 gel 안의 EB는 pod-like structure를가지는구조물이종종나타나며조직학적검사시좀더 homogenous한세포들로이루어지는것을관찰하였다 ( 그림 49). EB control (day14) x100 EB in alginate hydrogel (day14) x200 그림 49. Alginate hydrogel 안에서 EB 배양시배양시간에따른형태적변화 - 65 -
RT-PCR S1 S2 S3 A0 A1 A2 A3 Oct-4 Nanog Nestin Amylase GAPDH S1: Small clump suspension S2: EB suspension culture S3: ES colony A0: Single cells in alginate A1: Small clump in alginate A2: EB in alginate A3: ES colony in alginate 그림 50. Alginate hydrogel 을이용한배양에따른유전자발현의차이 RT-PCR 결과미분화 marker 인 Oct4 와 nanog 는 suspension cultured EB 와별차이가없었으나외배엽이나내배엽쪽의발현은억제되는결과가나타났다 ( 그림 50). - 66 -
아. 인간배아줄기세포로부터 motor neuron 으로의분화 인간배아줄기세포로부터 motor neuron 으로의분화를유도하기위하여 feeder-free culture 하에서 chemical method 혹은 lentiviriral vectors 을이용하여 hes cells 내로특 정유전자 (ngn1, olig2) 를도입하여, direct neural progenitor 로의분화를유도할수 있는 cell line 을확립하고 human foreskin fibroblast-conditioned medium 을이용한 feeder-free 상태에서 human embryonic stem cells 의배양조건확립하고자본연구 를수행하였다 ( 그림 51 ~ 53). Transfection Liposome Lentivirus SuperFect FUGENE6 On STO vs Feeder-free Feeder-free On STO vs Feeder-free DNA:Reagent attached clump 그림 51. 유전자도입계획 x100 x100 relative efficiency 35 30 25 20 15 10 5 5 30 0 Fugene6 1 SuperFect 2 x100 x100 그림 52. Liposome 에의한 transfection 효율비교 - 67 -
By lentivirus Feeder-free vs on STO 48hr 72 hr 96 hr 그림 53. Lentivirus 의한 transfection Conclusion 1. Transfection efficiency On STO => failed SNUhES3 cells (Early: p16-40 Middle: p22-80) By liposome By lentivirus Feeder-free => a little be successed On STO => failed Attached reaction => failed Feeder-free => failed Clump reaction => failed 2. G418 resistance => SNUhESCs : 50 ~ 100 ug/ml - 68 -
자. 인간배아줄기세포배양을위한지지세포배양조건의확립 인간배아줄기세포는주로지지세포위에서배양이되고있는데각연구자마다지지세포의배양조건을달리하고있으며이러한차이들은인간배아줄기세포배양에영향을줄수있다. 본연구에서는지지세포의증식을억제하는대표적인두가지방법 (mitomycin처리, gamma-irradiation) 이사용될때이들이줄기세포증식에어떠한영향을줄수있는지검정해보았다 ( 그림 54 ~ 57). 그림 54. 미분화 marker 인 Oct4/SSEA3 의발현비교 그림 55. 미분화 marker 인 Oct4/SSEA4 의발현비교 - 69 -
그림 56. 미분화 marker 인 Oct4/Tra1-60 의발현비교 그림 57. 미분화 marker 인 Oct4/Tra1-60 의발현비교 - 70 -
차. 정상인간배아줄기세포와염색체이상을갖는인간배아줄기세포에서 CD30 의발현차이비교 CD30은암세포나비정상적으로증식하는세포에서발현되는것으로알려져있으며최근줄기세포에서의발현이보고된바있다. 본연구에서는인간배아줄기세포에서 CD30의발현양상을확인하고비정상적인염색체를갖는인간배아줄기세포에서와의발현차이를비교하고자하였다 ( 그림 58 ~ 60). Abnormal versus Normal hescs hes19 p36 Normal XY hes19 p36 XY, +12 hes3 p11-141 Normal XY hes3 p11-141 XY, +12 All images magnified x 400 그림 58. 정상과비정상적인염색체를갖는인간배아줄기세포에서 CD30 발현의차이 - 71 -
FACS: CD30 in hes3 2.1% Negative control 67.6% 78.0% Normal Abnormal 그림 59. 유세포분석에의한 CD30 의차이비교 x400 그림 60. 분화에따른 CD30 발현의감소 DAPI(blue), Oct4(green), CD30(red), differentiated region(arrow) - 72 -
카. 인간배아줄기세포로부터 Oligodendrocyte 로의분화 손상된신경세포의 remyelination에중요한역할을하는 oligodendrocyte를인간배아줄기세포로부터분화시키기위해본연구를실행하였다. 신경계전구체형성후 oligodendrocyte의전구체를형성하였으며이들로부터성숙한 oligodendrocyte를얻을수있었고 myelination을확인하였다 ( 그림 61 ~ 67). Day 7 Day 11 Day 19 Day 27 Day 41-48 Expansion of undifferentiated ES cells Formation of EBs Induction of A2B5 -positive cells(opc) Selection of nestinpositive cells Differentiation to mature oligodendrocytes Stage I Stage II Stage III Stage IV Stage V 그림 61. Oligodendrocytes 의분화단계 A B C D 200um 200um 100um 100um 그림 62. EB 로부터 Neural progenitor(npc) 로의분화 - 73 -
E F G H 50um 50um 50um 50um 그림 63. NPC 로부터 mature oligodendrocyte 로의분화 그림 64. Mature oligodendrocyt(ng2-red, O1-green) 그림 65. Oligodendrocyt 전구체의수율 (75.89%) - 74 -
Stage1, 2, 3, 4, 5 A B C D E F GAPDH Nestin PDGF-R NG2 MBP PLP 그림 66. Stage-specific mrna expression 그림 67. 인간배아줄기세포로부터분화된 oligodendrocyte myelination 의 전자현미경관찰 - 75 -
5. 논문, 학술회의발표및특허출원 / 등록실적 1) 논문발표 : 21 건 국외 구분발표자논문제목 SCI Hwang WS, Ryu YJ, Park JH, Park ES, Lee EG, Koo JM, Chun HY, Lee BC, Kang SK, Kim SJ, Ahn C, Hwang JH, Park KY, Cibelli JB, Moon SY Yu DH, Lee KH, Lee JY. Kim S, Shin DM, Kim JH, Lee YS, Lee YS, Lee YS, Oh SK, Moon SY, Lee SH, Lee YS Suh MR, Lee Y, Kim JY, Kim SK, Moon SH, Lee JY, Cha KY, Chung HM, Yoon HS, Moon SY, Kim VN, Kim KS Kim SJ, Park JH, Lee JE, Kim JM, Lee JB, Moon SY, Roh SI, Kim CG, Yoon HS Chang KH, Lim JM, Kang SK, Lee BC, Moon SY, Hwang WS Evidence of a pluripotent human embryonic stem cell line derived from a cloned blastocyst Changes of Gene Expression Profiles During Neuronal Differentiation of Central Nervous System Orecursors Treated With Ascorbic Acid Human embryonic stem cells express a unique set of micrornas Effects of type IV collagen and laminin on the cryopreservation of human embryonic stem cells. An optimized protocol of a human-to-cattle interspecies somatic cell nuclear transfer 학술지 명칭 Science J Neurosc i Res Dev Biol Stem Cells. Fertil Steril 권 : 쪽 ( 년도 ) 303 :1669-16 74 (2004) 78 :29-37 (2004) 15 ;270:488-98 (2004) 22: 950-61 (2004) 82: 960-2 (2004) impact factor 책임또는제 1 저자및공동저자구분 29.162 책임 3.374 공동 5.351 공동 5.8 공동 3.483 공동 비 고 - 76 -
구분발표자논문제목 학술지 명칭 권 : 쪽 ( 년도 ) impact factor 책임또는제 1 저자및공동저자구분 비 고 Kim TM, Park TS, Shin SS, Han JY, Moon SY, Lim JM. An interclass nuclear transfer between fowl and mammal: in vitro development of chicken-to-cattle interclass embryos and the detection of chicken genetic complements. Fertil Steril. 82(4) :957-9 (2004) 3.483 공동 국 외 SCI Oh SK, Kim HS, Ahn HJ, Seol HW, Kim YY, Park YB, Yoon CJ, Kim DW. Kim SH, Moon SY SK Oh, HS Kim, YB Park, HW Seol, YY Kim, DW Kim, SY Moon SK Kim, MR Suh, HS Yoon, JB Lee, SK Oh, SY Moon, SH Moon, JY Lee, JH Hwang, WJ Cho, KS Kim Derivation and Characterization of New Human Embryonic stem cell lines, SNUhES1, SNUhES2 and SNUhES3 Methods for Expansion of Human Embryonic Stem Cells Identification of Developmental Pluripotency Associated 5 Expression in Human Pluripotent Stem Cells Stem Cells Stem Cells Stem Cells 23 :211-9 (2005) ;23 :605-9 (2005) 23 :458-62 (2005) 5.8 책임 5.8 책임 5.8 공동 Lee EM, Kim JY, Cho BR, Chung WK, Yoon BW, Kim SU, Lee BC, Hwang WS, Moon SY, Lee JS, Ahn C. Down-regulation of MHC class I expression in human neuronal stem cells using viral stealth mechanism. Bioche m Biophy s Res Comm un 28;326:8 25-35 (2005) 2.836 공동 - 77 -
국외 구분발표자논문제목 SCI WS Hwang, SI Roh, BC Lee, SK Kang, DK Kwon, S Kim, SJ Kim, SW Park, HS K, CK Lee, JB Lee, JM Kim, C Ahn, SH Paek, SS Chang, JJ Koo, HS Yoon, JH Hwang, YY Hwang, YS Park, SK Oh, HS Kim, JH Park, SY Moon, G Schatten SY Ha, BC Jee, CS Suh, HS Kim, SK Oh, SH Kim, SY Moon HS Kim, SK Oh, YB Park, HJ Ahn, LA Lee, DW Kim, SY Moon YD Kwon, SK Oh, HS Kim, S-Y Ku, SH Kim, YM Choi, SY Moon Patient-Specific Embryonic Stem Cells Derived from Human SCNT Blastocyst Cryopreservation of human embryonic stem cells without the use of a programmable freezer Derivation of Human Embryonic Stem Cells Depending on Quality of Blastocyst Cellular Manipulation of Human Embryonic Stem Cells by TAT-PDX1 Protein Transduction 학술지 명칭 권 : 쪽 ( 년도 ) impact factor 책임또는제 1 저자및공동저자구분 Science 2005. 5 29.162 공동 Human Reprod Stem Cells Molecular Therapy 20;1779-85(2005) 2004. 11 submiit ed 2005. 1 submiit ed 3.125 책임 5.8 책임 6.125 책임 비 고 - 78 -
국내 구분발표자논문제목 SCI 비 SCI Lee KJ, Choi SJ, Kim J, Park JK, Kang WS, Park KH, Kim S, Moon SY, ChungHM, Hwang TS, Song J 김희선, 안희진, 김윤영, 설혜원, 오선경, 서창석, 김석현, 문신용오선경, 김희선, 안희진, 윤철종, 문신용 김희선, 안희진, 김석현, 김수진, 오선경, 문신용 권영도, 오선경, 문신용 김윤영, 김희선, 오선경, 구승엽, 김석현, 최영민, 김정구, 문신용김희선, 설혜원, 안희진, 오선경, 구승엽, 김석현, 최영민, 김정구, 문신용 Neuronal Differentiation of Human ES Cells by Co-Culturing with PA6 Stromal Cells 배양액의조성차이에따른인간배아줄기세포의계대배양에관한연구 인간배아줄기세포의전자현미경적연구 인간배아줄기세포에서 Flow cytometry analysis를이용한 Apoptosis에관한연구 TAT PTD를이용한 Nkx2.5 단백질의인간배아줄기세포로의도입 인간배아줄기세포의심근세포로의분화유도 양수세포를이용한인간배아줄기세포의배양방법 학술지 명칭 Korean J Genetics 인구의학연구논집 인구의학연구논집 인구의학연구논집 인구의학연구논집 인구의학연구논집 대한불임학회지 권 : 쪽 ( 년도 ) 2004;26 :185-192 2002;15: 18-24 2004;17 :54-58 2004;17: 59-65 2004;17 :48-53 2004;17 :66-69 2004;31 :261-271 impact factor 책임또는제 1 저자및공동저자구분 0.562 공동 책임 책임 책임 책임 책임 책임 비 고 - 79 -
2) 학술대회발표 : 42 건 구분발표자학술회의명칭발표제목 국외 Oh SK, Kim HS, Ahn HJ, Kim YY, Seol HW, Moon SY Kim HS, Oh SK, Sung KC, Kang MJ, Moon SY Moon SY Kim YY, Seol HW, Ahn HJ Moon SY Moon SY Moon SY Oh SK, Kim HS, Seol HW, Ahn HJ, Kim YY, Kang MJ, Sung KC, Cho MS, Moon SY Keystone symposia Keystone symposia Pre-Congress course stem cells International society for stem cell research forth International seminar on reproductive medicine and asistedreproductive technology in Beijing Asian Stem Cell Network Workshop, kti2003 Stem cells and somatic cells cloning research: present status and future trends Keystone symposia Establishment of Human Embryonic stem cell and difference of temporal expression pattern in embryoid bodies The study on vitrification and ultrarapid thawing of human emryonic stem cells Establishment and characterization of human embryonic stem cells Temporal expression of differentiation markers in embryoid bodies from various human embryonic stem cell lines. Establishment and characterization of human embryonic stem cells Establishment and characterization of human embryonic stem cells Key Lecture : Future challenge in stem cell technology : Therapeutic cloning : Clinical application Human amniotic fluid cells prolonged expansion culture of human embryonic stem cell 발표년월일 ( 장소 ) 2003.3.29-4.3 (Keystone) 2003.3.29-4.3 (Keystone) 2003.6.29-7.2 (Madrid) 2003.6.7 (washington) 2003.3.8 (Beijing) 2003.3.11 (Kobe) 2003.12.3-4 (chulalongkorn Univ.) 2004. 1.23-1.29 (Keystone) 국명비고미국포스터미국포스터스폐인구연미국포스터중국강연일본강연 태국강연미국포스터 - 80 -
구분발표자학술회의명칭발표제목 국외 Ahn HJ, Seol HW, Oh SK, Kim HS, Kang MJ, Ku SY, Kim SH, Choi YM, Moon SY Cho MS, Oh SK, Kim HS, Kim YY, Kim MH, Kim DW, Moon SY International Society for Stem Cell Research (ISSCR) International Society for Stem Cell Research (ISSCR) Moon SY ASRM Ha SY, Oh SK, Kim HS, Suh CS, Moon SY Cho MY, Oh SK, Kim MH, Kim DW, Moon SY Kim HS, Park YB, Oh SK, Yoon CJ, Moon SY Keystone symposia Keystone symposia Keystone symposia Comparison of Harvesting Methods for Cytogenetic Analysis of human embryonic stem(hes) Distinct properties in neural differentiation among human embryonic stem cell lines Assisted Regenerative Medicine: The Future of ART? Improved cryopreservation efficiency of human embryonic stem cells via modified slow freezing protocols Distinct properties in induction of neuronal phenotypes among three hes cell lines Ultrastructural analysis of undifferentiated and differentiated hesc 발표년월일 ( 장소 ) 2004, 6.10-6.13 World Trade Center in Boston, Mass. 2004, 6.10-6.13 World Trade Center in Boston, Mass. 2004.10.16-20 Philadelphia, USA 2005. 2.10-15 (Banff) 2005. 2.10-15 (Banff) 2005. 2.10-15 (Banff) 국명비고미국포스터미국포스터미국강연캐나다포스터캐나다포스터캐나다포스터 - 81 -
구분발표자학술회의명칭발표제목 국내 김희선, 이기주, 안희진, 오선경, 서창석, 김석현, 최영민, 문신용안희진, 김희선, 김윤영, 설혜원, 오선경, 서창석, 김석현, 최영민, 문신용 Oh SK, Kim HS, Ahn HJ, Kim YY, Seol HW, Moon SY Kim YY, Seol HW, Ahn HJ, Cho MS, Kim HS, Oh SK, Moon SY Oh SK Cho MS, Oh SK, Ku SY, Kim HS, Choi YM, Kim JG, Moon SY 김희선, 윤철종, 안희진하성윤, 김윤영, 성기청, 설혜원, 오선경, 김석현, 문신용 Oh SK, Seol HW, Ahn HJ, Kim YY, Kang MJ, Kim HS, Ku SY, Kim SH, Choi YM, Moon SY Kim JS 대한불임학회 대한불임학회 조직공학회 조직공학회 2003 KRIBB Conference 대한불임학회 대한불임학회 대한불임학회 천연의약연구소심포지엄 인간배아줄기세포의확립과그특성분석 배양액의조성차이에따른인간배아줄기세포의계대배양에관한비교연구 Establishment of Human Embryonic Stem Cell lines cel and difference of Temporal Expression Pattern in embryoid bodies Temporal expression of differentiation markers in embryoid bodies from various human embryonic stem cell lines. Biological and laboratory aspect of human embryonic stem cell Effect of the some neural inducing factors in neural differentiation of human embryonic stem cells 인간배아줄기세포와배아체의전자현미경적연구 Human amniotic fluid cells prolonged expansion culture of human embryonic stem cell Sox10 maintains the multipotency and inhibits neuronal differentiation of neural differentiation of neural crest stem cells 발표년월일 ( 장소 ) 2002.11.22 ( 서울 ) 2002.11.22 ( 서울 ) 2003.5.24 ( 서울 ) 2003.5.24 ( 서울 ) 2003.11.6 ( 생명공학연구원 ) 2003.12.5 ( 서울 ) 2003.12.5 ( 서울 ) 2003.12.5 ( 서울 ) 2003.12.9 ( 한림대학교 ) 국명한국한국한국한국한국한국한국한국한국 비고포스터포스터구두포스터강연구연포스터포스터강연 - 82 -
구분발표자학술회의명칭발표제목 국내 Kim JS Cho MS, Oh SK, Kim HS, Kim YY, Kim DW, Moon SY Cho MS, Oh SK, Kim HS, Kim YY, Kim DW, Moon SY Cho MS, Oh SK, Kim MH, Ku SY, Kim SH, Choi YM, Kim DW, Moon SY 박용빈, 설혜원, 김희선, 오선경, 정순간, 문신용하성윤, 오선경, 김희선, 구승엽, 지병철, 서창석, 김석현, 최영민, 김정구, 문신용 Cho MS, Oh SK, Kim HS, Kim YY, Kim MH, Kim DW, Moon SY Moon SY Cho MS, Oh SK, Kim HS, Kim YY, Kim MH, Kim DW, Moon SY Seol HW, Oh SK, Kim HS, Ko HJ, Lim A, Ku SY, Kim SH, Choi YM, Kim JG, Moon SY 한국분자세포생물학회 기초의학회학술대회 한국생화학분자생물학회학술대회 대한불임학회 대한불임학회 대한불임학회 생리학회학술대회 대한기초치의학학술대회 한국뇌신경과학회학술대회 대한의학유전학회 Molecular characterization of neural stem cells of CNS and PNS Distinct properties in neural differentiation among human embryonic stem cell lines Distinct properties in neural differentiation among human embryonic stem cell lines, Distinct properties in neural differentiation among human embryonic stem cell lines 인간배아줄기세포 (SNUhES 3) 의자발적분화에따른내배엽세포유전자의발현 동결보존액의조성에따른인간배아줄기세포의대량동결보존에관한연구 Distinct properties in neural differentiation among human embryonic stem cell lines 줄기세포연구의현황및전망 Distinct properties in neural differentiation among human embryonic stem cell lines, SNUhES1, SNUhES2 and SNUhES3 Occurrences of chromosomal abnormalities in prolonged human embryonic stem cell (hesc) cultures 발표년월일 ( 장소 ) 2004.2.8-10 ( 강원도 ) 2004, 5.7-5.8 ( 고려대학교, 서 울 ) 2004, 5.27-5.28 (COEX 전시관 ) 2004. 6. 18 ( 서울, 한양대 ) 2004. 6. 18 ( 서울, 한양대 ) 2004. 6. 18 ( 서울, 한양대 ) 2004, 10.14-10.15 ( 경기도 중소기업종합 지원센터 ) 2004. 11. 5-6 ( 서울 ) 2004, 12.1 ( 서울대학교 문화관 ) 2004. 11. 25 ( 서울, 삼성서울병원 ) 국명한국한국한국한국한국한국한국한국한국한국 비고강연포스터포스터포스터포스터포스터포스터강연포스터구연 - 83 -
구분발표자학술회의명칭발표제목 김희선, 안희진, 김석현, 김수진, 성기청, 강문주, 오선경, 구승엽, 김석현, 최영민, 김정구, 문신용 대한불임학회 포배기배아의내세포괴분리방법에따른인간배아줄기세포의확립 발표년월일 ( 장소 ) 2004. 11. 26 ( 서울 ) 국명 한국 비고 구연 권영도, 김윤영, 오선경, 최영민, 김정구, 문신용 대한불임학회 Cellular modification of human embryonic stem cells by Pdx1 protein transduction 2004. 11. 26 ( 서울 ) 한국 구연 Oh SK, Seol HW, Kim HS, Ko HJ, Lee LA, Ku SY, Kim SH, Choi YM, Kim JG, Moon SY 대한불임학회 Occurrences of chromosomal abnormalities in prolonged human embryonic stem cell (hesc) cultures 2004. 11. 26 ( 서울 ) 한국포스터 Doh HM, Kim BM, Oh SK, Ahn HJ, Ku SY, Kim SH, Kim WB, Moon 대한불임학회 Effect of Glucose Concentrations on Human Embryonic Stem Cell Culture 2004. 11. 26 ( 서울 ) 한국포스터 국내 김은희, 지애리, 안희진, 오선경, 백선하, 문신용 Park YB, Huh WJ, Seol HW, Kwon HJ, Kim HS, Oh SK, Chung SG, Moon SY Cho MS, Oh SK, Kim HS, Seol HW, 대한불임학회 대한불임학회 Kim YY, Lee L, Kim 대한불임학회 MH, Kim DW, Moon SY Kim YY, Kim HS, Oh SK, Ku SY, Kim SH, Choi YM, Kim JG, Moon SY Kang SM, Cho MS, Oh SK, Kim DW, Moon SY 대한불임학회 대한불임학회 Gamma-Irradiation 과 Mitomycin C 처리된영양세포가인간배아줄기세포배양에미치는영향 Proliferation rate and differentiation potential during extended culture of human embryonic stem cells Directed Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into GABAergic Neurons Differentiation of cardiomyocyte from human embryonic stem cell Efficient Generation of Oligodendrocytes from Human Embryonic Stem Cells 2004. 11. 26 ( 서울 ) 2004. 11. 26 ( 서울 ) 2004. 11. 26 ( 서울 ) 2004. 11. 26 ( 서울 ) 2004. 11. 26 ( 서울 ) 한국포스터한국포스터한국포스터한국포스터한국포스터 - 84 -
3) 특허출원 / 등록 : 1 건 구 분 명칭국명 출원인 출원등록출원등록등록등록출원일번호인일번호 비고 국내 양수세포를이용한인간 배아줄기세포의배양방법 한국문신용 2 월 14 일 10-2004-00 09812 6. 국제협력 가. 중국북경대제 3병원과줄기세포공동연구 MOU 체결 ⑴ 목적및필요성 - 인간배아줄기세포상호연구협력및상호연구소방문, 연구참여를위한기회를제공 ⑵ 연구기관 ( 양측 ) : 한국세포응용연구사업단 중국북경대제 3병원 ⑶ 책임연구자 ( 양측 ) : 한국문신용단장 중국 Chen Gui An 교수 ⑷ 연구기간 : 2003. 9.13 ~ 공동연구종료시 ⑸ 연구내용 : 보조생식술 (ART), 인간배아줄기세포확립, 핵치환을통한인간체세포주의수립 ⑹ 기대효과 - 다양한의료기술개발및고부가가치생명공학기술개발촉진 - 조직및줄기세포공학을융합한인공조직 장기생산기술개발 - 첨단생명공학연구수행능력증대및고급인력육성의극대화 ⑺ 향후계획 - 연구주제에대한연구협력 - 한 중공동연구활성화를위한인력교류 - 중국의줄기세포연구현황및자료수집 - 85 -
나. 영국줄기세포관련연구자사업단방문 - 목적 : 줄기세포연구동향논의및연구시설견학 - 일시 : 2004. 9.23 - 방문자 : 주한영국대사관과학기술환경담당 1등서기관 James Thomson외 12명 (King's College London, Pfizer, Intemational Technology Promoters,Cellcentric, Merck Sharp & Dohme, Avar Bio Ventures) 다. 자료수집및연구협의 - 한 미 (NIH) 간줄기세포연구협력방안협의및자료수집 : 2002.11.11 ~ 18 - 아시아 태평양줄기세포및복제관련학회참가 ( 싱가폴 ) : 2003. 1.14 ~ 17 - 중국북경대및일본줄기세포연구회초청강연및아시아줄기세포워크숍참석 - 86 -
( 일시 : 2003. 3. 8 ~ 13) - 제1회줄기세포연구국제회의및 NIH 심포지움참석 ( 워싱턴 ) : 2003. 6. 7 ~ 14-2003년유럽불임학회 ( 스페인마드리드 ) : Special Interest Group on Stem Cells ( 일시 : 2003. 6.28 ~ 7. 2) - 2003 한 미학술회의참석자료수집 ( 미국칼텍 ) : 2003. 8. 5 ~ 11 - 줄기세포심포지움초청강연 ( 태국, 출라롱콜른대학 ) : 2003.12. 2 ~ 4 - 바이오비즈니스인테네셔널포럼 2003 초청강연 ( 일본, 고오베 ) : 2003. 8.27 ~ 29 - 제4차한 태평양불임학회초청강연 ( 일본, 오끼나와 ) : 2004. 3.10 ~ 12 - 제7차아시아 태평양내분비생식학회초청강연 ( 말레시아, 쿠알라룸프르 ) ( 일시 : 2004. 3.26 ~ 27) - 유엔본부 Press Conference 참석 ( 미국뉴욕 ) : 2004. 6. 1 ~ 3 - ISSCR 학회참석발표 ( 미국보스톤 ) : 2004. 6.11 ~ 14-2004 ESHRE 학회발표 ( 독일베를린 ) : 2004. 6.27 ~ 7. 2-2004 재미한인과학기술자협회 Conference 참석발표 ( 미국더햄 ) : 2004. 8.12 ~ 14 - 유럽 아시아조직공학회초청강연 ( 스위스로잔 ) : 2004.10.13 - Genetic & Humanism 년차회의초청강연 ( 스페인바르셀로나 ) : 2004.10.14 - 미국불임학회초청강연 ( 미국필라델피아 ) : 2004.10.15 ~ 20 - 미국미네소타대학초청강연 ( 미국 ) : 2004.11.14 ~ 17 - 연구협력방안협의, 자료수집 ( 미국코넬대, 하버드대, 펜실베니아대 ) : 2005. 1.17 ~ 21 - "Global Watch Mission Seminar: Stem Cell Science; FAR EAST POWERS AHEAD" 회의에서주제발표 ( 영국런던, Stem Cell Research in Korea) : 2005. 1.24 6. 연구성과의파급효과및활용사례 계획 가. 연구성과의파급효과 (1) 경제적파급효과 - 세포치료법이실용화될경우매년 6,000 억원의매출이추정되며국내독자개발에의한의료비부담을현저히줄일수있음 - 수입대체효과 ( 연 ) : 60억원 연구적인면 : 6억원 산업적인면 : 54억원 - 87 -
- 각종분화세포및유전자정보는세포치료법에응용될수있으므로, 생명과학산업분야에서외국과의경쟁적우위를점할수있음 - 줄기세포의치료법개발로국제경쟁력향상및외국환자유치 - 줄기세포연구및산업인력의해외진출 (2) 고용창출효과 - 줄기세포연구관련 BT분야의고급전문기술인력양성 - 세포치료법의개발에의한새로운패러다임의의료기술발달 - 인공조직및장기생산분야의산업발달 - 효율적인신약개발산업의발달 - 약물및독성분석시스템발달 - 유용단백질대량생산산업의발달 - 고부가특수질환모델동물및생체반응기동물생산산업의발달 - 첨단생명공학벤처회사창업촉진 (3) 국가경쟁력확보 - 이미다수의인간배아줄기세포주및인간성체줄기세포주를확보하였으며, 2004년세계최초로인간복제배아줄기세포를확립함으로서사업의기반이되는원천기술을보유하고있으며이에따른경쟁력을확보하고있음 - 우수한과제의선발및집중적인지원을통한연구개발촉진으로대등한경쟁가능 나. 연구성과의활용사례및활용계획 (1) 국내에비해대규모의연구비및연구인력을확보하고있는미국, 일본, 영국등에비해낙후된기술수준을갖고있으며이를극복하기위해서는대등한기술력을가지고있는배아줄기세포확립연구를기반으로한새로운배아줄기세포확립연구, 배아줄기세포특성연구등의기초연구에집중적인투자가필요함 (2) 분화조절기술개발연구및세포치료를위한이식등의연구는경쟁력이있다고판단되는부분또는틈새를찾아 선택과집중 의원리를적용할것임 (3) 치료복제기술로난치병치료의가능성제시 - 파킨슨병, 뇌졸중및치매등뇌신경계질환, 뇌척수손상, 관절염등운동장애, 당뇨병등의담도췌장질환을치료할수있는세포치료연구에활용 - 88 -
다. 주요홍보및수상실적 1) 홍보실적 - 2002. 8.17 배아줄기세포은행국내첫설립 ( 국민일보 ) - 2002.12.16 세포응용연구사업단공식출범 ( 과학신문등 ) - 2002.12.27 인간복제, 위험한도박 (KBS 1TV 등 ) - 2003. 1.13 복제아기진짜다, 사기다.( 일간스포츠등 ) - 2003. 1.13 의사신문 : 배아줄기세포연구의윤리적사회적고찰 - 2003. 2.21 KBS 라디오인터뷰 : 세포치료 - 2003. 5. 1 KBS1 사이언스 21 제3화 - 세포들의반란 - 2003. 10 레일로드 44-45p : 건강하고행복한장수를위해 - 2004. 2.12 국내기자회견 ( 서울대병원임상의학연구소대강당 ) ( 세계최초인간복제배아줄기세포확립 ) - 2004. 2.12 American Association for the Advanced Science : AAAS ( 세계최초인간복제배아줄기세포확립발표 ) - 2004. 2.18 귀국기자회견 ( 인천공항귀빈실 (3층, 무궁화홀 )) ( 세계최초인간복제배아줄기세포확립 ) - 2004. 3.30 바이오산업국제심포지움초청강연 ( 한국보건산업진흥원주최 ) - 2004. 4.19 세계에서가장영향력있는 100인중 1사람으로선정 미국시사주간지타임 - 2004. 5. 7 기초의학학술대회초청강연 - 2004. 5.25 국림암센타초청강연 - 2004. 6.25 가톨릭의사회초청강연 - 2004. Vol.2 No. 2 여름호 Bio-Medical Science : 난치병치료의새패러다임 : 줄기세포 - 2004. Vol.4 CURO : 인간복제배아의숨은주역, 서울대문신용교수 - 2004.10.22 대한이식학회초청강연 - 2004.10.23 대한산부인과학회초청강연 - 2004.10.24 대한내과학회초청강연 - 2004.10.28 KFDA 초청강연 - 2004.10.30 고려대학교줄기세포심포지움초청강연 - 2004.11. 5 대한치과의사협회초청강연 - 89 -
- 2004.12. 4 KBS1 사이언스 21 바이오혁명 - 2004.12.15 EBS 기획특강 나로서살아가는힘 - 2004.12.16 EBS 기획특강 성공의또다른이름도전 - 2004.12.17 EBS 기획특강 한국이미래의학을열어간다 - 2005. 1. 1 SBS 8시뉴스 줄기세포가희망 세계최초로인간복제배아줄기세포확립 국내기자회견 (2004. 2.12 서울대병원임상의학연구소대강당 ) 세계최초로인간복제배아줄기세포확립 귀국기자회견 (2004. 2.18 인천공항귀빈실 (3 층무궁화홀 )) - 90 -
Science 표지에실린복제배아줄기세포 (Hwang WS, Ryu YJ, Park JH, Park ES, Lee EG, Koo JM, Jeon HY, Lee BC, Kang SK, Kim SJ, Ahn C, Hwang JH, Park KY, Cibelli JB, Moon SY. Evidence of a pluripotent human embryonic stem cell line derived from a cloned blastocyst, Science 2004:303:1669-1674) 체세포를복제한배아를이용하여인간배아줄기세포를세계최초로확립미국시애틀에서개최된미국국가과학진흥회 (American Association for the Advanced Science : AAAS : 2004년 2월 12일 ) 연례회의에서황우석, 문신용교수의공동연구진은체세포를복제한배아를이용하여인간복제배아줄기세포를세계최초로확립하였다는보고이후국내언론사의기사모음 - 91 -
2) 수상실적 - 2004. 6.18 : 과학기술훈장인혁신장을수여 ( 세계최초로인간복제배아줄기세포확립에성공 ) - 2004. 6.18 : 대한불임학회제46회학술대회학술발표상 ( 인간배아줄기세포 (SNUhES3) 의자발적분화에따른내배엽세포유전자의발현 ) - 2004.11.26 : 대한불임학회제47회학술대회학술발표상 (Occurrences of chromosomal abnormalities in prolonged human embryonic stem cell (hesc) cultures) - 2005. 1.12 : 자랑스러운경기인상수상 ( 경기고등학교총동문회 ) 세계최초로인간복제배아줄기세포확립으로과학기술 훈 포장을받은문신용단장과연구진 - 92 -
7. 2 단계연구계획 가. 줄기세포연구관련신규연구분야확보 - 현재구축된연구기반을활용하여소규모로는진행하기어려운새로운첨단줄기세포 연구진행 나. 연구네트워크개발, 유지및교육프로그램진행 - 사업단내외연구자간의연구네트워크개발및유지를통하여연구자간의중복성을배제하고효율적인협동연구체계유지 - 사업단내외에서개발, 확립된줄기세포의등록및효과적인분양을위한세포주은행운영 다. 국제협력및줄기세포관련생명윤리프로그램개발 - 국제협력교류를위한다양한해외채널확보 - 국제적인생명윤리관련동향및관련연구분야의정보를바탕으로줄기세포관련생명윤리프로그램개발 - 93 -
제 4 장목표달성도및관련분야에의기여도 - 연구개발의목표 번호 세부연구목표 ( 연구계획서상에기술된연구목표 ) 달성내용 달성도 (%) 인간전분화능줄기세포주 11 종확립하였음 1 인간전분화능 줄기세포주 10 종확립 SNUhES1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 11, 12, 14의 11개의 cell line을확립하였다. 이들 cell line 의특성분석 100% 을완료하였거나시행중에있음 2 인간전분화능 줄기세포주은행운영 줄기세포주은행을통하여 24 개연구팀 22,146 colony, 3,810 EBs를분양하는등활발한은행운영이이루어졌음 100% 3 연구진에대한세포주 분배 줄기세포주은행통하여 24 개연구팀 22,146 colony, 3,810 EBs를분양하여각연구팀에게훌륭한성과를기대할수있음 100% hesc 로부터 cardiomyocyte 로의분화를유도하였다. 4 줄기세포주 연구 또세개의인간배아줄기세포주 (SNUhES1, SNUhES2, 분화관련 and SNUhES3) 로부터신경과상피세포쪽으로의분화능을비교하고성숙한신경세포로의분화를 100% 유도하였다. 5 단백질도입기술개발 HIV-1 TAT 단백질에서 47-57 번까지 11개의아미노산으로이루어진부위로서세포막을통과하는활성을가지는 TAT protein transduction domain (PTD) 이인간배아줄기세포에서작용하는지를조사하여보았다 100% - 94 -
- 평가의착안점 년도세부연구목표가중치평가의착안점및척도 1차년도 ( 02.10. 1~ 03. 6.30) 2차년도 ( 02. 7. 1~ 04. 3.31) 3차년도 ( 04. 4. 1~ 05. 3.31) 인간전분화능줄기세포 4 종확립 70% 인간전분화능줄기세포주관련 Workshop 개최및 Training program 실시 인간전분화능줄기세포주은행 운영및연구진에대한세포주분배 10% 인간전분화능줄기세포 3 종확립 60% 인간전분화능줄기세포주관련 Workshop 개최및 Training program 실시 인간전분화능줄기세포주은행 운영및연구진에대한세포주분배 인간전분화능줄기세포주를이 용한분화연구 인간전분화능줄기세포주확립과 특성규명여부 세포주관련 Workshop 개최및 교육훈련프로그램시행여부 20% 인간전분화능줄기세포주의분배여부 10% 인간전분화능줄기세포주확립과 특성규명여부 세포주관련 Workshop 개최및 교육훈련프로그램시행여부 인간전분화능줄기세포주의분 20% 배여부세포치료와뇌, 신경세포특이 10% 인간전분화능줄기세포 3 종확립 50% 인간전분화능줄기세포주관련 Workshop 개최및 Training program 실시 인간전분화능줄기세포주은행 운영및연구진에대한세포주분배 인간전분화능줄기세포주를이 용한분화연구및분화방법개발 10% 적유전자, 대사산물을대량으로 확보시, 이들의대사경로나신 호전달체계를연구하기위한 도구또한세포로부터거핵세포 와혈소판의분화유도인간전분화능줄기세포주확립과 특성규명여부 세포주관련 Workshop 개최및 교육훈련프로그램시행여부 20% 인간전분화능줄기세포주의분배여부 20% 거핵세포와혈소판의분화연구 단백질도입기술개발을통한기 능성세포분화법개발 인간전분화능줄기세포주확립 50% 인간전분화능줄기세포주확립 최종평가 ( 05. 2~3) Workshop 및교육훈련프로그 10% 교육훈련프로그램시행여부램실행인간전분화능줄기세포주의분 세포주은행운영 20% 배여부 인간전분화능줄기세포주의특 20% 논문제출성및이를이용한분화연구 - 95 -
1 절인간배아줄기세포주의확립 인간전분화능줄기세포주 11종 (SNUhES1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 11, 12, 14) 확립하였고이들 cell line 의특성분석을완료하였거나시행중에있다. 세계적으로인간배아줄기세포주를확립한기관이한정되어있기때문에이러한다량의세포주확립은큰경쟁력이될수있다. 2 절인간배아줄기세포주은행의운영및교육 인간전분화능줄기세포주은행운영하여 24개연구팀에세포주를분양하는등활발한은행운영을하였다. 또한 25개연구팀에게인간배아줄기세포에대한교육을무상으로진행하여각연구팀이세포주를배양할수있도록도와각연구팀이훌륭한성과를낼수있도록하였다. 3 절인간배아줄기세포주의분화연구 인간배아줄기세포의다양한세포로의분화능력은세포치료를위한하나의가능성을제시하고있다. 인간배아줄기세포에전달해주는경우특정세포로의분화를통한세포치료 (cell-based therapy) 또는분화과정에관여하는유전자의기능연구나새로운유전자의동정등에응용될수있는유용한연구수단을제공할것이다. 따라서보유하고있는줄기세포를이용한분화연구는다른연구자에게그초석을마련해줄수있다. 인간의심근세포는출생후완전히분화되어, 일단심장조직이손상을입을경우다시재생되지않는다고알려져있다. 손상된심근의기능을회복시키기위한방법의하나로세포치료가시도될수있다. 그러나이러한세포치료에사용될수있는공급원은매우한정적이다. 인간배아줄기세포는인체를구성하는모든종류의세포로분화할수있는능력을가진세포로이러한인간배아줄기세포의특성때문에심근세포로분화시킬경우세포치료에적합한공급원이될것으로기대되고있다. 본실험의결과 cardiac - 96 -
muscle contraction에중요한역할을하는 troponin complex의 subunit인 ctni, cardiomyocyte motor protein 의 subunit 인 ámhc, á actinin 등이 cardiomyocyte로분화유도된세포에서발현되었으며, 중배엽성세포로의분화과정에서발현되는 transcription factor인 GATA4, Nkx2.5, cardiomyocyte에서분비되는호르몬의한종류인 ANF, cardiac actinin 등의발현을 RT-PCR 방법으로확인하였다. 또한 growth factor 중중배엽성분화과정에관여하는것으로알려진 BMP2와 FGF2를처리한결과 cardiac specific marker 들의발현양이증가하는것을확인하였다. 질병이나상해에의한뇌또는신경조직의손상은자연적으로는재생이힘들고이에따라치유가어렵거나불가능한경우가많으며그만큼대부분인체에치명적이다. 이에따라이전부터연구되어진분화인자나분화조절기작들을이용하여배아줄기세포로부터뇌세포나신경세포를생산하여이를뇌, 신경계질환에의 한손상에적용하고자하는연구들이활발히진행되고있다. 더욱이배아줄기세 포는단계별로신경전구세포나더욱분화된신경세포로분화단계를조절할수있기때문에경우에따라목적에맞게사용할수있다. SNUhES1의경우분화를진행시키면대부분의세포군에서성숙한신경세포의표식자인 betaiii-tubulin과 neurofilament heavy chain을발현하는세포들이나타나며 retinoic acid를처리할경우대부분의세포가 (>80%) 상피세포의표식자중하나인 pancytokeratin을발현하는것을볼수있으며, 반면에 SNUhES1과 SNUhES3에서는일부만이 (<20%) 이와같은세포들로분화하는것을볼수있었다. 이러한결과로볼때각각다른배아줄기세포주들은그분화능에있어서차이를보이며원하는실험과얻고자하는목표세포로의분화를위해서는세포주의선택이하나의관건이될수있으며경우에따라서는세포주에따라각각다른방법들이사용되어져야할것으로사료된다. 인간배아줄기세포에적용된 genetic modification 기술의현황을보면 plasmid transfection의경우 5% 미만의효율로전달되며, retroviral transduction 의경우 gene silencing이일어나전달된유전자의발현이억제되는것으로알려져있으며, 가장높은효율로전달된다고보고된 lentiviral transduction의경우도효율이 7% 에머물러있다. 따라서유전자전달기술이인간배아줄기세포관련연구에큰제한요소로작용하고있다. 본연구에서는유전자의산물인단백질을단백질도입기술을이용하여높은효율로인간배아세포에전달하는기술을개발하 - 97 -
여그러한기술적난점을극복하고인간배아발생과분화유도에관련된연구의활성화를도모하고자하였다. 본연구에서는 HIV-1 TAT 단백질에서 47-57 번까지 11개의아미노산으로이루어진부위로서세포막을통과하는활성을가지는 TAT protein transduction domain (PTD) 이인간배아줄기세포에서작용하는지를 조사하여보았다. 또한췌장의발생에필수적인역할을하는 Pdx1 단백질을 TAT PTD에융합시켜인간배아줄기세포에처리해보았다. 그결과 TAT-Pdx1 단백질이세포내로전달됨을확인할수있었고단백질도입이 1 시간내에일어나는빠른과정이었다. 그결과 insulin과 Pdx1의 mrna 수준이증가하는것으로조사되었다. insulin에대한항체로배아체를염색해본결과인슐린단백질발현의증가를관찰할수있었다. 이상의결과로 TAT PTD를매개로하는단백질도입이인간배아줄기세포에서효율적으로작용함을알수있었다. 따라서단백질도입기술은다른여러종류의단백질에대해서도적용할수있을것이며특히분화를유도하거나세포의특성을변화시키는단백질을인간배아줄기세포에전달해주는경우특정세포로의분화를통한세포치료 (cell-based therapy) 또는분화과정에관여하는유전자의기능연구나새로운유전자의동정등에응용될수있는유용한연구수단을제공할것이다. 다양한배양체계에서거핵구 (megakaryocyte) 성숙과거핵구로부터분화되는혈소판 (platelet) 에대한연구가오랫동안진행되어왔다. 혈소판은혈액의응고와손상된혈관의재생에필요하며이들의기능이저하되면빈번한출혈로인한심각한질병을초래한다. 화학요법으로치료받는암환자의경우조혈기능이현격히감퇴되어수혈을통해혈소판을공급한다. 반면동맥경화증과같은혈관의퇴행성변화에서는혈소판의활성과응집이그증상을가져온다. 이를억제하기위해이미많은종류의약제들이쓰여지고있으며이러한약제에는aspirin, ticlopidine, clopidrogrel, abciximab, epitifibatidem, tirofiban등이있다. 인간전분화능줄기세포로부터거핵세포와혈소 판의분화유도는몇가지중요한가치를가진다고생각된다. 첫째, 응고기능저 하의치료에쓰여질수있다는점이다. 둘째, 동맥경화증치료신약개발에필 요한시험관내 system 으로쓰여질수있다는점이다. 심혈관계질환은우리나라 에서도이미중요한사망원인으로자리잡고있으며혈소판기능조절을통한합병증치료기술개발이시급한상황이다. 혈소판의활성과응집에는 thrombin과 vasopressin을포함한여러물질에의하여조절받는다양한신호전달체계가관여되어있으며이들은혈소판특이적인 integrin이라는수용기를활성화시킴으로써 - 98 -
그효과를나타낸다. 신약개발은혈소판활성화조절에관한연구를통하여이루 어질수있으며동질성을가진혈소판의안정적공급은중요한전제조건이다. 우리나라의경쟁력중의하나가인간전분화능줄기세포의다량공급가능에있다 는것을고려할때 이와같은연구는그경쟁력을최대한으로활용하여바로임 상치료와신약개발로연장될수있는연구라는점에서그의미가돋보인다. - 99 -
제 5 장연구개발결과의활용계획 인간전분화능줄기세포주의확립은향후엄청난부가가치가예상되는세포치 료술개발을위한가장기본적재료로서활용될예정에있어세포주의보유자체가원 천기술및산업재산으로활용될수있다고예상된다. 다양한종류의인간전분화능줄 기세포주를확립하기위한전세계적노력이치열하게전개될전망이다. 따라서본 연구에서계획하는인간전분화능줄기세포주의확립과이에따른세포주은행의운영은곧바로세포치료및유전자치료기술개발을획기적으로향상시킬수있는기초로활용될수있을뿐만아니라궁극적으로는난치병환자의치료세포로활용될수있다. 국내의경우도세포응용연구사업단을중심으로하는치료용인간전분화능줄기세포주의확립과세포주은행의운영은범국가적차원에서지원되어야할것으로사료된다. 더많은수의배아줄기세포의확립은경쟁력을높이는차원에서매우중요하다. 따라서법의테두리안에서일을계속진행시켜야하며특히세포치료에적합한세포주의확립이무엇보다필요하다. 현재인간배아줄기세포의배양법은다른동물로부터 의감염을피하기위하여인간에서유래된실험재료를이용하고자노력하고있다. 연구자들도인간유래의영양세포층을이용한배양및확립에중점을두고자한다. 본 또 한핵형분석에있어서장기간배양시에나타날수있는염색체이상의정도와그원인을파악하고자한다. 세포분화에있어서현재까지의연구를바탕으로더욱확실한세포분화법을개발하고자하며이들결과물을동물실험을통하여그결과를분석하여야하는연구가진행 되어져야한다. 우리의연구결과를바탕으로하여실험하고자하는실험자와그방법 과결과를공유하여공동연구함으로써실험의진척도를향상시키고자한다. - 100 -
제 6 장연구개발과정에서수집한해외과학기술정보 1 절인간배아줄기세포확립및배양방법부분 Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ, Marshall VS, Jones JM. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 1998;282(5391):1145-7. 인간배아로부터유도된 pluripotent cell line은정상적인핵형을가지면서높은 telomerase activity, primate embryonic stem cell의특징적인표식인자들을발현하면서다른초기 lineges의특성은갖지않는것을말한다. 체외에서 4-5개원이상미분화상태로증식되면서이들세포들은 trophoblast로부터의 developmental potential을유지하면서세가지 embryonic germ layer(endoderm, mesoderm & ectoderm) 로의유도가가능하다. 이러한 hesc lines은 human developmental biology, drug discovery 그리고 transplantation medicine의연구에이용될수있을것이다. Reubinoff BE, Pera MF, Fong CY, Trounson A, Bongso A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 2000;18(4):399-404. 본논문에서는인간배아로부터유도한전분화능을가진 ES cells에관해언급하고있다. 두개의 diploid ES cell lines은장시간동안배양되면서 pluripotent primate cells의특징적인표인인자를발현하면서동시에 mouse의전분화능세포의발달에중요한 Oct-4를발현하는것을확인하였다. 이를 SCID mice에주입하였을때에두가지 cell lines 모두세가지 embryonic germ layer를포함하고있는 teratoma를형성하는것을관찰할수있었다. 또한체외에서 extraembryonic cell line과 somatic cell line으로분화되는것을확인할수있었다. 분화되고있는 hescs의배양으로부터 neural progenitor cells을분리하여 mature neuron으로유 - 101 -
도하였다. 이후 hescs 는 early human embryology 의연구, novel growth factor 와 medicines 의발견을위한연구방법그리고 transplantion therapy 에이용될수 있는 potential source cells 을제공할수있을것이다. Mitalipova M, Calhoun J, Shin S, Wininger D, Schulz T, Noggle S, Venable A, Lyons I, Robins A, Stice S. Human embryonic stem cell lines derived from discarded embryos. Stem Cells. 2003;21(5):521-6. hescs를이용한연구는재생의학과인간의착상전발달연구에서중요한부분을차지하고있다. 그러나여전히인간배아를이용한실험은많은논란의여지를남겨두고있다. 본실험에서는폐기되는인간배아를이용하여 MEF 위에서배양액에 bfgf와 LIF, FBS를첨가하여 hescs를확립하였다. 확립된 hescs는 1년이상체외에서증식이가능하며 trophoblast와심근세포와신경조직등의체세포로유도될수있는성질을가지고있다. Park SP, Lee YJ, Lee KS, Ah Shin H, Cho HY, Chung KS, Kim EY, Lim JH. Establishment of human embryonic stem cell lines from frozen-thawed blastocysts using STO cell feeder layers. Hum Reprod. 2004;19(3):676-84. 최근 hescs는세포대체치료와다른의학적인적용등과같은근본적인연구의중요한공급원으로제공되고있다. 본연구에서는동결-융해한인간배아를이용하여성공적으로 hescs를확립하는목적으로하여 IVF 시술후 5년이상경과하여페기할인간배아를이용하였으며 STO cell을 feeder layer로사용하였다. 실험결과공여받은인간배아를해동한후 immunosurgery 방법을이용하여 ICM 부분을골라낸후 ICM을 STO cell 위에배양함으로써 hescs를확립하였다. 그결과동결-융해한 blastocyst에서 35%, pronuclear stage embryos에서 10% 의성공률을보이며 hescs이확립되었다. 이렇게확립된 hescs은 MEF 위에서자라는것과비슷한정도의 doubling time(~36h) 을가지며다양한미분화표식인자를정상적으로발현하였다. 또한 RT-PCR과간접적인면역염색방법등을이용하여다 - 102 -
양한세포로의분화가가능함을확인하였다. Hwang WS, Ryu YJ, Park JH, Park ES, Lee EG, Koo JM, Jeon HY, Lee BC, Kang SK, Kim SJ, Ahn C, Hwang JH, Park KY, Cibelli JB, Moon SY. Evidence of a pluripotent human embryonic stem cell line derived from a cloned blastocyst. Science. 2004;303(5664):1669-74. 체세포핵치환 (Somatic cell nuclear transfer;scnt) 기술은최근에같은유전적조합을갖는동물을만들어내는데이용되고있다. 본연구에서는 cloned human blastocyst를이용하여전분화능을갖는 SCNT-hES-1을확립하였다. SCNT-hES-1 cells은전형적인 ES cell 모양을하며다양한미분화표식인자를발현하면서배아체로분화할수있는능력을가지고있다. 또한 mice를이용한 in vivo 실험에서 teratoma를형성하여다양한세포로분화가가능함을증명하였다. SCNT-hES-1 cells은 70passage 이상배양되면서정상적인핵형을유지하고공여된체세포와유전적으로동일한것을확인하였다. 비록본실험에서 parthenogenetic origin으로부터완벽하게차단시키지는못했지만 imprinting analysis를통해유도된 hescs 이 SCNT origin임을입증할수있다. Xu RH, Peck RM, Li DS, Feng X, Ludwig T, Thomson JA. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nat Methods. 2005;2(3):185-90. Human embryonic stem cells(hescs) 은 fibroblast feeder layer나이를이용한 conditioned medium(cm) 을이용하여지속적으로배양되고있다. Bone morphologenetic proteins(bmps) 는기존에알려진바와같이 mouse embryonic stem (ES) cells을배양하는과정에서 leukemia inhibitory factor(lif) 와함께 synergic effect한성질을보이며 mouse ES cells의 self-renewal을유지하는데에도움을주는것으로알려져있다. 그러나 hesc를이용한실험에서는 bfgf가포함되어있는 CM에 BMPs를첨가하게되면 trophoblast로분화한다는연구결과를 - 103 -
보여주고있다. 이논문에서는고농도의 BMPs와 bfgf를 unconditioned medium(um) 와 CM에처리해봄으로써각각의물질이 hescs의배양에미치는영향을알아보고자했다. 또한 BMPs의 antagonis인 naggin을처리하여 BMPs의 signaling이억제되었을때에 hescs의배양에미치는영향에관해알아보았다. 그결과 CM에서미분화상태를유지하던 hescs가고농도의 BMPs를처리에의해분화률이높아지는것을확인할수있었다. 그러나 UM에 noggin과 bfgf를처리하였을때미분화상태를유지하는것을확인할수있었다. 또한고농도의 bfgf 를처리하였을경우 noggin없이도 BMPs signaling level을감소시킴으로써 hescs 를미분화상태로유지시키는것이가능하였다. 이러한사실은 mouse와 human ES cells간의 self-renewal mechanism에차이점이있음을시사해주고있다. Xu C, Rosler E, Jiang J, Lebkowski JS, Gold JD, O'Sullivan C, Delavan-Boorsma K, Mok M, Bronstein A, Carpenter MK. Basic fibroblast growth factor supports undifferentiated human embryonic stem cell growth without conditioned medium. Stem Cells. 2005;23(3):315-23. 기존에알려진실험에의하면미분화상태의 hescs의계대유지를위해서는 matrix components외에 mouse embryonic feeders(mef-cm) 을필요로하였다. 이는 hescs가여러가지 growth factor receptor를가지고있기때문이며그예로 bfgf 외에 stem cell factor(scf), fetal liver tyrosine kinase-3 ligand(flt3l) 등이있다. 이논문에서는 CM이없는상태에서위의여러가지 factor들이 hescs의미분화상태를유지하는것이가능하다는것을보여주고있다. 본연구결과에서는 bfgf를고농도로처리하거나다른여러가지 factor들을조합하여처리함으로써 hescs가 MEF-CM에서배양될때와같이특정한미분화표식인자를발현하는것을확인하였다. 또한 bfgf 없이 Flt-3L, thrombopoientin 그리고 SCF 등이각각첨가되거나함께첨가된실험군에서는 6주이상배양하였을때 hescs의대부분이분화되는것을확인하였다. 이러한실험결과를통해 UM과 growh factor들을이용하여 hescs의미분화상태유지가가능함을알수있었다. - 104 -
Klimanskaya I, Chung Y, Meisner L, Johnson J, West MD, Lanza R. Human embryonic stem cells derived without feeder cells. Lancet. 2005;365(9471):1636-41. 현재전세계에서의학적인치료를목적으로 hescs에관한연구가활발히진행되고있다. 그러나기존의 hescs는확립단계에서 mouse를이용한 feeder cell 위에서배양되거나배양액의조성에 serum등이첨가됨으로써다른종의 animal source에노출되고있으며이는 hescs를이용한실험의궁극적인목표인세포치료에커다란걸림돌로작용하고있다. 이에본연구에서는 feeder cells 없이특수처리된 culture dish 위에서 serum replacement를첨가한배양액을이용하여완전히외부의 animal source로부터차단된상태에서 hesc line을확립하였다. 이렇게확립된 hescs는특징적인미분화표식인자를발현하며정상적인핵형을가지고 mouse를이용한 in vivo 실험을통해다양한세포로분화가가능함을확인할수있었다. 이는외부의 pathogenic agents에의한 contamination을막을수있는가능성을시사해주고있다. Kim SJ, Park JH, Lee JE, Kim JM, Lee JB, Moon SY, Roh SI, Kim CG, Yoon HS. Effects of type IV collagen and laminin on the cryopreservation of human embryonic stem cells. Stem Cells. 2004;22(6):950-61. 기존의알려진연구결과에의하면여러가지 extracellular matrices(ecms) 가 hescs의발달에영향을주고있는것으로알려져있다. 특히 marcomolecular protein에속하는 type IV collagenase와 laminin은 hesc의증식과분화에영향을주는것으로알려져있다. 본논문에서는 freesing media에위의물질을첨가하여 slow freezing과 rapid thawing 후에 hescs의증식과분화에미치는영향을알아보고자하였다. 그결과 freezing medium에 type IV collagenase를넣은실험군이넣지않은대조군에비해현저하게높은생존율을보였다. 또한 type IV collagenase와 laminin을넣은실험군이대조군에비해분화정도가낮은것으로나타났다. 이러한과정으로통해배양되고있는 frozen-thawed hescs을 70passages 이상배양하면서정상적인모양과미분화표식인자의발현, 정상핵형을확인하였다. 이에 ECM을처리한 slow freezing 방법을이용하여 hescs를보다효율적으 - 105 -
로동결보관할수있을것으로사료된다. Reubinoff BE, Pera MF, Vajta G, Trounson AO. Effective cryopreservation of human embryonic stem cells by the open pulled straw vitrification method. Hum Reprod. 2001;16(10):2187-94. 본연구는 human embryo를효율적으로동결보관하는데사용되는 open pulled straw(ops) 를이용하여 hescs의동결보관에미치는영향에대하여알아보고자하였다. 그결과 OPS를사용하여동결보관과정을거친 hescs가정상적으로배양되는것을확인할수있었다. 대조군에비해실험군이배양초기에세포의크기가작고분화정도가증가하였으나곧회복되어대조군과유사하게자라는것을관찰하였다. 이렇게배양된 hescs 역시대조군과마찬가지로정상적인미분화표식인자와정상핵형을가지며 mice를이용한 teratoma 실험을통해세가지 embryonic germ layers로분화되는것을확인하였다. Ha SY, Jee BC, Suh CS, Kim HS, Oh SK, Kim SH, Moon SY. Cryopreservation of human embryonic stem cells without the use of a programmable freezer. Hum Reprod. 2005 Mar 10; [Epub ahead of print] 본연구에서는기존의알려진 programmable freezer 를사용하지않은 slow freezing-rapid thawing 방법을이용하여 hescs 를정상적으로동결보존하는것에 관해연구하였다. dimethylsulphoxide(dmso), etylene glycol(eg) 그리고 fetal bovine serum(fbs) 등의세가지 cryoprotectants 를이용하여각각의 freezing medium 의조성을다양하게하여 hescs 의동결과해동후생존율을비교해본 결과 5% DMSO + 50% FBS +10% EG 의 freezing medium 이가장효율적인것으 로나타났다. Stojkovic P, Lako M, Przyborski S, Stewart R, Armstrong L, Evans J, Zhang X, - 106 -
Stojkovic M. Human-serum matrix supports undifferentiated growth of human embryonic stem cells. Stem Cells. 2005 May 11; [Epub ahead of print] 인간배아줄기세포배양에필요한영양세포대신그동안많이이용되어져왔던 matrigel등은동물세포와의접촉으로인한동물세포의감염등의우려가있기때문에본논문에서는 matrigel대신인간혈청 (human serum, HS) 을이용하였다. 또한 feeder-free환경을위해서기존에이용되었던생쥐배아섬유세포배양액대신분화된인간배아줄기세포의배양액을이용하였다. 이러한인간혈청의이용과분화된인간배아줄기세포배양액을이용한인간배아줄기세포의배양은여러가지미분화마커들의발현양상확인과 teratoma 형성을통한체내삼배엽성세포로의분화가능성을확인함으로써성공적인배양이확인되었다. Inzunza J, Gertow K, Stromberg MA, Matilainen E, Blennow E, Skottman H, Wolbank S, Ahrlund-Richter L, Hovatta O. Derivation of human embryonic stem cell lines in serum replacement medium using postnatal human fibroblasts as feeder cells. Stem Cells. 2005;23(4):544-9. 인간배아줄기세포주를확립하는데있어서사용되어진영양배지에첨가된혈청성분의차이를비교하였다. 기존에사용하였던소태아혈청과새롭게 serumreplacement를비교사용하였는데 serum-replacement를사용하였을때소태아혈청을이용하였을때보다더많이, 그리고더좋은상태의인간배아줄기세포를확립하는것으로보고하였다. 또한기존에영양세포로이용되어져왔던생쥐배아섬유세포가아닌인간포피세포를영양세포로이용하여인간배아줄기세포주를확립하였고이세포주들이체외에서장기간배양되었을때정상적인미분화상태를유지하고있는지를여러가지미분화마커들의발현양상분석을통해확인하였고, 다양한세포로의분화가능여부도확인하였다. Beattie GM, Lopez AD, Bucay N, Hinton A, Firpo MT, King CC, Hayek A. Activin A maintains pluripotency of human embryonic stem cells in the absence of feeder - 107 -
layers. Stem Cells. 2005;23(4):489-95. 미분화상태의인간배아줄기세포배양을위해서는영양세포에서분비되어진알려지지않은여러가지용해성인자들의역할이중요한것으로알려져왔다. 본논문에서는기존의영양세포로이용되어져왔던생쥐배아섬유세포에서 activin A 라는물질이분비되어짐을확인하였고이물질이인간배아줄기세포의미분화증식에관여하는것으로보고하였다. Stojkovic P, Lako M, Stewart R, Przyborski S, Armstrong L, Evans J, Murdoch A, Strachan T, Stojkovic M. An autogeneic feeder cell system that efficiently supports growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Stem Cells. 2005;23(3):306-14. 인간배아줄기세포배양에필요한영양세포를기존의생쥐배아섬유세포가아닌분화된인간배아줄기세포를이용하였다. 이용된분화된인간배아줄기세포는이종및동종의세포가각각이용되어져인간배아줄기세포배양에차이가있는지비교되었으며그결과별다른차이없이인간배아줄기세포배양에성공적인결과를제시하였다. 이러한자기세포즉인간배아줄기세포에서만들어진영양세포의이용은미분화된인간배아줄기세포성장에 autogeneic 및 genotypically homogeouns system으로이용될수있겠다. Xu C, Jiang J, Sottile V, McWhir J, Lebkowski J, Carpenter MK. Immortalized fibroblast-like cells derived from human embryonic stem cells support undifferentiated cell growth. Stem Cells. 2004;22(6):972-80. 인간배아줄기세포를 feeder-free 환경에서배양하기위한배양액을만들기위해인간배아줄기세포의분화된형태의 HEF1 세포에 human telomerase reverse transcriptase(htert) 를감염시켜불멸의 HEF1-hTERT 세포를만들었다. 이세포에서얻어진배양액을이용하여인간배아줄기세포를배양하였을때정상적으로미분화상태를유지하면서인간배아줄기세포가배양되었다. - 108 -
Choo AB, Padmanabhan J, Chin AC, Oh SK. Expansion of pluripotent human embryonic stem cells on human feeders. Biotechnol Bioeng. 2004;88(3):321-31. 상업적으로사용가능한세개의인간포피세포를영양세포로이용하여역시 3개의인간배아줄기세포주를각각배양하여그결과를비교하였다. 또한각각의영양배지로서사용된배지에 serum 포함된것과, serum-replacement를첨가한것을비교실험하였다. 그결과 serum 첨가된영양배지를사용하였을때는얼마지나지않아서인간배아줄기세포들이분화되기시작하였고, serum-replacement를첨가한영양배지의경우성공적으로미분화상태를유지하면서인간배아줄기세포가배양되었다. Genbacev O, Krtolica A, Zdravkovic T, Brunette E, Powell S, Nath A, Caceres E, McMaster M, McDonagh S, Li Y, Mandalam R, Lebkowski J, Fisher SJ. Serum-free derivation of human embryonic stem cell lines on human placental fibroblast feeders. Fertil Steril. 2005;83(5):1517-29. 인간태반섬유세포를영양세포로사용하여새로운인간배아줄기세포주를확립하였다. 인간배아줄기세포배양에는 80% knockout DMEM 과 20% knockout serum repacement를사용하여 serum -free 환경에서배양되었으며이렇게확립된인간배아줄기세포는 25계대까지배양되고있으며 Oct-3/4, Tra 1-60, Tra 1-81 및 SSEA-4 와같은미분화마커의발현및정상적인핵형분석결과를보유하고있었다. 이러한인간태반섬유세포의이용은기존의생쥐섬유세포의이용과같은다른종에서의섬유세포의이용으로발생할수있는병원균의감염등의우려를방지할수있겠다. Carpenter MK, Rosler ES, Fisk GJ, Brandenberger R, Ares X, Miura T, Lucero M, Rao MS. Properties of four human embryonic stem cell lines maintained in a - 109 -
feeder-free culture system. Dev Dyn. 2004;229(2):243-58. 4개의인간배아줄기세포주를 feeder-free 배양환경에서배양한후세포표면표지들의양적인차이, 유전자발현양상의차이및 SOX-2, UTF-1, OCT-3/4, CRIPTO 와같은미분화마커, telomerase 활성도등을조사하였다. 그결과로서각각의미분화상태의인간배아줄기세포들은세포들간의 gap junction 이있음이확인되었고각각의미분화마커들발현에는미미한차이는있지만거의유사한발현양상이확인되었다. 하지만그들의주조직항원알로타입에는차이를보여이후이들인간배아줄기세포의이식반응에는어려움이있을것으로보고하였다. Rosler ES, Fisk GJ, Ares X, Irving J, Miura T, Rao MS, Carpenter MK. Long-term culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions. Dev Dyn. 2004;229(2):259-74. 3개의인간배아줄기세포주를 feeder-free 배양환경에서일년이상오랜기간배양하였을때발생할수있을것으로기대되는세포들간의항체발현이나전사인자, telomerase 활성도및염색체이상등을 flow cytometry 및 microarray 방법과같은좀더구체적이고자세한분석방법으로비교하였다. 결과로는 feeder-free 환경에서일년이상계대배양하였을때세포주들사이에작은차이는있으나미분화마커들의발현양상등은비교적유사하였으며정상적인염색체구성을유지하고있었다. Park JH, Kim SJ, Oh EJ, Moon SY, Roh SI, Kim CG, Yoon HS. Establishment and maintenance of human embryonic stem cells on STO, a permanently growing cell line. Biol Reprod. 2003 Dec;69(6):2007-14. 기존의인간배아줄기세포배양에영양세포로이용되어져왔던생쥐배아섬유 세포즉 Mouse embrynoic fibroblast(mef) 가아닌 STO( SIM mouse embryo-derived thioquanine and ouabain resistant) 세포를영양세포로이용하여 - 110 -
세개의인간배아줄기세포를확립하였다. STO에서확립된세개의인간배아줄기세포주들은모두정상적인염색체구성과여러가지미분화마커들의발현을확인할수있었다. 또한저자들은 laminin이라는물질이인간배아줄기세포의미분화증식을유지하는데중요한역할을수행하는것으로보고하였다. Amit M, Shariki C, Margulets V, Itskovitz-Eldor J. Feeder layer- and serum-free culture of human embryonic stem cells. Biol Reprod. 2004 Mar;70(3):837-45. 인간배아줄기세포배양에영양세포없이 fibronectin matrix와같은물질을사용하여 15% serum replacement 및 transforming growth factor β1 (TGFβ1), Leukemia inhibitory factor (LIF) 및 basic fibroblast growth factor (bfgf) 등의여러가지인자들을각각및조합하여영양배지에첨가하여인간배아줄기세포배양시세포의분화율및성장률등결과를비교하였다. 이러한배양체제는인간배아줄기세포의배양에좀더확실하고적절한배양환경조성에도움이될것이며기존의영양세포로이용되어져왔던생쥐배아섬유세포에서노출될수있었던동물병원균감염등의우려를극복할수있을것으로보고되었다. Xu C, Inokuma MS, Denham J, Golds K, Kundu P, Gold JD, Carpenter MK. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 2001;19(10):971-4. 인간배아줄기세포배양에기존에사용되어져왔던생쥐배아섬유세포와같은영양세포를사용하지않고그배양액을이용하여인간배아줄기세포를성공적으로배양하였다. 배양시생쥐배아섬유세포배양액과다른여러가지세포들의배양액을이용하여그결과를비교하였으며배양액의이용뿐만아니라 matrigel 및 laminin, fibronectin 및 collagen과같은다양한세포외기질들을이용하여인간배아줄기세포를정상적으로배양하는데성공하였다. 이논문은영양세포없이인간배아줄기세포를정상적으로배양하는데성공한최초의논문이다. - 111 -
Richards M, Fong CY, Chan WK, Wong PC, Bongso A. Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 2002;20(9):933-6. 기존의인간배아줄기세포들은생쥐배아섬유세포를영양세포로이용하여배양되어져왔다. 이러한환경은인간배아줄기세포들의이식등의이용에동물세포와의접촉을통한동물바이러스등의감염의이유로장애를가져올수있으므로그러한영양세포를대체할다른세포의이용이중요한문제로제시되어져왔었다. 본저자들은처음으로인간태아근육및피부에서얻어진섬유세포와성인나팔관에서얻어진섬유세포를이용하여성공적으로정상적인인간배아줄기세포를배양하였으며더불어여러가지 collagen, matrigel 및 laminin과같은세포외기질을이용하여인간배아줄기세포배양의결과를비교하였다. Cheng L, Hammond H, Ye Z, Zhan X, Dravid G. Human adult marrow cells support prolonged expansion of human embryonic stem cells in culture. Stem Cells. 2003;21(2):131-42. 인간배아줄기세포배양에필요한영양세포로기존의생쥐배아섬유세포가아닌출생후성인의골수섬유세포를영양세포로이용하여인간배아줄기세포를성공적으로배양하였다. 본저자는이전에보고된바있는생쥐배아섬유세포와인간태아섬유세포의획득방법이쉽지않은것으로사료하고이보다는좀더쉬울것으로판단되는골수섬유세포를이용하게되었다. 이러한체제의이용은인간배아줄기세포의자가재생산등에관여하는여러가지분자들이나분비물들을규명하는데도움을줄것으로보고하였다. Richards M, Tan S, Fong CY, Biswas A, Chan WK, Bongso A. Comparative evaluation of various human feeders for prolonged undifferentiated growth of human embryonic stem cells. Stem Cells. 2003;21(5):546-56. - 112 -
모두 11개의각기다른성인, 태아및신생아의인간세포를영양세포로이용하여인간배아줄기세포의외형적변화, 세포의분화율, 세포의성장률및여러가지미분화마커의발현양상등을비교하고인간배아줄기세포배양에좋은상태를유지할수있는능력에따라 11개의섬유세포들을영양세포로서이용될수있는가능성으로순위를제시하였다. 이가운데태아근육섬유세포가가장좋은것으로확인되었고그다음으로는태아피부섬유세포순이었다. Amit M, Margulets V, Segev H, Shariki K, Laevsky I, Coleman R, Itskovitz-Eldor J. Human feeder layers for human embryonic stem cells. Biol Reprod. 2003;68(6):2150-6. Serum -free의영양배지에서인간포피세포를영양세포로이용하여인간배아줄기세포를성공적으로배양하였다. 인간포피세포는 42 계대이상까지계대배양가능한것으로확인되었고이러한포피세포에서배양된인간배아줄기세포는 70 계대이상까지장기간미분화상태를유지하면서증식되었다. Hovatta O, Mikkola M, Gertow K, Stromberg AM, Inzunza J, Hreinsson J, Rozell B, Blennow E, Andang M, Ahrlund-Richter L. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Hum Reprod. 2003l;18(7):1404-9. 상업적으로구입가능한인간포피세포를영양세포로이용하여 5개의잉여배반포세포에서내세포괴를분리하여 2개의인간배아줄기세포주를확립하였다. 이들은모두정상적인염색체구성과 Oct-4, SSEA-4, Tra 1-60 및 Tra 1-81 과같은여러가지미분화마커들을발현하였고 teratoma 형성을통한체내분화가능성도확인되었다. - 113 -
2 절핵형분석관련부분 Draper JS, Smith K, Gokhale P, Moore HD, Maltby E, Johnson J, Meisner L, Zwaka TP, Thomson JA, Andrews PW. Recurrent gain of chromosomes 17q and 12 in cultured human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 2004;22(1):53-4. 본연구는인간배아줄기세포에서염색체이상에관해처음으로언급한논문으로세개의인간배아줄기세포주에서염색체 17번단완의증가를통한인간배아줄기세포에서의염색체변화에관해연구하였다. 또한염색체 12번의증가를확인함으로써염색체 17번단완의증가와염색체 12번의증가가각각의두염색체위에있는유전자에어떠한양적변화를가져와미분화상태의인간배아줄기세포배양시어떤선택적인이익을제공할수있을지의여부에관해언급하였다. Pera MF. Unnatural selection of cultured human ES cells? Nat Biotechnol. 2004;22(1):42-3. 앞서보고되어진인간배아줄기세포에서의염색체 17번단완의증가와 12번염색체증가가발생하게된원인을규명하는데있어서이염색체이상이발생한인간배아줄기세포를분양한연구실과분양받아배양한연구실간의배양환경의차이등의비교를통하여염색체이상이발생하게된원인을규명하려고하였다. 저자는이러한염색체이상이발생하게된데에는인간배아줄기세포가자라는환경이최적이지못해인간배아줄기세포가그러한상황에적응하기위해염색체이상이발생하는것으로보고하였다. Buzzard JJ, Gough NM, Crook JM, Colman A. Karyotype of human ES cells during extended culture. Nat Biotechnol. 2004;22(4):381-2. 1998 년 Thomson 등이인간배아줄기세포를확립하고보고한이래지금까지많 은연구보고를통해체외에서장기간미분화상태로배양된인간배아줄기세포는 - 114 -
안정적인염색체를보유하고있는것으로알려져왔다. 하지만최근들어인간배아줄기세포에서의염색체이상이보고되고있는시점에서본연구자들은인간배아줄기세포에서의염색체이상이오랜기간동안계대배양된결과이지않은가하는의문을제시하였고따라서어느정도의계대배양후에염색체이상이발생하는가에관해의문을갖게되었다. 하지만어느한편으로는계대배양기간과는상관없이많은연구기관에서다양한인간배아줄기세포주에서의염색체이상이보고된것으로보아인간배아줄기세포그자체가본질적으로염색체이상과같은변이로되려는경향이강한것이아닌가하는의문도제기되고있다. 본논문에서는인간배아줄기세포에서염색체이상이일어날수있는환경및가능성에관한여러가지의견들을제시하고있다. Mitalipova MM, Rao RR, Hoyer DM, Johnson JA, Meisner LF, Jones KL, Dalton S, Stice SL. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 2005;23(1):19-20. 본연구에서는인간배아줄기세포에서의염색체이상의발견이인간배아줄기세 포배양시 cell dissociation buffer(cdb) 방법을통한비효소처리방법과 효소 처리방법의차이로발생할수있을것으로가정하여두방법을초기계대의인간배아줄기세포와후기계대의인간배아줄기세포에서적용하여두방법의비교를통한인간배아줄기세포배양에서의염색체이상발생에관해연구하였다. 저자들은이러한인간배아줄기세포에서의염색체이상은이세포의 pluripotency를유지하는데관여하는후보유전자들의발현에심각한변화를줄것으로생각하였다. 설험결과후기계대의효소를처리한방법으로배양한인간배아줄기세포가비효소처리된초기와후기계대의인간배아줄기세포및효소처리된초기계대의인간배아줄기세포에비해비정상적인염색체를가진것이많았고이들중유전자의 70% 이상이심각하게다른것이분석되었다. Clark AT, Rodriguez RT, Bodnar MS, Abeyta MJ, Cedars MI, Turek PJ, Firpo MT, Reijo Pera RA. Human STELLAR, NANOG, and GDF3 genes are expressed in - 115 -
pluripotent cells and map to chromosome 12p13, a hotspot for teratocarcinoma. Stem Cells. 2004;22(2):169-79. 인간배아줄기세포의 pluripotency를유지하는데필요한유전자는지금까지 Oct-4 이외에알려진것이거의없다. 본연구에서는매우다양한단백질을만들어내는데관여하는것으로알려져있으며인간배아줄기세포의분화시그들의발현이감소하는것으로알려진 stella 유전자가인간염색체 12번단완 13에위치하고있는것을확인하였다. 본연구에서는 stella 유전자이외에종양생식세포의유전자전사에관여하는것으로알려지고있는 Nanog 와 GDF3에관해서도연구하였다. Geissler EN, Liao M, Brook JD, Martin FH, Zsebo KM, Housman DE, Galli SJ. Stem cell factor (SCF), a novel hematopoietic growth factor and ligand for c-kit tyrosine kinase receptor, maps on human chromosome 12 between 12q14.3 and 12qter. Somat Cell Mol Genet. 1991;17(2):207-14. Hematopoietic 성장인자와 stem cell factor(scf) 가클로닝되어이것이 c-kit tyrosine kinase receptor의 ligand가되는것으로밝혀진바있다. 본연구에서는쥐에서의 SCF가염색체 10번에위치하고있으며이것이동물의 hematopoiesis에관여하는중요한역할을수행하는것과비교해서체세포교잡을통하여인간에서는염색체 12번에위치하고있다는것을확인하였으며더나아가이것의정확한역할에관하여서는좀더연구해보아야할것으로언급하고있다. - 116 -
3 절인간배아줄기세포의분화부분 Kehat I, Kenyagin-Karsenti D, Snir M, Segev H, Amit M, Gepstein A, Livne E, Binah O, Itskovitz-Eldor J, Gepstein L. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. J Clin Invest. 2001 ;108(3):407-14. 인간의심장조직에관한연구는적절한 in vitro model의부족으로인해거의이루어지지못하였다. 본연구에서는인간배아줄기세포로부터유래된심근세포의표현형적특성을기술하였다. 인간배아세포는부유배양후배아체를형성하였다. 자연적으로수축하는부분은전체배아체의 8.1 % 에서나타났다. 수축하는부분은심근세포관련표지에양성반응을나타내었다. 전자현미경관찰결과다양한정도의심근세포의구성을확인할수있었다. 역전사중합반응연구결과심근특이적유전자및전사인자의발현을확인하였으며, 심전도및칼슘의이동을확인하였다. isoproterenol과 carbamylcholine을적용하여 chronotropic effects를확인하였다. 결론으로인간배아줄기세포에서유래한심근세포는초기단계심근세포의구조및기능적특성을나타내었다. Xu C, Police S, Rao N, Carpenter MK. Characterization and enrichment of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Circ Res. 2002;91(6):501-8. 기능을나타내는심근세포가인간배아줄기세포로부터유래될수있는지를조사하였다. 모두 5개의인간배아줄기세포주에서의심근세포로의분화를조사하였다. 모든세포주는심근세포로분화되었다. 분화가진행됨에따라수축하는세포는분화일주일후에나타났으며시간이지남에따라증가하였고, 70일이상수축성을유지하였다. 수축하는세포들은심근세포의표지인자들을발현하였다. 또한 5 aza 2' deoxycytidine의처리에의해심근세포의분화는증가될수있었다. 분화된세포들은 percoll 비중원심분리에의해 enrichment시킬경우 70% 정도의심근세포의 population을나타낸다. enriched population은 proliferation과분화능을보여주었다. 인간배아줄기세포의복제능력과기능적심근세포로의분화및증식할수있는능력은심장질병에있어서임 - 117 -
상적적용을위한이세포의가능성을나타내어준다. Mummery C, Ward-van Oostwaard D, Doevendans P, Spijker R, van den Brink S, Hassink R, van der Heyden M, Opthof T, Pera M, de la Riviere AB, Passier R, Tertoolen L. Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells. Circulation. 2003;107(21):2733-40. 인간배아줄기세포로부터심근세포를유도하고원시인간 fetal 심근세포와전기생리학적특성을비교하였다. 인간배아줄기세포는생쥐의 visceral- endoderm 유사세포와함께공배양하였다. 이세포들은 beating cell로분화되었다. 표지단백질, chronotropic responses, 이온채널발현및기능모두심근세포의특성을나타내었다. 전기생리학적소견은대부분의분화된세포들이인간 fetal ventricular 세포와유사하다는것을나타내었다. 실시간세포내칼슘측정, luciferase 주사, connexin 43 등이배양상에서 fetal 세포와인간배아줄기세포유래심근세포가 coupling된것을보여주었다. verapamil에의한전기적반응의억제는기능적 α 칼슘이온채널이존재함을증명하였다. 이연구는최초로자연분화가아닌심근세포로의분화를유도한연구이다. He JQ, Ma Y, Lee Y, Thomson JA, Kamp TJ. Human embryonic stem cells develop into multiple types of cardiac myocytes: action potential characterization. Circ Res. 2003 Jul 11;93(1):32-9. 인간배아줄기세포는 in vitro상에서분화할수있으며인체의삼배엽성세포로구성된배아체를형성한다. 배아체로부터발생하는자연적인수축부분은심근세포를포함하고있다. 그러나인간심근세포의종류및그들의기능은잘알려져있지않다. 이연구는 40일에서 95까지의배양된 beating EB에서수축과활성전위의특성을분석하였다. 자연적및전기자극에의한수축이측정되었다. 측정결과 beating EB에서측정된전위들은세가지종류의활성전위로분류되었다 : nodal - like, embryonic atrial-like, embryonic ventricular-like. 이상의연구결과, 인간배아줄기세포는인간심장근육의기능적특성을보이는다양한종류의심근세포로분화될수있다. 인간배아줄기세포는 - 118 -
기초연구, 약물검정, 세포치료등의다양한종류의인간심장근육세포의공급원이될 수있다. Takahashi T, Lord B, Schulze PC, Fryer RM, Sarang SS, Gullans SR, Lee RT. Ascorbic acid enhances differentiation of embryonic stem cells into cardiac myocytes. Circulation. 2003;107(14):1912-6. 배아체형성과정없이배아줄기세포로부터심근세포로의분화를유도하였다. EGFP 가삽입된 αmhc 프로모터를삽입하여 880개의화학물질을스크리닝하였다. ascorbic acid를처리한결과 EGFP 양성세포들의현저한증가를확인하였으며이세포들은규칙적인수축력과 myosin과 actinin에양성으로염색되었다. 또한, ascorbic acid는심근특이적유전자들의발현을유도하였다. 이러한 ascorbic acid의심근세포분화유도효과는다른항산화제에의해서는나타나지않았다. Kehat I, Khimovich L, Caspi O, Gepstein A, Shofti R, Arbel G, Huber I, Satin J, Itskovitz-Eldor J, Gepstein L. Electromechanical integration of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 2004;22(10):1282-9. 심근세포치료의임상적적용은세포공급의한정성과이식후 recipient와 donor 세포간의직접적인기능적융합 (integration) 의증거부족등으로인해잘이루어지지않고있다. 인간배아줄기세포는심근세포의적절한공급원으로인식되고있다. 본연구에서는인간배아줄기세포를배아체분화방법을이용하여분화유도된심근세포가심장의전기적인특성을회복시킬수있는지를조사하였다. 분화유도된심근세포는배양된쥐의심근세포와구조및전기적인연결을형성하였다. 또한완전히심장기능을상실한돼지에이식하여 in vivo test를하였을때이식된심근세포는성공적으로 ventricle을 pace한다는것을 3차원전기생리적 mapping과조직병리학적소견으로확인하였다. 이결과는이식된세포가살아서기능을나타내며, recipient의세포와융합된다는사실을알게해주며, 이세포들의능력이전기적 pacemaker의생물학적대안으로기능할수있는능력의증거를제 - 119 -
시한다. Xue T, Cho HC, Akar FG, Tsang SY, Jones SP, Marban E, Tomaselli GF, Li RA. Functional integration of electrically active cardiac derivatives from genetically engineered human embryonic stem cells with quiescent recipient ventricular cardiomyocytes: insights into the development of cell-based pacemakers. Circulation. 2005 ;111(1):11-20. 인간배아줄기세포는세포치료를위한인간심근세포의무한공급원이될수있는성질을가지고있다. 심근세포는인간배아줄기세포로부터생성될수있지만이식후 recipient와 donor 사이의기능적 syncytium이형성될수있는지는아직확실하지않다. 전기생리학및 imaging technique를이용하여, lentivirus를이용하여조작된전기적으로활성을가지는 donor 심근세포를 in vitro 상에서기능적으로 integrate될수있음을보여주었다. 인간배아줄기세포로부터유래된심근세포를이식한 guinea pig의심장의 epicardial 표면을관찰한결과 injection site로부터둘러싼 myocardium까지의 membrane depolarization의성공적인이동을확인할수있었다. 이결과는전기적으로활성화된인간배아줄기세포유래의심근세포가 ventricular 심근세포를 in vitro 심근박동조절을교정하는데있어대안또는보조적수단이될수있다는가능성을제시하였다. Buytaert-Hoefen KA, Alvarez E, Freed CR. Generation of tyrosine hydroxylase positive neurons from human embryonic stem cells after coculture with cellular substrates and exposure to GDNF. Stem Cells. 2004;22(5):669-74. 인간배아줄기세포를 PA6 세포와공배양한후에 glial 세포유래신경성장인자 (GDNF) 를첨가함으로써도파민신경세포의수율을높일수있었다는연구결과를발표 하였다. - 120 -
Zeng X, Cai J, Chen J, Luo Y, You ZB, Fotter E, Wang Y, Harvey B, Miura T, Backman C, Chen GJ, Rao MS, Freed WJ. Dopaminergic differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cells. 2004;22(6):925-40. 인간배아줄기세포를기질세포인 PA6 세포와공배양하여 80% 이상의배아줄기세포집합체에서도파민신경세포가나타나며이들이도파민신경세포특이적인표식자를발현함을확인하였다. 그러나이식후에는극히일부의세포만이도파민신경세포이고나머지는다른종류의세포들이살아남는문제점을가진다고보고하였다. Schulz TC, Noggle SA, Palmarini GM, Weiler DA, Lyons IG, Pensa KA, Meedeniya AC, Davidson BP, Lambert NA, Condie BG. Differentiation of human embryonic stem cells to dopaminergic neurons in serum-free suspension culture. Stem Cells. 2004;22(7):1218-38. 배아줄기세포집합체를다른유도인자없이혈청이없는배지에서자연적으로부유배 양하여도파민을분비하면서전기생리학적반응을하는신경세포로유도하였고이식 후도파민을발현하는세포를확인하였다. Perrier AL, Tabar V, Barberi T, Rubio ME, Bruses J, Topf N, Harrison NL, Studer L. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004;101(34):12543-8. 기질세포인 MS5 세포를이용하여인간배아줄기세포로부터신경세포의전구체덩어 리를형성한후다양한성장인자및분화유도인자들을첨가함으로써신경세포의 70% 이상을도파민신경세포로분화시키는데성공하였다. Ben-Hur T, Idelson M, Khaner H, Pera M, Reinhartz E, Itzik A, Reubinoff BE. Transplantation of human embryonic stem cell-derived neural progenitors improves - 121 -
behavioral deficit in Parkinsonian rats. Stem Cells. 2004;22(7):1246-55. 인간배아줄기세포로부터분화된신경전구체를 rat 에이식하여자발적으로분화되는 도파민신경세포가극히일부분이라도파킨슨병에의한행동장애를많이호전시킬수 있었음을발표하였다. - 122 -
제 7 장참고문헌 Amit M, Margulets V, Segev H, Shariki K, Laevsky I, Coleman R, Itskovitz-Eldor J. Human feeder layers for human embryonic stem cells. Biol. Reprod. 2003; 68:2150-2156. Amit M, Shariki C, Margulets V, Itskovitz-Eldor J. Feeder layer- and serum-free culture of human embryonic stem cells. Biol. Reprod. 2004; 70:837-845. Beattie GM, Lopez AD, Bucay N, Hinton A, Firpo MT, King CC, Hayek A. Activin A maintains pluripotency of human embryonicstem cells in the absence of feeder layers. Stem Cells. 2005; 23:489-495. Buttery LD, Bourne S, Xynos JD, Wood H, Hughes FJ, Hughes SP, Episkopou V, Polak JM. Differentiation of osteoblasts and in vitro bone formation from murine embryonic stem cells. Tissue Eng. 2001; 7:89-99. Evans MJ, Kaufman MH. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryo. Nature. 1981; 292:154-156 Guan K, Chang H, Rollestschek A, Wobus AM. Embryonic stem cell-derived neurogenesis: Retinoic acid induction and lineage selection of neuronal cells. Cell Tissue Res. 2001; 305:171-176. Ha SY, Jee BC, Suh CS, Kim HS, Oh SK, Kim SH, Moon SY. Cryopreservation of human embryonic stem cells without the use of a programmable freezer. Hum Reprod. 2005; Mar 10: [Epub ahead of print]. Hwang WS, Ryu YJ, Park JH, Park ES, Lee EG, Koo JM, Jeon HY, Lee BC, Kang SK, Kim SJ, Ahn C, Hwang JH, Park KY, Cibelli JB, Moon SY. Evidence of a - 123 -
pluripotent human embryonic stem cell line derived from a cloned blastocyst. Science. 2004; 303:1669-1674. Hovatta O, Mikkola M, Gerrow K, Stromberg AM, Inzunza J, Hreinsson J, Rozell B, Blennow E, Andang M, Ahrlund-Richter L. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Hum. Reprod. 2003; 18:1404-1409. Inzunza J, Gertow K, Stromberg MA, Matilainen E, Blennow E, Skottman H, Wolbank S, Ahrlund-Richter L, Hovatta O. Derivation of human embryonic stgem cell lines in serum replacement medium using postnatal human fibroblasts as feeder cells. Stem Cells. 2005; 23:544-549. James D, Levine AJ, Besser D, Hemmati-Brivanlou A. TGF/activin/nodal signaling is necessary for the maintenance of pluripotency in human embryonic stem cells. Development. 2005; 132:1273-1281. Kawasaki H, Nishikawa S, Kaneko S, Kuwana Y, Nakanishi S, Nishikawa SL, Sasai Y.Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 2000; 28:31-40. Kim HS, Oh SK, Park YB, Ahn HJ, Sung KC, Kang MJ, Lee LA, Suh CS, Kim SH, Kim D-W, Moon SY. Derivation of Human Embryonic Stem Cells Depending on Quality of Blastocyst. Stem Cells. 2005 (In Revison). Kim SJ, Cheon SH, Yoo SJ, Kwon J, Park JH, Kim CG, Rhee K, You S, Lee JY, Roh SI, Yoon HS. Contribution of the PI3K/Akt/PKB signal pathway to maintenance of self-renewal in human embryonic stem cells. FEBS Lett. 2005; 579:534-540. Kim SJ, Park JH, LEE JE, Kim JM, Lee JB, Moon SY, Rho SI, Kim CG, Yoon HS. Effects of type IV collagen and laminin on the cryopreservation of human embryonic - 124 -
stem cells. Stem Cells. 2004; 22:950-961. Ko JY, Lee JY, Park CH, Lee SH. Effect of cell-density on in-vitro dopaminergic differentiation of mesencephalic precursor cells. Neuroreport. 2005; 16:499-503. Kramer J, Hegert C, Guan K, Wobus AM, Muller PK. Rohwedel J. Embryonic stem cell-derived chondrogenic differentiation in vitro: activation by BMP-2 and BM P-4. Mech. Devel. 2000; 92:193-205. Lee JB, Lee JE, Park JH, Kim SJ, Kim MK, Roh SI, Yoon HS. Establishment and maintenance of human embryonic stem cell lines on human feeder cells derived from uterine endometrium under serum-free condition. Biol Reprod. 2005; 72:42-49. Lee JB, Song JM, Lee JE, Park JH, Kim SJ, Kang SM, Kwon JN, Kim MK, Roh SI, Yoon HS. Available human feeder cells for the maintenance of human embryonic stem cells. Reproduction. 2004; 128:727-735. Li F, Lu S, Vida L, Thomson JA, Honig GR. Bone morphogenic protein 4 induces efficient hematopoietic differentiation of rhesus monkey embryonic stem cells in vitro. Blood. 2001; 98:335-342. Oh SK, Kim HS, Ahn HJ, Seol HW, Kim YY, Park YB, Yoon CJ, Kim DW, Kim SH, Moon SY. Derivation and characterization of new human embryonic stem cell lines, SNUhES1, SNUhES2, and SNUhES3. Stem Cells. 2005; 23:211-219. Oh SK, Kim HS, Park YB, Seol HW, Kim YY, Cho MS, Ku SY, Choi YM, Kim DW, Moon SY. Methods for Expansion of Human Embryonic Stem Cells. Stem Cells. 2005; 23:605609. Okabe S, Forsberg KN, Spiro AC, Segal M, McKay RDG. Development of - 125 -
neural precursor cells and functional postmitotic neurons from embryonic stem cells in vitro. M echanism of Development. 1996; 59:89-102. Park CH, Minn YK, Lee JY, Choi DH, Chang MY, Shim JW, Ko JY, Koh HC, Kang MJ, Kang JS, Rhie DJ, Lee YS, Son H, Moon SY, Kim KS, Lee SH. In vitro and in vivo analyses of human embryonic stem cell-derived dopamine neurons. J Neurochem.2005 Mar;92(5):1265-76 Park JH, Kim SJ, Oh EJ, Moon SY, Roh SI, Kim CG, Yoon HS. Establishment and maintenance of human embryonic stem cells on STO, a permanently growing cell line. Biol. Reprod. 2003; 69:2007-2014. Richards M, Fong CY, Chan WK, Wong PC, Bongso A. Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 2002; 20:933-936. Soria B, Roche E, Berna G, Quinto TL, Reig JA, Franz MF. Insulin-secreting cells derived from embryonic stem cells normalize glycemia in streptozotocin-induced diabetic mice. Diabetes. 2000; 49:157-162. Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ,Marshall VS, Jones JM. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 1998; 282: 1145-1147. Thomson JA, Kalishman J, Golos TG, Durning M, Harris CP, Becker RA, Hearn JP. Isolation of a primate embryonic stem cell line. Proc Natl Acad Sci USA. 1995; 92:7844-7848. Xu C, Inokuma MS, Denham J, Golds K, Kundu P, Gold JD, Carpenter MK. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 2001; 19:971-974. - 126 -
Zhang SC, Wernig M, Duncan ID, Brustle O, Thomson JA. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nature Biotechnol. 2001; 19:1129-1133. - 127 -
제 8 장위탁연구과제 과제관리번호 연구사업명 SC110111 중사업명 세부사업명 해당단계연구기간 보고서초록 21 세기프론티어연구개발사업 세포응용연구사업 2003.7.1.-2005.3.31. 단계구분 1 단계 / 3 단계 연구과제명 연구책임자 연구기관명및소속부서명 양윤선 해당단계참여연구원수 인간제대혈유래줄기세포은행운영 총 : 8명 내부 : 8명 외부 : 0명 해당단계연구비 정부 : 기업 : 계 : 메디포스트 ( 주 ) 생명공학연구소참여기업명메디포스트 ( 주 ) 국제공동연구상대국명 : 해당사항없음상대국연구기관명 : 위탁연구연구기관명 : 메디포스트 ( 주 ) 연구책임자 : 양윤선 요약 ( 연구결과를중심으로개조식 500 자이내 ) 1. 제대혈유래간엽줄기세포분리및배양의최적기술개발 가. 새로운배양기술도입으로고품질세포단기배양법확립 보고서면수 나. 제대혈유래간엽줄기세포재고확보 (500 vial 이상확보, 1.0 10 6 cells/vial) 2. 제대혈유래간엽줄기세포분양 160,000 천원 60,000 천원 220,000 천원 35 (128-163p) 가. 세포응용연구사업단내홈페이지를통한인간제대혈유래간엽줄기세포분양공고 실시 나. 분양되는세포에대한 GMP 수준의규격에따른세포품질평가실시 다. 세포응용연구사업단내과제연구자들에게인간제대혈유래간엽줄기세포분양 ( 총 23 회분양 ) 라. 세포신청연구자들에게간엽줄기세포의세포평가내용및배양방법을기시한 Label 발송 마. 제대혈유래줄기세포은행설립및운영에관한기준안확립 - 한국식품의약품안전청의생물학적제제의품질관리지침에근거한세포배양및품질 관리과정확립 - 세포응용연구사업단내홈페이지를통한인간제대혈유래간엽줄기세포분양공고 후세포응용연구사업단제대혈줄기세포주분양계획에따라물질양도각서 (MTA) 작성후세포분양신청접수및분양 3. GMP 수준의규격에따른세포품질평가 가. 제대혈기증동의서작성및검사방법기준마련 나. 세포평가항목및기준마련 다. 인간제대혈유래간엽줄기세포세포평가 색인어 ( 각 5 개이상 ) 한글간엽줄기세포, 제대혈, 줄기세포은행, 세포배양, 품질관리 영어 mesenchymal stem cells, umbilical cord blood, ex vivo expansion, quality control - 128 -
요약문 Ⅰ. 제목 인간제대혈유래줄기세포은행운영 Ⅱ. 연구개발의목적및필요성 제대혈로부터간엽줄기세포분리및배양방법을확립하고제대혈유래간엽줄기세 포를분양하는줄기세포은행의설립과원활한운영을목표로한다. Ⅱ. 연구개발의목적및필요성 최근간엽줄기세포의자가재생능과다능성이 밝혀지면서간엽줄기세포를이용한 세포치료의가능성이높아지고있다. 그러나간엽줄기세포등성체줄기세포의경우그수가제한적이므로효과적인분리및배양기술이선행되어야한다. 본연구에서는제대혈로부터간엽줄기세포를분리, 배양하는기술을개발하고배양된간엽줄기세포의면역표지자발현양상을취합, 연구하여다량의제대혈유래미분화간엽줄기세포를확보하고자한다. 또한미분화간엽줄기세포의분화포텐셜을확인하고세포평가지침안을마련하여분양되는세포의품질관리를도모하였다. Ⅳ. 연구개발결과및활용계획 본연구에서는제대혈로부터간엽줄기세포를분리, 배양하는기술을개발하고배양된간엽줄기세포의면역표지자발현양상을취합, 연구하여다량의제대혈유래미분화간엽줄기세포를확보하였다. 또한미분화간엽줄기세포의분화포텐셜을확인하기위하여시험관내골세포, 지방세포, 연골세포및신경세포로의분화조건을확립하고자사가분리, 배양한간엽줄기세포가중배엽뿐만아니라외배엽성세포까지도분화됨을확인하였다. 또한식품의약품안전청의세포품질평가지침안에근거하여세포평가지침안을마련하여분양되는세포의품질관리를도모하였다. 현재국내에는연구용혹은치료용의목적으로운영되는제대혈유래의간엽줄기세포를제공하는줄기세포은행이없다. 따라서본연구과 - 129 -
제의성공적인수행으로효율적인제대혈간엽줄기세포은행의운영이가능해질것이며이 를통해효율적으로연구를수행할뿐만아니라관련분야산업발전의여건성숙및활 성화를기대할수있다. - 130 -
S U M M A R Y 1. Title of Project Management of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell bank 2. Purpose of Project: The primary goal of this project is to establish and manage the human umbilical cord blood(hucb)-derived mesenchymal stem cell(msc) bank. For the purpose of the project, we will develop the isolation and culture-expansion method of MSC from husb. 3. Contents of Project MSCs are capable of renewing themselves and generating multiple cell types. Efforts are now underway to harness MSCs and to take advantage of this new found capability, with the goal of devising new and more effective treatments for a host of disease and disabilities. MSCs are rare. We should develop optimal methods for the isolation and culture-expansion methods of MSC. By using the technique of isolation and expansion of hucb-derived MSCs and by stduying their molecular and immunophenotyping characteristics, it is possible to identify the culture conditions that maximize the yields of primitive uncommited MSCs and evaluate their quality. The cells could be induced to differentiate into osteocyte, adipocyte, chondrocyte and neuronal cells under proper stimulation. It will be possible to supply the uncommited MSCs for stem cell researcher and futhermore it will be available to manage the hucb-derived MSCs bank. - 131 -
C O N T E N T S Chapter 8-1. Overview --------------------------------------------------------------------- 236 Chapter 8-2. Trends of R&D in Korea & Overseas ------------------------------- 239 Chapter 8-3. Research Methods & Results -------------------------------------------- 242 Chapter 8-4. Performance against Targets & Contribution ----------------------- 253 Chapter 8-5. Plans for Future Usage ----------------------------------------------------- 257 Chapter 8-6. Foreign R&D Information Collected during the Research ------ 258 Chapter 8-7. References ------------------------------------------------------------------------- 259-132 -
목 차 제 8-1 장연구개발과제의개요 ---------------------------------------------------------- 236 제 8-2 장국내외기술개발현황 --------------------------------------------------------- 239 제 8-3 장연구개발수행내용및결과 -------------------------------------------------- 242 제 8-4 장목표달성도및관련분야에의기여도 --------------------------------------- 253 제 8-5 장연구개발결과의활용계획 ------------------------------------------------------- 257 제 8-6 장연구개발과정에서수집한해외과학기술정보 ------------------------------ 258 제 8-7 장참고문헌 ------------------------------------------------------------------------------- 259-133 -
제 1 장연구개발과제의개요 1 절. 줄기세포의정의및특성 줄기세포는인체내의각조직이나기관을구성하는 260가지가넘는신체구성세포로분화되는세포를말한다. 줄기세포는끊임없이스스로증식하는자가재생능력 (self renewal) 과신체의모든세포나조직으로분화할수있는능력 (differentiation to specific tissue) 을가진만능세포이기도하다. 줄기세포는얻는과정에따라발생초기의배반포 (blastocyst) 에서얻을수있는배아줄기세포와발생과정이끝난성인또는태반에서얻을수있는성체줄기세포로구분하고있다. 이두가지줄기세포는서로상이한특징을가지고있어서, 배아줄기세포의경우미분화상태의자기증식능력이뛰어나서증식이용이한반면, 생체내에세포치료를위해이식한경우기형종 (teratoma) 같은암의발생가능성도있다. 반면성체줄기세포는태아가아닌발생이끝난성인의각종분화된조직내에있는 미분화세포로서골수, 혈액, 제대혈, 근육, 뇌, 피부, 망막, 간, 췌장등에있다고알려져있 다. 성체줄기세포를사용한재생의학치료는다음과같은장점이있다. 첫째, 성체줄기세포는생체내에이식된후장기의특성에맞게분화하는장기특이적분화 (site-specific differentiation) 능력을가지고있으므로, 환자에게이식시특정조직의재생이용이하다. 몇몇성체줄기세포는이식후본래의세포특성과다른종류의장기세포로교차분화 (trans-differentiation) 할수있는형성성 (stem cell plasticity) 을가지고있는것이두번째장점이며, 세번째장점은새로이알려진특성이외에도성체줄기세포가과거생각했던것보다더많은세포로분화될수있는만능성 (pluripotency) 이있는것으로밝혀지면서성체줄기세포를통한좀더다양한조직의치료가능성을높이고있다. 현재는성체줄기세포에대한새로운개념의정립을요구함과함께성체줄기세포의 형성성 (plasticity) 및다능성 (multipotency) 에대한의학적응용범위를확대해나가고있는 - 134 -
단계에있다. 여기에대한단일세포단위에서의교차분화및다중성에대한보다정밀한연구가진행되어야할것으로사료된다. 현재로서는이러한형성성의기전이어떠한과정을거치는지에대한결론과는별도로성체줄기세포의분화특성을이용한세포치료적응용은이미현실화된가능성으로제시되고있다 ( 그림 1). 앞으로의과제의주요한부분은이러한과정을연구하는연구자들이그수가충분하고분화되지않은상태의줄기세포를얻어효율적으로연구할수있는지의여부가될것이다. 본과제위탁연구기관인메디포스트는이미제대혈유래성체줄기세포를분리하여보관하는기술을보유하고있으며, 앞으로줄기세포은행운영에필요한기초 database구축에투자와협력을필요로하고있다. 이러한투자는연구자들간의정보공유등을유발하여재생의학발전에크게기여할것이며, 이는국제경쟁에서우위를선점할수있는좋은계기가될것이다. Fig. 1. 성체줄기세포를이용한질환치료기술의적용범위 1) ( 국가기술지도비젼 II. 줄기세포응용기술, 2002, 한국과학기술평가원 ) - 135 -
2 절. 연구개발의목적및필요성 성체줄기세포를치료에응용하려면아래와같은많은기술적인난관을극복해야한다. 첫째, 성체줄기세포는그수가적고순수한성체줄기세포만을분리하기어렵다. 둘째, 성체줄기세포가분화되는세포로되는기전은거의알려져있지않다. 성체줄기세포에서분화된세포가과연해당조직에서제대로기능을하는지가명확하지않다는것이세번째단점이며, 넷째로성체줄기세포는체외배양등의조건에서쉽게분화에빠져증식팽창이어려운측면이있다. 따라서본연구에서는제대혈로부터줄기세포를분리하여미분화상태의자가복제능력을상실하지않은성체줄기세포로서제대혈유래간엽줄기세포은행의설립과운영을궁극적목표로하고있다. 이를위해서는제대혈유래간엽줄기세포분리후세포의최적배양기술개발및확립이우선적과제가되어야할것이다. 이러한기술은이미위탁연구기관인메디포스트 ( 주 ) 가제대혈로부터간엽줄기세포를분리, 배양하는기술을확보하고있으며, 실험실수준에서골세포화, 연골세포화, 지방세포화로분화유도한기술의경험을바탕으로더많은수의제대혈유래간엽줄기세포를확보할수있을것이다. 또한성체줄기세포는체외배양등의조건에서쉽게분화되는단점을가지고있다. 이런점에서확보된제대혈유래간엽줄기세포가체외배양등의조건에서쉽게분화되지않고자기복제능력을상실하지않도록하는연구가동반되어야할것이다. 본연구에서는유세포분석기를이용하여배양시기와배양방법에따라달리배양된줄기세포의면역표지자의발현의변화와줄기세포의특징인형성성 (stem cell plasticity) 및다능성 (multipotency) 간의상관관계를검색할것이다. 이러한결과를바탕으로제대혈에서성체줄기세포를분리하고이미알려진성체줄기세포의면역학적, 분자생물학적표현형을선별하여분리하고, 분리된줄기세포의분자생물학적, 면역학적변화를 database화시켜서줄기세포관련분야의연구에사용되고있는세포를필요로하는연구자들에게줄기세포를분양하고자한다. 나아가실제로치료목적에이용하려는줄기세포를분리한다음일정기간동안분화하지않는상태로유지하는기술의 assay system을정립하고연구자들에게일정한수준의유효성을유지하는간엽줄기세포를분양하기위해한국식품의약품안전청의생물학적제제의제조공정관리및품질관리지침에따라제대혈유래간엽줄기세포의제조공정과품질관리를설정하고자한다 2). - 136 -
이는또한줄기세포를이용한세포치료제의개발에따르는생명윤리및생물의약품 의생물분석법규격설정등산업화에반드시필요한기술의표준화를이룰수있는인프 라를구축하는계기가될것으로사료된다. - 137 -
제 2 장국내외기술개발현황 1 절. 기술동향및수준 세계각국이고령화사회로접근함에따라매년세계적으로천문학적인연구금액의보건의료비가지출되고있으며, 그비율이점차적으로증가하여개인적으로나국가적으로부담이가중되고있다. 기존의의학은질병치유를외과적수술이나약물요법에만의존하고있어선천적인유전질환이나퇴행성질환의치료에는큰효과를기대할수없는상황이다. 이경우질병의근원치유를위해서는보다근본적인치료방법이요구된다. 이에세포대체요법 (Cell replacement therapy) 또는재생의학 (regenerative medicine) 이가장효과적인방법으로생각되며최근이방면에관한큰관심과상응하는연구개발노력이과학선진국을중심으로진행되고있다. 국내에서도 2002 년 1 월배아줄기세포연구에대하여생명윤리법을통하여가이드라인 을정하였고, 2005 년부터시행되는생명윤리및안전에관하법률을제정하고정부각부 처의국책연구과제로지원을확대하는등치료용줄기세포연구에박차를가하고있다 3). 이미분화가진행되어한정된세포들로만분화하는것으로이해해왔던성체줄기세포는최근의몇가지연구로인하여개념의수정을요구받고있다. 성체줄기세포는분화능력에서배아줄기세포보다는만능성이떨어지고때로는단한단계만분화하는줄기세포도있지만골수및제대혈의혈액전구세포나줄기세포는유연성을갖고있음이밝혀지고있다. 최근바이오산업육성이범정부차원으로지원이강화되면서인체를대신할수있는바이오인공장기의개발이향후바이오산업을견인할것으로전망된다. 특히체세포배아복제기술, 성체줄기세포배양및분화기술등줄기세포기술은세포치료제와관련된핵심원천기술로서향후산업화진전에따라제품개발, 막대한기술료수입등부가가치창출이기대되므로, 현재집중적으로증가되고있는조직특이줄기세포, 성체줄기세포, 배아줄기세포등다분화능이있는줄기세포를이용해그자체를세포치료제로이용하는기술개발이진행되고있다. - 138 -
표 1. 줄기세포연구및기술적성장과정 인간배아줄기세포주확립및각장기별조직분화증명 - 1998 년인간배아줄기세포주의확립및신체각부위로의분화증명 (James Thomson 등 ) 4) 2차바이오붐 - 2000 년외배엽 ( 뇌, 피부, 부신 ), 중배엽 ( 근육, 골, 신장, 비뇨기계, 심장, 혈액 ), 내배엽 ( 간, 췌장 ) 세포로의분화 (Schuldiner 등 ) 5) - 2001 년심근세포로의분화 (Assady, Kehat 등 ) 6) - 2001 년췌장베타세포분화 (Assady 등 ) 7) - 2004 년인간의체세포를복제해배아줄기세포를만드는데성공 ( 서울대황우석교수 ) 8) 성체줄기세포의다중분화능발견과다양한장기세포로의분화증명 - 2000 년배엽간의장벽을넘는분화능력이성체줄기세포에있음을발견 9) ( 신경줄기세포 신경, 위장, 간, 신사구체등으로분화, Clarke 등 ) - 2001 년조혈모줄기세포로부터신체각부위를형성하는거의모든장기가만들어지는것을확인 (Krause 등 ) 10) - 2001 년골수간엽줄기세포의증식, 조작용이성및신경, 근육, 골등분화 (Varfaillie 등 ) 11) 줄기세포를이용한세포치료 - 2000 년조혈모줄기세포가간세포로분화되어간부전에빠진쥐의간을재생 (Lagasse 등 ) 12) - 2000 년조혈모줄기세포가심근경색으로괴사에빠진심근의괴사부에주입되어심근으로분화 (Orlic 등 ) 13) - 2001 년골수간엽줄기세포는신경, 뇌세포, 근육뿐만아니라선천성기형에의한골대사질환 ( 불완전골형성증 ) 에서도치료효과를나타냄, 임상시험결과 (Horwitz 등 ) 14) - 139 -
2 절. 국내 외연구개발현황 표 1. 세포치료제관련국외제품개발현황 회사기원세포대상질환임상단계 아스트롬바이오사이언스 골수줄기세포 골절 임상 1/2 상 (Aastrom Biosciences) 조혈줄기세포 면역저하기능 임상 1 상 게론 (Geron Corp.) 동종배아줄기세포암전임상 젠자임바이오서저리 자가연골세포 연골결손 판매승인 (Genzyme Biosurgery) 자가피부표피세포 3 도이상화상 판매승인 레이톤바이오사이언스 (Lyton Bioscience) 뉴랄스템바이오파마슈티컬 (NeuralSTEM BioPharmaceuticals, Ltd.) 넥셀세라퓨틱스 (Nexell therapeutics, Inc.) 신경줄기세포 뇌졸증 전임상 동종배아유래 신경줄기세포 뇌질환 전임상 조혈줄기세포 면역기능저하 - 면역기능저하 임상 2 상 오시리스세라퓨틱스 동종골수유래 메니스커스손상 IND (Osiris Therapeutics) 간엽줄기세포 심근경색 임상 1 상 골손상 임상 1 상 에게라세라퓨틱스 (Agera Therapeutics) 리뉴론 (Reneuron) 스템셀스 (StemCells inc.) 피부줄기세포피부손상전임상 신경상피줄기세포뇌졸증전임상 동종신경줄기세포신경손상 IND - 140 -
제 3 장연구개발수행내용및결과 1 절. 연구의목적 본연구에서는제대혈로부터줄기세포를분리하여미분화상태의자가복제능력을상실하지않은성체줄기세포로서제대혈유래간엽줄기세포은행의설립과운영을궁극적목표로하고있다. 이를위해서는제대혈유래간엽줄기세포분리후세포의최적배양기술개발이선행되어져야할것이다. 또한일정한수준의세포를줄기세포관련분야의연구자들에게분양하기위해서는세포의규격및품질관리의방법등이확립되어져야한다. 따라서본연구에서는제대혈로부터간엽줄기세포를분리, 배양하는기술을최적화하고자한다. 또한시험관내에서세포의골, 지방, 연골세포로의분화능및신경세포로의분화능을확인하여자사가배양하는간엽줄기세포의분화포텐셜을확인하고자하며, 유세포분석기를이용하여배양시기와배양방법에따라달리배양된줄기세포의면역표지자발현의변화를확인하고자한다. 또한일정한세포의규격설정과배양과정중외래성오염원의감염여부를확인을위하여식품의약품안전청의생물학제제의품질관리기준의가이드에따라원료단계부터최종세포단계에까지자사기준및시험방법을정하고세포를평가하고자한다. 2 절. 연구내용및결과 1. 제대혈유래간엽줄기세포의분리및배양 본연구에서는채취된제대혈로부터 Ficoll-Hypaque 용액 (1.077 g/cm3) 을이용한원심분리방법으로저밀도단핵세포층을분리하였다. 분리된단핵세포층을 10% 우태혈청 (FBS) 을포함한 α-mem 배지를이용하여배양하였다. 제대혈로부터분리된단핵세포는배양후 3-5일부터방추형 (shpindle-shaped) 의긴모양인섬유세포양형태와원형의단핵성혈구세포가혼합된형태로배양되기시작하였다. 계대배양후 2-3세대경에는세포의형태가 95% 이상방추형의섬유세포모양의균질한세포임을관찰할수있었다. 그와같은제대혈유래유착성섬유세포양세포군은세포수가 10 13 까지균질한방추형의섬유세포양형태를비교적잘유지하면서계대배 - 141 -
양이가능하였다. A. 10 13 B. 10 12 10 11 Cell number 10 10 10 9 10 8 10 7 10 6 10 0 0 20 40 60 80 100 120 Days in culture Fig 2. 제대혈유래간엽줄기세포의증식율 (A) 및세포형태 (B). 2. 제대혈유래간엽줄기세포의유세포분석 제대혈로부터배양된섬유세포양형태의균질성세포군에대해유세포분석기를이용해면역표현형을분석하였다. 균질성의섬유세포양형태의세포집락이관찰된세포군에대해면역표현형을분석한결과, 골수유래간엽줄기세포관련항원인 SH2, SH3, SH4에대해양성이었으며, 95% 이상균질한양상을나타내었다. 조혈모세포관련항원인 CD34는음성, 조혈관련항원인 CD45와 CD14는음성, 조직적합항원인 HLA-DR 및내피세포관련항원인 CD31, 파골세포관련항원인 CD51/61 모두 1% 미만으로음성이었다. 그외 integrin 수용체관련항원중 CD29는양성, CD49d는음성이었으며, matrix 수용체관련항원인 CD44는양성, CD106는음성이었다. 기타항원으로는 CD13은양성, CD90 양성그리고 CD64는음성이었다 (Fig 2.). - 142 -
SH-2 SH-3 SH-4 Fig. 3. 유세포분석기를이용한제대혈유래간엽줄기세포의면역표현형결과 3. 시험관내골세포분화능 제대혈로부터분리, 배양한균질성의섬유세포양형태의세포들을골세포분화배지에배양하면서배양 7, 14, 21 그리고 28일째골세포관련인자인 alkalinephospatase(alp), osteocalcin(oc), osteopontin(op), type I collagen(col I) 그리고 cbfa에관해역전사중합효소반응을시행하였으며양성대조군으로 MG63 세포를이용하였다. 그결과골세포분화전단계에서는약하게발현되던골세포분화관련유전자가골세포분화가 7일이후강양상을보였다. 또한세포의분화시기에따라 ALP 염색및 calcium 침착을확인하기위한 Von Kossa' 염색을수행한결과 ALP의경우분화 7일째부터발현되는것을확인하였으며, 14일째전체 50% 이상의세포가 ALP에양성이었으며, 21일째전체세포의 95% 이상양성을보였다. 또한 - 143 -
골세포분화배지에배양하면서 calcium 침착을확인한결과, 분화 14 일째 calcium 침착을확인 할수있었으며, 이후분화 28 일까지 calcium 침착이증가하는것을확인하였다. M 0d 7d 14d 21d 28d MG63 ALP 453 bp OP 347 bp OC 310 bp Col I 360 bp Cbfa I 398 bp GAPDH 452 bp Fig. 4. 제대혈유래간엽줄기세포의골세포유도분화후 RT-PCR 결과 Fig. 5. 제대혈유래간엽줄기세포의골세포유도분화에따른 ALP 합성 (A) 및 calcium 침착결과 (B). A. 골세포분화유도배양시간에따른 ALP 염색법을이용한 ALP 합성정도확인 B. 골세포분화유도배양시간에따른 Von Kossa's 염색법을이용한 calcium 침착확인 - 144 -
4. 시험관내지방세포분화능 제대혈로부터분리, 배양한균질성의섬유세포양형태의세포들을지방세포분화배지에배양하면서배양 7, 14, 21 그리고 28일째지방세포관련인자인 LPL, C/EBPα, PPARϒ, leptin 그리고 αp2에관해역전사중합효소반응을시행하였다. 그결과지방세포분화전단계에서는지방세포분화관련유전자가 leptin과 αp2를제외하고모두음성이었으나, 지방세포분화 7일째지방세포의분화를유도하는전사인자중하나인 PPARϒ가발현되었다. 또한분화시간이지날수록지방세포표지인자인 LPL, C/EBPα, PPARϒ, leptin 그리고 αp2 모두가발현되었다. 또한세포의분화시기에따라 oil-red O 염색을수행한결과 lipid vacuole 이분화 14일째형성되었으며, 21일째점점증가하였다. M 0d 7d 14d 21d 28d LPL 575bp C/EBPα 374bp PPARγ 599bp leptin 481bp αp2 240bp GAPDH 452bp Fig. 6. 제대혈유래간엽줄기세포의지방세포유도분화후 RT-PCR 결과 A. B. C. Fig. 7. 제대혈유래간엽줄기세포의지방세포유도분화후세포형태 (A) 및 oil-red O 염색결과 (B) A. 지방세포분화유도 14일째분화된세포의형태 B. 지방세포분화유도 14일째 oil-red O 염색수행결과 C. 지방세포분화유도 21일째 oil-red O 염색수행결과 - 145 -
5. 시험관내연골세포분화능 제대혈로부터분리, 배양한균질성의섬유세포양형태의세포들을펠렛형태로연골분화배지에배양하면서배양 3주째 aggrecan, type II collagen, type IX collagen, SOX-9에관해역전사중합효소반응을시행하였다. 그결과연골세포분화전단계에서는연골분화관련유전자가음성이었으나, 연골세포분화 3주째연골세포의분화를유도하는전사인자중하나인 SOX-9 이발현되었다. 또한연골세포표지인자인 type II collagen 및 aggrecan, type IX collagen 모두가발현되었다. Proteoglycan 의합성정도를비교하기위해서 safranin-o 염색을분화시행한결과연골분화 2주후부터펠렛의중앙부터연골세포형태와유사한세포가관찰되었으며, 연골세포형태의세포주변의 ECM(Extra cellular matrix) 부터 proteoglycan 의합성이이루어점을육안으로확인할수있었다. 또한분화시간이지날수록연골세포형태의세포가펠렛에전체에나타나는것을알수있었으며, safranin-o 염색정도가점점진해지는것을관찰할수있었다. 동시에연골세포의대표인자인 type II collagen 애대한면역염색을수행한결과, 연골세포분화 2 주째부터분화된펠렛의중앙부터약하게발현되는것을알수있었으며, 분화시기가지나면서 type II collagen 의발현이강양성이되는것을확인할수있었다. M GAPDH (452bp) Aggrecan (392bp) Type II Collagen (432bp&225bp) Type II Collagen (377bp) Type IX Collagen (159bp) Sox IX (401bp) 0d 21d Fig. 8. 제대혈유래간엽줄기세포의연골유도분화 3 주후 RT-PCR 결과 - 146 -
A. 2W 4W 6W B. 2W 4W 6W Fig. 9. 제대혈유래간엽줄기세포의연골유도분화시기에따른 safaranin-o 염색법을이용한 proteoglycan 의합성정도및 type II collagen 에대한면역염색의변화. A. Proteoglycan 의합성정도의변화 ( 왼쪽부터 2주, 4주그리고 6주결과 ) B. Type II collagen 의합성정도의변화 ( 왼쪽부터 2주, 4주그리고 6주결과 ) 6. 시험관내신경세포분화능 제대혈로부터분리, 배양한균질성의섬유세포양형태의세포들을신경세포분화배지에배양하면서배양 6시간, 24시간, 그리고 72시간째세포의형태를관찰하였다. 분화전세포는간엽줄기세포의전형적인섬유세포양형태를유지하고있었으나초기분화배양 6시간이후세포가 cytoplasmic process 를형성하면서 polarlizing cell 주변으로세포핵이커지면서신경세포와유사한세포가관찰되었다. 분화배양 24시간후분화된세포는전형적인신경세포의형태가관찰되기시작했으며, 이러한세포의형태는분화배양 72시간이후에도잘유지되고있음을알수있었다. - 147 -
A. B. C. D. Fig. 10. 제대혈유래간엽줄기세포의신경세포유도분화시기에따른세포의형태학적변화 A. 분화전제대혈유래간엽줄기세포 B. 신경세포유도분화후 6시간째세포의형태 C. 신경세포유도분화후 24시간째세포의형태 D. 신경세포유도분화후 72시간째세포의형태 제대혈유래간엽줄기세포의신경세포유도분화에따른세포의신경세포관련단백질의특이적발현을확인하기위하여분화유도배양 6일후 western blot을수행하였다. 이때음성대조군은분화유도되지않은제대혈유래간엽줄기세포를사용하였으며, 양성대조군은 rat brain 을사용하였다. 신경세포관련단백질의발현양상을확인한결과제대혈유래간엽줄기세포는분화유도전신경세포초기발현인자인 tubulin β III를제외한나머지단백질의발현은관찰되지않았다. 분화유도후 6일째신경줄기세포표지자인 nestin이발현되는것을확인할수있었으며, 그외신경세포표지자 (neuronal marker) 인 tubulin β III, NeuN 그리고 MAP2 가발현되는것을확인할수있었다. 반면성상세포 (astrocyte) 나핍지세포 (oligodendrocyte) 의대표적발현단백질인 GFAP 나 MBP는분화배양기간중발현되지않는것을확인하였다. - 148 -
nestin tubulin ß III NeuN Naïve Induced control 440 kda 62 kda 150 kda MAP2 GFAP MBP ß-actin 66 kda 48 kda 270 kda 51 kda 67-74 kda 52 kda Fig. 11. Western Blot으로확인한제대혈유래간엽줄기세포의신경세포유도분화에따른신경세포특이단백질의발현 Naive: 신경세포분화유도전제대혈유래간엽줄기세포 Induced: 신경세포분화유도 6일째 Control: rat brain A. B. C. 99.4 % 82.5 % 36.8 % Differentiating neuron Fig. 12. 유세포분석기를이용한신경세포분화과정에따른제대혈유래간엽줄기세포특이항원 (CD105) 발현의변화양상 A. 신경세포분화유도전제대혈유래간엽줄기세포 B. bfgf pre-induction (3일) 후 C. 신경세포분화유도 3일째 D. 신경세포분화유도 6일째 - 149 -
이러한결과를종합해볼때, 자사에서분리, 배양한제대혈유래간엽줄기세포는신경세포분화자극에의해신경세포로만분화되는세포임을알수있었다. 또한분화과정중간엽줄기세포의특성변화를확인하기위하여간엽줄기세포특이면역관련항원인 CD105에대한표현형변화를확인한결과, 분화전 99.4% 였던 CD105의발현양상이 bfgf로 pre-induction 한결과 82.5% 로감소하였으며, 분화 3일째 36.8%, 6일째는 5.8% 로감소함을보였다. 이러한결과를통하여제대혈유래간엽줄기세포가신경세포로분화되면서간엽줄기세포의특성을잃어버리는것을알수있다. 7. 제대혈유래간엽줄기세포의최종세포품질관리시스템의정립 가. 세포평가항목및기준마련평가항목 평가방법 평가기준 1. 외래성미생물부정시험 직접배양 음성 2. 마이코플라즈마부정시험 직접배양 음성 3. 외래성바이러스부정시험 직접배양 음성 4. 엔도톡신시험 LAL 시험법 음성 (< 2EU/ml) 5. 세포확인 면역표지자분석법 :CD44 +, CD166 +, CD29 +, CD90 +, CD14 -, CD45 -, CD34 -, CD51-61 -, HLA-DR -, Stro-I - SH2 +, SH3 +, SH4 + 양성 80%, 음성 1% 6. 세포순도세포형태관찰 95% 섬유아세포형태 세포수 / 전체세포수 7. 세포생존율 trypan exclusion method 80% 8. 세포함량세포수측정오차범위 ±5% 이내 10. 시험관내골세포분화능 ALP staining 95% 11. 시험관내연골세포분화능 collagen type II 발현관찰 Safranin-O staining 70% 12. 시험관내지방세포분화능 Oil red-o staining 30% - 150 -
나. 세포분양실적 구분세포명분양일자분양처분양세포수비고 세포분양 제대혈유래 간엽줄기세포 2004.01.09 2004.10.01 골수중간엽줄기세포에 대한특이항체의개발 (SC13020) 흰쥐의척수손상동물 모델에서성체줄기세포를 이용한세포이식술개발 1.0 10 6 cells 2.0 10 6 cells (SC13162) 2004.10.12 상동 1.0 10 7 cells 2004.10.19 상동 1.0 10 7 cells 2004.11.15 중간엽줄기세포와골격근 근육모세포의심근 세포로의분화기술및 이를응용한치료기술의 개발 (SC13122) 4.0 10 6 cells 2004.11.01 상동 4.0 10 6 cells 2004.10.21 상동 4.0 10 6 cells 2004.10.11 상동 4.0 10 6 cells 2004.10.06 상동 1.0 10 6 cells 2004.10.06 상동 4.0 10 6 cells 2004.10.01 상동 2.0 10 6 cells 2004.09.14 상동 2.0 10 6 cells 2004.08.27 상동 3.0 10 6 cells 2004.08.10 상동 3.0 10 6 cells 2004.07.26 상동 3.0 10 6 cells 2004.07.23 상동 2.0 10 6 cells 2004.07.01 상동 2.0 10 6 cells 2004.05.25 상동 2.0 10 6 cells 2004.02.24 상동 2.0 10 6 cells 2004.01.08 상동 2.0 10 6 cells 2003.11.21 상동 2.0 10 6 cells 2003.09.08 상동 5.2 10 6 cells 2003.08.20 상동 2.0 10 6 cells - 151 -
3 절. 결론 본연구에서는제대혈로부터간엽줄기세포를분리, 배양하는기술을개발하고배양된간엽줄기세포의면역표지자발현양상을취합, 연구하여다량의제대혈유래미분화간엽줄기세포를확보하였다. 또한미분화간엽줄기세포의분화포텐셜을확인하기위하여시험관내골세포, 지방세포, 연골세포및신경세포로의분화조건을확립하고자사가분리, 배양한간엽줄기세포가중배엽뿐만아니라외배엽성세포까지도분화됨을확인하였다. 또한식품의약품안전청의세포품질평가지침안에근거하여세포평가지침안을마련하여분양되는세포의품질관리를도모하였다. - 152 -
제 4 장목표달성도및관련분야에의기여도 1 절. 연구개발의최종목표 1. 제대혈유래간엽줄기세포분리후세포의최적배양기술개발 2. 제대혈유래간엽줄기세포의분자생물학적, 세포학적, 면역학적특성분석에따른 database 구축 3. 제대혈유래줄기세포은행설립및운영에관한기준안확립 - 153 -
2 절. 연차별연구개발목표및내용 구분연구개발목표연구개발내용및범위결과물 - 제대혈유래간엽줄기세포 2차년도 (2003. 7.1 제대혈유래간엽줄기세포의분리및배양기술개발 제대혈유래간엽줄기세포및배양의최적기술개발 의대량생산기술개발 - 제대혈유래간엽줄기세포의분화포텐셜확인 ( 시혐관내골세포, 지방세포, 연골세포, 신경세포분화능 ~ 2004. 3.31) 분자생물학적, 세포학적, 면역학적특성분석에따른 database 구축 제대혈유래간엽줄기세포의면역표지자분석제대혈유래간엽줄기세포의재고확보 확인 ) - 미분화간엽줄기세포순도분석기준확립 - 200 vials 이상확보 제대혈유래간엽줄기세포의재고확보 - 500 vials 이상확보 3 차년도 줄기세포은행 세포를필요로하는 연구자들에게제대혈유 래간엽줄기세포를분양 - 제대혈유래간엽줄기세포 분양 ( 총 23 회 ) (2004. 4.1 의설립및운영 - 식품의약품안전청의세포 ~ 2005. 3.31) 에관한기준안 확립 2차년도에확립된 system을통한 GMP 수준의세포품질평가규격및기준설정 치료제지침안에따른제대혈유래간엽줄기세포의품질평가규격및기준설정 - 사업단내연구자들에게분양시품질평가규격에따라 시험후분양 - 154 -
3 절. 연구평가의착안점및척도 년도세부연구목표가중치평가의착안점및척도 제대혈유래간엽줄기세포분리 및배양의최적기술개발및확 립 20% - 배양후미분화간엽줄기세포의수 - 유세포분석기를이용한양성 / 음성판단 ; 양성 80% 배양후간엽줄기세포순도분석 20% 음성 2% 2 차년도 ( 02. 7. 1 ~ 04. 3.31) 제대혈유래간엽줄기세포의재고확보 제대혈유래간엽줄기세포의분주과정확립 - 세포형태관찰 ; 95% 섬유아세포형태 / 전체세포 30% - 200 vials 확보 - cell viability 70% 10% - 1.0 10 6 cells/vial - 1.0 10 6 cells/vial - cell viability 70% 제대혈유래간엽줄기세포은행설립및운영 20% - 세포형태관찰 ; 95% 섬유아세포형태 / 전체세포 - 면역표지자발현양상 ; lot No. 로관리 3 차년도 ( 04. 4. 1 ~ 05. 3.31) 제대혈유래성체줄기세포의재고확보 GMP 수준의세포품질평가규격및기준설정 40% 30% - 500 vials 확보 - 1.0 10 6 cells/vial - 무균부정 : 양성 / 음성 - 마이코플라즈마부정 : 양성 / 음성 - 바이러스부정 : 양성 / 음성 - 엔도톡신 : 양성 / 음성 - 155 -
제대혈유래간엽줄기세포은행 운영 30% - 세포확인 : 양성 / 음성 - 세포형태확인 ( 순도 ) 95 % - 세포생존율 70 % - 세포함량 70 % - 시험관내골세포분화능 : ALP 합성 95 % - 시험관내연골세포분화능 : proteoglycan 합성 70 % - 시험관내지방세포분화능 : oil red O staining 30 % - 물질양도협의조건에따른과제연구자들에게세포분양 4 절. 연구성과물 1. Yang SE, Ha CW, Jung MH, Jin HJ, Lee MK, Song HS, CHoi SJ, Oh W, Yang YS, Mesenchymal stem/progenitor cells developed in cultures from UC blood. Cytotherapy. 5:476-486 (2004). 2. Jung MH, Yang SE, Jin HJ, Lee MK, Song HS, Yang JY, Yang YS, HA CW, Chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells from human umbilical cord blood. 대한정형외과학회지, 39:607-613 (2004). - 156 -
5 절. 관련분야기여도 1. 기술적측면 가. 제대혈내에포함되어있는간엽줄기세포 (mesenchymal stem cells) 를분리 한후배양하여대량의간엽줄기세포를확보하는기술을확보 나. 본연구과제에서확보된제대혈유래간엽줄기세포를사업단내연구자들에 게분양함으로서효율적으로연구를수행도모 (1) 중간엽줄기세포와골격근근육모세포의심근세포로의분화기술및이를응용한치료기술의개발 ( 과제번호 SC13122) - 19회분양 (2) 세포분양 : 골수중간엽줄기세포에대한특이항체의개발 ( 과제번호 SC13020)- 1회분양 (3) 세포분양 : 흰쥐의척수손상동물모델에서성체줄기세포를이용한세포이식술개발 ( 과제번호 SC13162) - 3회분양 다. 식품의약품안전청의세포치료제지침안에따른자사기준및시험방법의규 격설정및제반기술확보 2. 경제 산업적측면 가. 정량, 정성화된제대혈유래간엽줄기세포의보급으로관련분야산업발전 의여건성숙및활성화 나. 골수에비하여제대혈은자원을얻기가용이하므로관련연구비용감소치 료재료로서수입대체효과까지기대 다. 21 세기를주도할생명공학산업의중요한한분야로서기술우위확보를통 - 157 -
한세계시장주도 라. 간엽줄기세포를기반으로하는지식산업구조기반구축에기여 마. 생명공학및지식산업분야의최첨단기술로서 21 세기국가산업의견인차 적산업 3. 사회 문화적측면 가. 난치병질환으로고통받고있는환자들의사회생활능력증진 나. 국가적차원에서만성질환의장기치료에따른의료비상승억제를유발 다. 국민의건강복지증진및국민생활의질향상을유발 - 158 -
제 5 장연구개발결과의활용계획 현재국내에는연구용혹은치료용의목적으로운영되는제대혈유래의간엽줄기세포를제공하는줄기세포은행이없다. 따라서본연구과제의성공적인수행으로효율적인제대혈간엽줄기세포은행의운영이가능해질것이며이를통해효율적으로연구를수행할뿐만아니라관련분야산업발전의여건성숙및활성화를기대할수있다. 또한지금까지완치가불가능하였던간경화, 알츠하이머병, 파킨스씨병, 당뇨병, 심장질환, 척수손상등의치료를가능하게하는세포단위의신치료소재의개발로이어지며의료및생명공학산업의경쟁력우위확보가가능할것으로기대된다. - 159 -
제 6 장연구개발과정에서수집한해외과학기술정보 1 절. 성체줄기세포의다중분화능발견과다양한장기세포로의분화 증명 1. 2000년배엽간의장벽을넘는분화능력이성체줄기세포에있음을발견 ( 신경줄기세포 신경, 위장, 간, 신사구체등으로분화, Clarke 등 ) 9) 2. 2001년조혈모줄기세포로부터신체각부위를형성하는거의모든장기가만들어지는것을확인 (Krause 등 ) 10) 3. 2001년골수간엽줄기세포의증식, 조작용이성및신경, 근육, 골등분화 (Varfaillie 등 ) 11) 4. 2004년 Lin - selection하여외배엽, 중배엽, 내배엽성세포로분화되는제대혈유래간엽줄기세포배양 (Oscar K. Lee 등 ) 15) 5. 2004년 CD45 - selection하여외배엽, 중배엽, 내배엽성세포로분화되는제대혈유래간엽줄기세포배양 (Kogler 등 ) 16) 6. 2005년 rat liver에 direct inoculation 한사람의골수유래간엽줄기세포가세포융합없이간세포로분화됨을증명 (Sato 등 ) 17) - 160 -
제 7 장참고문헌 1. 국가기술지도비젼 II, 줄기세포응용기술, 한국과학기술평가원, 2002. 2. Guidance for Reviewers: Instructions and template for chemistry, manufacturing, and control(cmc) reviewers of human somatic cell therapy investigational new drug applications (INDs). 2003. 8. CBER, FDA 3. 생명윤리및안전에관한법률시행령, 2005. 1. 보건복지부 4. Thomson JA, Marshall VS. Primate embryonic stem cells. Curr Top Dev Biol. 1998;38:133-65. 5. Schuldiner M, Yanuka O, Itskovitz-Eldor J, Melton DA, Benvenisty N. Effects of eight growth factors on the differentiation of cells derived from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Oct 10;97(21):11307-12. 6. Kehat I, Kenyagin-Karsenti D, Snir M, Segev H, Amit M, Gepstein A, Livne E, Binah O, Itskovitz-Eldor J, Gepstein L. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. J Clin Invest. 2001 Aug;108(3):407-14. 7. Assady S, Maor G, Amit M, Itskovitz-Eldor J, Skorecki KL, Tzukerman M. Insulin production by human embryonic stem cells. Diabetes. 2001 Aug;50(8):1691-7. 8. Hwang WS, Ryu YJ, Park JH, Park ES, Lee EG, Koo JM, Jeon HY, Lee BC, Kang SK, Kim SJ, Ahn C, Hwang JH, Park KY, Cibelli JB, Moon SY. Evidence of a pluripotent human embryonic stem cell line derived from a cloned blastocyst. Science. 2004 Mar 12;303(5664):1669-74. Epub 2004 Feb 12. 9. Clarke DL, Johansson CB, Wilbertz J, Veress B, Nilsson E, Karlstrom H, Lendahl U, - 161 -
Frisen J. Generalized potential of adult neural stem cells. Science. 2000 Jun 2;288(5471):1660-3. 10. Krause DS, Theise ND, Collector MI, Henegariu O, Hwang S, Gardner R, Neutzel S, Sharkis SJ. Multi-organ, multi-lineage engraftment by a single bone marrow-derived stem cell. Cell. 2001 May 4;105(3):369-77. 11. Reyes M, Lund T, Lenvik T, Aguiar D, Koodie L, Verfaillie CM. Purification and ex vivo expansion of postnatal human marrow mesodermal progenitor cells. Blood. 2001 Nov 1;98(9):2615-25. 12. Lagasse E, Connors H, Al-Dhalimy M, Reitsma M, Dohse M, Osborne L, Wang X, Finegold M, Weissman IL, Grompe M. Purified hematopoietic stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo. Nat Med. 2000 Nov;6(11):1229-34. 13. Orlic D, Kajstura J, Chimenti S, Jakoniuk I, Anderson SM, Li B, Pickel J, McKay R, Nadal-Ginard B, Bodine DM, Leri A, Anversa P. Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium. Nature. 2001 Apr 5;410(6829):701-5. 14. Horwitz EM, Prockop DJ, Gordon PL, Koo WW, Fitzpatrick LA, Neel MD, McCarville ME, Orchard PJ, Pyeritz RE, Brenner MK. Clinical responses to bone marrow transplantation in children with severe osteogenesis imperfecta. Blood. 2001 Mar 1;97(5):1227-31. 15. Lee OK, Kuo TK, Chen WM, Lee KD, Hsieh SL, Chen TH. Isolation of multipotent mesenchymal stem cells from umbilical cord blood. Blood. 2004 Mar 1;103(5):1669-75. Epub 2003 Oct 23. 16. Kogler G, Sensken S, Airey JA, Trapp T, Muschen M, Feldhahn N, Liedtke S, Sorg RV, Fischer J, Rosenbaum C, Greschat S, Knipper A, Bender J, Degistirici O, Gao J, Caplan AI, Colletti EJ, Almeida-Porada G, Muller HW, Zanjani E, Wernet P. A new - 162 -
human somatic stem cell from placental cord blood with intrinsic pluripotent differentiation potential. J Exp Med. 2004 Jul 19;200(2):123-35. 17. Sato Y, Araki H, Kato J, Nakamura K, Kawano Y, Kobune M, Sato T, Miyanishi K, Takayama T, Takahashi M, Takimoto R, Iyama S, Matsunaga T, Ohtani S, Matsuura A, Hamada H, Niitsu Y. Human mesenchymal stem cells xenografted directly to rat liver differentiated into human hepatocytes without fusion. Blood. 2005 Apr 7; [Epub ahead of print] - 163 -
부록 Ⅰ [ 첨부 1 ] 제 1 차세포응용연구사업단배아줄기세포워크숍 The 1st Embryonic Stem Cell Workshop 일시 : 2002 년 10 월 24 일 ( 목 ) 13:00-17:00 장 소 : 세포응용연구사업단 서울대학교의과대학의학연구원 2 층회의실, 3 층실험실 주 최 : 세포응용연구사업단정책지정과제연구팀 - 164 -
제 1차세포응용연구사업단배아줄기세포워크숍 The 1st Embryonic Stem Cell Workshop 세포응용연구사업단에서는인간전분화능줄기세포연구분야의효율성제고를위하여제 1회인간전분화능줄기세포워크숍을다음과같이개최하고자하오니배아줄기세포연구분야의과제에선정된연구책임자드른참조하시기바랍니다. 일시 : 2002년 10월 24일 ( 목 ) 13:00-17:00 장소 : 세포응용연구사업단서울대학교의과대학의학연구원 2층회의실, 3층실험실주최 : 세포응용연구사업단정책지정과제연구팀대상 : 21세기프론티어세포응용연구배아줄기세포분야연구협약팀을대상으로각과제별 2명이내로선별하여 20명으로제한함신청 : 2002년 10월 22일까지등록 : 세포응용연구사업단 Home page 내신청또는 Fax로신청요망 Fax : 02-3672-7601 12:50-13:00 등록 13:00-13:10 단장님인사 진 행 13:10-13:30 Cell Biology in human embryonic stem cell ( 강의 /2층/ 오선경 ) 13:30-14:10 Culture of human embryonic stem cell ( 실습, 강의 /3층/ 윤현수 ) 14:20-15:00 Cryopreservation of human embryonic stem cell ( 실습, 강의 /3층/ 정형민 ) 15:00-15:40 Characterization of human embryonic stem cell ( 실습, 강의 /3층/ 오선경 ) 15:40-16:20 Discussion(2 층 ) MTA, 배양준비, 기타등등 16:30-17:00 연구사업협약안내 ( 사무국장박윤주 ) 세포응용사업단제 1 정책지정과제오선경 ( 전화 : 760-2403) - 165 -
1. 인간배아줄기세포주배양관련 Protocol A. 지지세포 (Feeder cell) 배양액조성표 Agent concentration DMEM no pyruvate, high glucose(gibco BRL 12100-038/046) 1 pack 10% FBS (Hyclone SH30070.03) 100 ml/l 0.1mM nonessential amino acid (GIBCO BRL 11140-050) 10 ml/l 0.1mM β-mercaptoethanol (Sigma M-7522) 6.8 l /L 2mM glutamine (Sigma G-8540 or G-5763) 0.2922 g/l 1mM sodium pyruvate (Sigma P-4562) 0.11 g/l 100 U/ml penicillin G (Simga P-7764) 0.075 g/l 100 g/ml sterptomycin (Sigma S-1277) 0.074 g/l sodium bicarbonate (Sigma S-5761) 3.7 g/l B. 인간배아줄기세포배양액조성표 - I Agent concentration Knockout DMEM (GIBCO BRL 10829-018) 1 bottle (500ml) 20% Knockout SR (GIBCO BRL 108280028) 100ml/500ml 0.1mM nonessential amino acid (GIBCO BRL 11140-050) 5 ml/500ml 0.1mM β-mercaptoethanol (Sigma M-7522) 3.4μl/500ml 1mM glutamine (Sigma G-8540 or G-5763) 0.07305 g/500ml 100 U/ml penicillin G (Simga P-7764) 0.0375 g/500ml 100 g/ml sterptomycin (Sigma S-1277) 0.0375 g/500ml 4ng/ml recombinant human bfgf (Invitrogen 13256-029) 2 μl/500ml C. 인간배아줄기세포배양액조성표 - II Agent concentration DMEM/F-12 (GIBCO BRL 11320-033) 1 bottle (500ml) 20% Knockout SR (GIBCO BRL 108280028) 100ml/500ml 0.1mM nonessential amino acid (GIBCO BRL 11140-050) 5 ml/500ml 0.1mM β-mercaptoethanol (Sigma M-7522) 3.4μl/500ml 100 U/ml penicillin G (Simga P-7764) 0.0375 g/500ml 100 g/ml sterptomycin (Sigma S-1277) 0.0375 g/500ml 4ng/ml recombinant human bfgf (Invitrogen 13256-029) 2 μl/500ml - 166 -
D. 인간배아줄기세포주배양법 1. 약 50 세포에서 100 세포정도의세포로구성된인간배아줄기세포덩어리 (clump) 를지 지세포 ( 생쥐배아섬유아세포또는인간배아섬유아세포 ) 위에접종한다. 2. 인간배아줄기세포주가접종된배양용기는 48 시간이상방치하여인간배아줄기세포 덩어리가지지세포위에정착하도록한다. 3. 접종후 48 시간이지나면배양용기로부터배양액을제거하고 serum 이제외된인간 배아줄기세포배양액으로세척한다. 4. 세척후적당한양 ( 예, 4 well 배양용기의경우 well 당약 0.8 ml 을첨가 ) 의인간배 아줄기세포배양액을첨가한다. 5. 배양액은 48 시간마다한번씩교체한다. 6. 접종후약 6-7 일후에계대배양한다. ( 인간배아줄기세포콜로니의크기와자발적인 분화정도에따라계대배양의시기를결정해야함으로지속적인관찰이요구됨 ) E. 인간배아줄기세포주계대배양법 1. 접종한후약 6-7 일이지나면인간배아줄기세포주의콜로니크기는계대배양하기에적 당한정도로자란다. 2. 해부현미경하에서 0.2ml 용팁을이용하여인간배아줄기세포콜로니주변의지지세포 를제거한다. 3. 주변의지지세포가제거된콜로니는 0.2ml 용팁또는얇게뽑혀진유리 pipette 을이용 하여적당한크기 (50-100 cells) 의조각으로나누다. 4. 인간배아줄기세포주의자각들은새로운지지세포가있는배양용기로옮긴다. - 167 -
F. 인간배아줄기세포주의배양을위한지지세포의준비 1. 지지세포는인간배아섬유아세포또는생쥐섬유아세포를사용한다. 2. 계대배양하루전날까지배양용기에충분한양으로배양된섬유아세포를준비한다. 3. 준비된섬유아세포에 10mg/ml 농도의 mitomycin C 를 1 시간반에서 2 시간정도처리 한다. 4. Mitomycin C 를처리한후, 섬유아세포는 1XPBS 로충분히 (3-4 회 ) 세척한다. 5. 세척후트립신 /EDTA (0.05% Trypsin, 0.53mM EDTA-4Na, GIBCO-BRL, Cay#:25300-054) 을처리하고 5 분간 37 에서방치한다. 6. 트립신처리된섬유아세포는원심분리하여수거하고 1XPBS 로한번세척한다. 7. 세척후에원심분리하여 PBS 를제거하고배양액으로치환한다. 8. 섬유아세포는 7.5X10 4 cells/cm2 정도의수로배양용기에접종한다. - 168 -
2. 인간전분화능줄기세포의동결보존 (Cryopreservation of Human Pluripotent Stem Cells) 세포응용연구사업단보유인간전분화능줄기세포주의동결보존은유리화동결법 (Vitrification method) 를이용한다. 현재세계적으로이용가능한인간전분화능줄기세포주 의동결보존법은기존의배아를동결하는완만동결 - 급속해동법 (Slow freezing-rapid Thawing) 은사용하지않는추세이다. 유리화동결보존법은고농도의동결보호제를세포에처리한다음순간적으로초저온에노출시키는방법으로정교한동결기를사용하지않고연구실에서비교적손쉽게동결할수있다는장점을갖고있다. 유리화동결보존법은동결용기에따라금속합금판을이용하는 EM grid 법, Cryo-Loop Method, Open Pulled Method 등이있다. 현재세포응용연구사업단에서는열전도율이매우높은 Electron microscopic (EM) grid를사용하는방법을채택하고있다. I. 장비및시약 1. 필요장비 1) CO2 incubator 2) Dissection Microscope 3) Slide warmer 4) Clean bench 5) LN2 tank 2. 필요시약류및소모품류 1) Ethylene glycol (EG) 2) DMSO 3) Sucrose 4) DMEM 5) HEPES-DMEM 6) DMEM 7) Fetal Bovine Serum (FBS) 8) EM grid (Mesh # 400) - 169 -
II. 동결용액의제조 1. Vitrification Solution (VS) 의제조 1) VS1 solution : EG 1%, DMSO 10% in HEPES-DMEM (20% FBS) 2) VS2 solution : EG 20%, DMSO 20% in HEPES-DMEM (20% FBS) with 0.5M Sucrose 제조된 VS1 및 VS2 용액은여과한다음사용전 1시간동안 slide warmer에서배양한다. 2. Thawing Solution (TS) 의제조 1) TS1 solution : 0.2M Sucrose in HEPES-DMEM (20% FBS) 2) TS2 solution : 0.1M Sucrose in HEPES-DMEM (20% FBS) 3) TS3 solution : 0M Sucrose in HEPES-DMEM (20% FBS) 모든동결용액및융해용액은 1 주일이상사용하지않으며보관시빛을차단하여 4 에 서보관한다. III. 배아줄기세포주의유리화동결보존 (Vitrification of hes) 1. 배아줄기세포주 1 colony를 3-4 pieces로분리한다. 2. 분리된 hes pieces는 pipette을사용하여 HEPES-DMEM 배양액으로옮겨 3-4회세척한다. 3. 이들 hes pieces를 VS1 solution에옮겨 1분간배양한다. 4. VS1 용액에처리된 hes pieces는 VS2 용액에옮겨 25초간처리한다. 5. VS2 용액에처리된 3-4개의 hes pieces는 pipette을사용하여 EM grid상에 mounting 하고즉시 LN2에침지한다. 6. EM grid는보관용 canister에넣어해동전까지 LN2 storage tand에서보관한다. 7. 동결보관된내용을기록한다. - 170 -
IV. 인간배아줄기세포의해동 (Thawing of hes) 1. 4-well dish에각각 TS1, TS2 및 TS3 (2개) 용액을준비한다. 2. LN2 tank로부터 hes가보관된 canister를꺼내 LN2 내에서 EM grid를준비한다. 3. hes가함유된 EM grid를 fine pincet을사용하여 TS1 용액에침지한다음 5분간배양한다. 4. 동일한방법으로 EM grid를 TS2, TS3 용액에순차적으로옮겨각각 5분간배양한다. 5. TS3 용액의처리가끝난 EM grid를실체현미경하에서관찰하면서 grid상에부착된 hes piece를떼어내고이를 fresh TS3 용액에옮겨재차 5분간배양한다. 6. 모든해동과정이완료된 hes piece는미리준비된 feeder layer에옮겨배양하면서세포주의부착과증식을관찰한다. 7. 해동과정이종료된즉시그내용을기록한다. - 171 -
3. Characterization of human pluripotent stem cell Alkaline Phosphatase Staining 1 실험대상 dish의 culture media 제거 2 PBS 첨가, 조심스럽게 washing x2 3 fixiation solution(citrate-acetone-formaldehyde) 첨가, 1min 4 PBS로 washing x2 5 Naphthol AS-BI alkaline solution 첨가, 15min 붉은색으로발색 6 PBS로 washing x2 ( 위의모든단계는상온의암실상태에서이루어진다.) 참고 ) 5 Alkaline phosphatase kit (Sigma, Cal No.:86-R) Immunocytochemistry for SSEA-1, 3 & 4 1 실험대상 dish의 culture media 제거 2 fixiation solution(4% parafromaldehyde) 첨가, 30min 3 3% H2O2 첨가, 10min 4 PBS washing 5min x3 5 Normal serum 처리, 1hr 6 Primary antibody 처리 (SSEA-1,3 & 4) 7 PBS washing 3min x3 8 Secondary antibody 처리, 45min 9 PBS washing 3min x3 10 ABC 처리 (third antibody), 30min 11 PBS washing 3min x3 12 DAB staining 20min 갈색으로발색 13 PBS washing 3min x3 ( 위의모든단계는상온의암실상태에서이루어진다 ) 참고 ) 5, 8, 10 Vectastain ABC kit, Elite, Mouse Ig G(Vestor, Cal No.: PK-6102) 6 SSEA-1 : MC-480 SSEA-3 : MC-631 SSEA-4 : MC-813-70 12 Peroxidase substrate kit DAB (Vector, Cal No.: SK-4100) - 172 -
Expression of Oct-4 in hes cell 1 hes cells dissociated mechanically and collected in E tubes. 2 washing with PBS by centrifuge 3,000rpm, 5min. 3 discard the supernatant 4 isolation of total RNA using RNeasy mini kit(qiagen) 5 RT - PCR PCR condition 1st 2nd 25, 10 min 94, 5min 42, 60 min 94, 40sec 99, 5 min 61, 40sec 4 72, 40sec 34 cycles 72, 7min 4 β - actin Forward : 5' - CGCACCACTGGCATTGTCAT Reverse : 5' - TTCTCCTTGATGTCACGCAC Oct-4 Forward : 5' - GGCGTTCTCTTTGGAAAGGTGTTC Reverse : 5' - CTCGAACCACATCCTTCTCT 6 electrophoresis using 1.8 ~ 2.0% agarose gel 7 data analysis - 173 -
Detection of telomerase activity in hes cell ⑴ ES cell dissociated mechanically and collected in E tubes ⑵ washing with PBS by centrifuge 3,000 rpm, 5 min. ⑶ extraction of telomerase protein using TRAPeze kit(intergen) 1 add 200μl of TRAP lysis buffer and pipetting 2 incubation for 30min on ice. 3 centrifuge 12,000rpm, 20min 4 take the supernatant and aliquot... - keep the supernatant in -70 - teleomerase activity is stable for 12 months in -70 - don't freeze and thaw for more than five times. ⑷ PCR for telomerase expression controls 1 positive : supplied by manufacturer 2 negative : samples which were heat inactivated at 85 for 10min. 3 PCR contamination : addition lysis buffer instead of addition of template 4 quantity : addition of template 1μl addition of template 2μl 5 PCR amplification : internal 36 bp PCR condition 30, 30min 94, 30sec 59, 30sec 35 cycles 4 ⑸ 12.5% non - denaturing PAGE ⑹ staining with SYBR green I ⑺ data analysis - 174 -
[ 첨부 2] 제 1 차세포응용연구사업단배아줄기세포워크숍참가자명단 -1 연구 참가자 책임자 1 정형민 정형민 2 박현석 박현석 3 박웅양 박웅양 과제명인간전분화능줄기세포주확립과특성규명및중배엽성세포로의분화유도및관련표식인자의발굴줄기세포분화네트워크데이터마이닝시스템줄기세포분화네트워크데이터마이닝시스템 연구기관포천중문의과대학교 ( 주 ) 마크로젠서울대학교 4 박은정박은정세포응용연구관련윤리프로그램개발서울대학교 5 임정묵 임정묵 6 김계성 김계성 7 성제경 성제경 8 이배환 이배환 9 안규리 안규리 세포응용연구제2단계사업추진방안에관한연구전분화능줄기세포의분화조절기술개발및임상응용기반기술확립프로테옴기술을활용한줄기세포분화관련단백질의발굴및기능해석척수손상모델동물을이용한줄기세포이식치료기반기술개발배아줄기세포의면역학적특성규명및면역관용유도기술개발 서울대학교한양대학교서울대학교연세대학교서울대학교 10 황정혜 ( 권희선 ) 황정혜 인간배아줄기세포에서생식관련세포 분화및발달에관한연구 한양대학교 인간전분화능배아줄기세포의증식과 11 윤현수윤현수 12 전진현전진현 분화조절기전규명및표식인자발굴에의한분화유도기술개발인간전분화능줄기세포에서다양한분화조건에의한질환치료용삼배엽성줄기세포주의확립기술에관한연구 미즈메디병원 삼성제일병원 - 175 -
제 1 차세포응용연구사업단배아줄기세포워크숍참가자명단 -2 연구 참가자 책임자 13 홍효정 홍효정 14 인경수 인경수 15 홍승환 홍승환 16 이영희 이영희 17 김병수 김병수 18 이상훈 이상훈 과제명항체라이브러리를이용한전분화능줄기세포분화관련세포표면표식인자발굴과특성규명및항체의개발과생산전분화능줄기세포분화관련세포표면표식인자에대한항체의개발과생산배아줄기세포의자가증식과초기분화기작에관한연구전분화능줄기세포의조혈세포분화조절기전연구인간배아줄기세포로부터혈구줄기세포 / 혈액세포로의선택적분화, 분리및세포치료기반기술개발사람배아줄기세포를이용한파킨슨병세포치료 연구기관한국생명공학연구원 ( 주 ) 에이프로젠서울대학교충북대학교고려대학교한양대학교 19 이홍규이홍규배아줄기세포를이용한인슐린분비세포분화서울대학교 인간전분화능줄기세포주의내배엽분화유도 20 박현숙 박현숙 기술개발 조혈줄기세포의자가재생산및면역 21 오일환 오일환 관용유도를통한임상응용과산업화 유전자변이배아간세포대량생산및 DUB 22 백광현 백광현 유전자생체내기능분석 23 한용만 한용만 인간배아줄기세포의자가재생산기전연구 체외생산된돼지수정란유래배아 원자력의학원가톨릭대학교포천중문의과대학교한국생명공학연구원 24 한호재한호재 25 심호섭심호섭 줄기세포의활용기술및낭포성섬유증질환모델돼지의개발배아줄기세포를이용한낭포성섬유증질환모델돼지의개발 전남대학교 단국대학교 - 176 -
부록 Ⅱ [ 첨부 1 ] 인간배아줄기세포주분양및배양기술교육 서울대학교인구의학연구소줄기세포연구실에서인간배아줄기세포를이용한연구를수행하시 는연구자분들께인간배아줄기세포주분양및배양기술교육에관한안내를다음과같이하고 자합니다. -다음- 1. 인간배아줄기세포주분양인간배아줄기세포주를분양받고자하는연구진은분양받고자하는시점으로부터 2주일전에분양신청서를제출하시고세포분양담당자로부터확인을받으시면됩니다. 2. 배양기술교육 인간배아줄기세포배양기술에대한교육은기관의여건에따라시기와방법이결정되며배양기 술에대한교육은 3 일을기준으로시행됩니다. 교육내용 : 1) Presentation for hesc culture (observation of hesc morphology and density of feeder layer, etc) 2) feeder cell culture and feeder layer preparation for hesc subculture 3) media preparation for hesc culture and feeder cell culture 4) subculture of hesc (passaging) 다. 위안내에대한자세한내용은세포응용연구사업단홈페이지공지사항을참고하시기바랍니 서울대학교인구의학연구소줄기세포연구실 세포분양담당자 : 김희선 (TEL: 02-740-8955) 배양기술교육담당자 : 설혜원 (TEL: 02-740-8948) - 177 -
[ 첨부 2 ] 인간배아줄기세포배양교육 1 일째 1) Preperation of hesc medium and STO medium D-MEM/F12 for hesc ( Total 100ml 기준 ) 시약명 제작회사 Cataloge Number 첨가량 D-MEM/F12 Gibco 11320-033 77.5ml Knockout SR Gibco 10828-028 20 ml 2-Mercaptoethanol Sigma M-7522 0.7μl MEM Non-Essential Amino Acids Solution Gibco 11140-050 1ml Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122 0.5ml 위의조성에 0.4ng/ml 의 Basic fibrogrowth factor(bfgf, Gibco, Cat. No.: 13256-029) 를첨가한 다. EB culture media 는 bfgf 를첨가하지않은것을말한다. 참고 ) D-MEM/F12 대신 Knockout D-MEM(Gibco, Cat.No.: 10829-018) 을사용할경우위에적 힌시약과함께 L-Glutamin-200mM(Gibco, Cat.No.: 25030-081) 1ml 을첨가한다. Medium for STO (Total 200ml 기준 ) 시약명 제조회사 Cataloge Number 첨가량 DMEM( 아래참조 ) Gibco 12100-046 179ml Fetal Bovine Serum Hyclone SH30070.03 20ml Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122 1ml - 178 -
DMEM(1pack/1L) powder 를 4 차증류수에풀어준후 magnetic bar 를이용하여계속저어주면 서여기에 0.11g/L 의 pyruvic acid sodium salt(sigma, P-4562) 와 sodium bicarbonate(gibco, S8875) 1.5g/L 의양을넣어준후모두녹을수있도록잘저어준다. 2) Preperaion of feeder cells(sto) 1 ATCC사로부터 STO(Cat. number-crl-1503) 구입한다. 2 25T culture flask를 30분이상 0.1% gelatin을이용하여 coating한후걷어내고 wariming되어있던 STO media 10ml을첨가해준다. 3 37 water bath에서 rapid thawing 한후 e-tube로옮겨담은뒤 7000rpm에서 30초간 centrifuge 한후 upper solution은걷어내고 warming 되어있던 STO media 1ml을첨하후조심스럽게 pipeting 한다. 4 (Day0) 미리준비되어있던 25T flask에 e-tube의 STO cell을넣어준후고루퍼지도록잘흔들어준후배양한다. 5 (Day1) 다음날 attach 정도를확인한다. 6 (Day2) seeding 한지이틀째에새로운 STO media 5ml로 media를갈아준다. 7 (Day3) 75T culture flask 2개를위와같은방법으로 gelatin coating한후 STO media 10ml을넣어준다. 8 STO cell이빽빽이자란 25T flask를 warming 되어있던 dpbs로 washing한다. 9 0.25% trypsin-edta 1ml을 25T에넣어준후조심스럽게흔들며바닥으로부터 cell들을떨어뜨려준다. 10 cell이모두떨어진것을확인한후 STO media 5ml을넣어준후 15ml falcon tube에모은다. 11 1000rpm에서 10분간 centrifuge 한후 upper solution은걷어내고새로운 STO media 2ml을넣어준후조심스럽게 pipeting 한후준비되어있던 75T flask에각각 1ml씩분주한후고루퍼지도록흔들어주고배양한다 (STO passage : 1P0). 12 (Day4) 다음날 attach 정도를확인한다. 13 (Day5) seeding 한지이틀째에새로운 STO media 10ml로 media를갈아준다. 14 (Day6) 75T flask 5개를위와같은방법으로 gelatin coating한후 STO media 10ml을넣어준다. 15 미리준비되어있던두개의 75T flask 중한개를위에서서술한바와같은 (8-11) 과 - 179 -
정을통해 14번의 75T flask 5개로불려준다 (STO passage : 2P0). 나머지하나의 75T flask의 STO cell은 dpbs로 washing 하고나서 trypsin을처리하여떼어낸다. 이를 15ml falcon tube에모으고 1000rpm에서 10분간 centrifuge 한후 upper solution은걷어내고여기에 STO freezing media를넣어준후조심스럽게 pipeting 한후에 counter staining을통해 1x10 7 /ml의 cell 수로 cryotube에분주한후 Nalgene container에넣어서 -70 deep-freeser에서 overnight 한후 LN 2 tank에넣어보관한다 (STO passage : 2P1). (Day7) 15의 75T flask의 attach 정도를확인한다. (Day8-9) 8-11, 의방법으로불려주면서 (STO passage : 3P0) 얼려서보관한다 (STO passage : 3P1) 3) Preperaion of subculture dish 1 다음날계대할 dish의수를결정한다 ( 예 : 18dish). 2 15개의 30mm culture dish를 0.1% gelatin으로 30분이상 coating 한다. 3 30분이후 dish의 gelatin을걷어내고 1ml의 STO media를넣어주고 incubation한다. 4 LN2 tank의 STO bial( 예 :10dish/1tube) 2개를꺼내어 37 water bath에서 rapid thawing 한후 2개의 e-tube로옮겨담은뒤 7000 rpm에서 30초간 centrifuge 한다. 5 upper solution을걷어낸후새로운 STO media를 1ml씩첨가한후조심스럽게 pipeting 한후 18ml의 STO media가담겨있는 50ml falcon tube에넣어준다. 6 pipeting을통해 cell이고루섞이도록한후미리준비되어있던 30mm culture dish에 1ml씩분주해준다 ( 분주하는동안 cell이가라앉지않도록종종섞어준다 ). 7 분주된 30mm culture dish를 cell이몰리지않도록고루잘흔들어준후 incubation 한다. 8 다음날적정량의 STO(dish 바닥을 70% 정도채워야한다 ) 붙었는지확인한후 ES washing media 2ml을이용해한번 washing해준후 ES culture media 2ml을채워준다. - 180 -
인간배아줄기세포배양교육 2 일째 1) Human embryonic stem cells transfer 1 소독된 pasteur pipet 2 개를 alcohol lamp 에달궈아래와같은두가지모양의 pipet 을 준비한다. i) ii) 2 해부현미경하에서계대해야할 colony 주변의 STO cell들을 i) 의 pipet을이용하여밀어낸후 colony를 200개정도의 cell을포함하고있는 clump로조각낸다. 3 약 150-200개의조각난 clump를 ii) 의 pipet과 spoid를이용하여빨아들여준후미리준비되어있는새로운 STO dish(iii.) 에뭉치지않도록일정한간격으로고루뿌려주고 incubation 한다. 4 이틀후 attach 정도를확인하고미리준비해두었던새로운 ES culture media 2ml로 media change 해준다. 5 Media change는계대후이틀째부터다음계대전날까지매일일정한시간에해준다. 2) Expansion and freezing of feeder cells(sto) 1 LN 2 tank에보관되어있던 STO 1bial을 I. 의 2-15의과정을통해 25T flask 1개에서 75T flask 2개, 다음에 75T flask 10개로불린다. 2 STO cell이빽빽이자란 75T flask 10개를 dpbs로 washing 한후 10ml의 STO media 에 0.1mg/ml의 Mitomycin C를처리하여 2시간 30분간 incubation 한다. 3 dpbs로 washing 한후 0.25% trypsin-edta 1ml씩첨가하여 cell을떼어주고 STO media 9ml을넣어준후 50ml falcon tube 2개에모은다. 4 1000rpm에서 10분간 centrifuge 한후 upper solution은걷어내고각각 25ml의 STO freezing media를넣어주고조심스럽게 pipeting 한다. - 181 -
5 미리 laveling 되어있는 cryotube에 1ml씩분주한후 Nalgene container에넣어서 -7 0 deep-freeser에서 overnight 한후 LN 2 tank에넣어보관한다. 6 실험가능한 cell 양을확인하기위해 gelatin coating 된 10개의 30mm culture dish에깔아본후다음날 attach 정도를확인하여 tube 당준비할수있는 30mm culture dish 의수를결정한다. 인간배아줄기세포배양교육 3 일째 1) hesc media change and culture 1 이틀전에계대한 hesc의 attach 정도를확인한다. 2 culture dish 내의붙지않은세포들을조심스럽게 pipeting하면서걷어낸후새로운 fresh media 2ml을넣어준다. 3 이후 24시간간격으로다음계대때까진 media change 해준다. 4 배양후 6일째에다음계대를위한 subculture dish를준비한후 7일째에다음계대를진행한다. 2) Hand-out checking 3 일간의배양기술과정습득을거친후배양기술교육담당자가교육생이교육과정내용 에관해정리한 protocol 을확인함으로써최종정리단계를말한다. - 182 -
[ 첨부 3 ] : 1-3 차년도교육생명단 인간배아줄기세포배양기술교육생명단 (1 차년도 : 02 년 10 월 1 일 - 03 년 6 월 30 일 ) 소속연구책임자연구원교육기간 1 한국생명공학연구원홍효정서윤정 2002 년 12 월 12 일 - 2002 년 12 월 21 일 2 서울의과대학내분비내과 이홍규 박수진 2002 년 12 월 12 일 - 2002 년 12 월 21 일 3 한양의과대학산부인과 황정혜 권희선 2002 년 12 월 12 일 - 2002 년 12 월 21 일 4 한국생명공학연구원한용만한지수 2002 년 12 월 2 일 - 2003 년 2 월 2 일 5 6 7 8 9 한양의과대학생화학교실고려의과대학혈액종양내과서울의대유전자이식연구실원자력의학원생체조직재생연구실단국의과대학생리학교실 이상훈 이지연 2002년 12월 23일 - 2002년 12월 28일 김병수 오지현 2002년 12월 30일 - 2003년 1월 4일 박웅양 김영진 2003년 1월 6일 - 2003년 1월 9일 박현숙 이동선 2003년 1월 22일 - 2003년 1월 25일 심호섭 강지현 2003년 2월 26일 - 2003년 3월 3일 10 주 ) 동아제약도현미 2003 년 4 월 21 일 - 2003 년 5 월 3 일 11 서울대학교 수의과대학수의산과 교실 황우석권대기 2003 년 4 월 28 일 - 2003 년 5 월 13 일 12 주 ) 제일약품김정림 2003 년 5 월 6 일 - 2003 년 5 월 13 일 - 183 -
인간배아줄기세포배양기술교육생명단 (2 차년도 : 03 년 7 월 1 일 - 04 년 3 월 31 일 ) 소속연구책임자연구원교육기간 10 서울대유전공학연구소 분자면역학연구실 성노현 박효영 2003 년 7 월 29 일 - 2003 년 8 월 4 일 11 한양의대산부인과황정혜장윤정 2003 년 9 월 8 일 - 2003 년 9 월 9 일 12 서울의과대학 면역학연구실 안규리 이은미 2003 년 8 월 27 일 - 2003 년 9 월 5 일 13 이화여대김재상임진경 2003 년 10 월 1 일 - 2003 년 11 월 29 일 14 삼진제약박용빈 2003 년 10 월 1 일 - 2003 년 11 월 29 일 15 의학연구원 BT 분야공통활용장비 문신용지애리 2003 년 10 월 1 일 - 2003 년 11 월 29 일 13 인하대병원신경외과조진모 2003 년 12 월 15 일 - 2003 년 12 월 18 일 14 울산대면역제어연구센터 황선희 2003 년 12 월 15 일 - 2003 년 12 월 18 일 15 서울대유전공학연구소분자면역학연구실 성노현 신동호 2004 년 1 월 20 일 - 2004 년 3 월 30 일 16 서울의대치과대학조재진양지혜 2004 년 2 월 25 일 - 2004 년 3 월 4 일 - 184 -
인간배아줄기세포배양기술교육생명단 (3 차년도 : 04 년 4 월 1 일 - 05 년 3 월 31 일 ) 소속연구책임자연구원교육기간 17 18 19 20 21 22 Chulalongkom Univ. Ob & Gy (Tail land) 경희의료원동서의학연구소연세의과대학생리학교실원자력의학원생체조직재생연구실전남대수의과대학생리학교실서울의과대학순환기내과 Ruttachuk 2004년 3월 31일 - 2004년 6월 28일 Rungsiwiwv 김수영 김동환 2004년 7월 12일 - 2004년 7월 24일 김동욱 김대성 2004년 9월 4일 - 2004년 9월 6일 박현숙 강재선 2004년 10월 18일 - 2004년 10월 20일 한호재 허정선 2004년 12월 20일 - 2004년 12월 22일 김효수 김지현 2005년 1월 26일 - 2005년 1월 28일 23 포천중문의과대학송지환전성호 2005 년 3 월 21 일 - 2005 년 3 월 23 일 - 185 -
부록 Ⅲ 1 차년도 (2002 년 10 월 1 일 - 2003 년 6 월 30 일 ) 인간배아줄기세포분양상황 1 2 3 4 5 연구기관포천중문의과대학교포천중문의과대학교포천중문의과대학교포천중문의과대학교포천중문의과대학교 연구 책임자 날짜분양세포주연구목적및내용 SNUhES3 P59 김계성 2002-12-14 (130 colony) SNUhES3 P45 김계성 2003-01-25 (450 colony) SNUhES3 P47 김계성 2003-02-08 (300 colony) SNUhES3 P48 김계성 2003-02-11 (500 colony) SNUhES3 P49 김계성 2003-02-22 (720 colony) 줄기세포증식배양체계구축및 줄기세포분화유도배양체계도입 줄기세포증식배양체계구축및 줄기세포분화유도배양체계도입 줄기세포증식배양체계구축및 줄기세포분화유도배양체계도입 줄기세포증식배양체계구축및 줄기세포분화유도배양체계도입 줄기세포증식배양체계구축및 줄기세포분화유도배양체계도입 6 한국생명공학연구원 SNUhES3 P44 남기환 2003-01-16 (100 colony) 인간배아줄기세포를이용한발생학적분화실험연구 7 8 9 10 11 서울의과대학유전자이식연구실서울의과대학유전자이식연구실서울의과대학유전자이식연구실서울의과대학유전자이식연구실서울의과대학유전자이식연구실 SNUhES1 P36 박웅양 2002-11-27 (100 colony) SNUhES3 P37 박웅양 2002-11-30 (100 colony) SNUhES1 P36 박웅양 2002-12-01 (100 colony) SNUhES3 P38 박웅양 2002-12-03 (100 colony) SNUhES1 P37 박웅양 2002-12-04 (100 colony) 인간배아줄기세포를이용한 gene expression profiling 인간배아줄기세포를이용한 gene expression profiling 인간배아줄기세포를이용한 gene expression profiling 인간배아줄기세포를이용한 gene expression profiling 인간배아줄기세포를이용한 gene expression profiling - 186 -
연구기관 연구 책임자 날짜분양세포주연구목적및내용 12 서울의과대학유전자이식연구실 박웅양 2002-12-10 SNUhES3 P39 (150 colony) 인간배아줄기세포를이용한 gene expression profiling 13 서울의과대학유전자이식연구실 박웅양 2003-01-04 SNUhES2 P57 (150 colony) 인간배아줄기세포를이용한 gene expression profiling 14 서울의과대학유전자이식연구실 박웅양 2003-02-27 SNUhES3 P50 (220 colony) 인간배아줄기세포를이용한 gene expression profiling 15 서울의과대학유전자이식연구실 박웅양 2003-03-06 SNUhES3 P51 (216 colony) 인간배아줄기세포를이용한 gene expression profiling 16 서울의과대학유전자이식연구실 박웅양 2003-03-27 SNUhES3 P54 (100 colony) 인간배아줄기세포를이용한 gene expression profiling 17 서울의과대학유전자이식연구실 박웅양 2003-03-29 SNUhES1 P53 (100 colony) 인간배아줄기세포를이용한 gene expression profiling 18 서울의과대학유전자이식연구실 박웅양 2003-03-29 SNUhES2 P69 (100 colony) 인간배아줄기세포를이용한 gene expression profiling 19 서울의과대학유전자이식연구실 박웅양 2003-04-02 SNUhES3 P55 (100 colony) 인간배아줄기세포를이용한 gene expression profiling 인간배아줄기세포를 20 원자력의학원생체조직재생연구실 박현숙 2003-02-17 SNUhES3 P49 (200 colony) 이용하여당뇨병, 간및신장의세포치료를위한 human embryogenesis 동안의 내배엽으로의분화연구인간배아줄기세포를이용하여 21 원자력의학원생체조직재생연구실 박현숙 2003-04-15 SNUhES3 P57 (80 colony) 당뇨병, 간및신장의세포치료를위한 human embryogenesis 동안의 내배엽으로의분화연구인간배아줄기세포를이용하여 22 원자력의학원생체조직재생연구실 박현숙 2003-04-29 SNUhES3 P59 (100 colony) 당뇨병, 간및신장의세포치료를위한 human embryogenesis 동안의 내배엽으로분화연구 - 187 -
연구기관 연구 책임자 날짜분양세포주연구목적및내용 23 원자력의학원 생체조직재생연구 실 인간배아줄기세포를이용하여 SNUhES3 P62 당뇨병, 간및신장의세포치료를박현숙 2003-05-23 (70 colony) 위한 human embryogenesis 동안의내배엽으로의분화연구 24 25 26 27 28 29 30 원자력의학원 생체조직재생연구 실 원자력의학원 생체조직재생연구 실 원자력의학원 생체조직재생연구 실 서울대학교 유전공학연구소 서울대학교 유전공학연구소 서울대학교 유전공학연구소 서울대학교 유전공학연구소 인간배아줄기세포를이용하여 SNUhES3 P63 당뇨병, 간및신장의세포치료를박현숙 2003-05-28 (120 colony) 위한 human embryogenesis 동안의내배엽으로의분화연구인간배아줄기세포를이용하여 SNUhES3 P63 당뇨병, 간및신장의세포치료를박현숙 2003-05-29 (100 colony) 위한 human embryogenesis 동안의내배엽으로의분화연구인간배아줄기세포를이용하여 SNUhES3 P63 당뇨병, 간및신장의세포치료를박현숙 2003-06-09 (100 colony) 위한 human embryogenesis SNUhES2 P57 성노현 2003-01-04 (150 colony) SNUhES3 P43 성노현 2003-01-07 (100 colony) SNUhES1 P42 성노현 2003-01-08 (100 colony) SNUhES3 P58 성노현 2003-04-28 (1000 colony) 동안의내배엽으로의분화연구미분화상태의인간배아 줄기세포와배아체형성 단계에서의 gene expression 에 관한 micro-assay 미분화상태의인간배아 줄기세포와배아체형성 단계에서의 gene expression 에 관한 micro-assay 미분화상태의인간배아 줄기세포와배아체형성 단계에서의 gene expression 에 관한 micro-assay 미분화상태의인간배아 줄기세포와배아체형성 단계에서의 gene expression 에 관한 micro-assay - 188 -
31 32 33 연구기관서울대학교유전공학연구소서울대학교유전공학연구소서울대학교유전공학연구소 연구 책임자 날짜분양세포주연구목적및내용 SNUhES3 P58 성노현 2003-05-01 (500 EBs) SNUhES3 P58 성노현 2003-05-06 (20 EBs) SNUhES3 P58 성노현 2003-05-12 (20 EBs) 미분화상태의인간 배아줄기세포와배아체형성 단계에서의 gene expression 에 관한 micro-assay 미분화상태의인간 배아줄기세포와배아체형성 단계에서의 gene expression 에 관한 micro-assay 미분화상태의인간 배아줄기세포와배아체형성 단계에서의 gene expression 에 관한 micro-assay 34 서울수의과대학발생유전학연구실 성제경 2002-12-21 SNUhES3 P40 (320 colony) 인간배아줄기세포의프로테옴 분석 35 서울수의과대학발생유전학연구실 36 37 38 39 40 단국의과대학 생리학교실 단국의과대학 생리학교실 서울의과대학 면역학연구실 서울의과대학 면역학연구실 서울의과대학 면역학연구실 성제경 2003-01-28 SNUhES3 P46 (1250 colony) SNUhES1 P38 심호섭 2002-12-12 (100 colony) SNUhES3 P51 심호섭 2003-03-06 (210 colony) SNUhES1 P37 안규리 2002-12-04 (100 conoly) SNUhES1 P38 안규리 2002-12-16 (200 conoly) SNUhES2 P56 안규리 2002-12-30 (350 conoly) 인간배아줄기세포의프로테옴 분석 배아줄기세포를이용한낭포성 섬유증질환모델돼지의개발과정에 필요한인간배아줄기세포주와 돼지배아줄기세포주의비교연구배아줄기세포를이용한낭포성 섬유증질환모델돼지의개발과정에 필요한인간배아줄기세포주와 돼지배아줄기세포주의비교연구 줄기세포이식모델확립과 줄기세포의 HLA 발현조사 줄기세포이식모델확립과 줄기세포의 HLA 발현조사 줄기세포이식모델확립과 줄기세포의 HLA 발현조사 - 189 -
연구기관 연구 책임자 날짜분양세포주연구목적및내용 41 서울의과대학면역학연구실 안규리 2002-12-31 SNUhES1 P41 (100 conoly) 줄기세포이식모델확립과 줄기세포의 HLA 발현조사 42 서울의과대학면역학연구실 안규리 2002-12-31 SNUhES3 P42 (400 conoly) 줄기세포이식모델확립과 줄기세포의 HLA 발현조사 43 서울의과대학면역학연구실 안규리 2003-01-03 SNUhES1 P41 day1 EBs(200 conoly) 줄기세포이식모델확립과 줄기세포의 HLA 발현조사 44 서울의과대학면역학연구실 안규리 2003-01-9 SNUhES1 P41 day 7 EBs(200 conoly) 줄기세포이식모델확립과 줄기세포의 HLA 발현조사 45 서울의과대학면역학연구실 안규리 2003-01-16 SNUhES1 P41 day 14 EBs (200 conoly) 줄기세포이식모델확립과 줄기세포의 HLA 발현조사 46 서울의과대학면역학연구실 안규리 2003-01-23 SNUhES1 P41 day 21 EBs (100 conoly) 줄기세포이식모델확립과 줄기세포의 HLA 발현조사 47 서울의과대학면역학연구실 안규리 2003-01-30 SNUhES1 P41 day 28 EBs (300 conoly) 48 한양의과대학생화학교실이상훈 2003-01-02 SNUhES3 P42 (400 colony) 49 한양의과대학생화학교실이상훈 2003-02-20 SNUhES3 P49 (140 colony) 50 한양의과대학생화학교실이상훈 2003-02-27 SNUhES3 P50 (135 colony) 줄기세포이식모델확립과줄기세포의 HLA 발현조사인간배아줄기세포로부터도파민신경세포의분화법개발인간배아줄기세포로부터도파민신경세포의분화법개발인간배아줄기세포로부터도파민신경세포의분화법개발 - 190 -
연구기관 연구 책임자 날짜분양세포주연구목적및내용 51 한양의과대학생화학교실 SNUhES3 P54 이상훈 2003-03-26 (100 colony) 인간배아줄기세포로부터도파민 신경세포의분화법개발 52 한양의과대학생화학교실 SNUhES3 P57 이상훈 2003-04-14 (300 colony) 인간배아줄기세포로부터도파민 신경세포의분화법개발 53 한양의과대학생화학교실 54 서울의과대학내분비내과 SNUhES3 P62 이상훈 2003-05-27 (100 colony) SNUhES3 P47 이홍규 2003-02-06 (125 colony) 인간배아줄기세포로부터도파민신경세포의분화법개발인슐린분비세포형성을위한인간배아줄기세포배양및유지법확립 55 서울의과대학내분비내과 56 서울의과대학내분비내과 57 서울의과대학내분비내과 58 59 포천중문 의과대학 세포유전자 치료연구소포천중문 의과대학 세포유전자 치료연구소 60 한양의과대학산부인과 SNUhES3 P48 이홍규 2003-02-14 (100 colony) SNUhES3 P52 이홍규 2003-03-18 (100 colony) SNUhES3 P54 이홍규 2003-03-26 (100 colony) 정형민 2002-12-09 정형민 2002-12-06 SNUhES3 P38 (140 colony) SNUhES3 P39 (400 colony) SNUhES3 P44 황정혜 2003-01-18 (470 colony) 인슐린분비세포형성을위한인간배아줄기세포배양및유지법확립인슐린분비세포형성을위한인간배아줄기세포배양및유지법확립인슐린분비세포형성을위한인간배아줄기세포배양및유지법확립인간전분화기능줄기세포주확립, 분화유도및표식인자발굴인간전분화기능줄기세포주확립, 분화유도및표식인자발굴인간줄기세포의증식유지배양배아체형성시험관내분화기술을확립하고, 분화시기별시료확보, 분화인자적용후분화시기별시료확보및 HOX 유전자군의발현양상변화검색 - 191 -
61 62 연구기관 한양대학교 산부인과 한양대학교 산부인과 63 고려의과대학혈액종양내과 연구 책임자 날짜분양세포주연구목적및내용 SNUhES3 P44 황정혜 2003-01-20 (100 colony) SNUhES3 P64 황정혜 2003-06-03 (100 colony) 김병수 2003-04-08 SNUhES3 P56 (100 colony) 인간줄기세포의증식유지배양 배아체형성시험관내분화기술을 확립하고, 분화시기별시료확보, 분화인자적용후분화시기별 시료확보및 HOX 유전자군의발현 양상변화검색 인간줄기세포의증식유지배양 배아체형성시험관내분화기술을 확립하고, 분화시기별시료확보, 분화인자적용후분화시기별 시료확보및 HOX 유전자군의발현 양상변화검색 인간배아줄기세포로부터혈구 줄기세포를비롯한혈액세포로의 선택적분화촉진과효율적분리 64 고려의과대학혈액종양내과 65 고려의과대학혈액종양내과 66 고려의과대학혈액종양내과 67 고려의과대학혈액종양내과 김병수 2003-04-22 SNUhES3 P58 (100 colony) 김병수 2003-05-30 SNUhES3 P63 (400 colony) 김병수 2003-06-20 SNUhES3 P67 (150 colony) 김병수 2003-06-25 SNUhES3 P67 (20 colony) 인간배아줄기세포로부터혈구줄기세포를비롯한혈액세포로의선택적분화촉진과효율적분리인간배아줄기세포로부터혈구줄기세포를비롯한혈액세포로의선택적분화촉진과효율적분리인간배아줄기세포로부터혈구줄기세포를비롯한혈액세포로의선택적분화촉진과효율적분리인간배아줄기세포로부터혈구줄기세포를비롯한혈액세포로의선택적분화촉진과효율적분리 - 192 -
2 차년도 (2003 년 7 월 1 일 - 2004 년 3 월 31 일 ) 인간배아줄기세포분양상황 68 연구기관 울산대학교 면역제어연구센터 연구 책임자 날짜분양세포주연구목적및내용 권병세 2004-02-09 SNUhES3 P60 (100 colony) 인간배아줄기세포에서의 조혈줄기세포로의분화유도 조건탐색및분리 69 포천중문 의과대학교 SNUhES3 P88 김계성 2003-11-22 (200 colony) 줄기세포분화유도배양체계 구축및줄기세포증식 / 분화에 관여하는유전자발굴 70 고려의과대학 혈액종양내과 SNUhES3 P68 김병수 2003-07-02 (20 colony) 인간배아줄기세포로부터혈구 줄기세포를비롯한혈액세포로의 선택적분화촉진과효율적분리 71 고려의과대학 혈액종양내과 SNUhES3 P70 김병수 2003-07-16 (20 colony) 인간배아줄기세포로부터혈구 줄기세포를비롯한혈액세포로의 선택적분화촉진과효율적분리 72 고려의과대학 혈액종양내과 SNUhES3 P71 김병수 2003-07-22 (20 colony) 인간배아줄기세포로부터혈구 줄기세포를비롯한혈액세포로의 선택적분화촉진과효율적분리 73 고려의과대학 혈액종양내과 SNUhES3 P59 김병수 2004-01-30 (100 colony) 인간배아줄기세포로부터혈구 줄기세포를비롯한혈액세포로의 선택적분화촉진과효율적분리 SNUhES3 P89 74 이화여자대학교김재상 2003-11-22 (100 colony) SNUhES3 P60 75 이화여자대학교김재상 2003-02-06 (100 colony) 인간배아줄기세포를이용한조혈모세포로의분화및분화유도조절유전자발굴인간배아줄기세포를이용한조혈모세포로의분화및분화유도조절유전자발굴 - 193 -
76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 연구기관한양대학교분자유전학연구실서울의과대학유전자이식연구실서울의과대학유전자이식연구실서울의과대학유전자이식연구실서울의과대학유전자이식연구실서울의과대학유전자이식연구실서울의과대학유전자이식연구실서울의과대학유전자이식연구실서울의과대학유전자이식연구실서울의과대학유전자이식연구실서울의과대학유전자이식연구실 연구 책임자 날짜 분양세포주 연구목적및내용 전분화능줄기세포의미분화및 SNUhES 3 김철근 2003-08-29 P76 (200 colony) 분화관련기전을분석하고자배아줄기세포의성장과분화에중요한 JAK-STAT 신호전달계및여러종류의 JAK과 STAT isoform들에관한연구 SNUhES3 P81 인간배아줄기세포를이용한박웅양 2003-10-10 day 4 30 EBs gene expression profiling SNUhES3 P82 인간배아줄기세포를이용한박웅양 2003-10-14 (520 colony) gene expression profiling SNUhES3 P81 박웅양 2003-10-14 day 8 30 EBs SNUhES3 P81 박웅양 2003-10-18 day 12 30 EBs SNUhES3 P83 박웅양 2003-10-21 (520 colony) SNUhES3 P81 박웅양 2003-10-27 day 21 30 EBs SNUhES3 P84 박웅양 2003-10-31 day 4 50 EBs SNUhES3 P84 박웅양 2003-11-04 day 8 50 EBs SNUhES3 P85 박웅양 2003-11-04 (520 colony) SNUhES3 P85 박웅양 2003-11-07 day 4 50 EBs 인간배아줄기세포를이용한 gene expression profiling 인간배아줄기세포를이용한 gene expression profiling 인간배아줄기세포를이용한 gene expression profiling 인간배아줄기세포를이용한 gene expression profiling 인간배아줄기세포를이용한 gene expression profiling 인간배아줄기세포를이용한 gene expression profiling 인간배아줄기세포를이용한 gene expression profiling 인간배아줄기세포를이용한 gene expression profiling - 194 -
연구기관 연구 책임자 날짜분양세포주연구목적및내용 87 서울의과대학 유전자이식연구실 박웅양 2003-11-08 SNUhES3 P84 day 12 50 EBs 인간배아줄기세포를이용한 gene expression profiling 88 서울의과대학 유전자이식연구실 박웅양 2003-11-11 SNUhES3 P84 day 15 50 EBs 인간배아줄기세포를이용한 gene expression profiling 89 서울의과대학 유전자이식연구실 박웅양 2003-11-11 SNUhES3 P85 day 8 50 EBs 인간배아줄기세포를이용한 gene expression profiling 90 서울의과대학 유전자이식연구실 박웅양 2003-11-15 SNUhES3 P85 day 12 50 EBs 인간배아줄기세포를이용한 gene expression profiling 91 서울의과대학 유전자이식연구실 박웅양 2003-11-17 SNUhES3 P84 day 21 50 EBs 인간배아줄기세포를이용한 gene expression profiling 92 서울의과대학 유전자이식연구실 박웅양 2003-11-18 SNUhES3 P85 day 15 50 EBs 인간배아줄기세포를이용한 gene expression profiling 93 서울의과대학 유전자이식연구실 박웅양 2003-11-24 SNUhES3 P85 day 21 50 EBs 인간배아줄기세포를이용한 gene expression profiling 94 서울의과대학 유전자이식연구실 박웅양 2003-12-01 SNUhES1 P88 (150 colony) 인간배아줄기세포를이용한 gene expression profiling 95 서울의과대학 유전자이식연구실 박웅양 2003-12-01 SNUhES2 P104 (150 colony) 인간배아줄기세포를이용한 gene expression profiling 96 97 98 원자력의학원 생체조직재생연구실 원자력의학원 생체조직재생연구실 서울대학교 유전공학연구소 박현숙 2004-02-27 SNUhES3 P63 (100 colony) 박현숙 2004-03-12 SNUhES3 P65 (100 colony) SNUhES2 P86 성노현 2003-07-28 (720 colony) 전분화능줄기세포의전장및췌장세포로의분화유도조건탐색전분화능줄기세포의전장및췌장세포로의분화유도조건탐색미분화상태의인간배아줄기세포와배아체형성단계에서의 gene expression에관한 micro-assay - 195 -
99 연구기관 서울대학교 유전공학연구소 연구 책임자 날짜분양세포주연구목적및내용 성노현 2003-08-01 SNUhES2 P86 day 3 920 EBs 미분화상태의인간 배아줄기세포와배아체형성 단계에서의 gene expression 에 관한 micro-assay 미분화상태의인간 100 서울대학교 유전공학연구소 성노현 2003-08-05 SNUhES2 P86 day 7 400 EBs 배아줄기세포와배아체형성단계에서의 gene expression에 관한 micro-assay 101 서울대학교 유전공학연구소 성노현 2003-08-12 SNUhES2 P86 day 14 180 EBs 미분화상태의인간배아줄기세포와배아체형성단계에서의 gene expression에관한 micro-assay 미분화상태의인간 102 서울대학교 유전공학연구소 성노현 2004-03-19 SNUhES3 P65 150 EBs 배아줄기세포와배아체형성단계에서의 gene expression에 관한 micro-assay SNUhES1 P60 103 서울의과대학면역학연구실 안규리 2003-08-12 culture media 4.5ml fresh culture 줄기세포배양기술확립과 T 세포반응조사및 NK 세로 receptorligand 발현조사 media 4.5ml SNUhES1 P62 104 서울의과대학면역학연구실 안규리 2003-08-27 1000 EBs culture media 6ml frech EB culture 줄기세포배양기술확립과 T 세포반응조사및 NK 세로 receptorligand 발현조사 media 20ml 1. 인간배아줄기세포로부터 도파민신경세포분화효율개선 105 한양의과대학생화학교실 이상훈 2004-02-20 SNUhES3 P62 (100 colony) 2. 분화된도파민신경세포특성분석 3. 인간배아줄기세포로부터분화, 이식된도파민신경세포 특성최적화 I - 196 -
106 연구기관 한국생명공학 연구원 세포생물학실 107 서울의과대학내분비내과 108 서울의과대학내분비내과 109 포천중문 의과대학교 연구 책임자 이영희 2003-09-05 날짜분양세포주연구목적및내용 SNUhES3 P77 (500 colony) 이홍규 2004-01-10 SNUhES3 P56 (100 colony) 이홍규 2004-03-26 SNUhES3 P67 (100 colony) 정형민 2003-12-06 SNUhES3 P90 (550 colony) 분화연구기반확립, 분화유도 조건최적화및신호전달기전규명 인간배아줄기세포를이용하여 인슐린분비세포로의분화과정에서 필요한세포간상호작용, 세포 - 기질간상호작용, 각종분화 관련성장인자및 cytokine 등의 분석인간배아줄기세포를이용하여 인슐린분비세포로의분화과정에서 필요한세포간상호작용, 세포 - 기질간 상호작용, 각종분화관련성장인자 및 cytokine 등의분석 인간전붕화기능줄기세포주확립, 분화유도및표식인자발굴 110 서울의대 치과대학 111 한양의과대학산부인과 112 한양대학교산부인과 113 한양대학교산부인과 조재진 2003-11-25 SNUhES3 P88 (150 colony) 황정혜 2003-09-19 SNUhES3 P79 (200 colony) 황정혜 2003-10-29 SNUhES3 P85 (290 colony) 황정혜 2003-11-21 SNUhES3 P88 (250 colony) 인간배아줄기세포의 RNA 분리및특성분석 Hox 유전자군 ( 약 30종 ) 의발현양상변화검색및 Hox 유전자의 CpG 섬의 epigenetic pattern 변화검색, Hox 유전자발현의 cell localization (In situ hybridization) 실시 Hox 유전자군 ( 약 30종 ) 의발현양상변화검색및 Hox 유전자의 CpG 섬의 epigenetic pattern 변화검색, Hox 유전자발현의 cell localization (In situ hybridization) 실시 Hox 유전자군 ( 약 30종 ) 의발현양상변화검색및 Hox 유전자의 CpG 섬의 epigenetic pattern 변화검색, Hox 유전자발현의 cell localization (In situ hybridization) 실시 - 197 -
3 차년도 (2004 년 4 월 1 일 - 2005 년 3 월 31 일 ) 인간배아줄기세포분양상황 연구기관 114 연세의과대학생리학교실 경희대학교 115 동서의학연구소 연구 책임자 날짜분양세포주연구목적및내용 SNUhES3 P45 김동욱 2004-10-18 (100 colony) 김수영 2004-08-18 SNUhES3 P36 (100 colony) 쥐또는인간배아줄기세포로부터 oligodendrocyte 와 GABA 신경세포를만들기위한최적 배양조건의확립 - Neurotrophic factor 를분비하는 세포주또는 GABA 신경세포 분화관련전사인자가도입되 세포주확립 Establishment of culture system of pluripotential human embryonic stem cells and lineage specific differentiation : its use and application in toxicology. 116 고려의과대학혈액종양내과 SNUhES3 P25 김병수 2004-03-14 (100 colony) 인간배아줄기세포로부터혈구 줄기세포를비롯한혈액세포로의 선택적분화촉진과효율적분리 SNUhES3 P25 117 이화여자대학교김재상 2004-10-12 (50 colony) SNUhES3 P95 118 이화여자대학교김재상 2004-10-12 (100 colony) SNUhES3 P99 119 이화여자대학교김재상 2004-11-08 (100 colony) SNUhES3 120 이화여자대학교김재상 2004-11-23 P102 (100 colony) SNUhES3 121 이화여자대학교김재상 2004-12-17 P105 (100 colony) 인간배아줄기세포를이용한조혈모세포로의분화및분화유도조절유전자발굴인간배아줄기세포를이용한조혈모세포로의분화및분화유도조절유전자발굴인간배아줄기세포를이용한조혈모세포로의분화및분화유도조절유전자발굴인간배아줄기세포를이용한조혈모세포로의분화및분화유도조절유전자발굴인간배아줄기세포를이용한조혈모세포로의분화및분화유도조절유전자발굴 - 198 -
연구기관 연구 책임자 날짜분양세포주연구목적및내용 122 이화여자대학교김재상 2005-01-31 SNUhES P59 (100 colony) 인간배아줄기세포를이용한 조혈모세포로의분화및분화유도 조절유전자발굴 인간배아줄기세포를이용한 SNUhES3 P65 123 이화여자대학교김재상 2005-03-10 조혈모세포로의분화및분화유도 (100 colony) 조절유전자발굴 인간배아줄기세포를이용한 SNUhES3 P27 124 이화여자대학교김재상 2005-03-28 조혈모세포로의분화및분화유도 (100 colony) 조절유전자발굴 125 서울의과대학순환기내과 126 127 128 원자력의학원 생체조직 재생연구실 원자력의학원 생체조직 재생연구실 원자력의학원 생체조직 재생연구실 SNUhES3 P22 김효수 2005-02-21 (100 colony) SNUhES3 P72 박현숙 2004-04-30 (100 colony) SNUhES3 P27 박현숙 2004-06-15 (100 colony) SNUhES3 P32 박현숙 2004-07-23 (100 colony) 인간배아줄기세포의배양조건 확립과 epithelial cell 로의분화및 특성분석 초기내배엽세포로부터전장및 췌장세포로의분화유도조건 탐색 초기내배엽세포로부터전장및 췌장세포로의분화유도조건 탐색 초기내배엽세포로부터전장및 췌장세포로의분화유도조건 탐색 129 포천중문 의과대학 SNUhES3 P36 송지환 2004-08-17 (100 colony) 130 서울의과대학내분비내과 SNUhES3 P22 이홍규 2004-05-14 (100 colony) 분화와관련된유전자및단백 발현을분석하기위해 cdna MicroARRAY 및 proteomics 기법을이용하여얻어진결과를 다시분화조건에적용, 분화조건 확립및체외실험을통한각종 인슐린분비자극에대한반응을 관찰함으로서기능성을확인 - 199 -
연구기관 131 서울의과대학내분비내과 132 서울의과대학내분비내과 133 서울의과대학내분비내과 134 서울의과대학내분비내과 연구 책임자 날짜분양세포주연구목적및내용 SNUhES3 P31 이홍규 2004-07-12 (100 colony) SNUhES3 P35 이홍규 2004-08-10 (100 colony) SNUhES3 P45 이홍규 2004-10-19 (200 colony) SNUhES3 P19 이홍규 2004-01-28 (250 colony) 분화와관련된유전자및단백 발현을분석하기위해 cdna MicroARRAY 및 proteomics 기법을 이용하여얻어진결과를다시분화 조건에적용, 분화조건확립및 체외실험을통한각종인슐린분비 자극에대한반응을관찰함으로서 기능성을확인분화와관련된유전자및단백 발현을분석하기위해 cdna MicroARRAY 및 proteomics 기법을 이용하여얻어진결과를다시분화 조건에적용, 분화조건확립및 체외실험을통한각종인슐린분비 자극에대한반응을관찰함으로서 기능성을확인분화와관련된유전자및단백 발현을분석하기위해 cdna MicroARRAY 및 proteomics 기법을 이용하여얻어진결과를다시분화 조건에적용, 분화조건확립및 체외실험을통한각종인슐린분비 자극에대한반응을관찰함으로서 기능성을확인분화와관련된유전자및단백 발현을분석하기위해 cdna MicroARRAY 및 proteomics 기법을 이용하여얻어진결과를다시분화 조건에적용, 분화조건확립및 체외실험을통한각종인슐린분비 자극에대한반응을관찰함으로서 기능성을확인 - 200 -
135 연구기관 한국생명공학 연구원 세포생물학실 136 한국생명공학연구원 137 한국생명공학연구원 138 서울수의과대학산과학교실 연구 책임자 날짜분양세포주연구목적및내용 SNUhES3 P40 이영희 2004-09-13 (100 colony) 분화조절인자발굴및활용 인간배아줄기세포에서신호전달에 SNUhES3 P71 한용만 2004-04-23 의한자가재생산을조절하는 (100 colony) 전사인자발현연구인간배아줄기세포에서신호전달에 SNUhES3 P34 한용만 2004-08-03 의한자가재생산을조절하는 (100 colony) 전사인자발현연구 SNUhES3 P68 IVF human ESC와 NT human 황우석 2004-04-02 (100 colony) ESC간의특성분석및분화실험 - 201 -
부록 Ⅳ. - Science 지에실린세계최초복제배아줄기세포확립논문 - 202 -
- 203 -
- 204 -
- 205 -
- 206 -
- 207 -
- 208 -
- 209 -
- 주요논문 - 210 -
- 211 -
- 212 -
- 213 -
- 214 -
- 215 -
- 216 -
- 217 -
- 218 -
- 219 -
- 220 -
- 221 -
- 222 -