명세서청구범위청구항 1 황련, 황백, 황금, 황기, 당귀, 적작약, 금은화의복합추출물을유효성분으로함유하는것을특징으로하는여드름예방및치료용화장료조성물. 청구항 2 제 1항에있어서, 상기추출물은황련 30중량부, 황백 20중량부, 황금 10중량부, 황기 10중량부, 당귀 10

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희령 내
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1 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (11) 공개번호 (43) 공개일자 2016년06월15일 (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) A61K 8/97 ( ) A61Q 19/00 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일자 2014 년 12 월 05 일 심사청구일자 전체청구항수 : 총 6 항 2014 년 12 월 05 일 (71) 출원인 주식회사고운선형 부산광역시남구수영로 309, 5 관비 102 호 ( 대연동, 경성대학교 ) (72) 발명자 송창호 부산광역시수영구광안로 4, 104 동 2702 호 ( 광안동 ) 김학주 부산광역시해운대구대천로 103 번길 61 ( 좌동, 엘지아파트 ), 113 동 401 호 (74) 대리인 황여현, 한복연 (54) 발명의명칭천연추출물을함유하는여드름개선용화장료조성물 (57) 요약 본발명은황련, 황백, 황금, 황기, 당귀, 적작약, 금은화의복합추출물을유효성분으로함유함으로써항염및항균효과를가지며, 나아가피부의자극을억제하여여드름의치료및예방에효과가있는화장료조성물에관한것이다. 나아가본발명에의한화장료조성물은에센스등제품중에서선택되는제형을갖는것이다

2 명세서청구범위청구항 1 황련, 황백, 황금, 황기, 당귀, 적작약, 금은화의복합추출물을유효성분으로함유하는것을특징으로하는여드름예방및치료용화장료조성물. 청구항 2 제 1항에있어서, 상기추출물은황련 30중량부, 황백 20중량부, 황금 10중량부, 황기 10중량부, 당귀 10중량부, 적작약 10중량부, 금은화 10중량부의비율로혼합되는것을특징으로하는여드름예방및치료용화장료조성물. 청구항 3 제 1항또는제2항에있어서, 상기추출물은상기조성물총량에대하여 0.05 ~ 30.0중량 % 로함유되는것을특징으로하는여드름예방및치료용화장료조성물. 청구항 4 제 3항에있어서, 상기추출물은용매로서에틸알코올또는물을사용하여추출되는것을특징으로하는여드름예방및치료용화장료조성물. 청구항 5 제 4항에있어서, 상기추출물은 50~80 에서 2~4시간동안순환추출장치로추출되는것을특징으로하는여드름예방및치료용화장료조성물. 청구항 6 제 1항내지제 5항중어느하나의항에있어서, 상기화장료조성물은수렴화장수, 젤, 수용성리퀴드, 밀크로션, 영양크림, 마사지, 크림, 에센스, 연고, 클렌징폼, 클렌징워터, 샴푸, 린스, 팩등의기초화장료 ; 수중유형또는유중수형메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버등메이크업제품, 헤어팩, 헤어에센스등헤어제품중에서선택되는제형을갖는것을특징으로하는화장료조성물. 발명의설명 [0001] 기술분야 본발명은황련, 황백, 황금, 황기, 당귀, 적작약, 금은화의복합추출물을유효성분으로함유하는여드름예방 - 2 -

3 및치료용화장료조성물에관한것으로, 더욱상세하게는황련, 황백, 황금, 황기, 당귀, 적작약, 금은화의복 합추출물을유효성분으로함유함으로써염증및항균작용이우수할뿐만아니라피부자극이감소되어여드름 예방및치료효과를갖는화장료조성물에관한것이다. [0002] [0003] [0004] [0005] [0006] [0007] [0008] [0009] 배경기술일반적으로여드름은사춘기의청소년들에게발생하는심상성좌창 ( 尋常性挫創 ) 을일컫는데, 치유가된후에도상처를남기기때문에외모에관심이많은청소년들에게정신적스트레스를가중시켜병변을일으키는악순환을유발하므로발생한즉시조치를취하여회복시켜야한다. 여드름은주로사춘기에접어들면서피지선의증대및활성화가일어나피지가과다분비되고, 각화과정의이상이생겨나각질형성세포의이각화증또는과각화증이발생하는것이일차적인원인으로작용하게되므로피지가자연스럽게분비되지못하고케라틴, 세포데브리스 (cell debris) 와함께모낭내에저류하게되면, 여드름의특징적병변인면포가생겨나게된다. 여기에 propionibacterium acnes 등의세균이증식하면서영향을미치면염증성병변을만들어내어육안으로보이는붉거나곪은여드름병변, 즉, 구진, 농포, 결절등을만들어내게된다. 지금까지알려진여드름에대한치료약물은결국피지분비의조절, 각화과정이상의교정, propionibacterium acnes로대표되는세균에대한억제기능, 이세가지중에서적어도한가지이상의역할을하여야만여드름치료에유용한약물이될수있는것이다. 구체적으로는, 피지과분비억제를위해비정상적인남성호르몬의분비를제어하는항안드로겐제등의여성호르몬의사용, 여드름균의생장을억제하는항균제및항생제의사용, 항염증작용을하는비스테로이드계소염제를사용하는방법이이용되고있다. 이와관련한종래기술로서, 특허문헌 1에는 황금, 감초, 연교, 승마, 백지, 작약의혼합복합추출물을유효성분으로함유하는것을특징으로하는여드름예방및개선용화장료조성물 이개시되어있는데, 상기조성물은항염증효과를가지나, 피지분비억제효과를가져스트레스시발생하는피지생성및염증성사이토카인의생성을억제하는것으로항균및피부자극을완화하는것과는차이가있다. 또한특허문헌 2에는 황련, 어성초, 은행추출물및마데카소사이드를유효성분으로포함하며, 상기황련, 어성초및은행추출물은각원료를발효시키고초음파추출하여얻어지는것임을특징으로하는, 여드름개선용화장료조성물 이개시되어있는데, 상기조성물을얻기위한공정이복잡하고, 항균기능이현저히증진되고, 피부자극이거의없다고하나, 그효과가만족할만한수준으로볼수없는것이다. 계속하여특허문헌 3에는 용담, 토복령, 황백, 연교추출물을유효성분으로함유하는것을특징으로하는항여드름조성물 이개시되어있는데, 상기조성물은항염및항균활성이우수하다고하나, 피부자극의완화와상이한것이다. 나아가여드름에대한전형적인항염및항균제로서는살리실산 (salicylic acid), 트리클로산 (triclosan) 등을들수있는데, 살리실산은면포성여드름이나감염되지않은여드름치료에쓰이며, 트리클로산은여드름균이세포벽에부착하는것을막아주는역할을한다. 그러나사용시에둘다피부작열감과따가움을유발시키는물질로서피부건조나피부박피등을유발하는문제점이있고, 특히이들을임산부나수유부가사용시에는의사처방이필요한것이다. 본발명자는상기와같은문제점을해결하기위하여연구를거듭한결과염증과항균작용이우수할뿐만아니라피부자극이적은여드름예방및치료용화장료조성물을완성하게되었다. 선행기술문헌 [0010] 특허문헌 ( 특허문헌 0001) 등록특허공보 호 ( 등록 ) ( 특허문헌 0002) 등록특허공보 호 ( 등록 ) - 3 -

4 ( 특허문헌 0003) 등록특허공보 호 ( 등록 ) 발명의내용 [0011] 해결하려는과제본발명은상기문제점을해결하고자안출된것으로서, 황련, 황백, 황금, 황기, 당귀, 작약, 금은화의복합추출물을유효성분으로함유함으로써항염및항균작용이우수할뿐만아니라피부자극이없는여드름예방및치료용화장료조성물을제공하는것이다. [0012] [0013] [0014] 과제의해결수단본발명은황련, 황백, 황금, 황기, 당귀, 적작약, 금은화의복합추출물을유효성분으로함유하는것을특징으로하는여드름예방및치료용화장료조성물을제공한다. 또한본발명은상기화장료조성물이수렴화장수, 젤, 수용성리퀴드, 밀크로션, 영양크림, 마사지, 크림, 에센스, 연고, 클렌징폼, 클렌징워터, 샴푸, 린스, 팩등의기초화장료 ; 수중유형또는유중수형메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버등메이크업제품, 헤어팩, 헤어에센스등헤어제품중에서선택되는제형을갖는것을특징으로하는화장료조성물을제공한다. 한편, 본발명에의한그밖의구체적인과제의해결수단은발명의상세한설명에기재되어있다. [0015] 발명의효과상기한바와같이본발명에의한화장료조성물은황련, 황백, 황금, 황기, 당귀, 적작약, 금은화의복합추출물을유효성분으로함유함으로써뛰어난항염및항균효과를가지며, 나아가피부의자극을억제하여여드름의치료및예방에효과가우수하다. [0016] [0017] [0018] [0019] [0020] 발명을실시하기위한구체적인내용이하본원발명의바람직한실시예및실험예를구체적으로설명한다. 먼저본원발명에의한황련, 황백, 황금, 황기, 당귀, 적작약, 금은화의복합추출물을유효성분으로함유하는여드름예방및치료용화장료조성물의구성물질중에대하여상세히설명한다. 황련 ( 黃連 ) 은미나리아제비과다년생초본식물의뿌리줄기를약재로사용하는데, 오래전부터한방에서사용해오던재료로서피부및점막에대한자극이없는안전한식물이다. 황련은베르베린 (berberine) 이주성분이고그외에팔마틴 (palmatine) 을함유하고콥티신 (coptisine), 워레닌 (worenine), 콜룸바민 (columbamaine) 등의알칼로이드를함유하며, 항염작용및동맥경화예방효과가공지되어있다. 황백 ( 黃柏 ) 은운향과에속한낙엽교목식물인황벽과황피수 ( 천황백, 관황백 ) 의전피를제거한수건피를황백 (Phellodendri Cortex) 이라하며, 수피와과실을약재로사용하여왔다. 전남, 충북을제외한전국에야생하며일본, 중국, 만주에분포한다. 수피에베르베린 (Berberin), 자트로진 (jatrorrhi-zine), 팔마틴 (palmatine), 메니스퍼민 (menispermine), 마그노플로린 (magnofl-orine), 베타시토스테롤 (β-sitosterol) 등을함유하며과실에펠로덴드론스테롤 (phellodendronsterol) 을함유한다. 황백은오래전부터청열조습, 사화제증, 해독정창, 습열사리, 황달, 대하, 열림, 각기, 골증노열, 도한, 유정, 창양종독, 방광습열, 뇨도염, 하초열, 고미건위, 정장, 특히수렴, 방부약, 소염약, 안약원료로한방에서사용해오던것으로서체내섭취에따른인체안정성이이미확인되었다. 황금 ( 黃芩 ) 은꿀풀과다년생초본식물로서플라보노이드, 우고닌 (Wogonin), 바이칼린 (Baicalin) 등의생리활성성분을함유하며, 약리효과로는심장및폐의열을내리게하거나기침및피를멈추게하는효과를갖고있으며, 피부에는항알레르기, 항산화, 항염증효과를갖고있고유해산소제거효과가우수하고알려져있다

5 [0021] [0022] [0023] [0024] [0025] [0026] [0027] [0028] [0029] [0030] [0031] [0032] 황기 ( ) 는콩과에속하는다년생초본으로우리나라의중북부지역에자생하며약용을목적으로널리재배되고있는바, 한방에서는그뿌리를주로약재로사용하고있으며간장보호작용, 면역촉진작용, 항암작용, 강장작용, 이뇨작용등의효능이있고, 항균활성, 항산화능, 다량의폴리페놀물질및이소플라보노이드 (Isoflavonoid) 함유에따른생리활성이보고되었다. 당귀 ( 當歸 ) 는산형과 ( 미나리과, Umbelliferae) 에속하는 2~3년생초본식물로서, 강원도와경상도의고냉지대에서주로재배되고있는데, 보혈강장및진통작용을목적으로냉증, 빈혈, 혈행장애및정신증상등의부인과질환에주로보혈청혈약으로널리사용되어왔다. 적작약 ( 赤芍藥 ) 은미나리아제비과인붉은색또는가지색꽃이피는작약의뿌리로서, 단백질, 당질, 지질등과함께나이아신, 비타민 A, B군, K, Ca, Fe 등다양한성분이함유되어있어영양부족으로인한도한을완화하는수렴작용을한다. Paeonifolrin의혈관운동능력강화작용이신나믹알데하이드의혈관확장작용에힘입어말초혈관과소화관점막에분포된혈관의혈액순환을원활히하고소화관운동능력을항진시켜소화, 흡수를촉진한다. Paeoniflorin이중추신경흥분을억제해진정, 진경, 진통을하며위산분비억제작용이있다. 금은화 ( 金銀花 ) 는인동과 (Capriofoliaceae) 에속하는반상록덩굴성관목식물로서, 인동초라고도불리며, 억균작용, 면역부활작용, 소염작용, 진통작용, 이뇨작용, 항암작용, 항바이러스작용등이있다고알려져있는전통적인한약재로서주요성분으로는루리세린, 후라보노이드, 탄닌, 알칼로이드, 루테루닌, 이노시톨, 사포닌, 로니세린및루테오린성분등이있다. 본발명에적용되는부위는꽃부위이다. 본발명에따른황련, 황백, 황금, 황기, 당귀, 작약, 금은화의복합추출물은다음과같이단계를거쳐제조될수있다. 먼저, 황련, 황백, 황금, 황기, 당귀, 작약, 금은화를물로깨끗이세척한후에그늘에서충분히건조하고, 건조된황련, 황백, 황금, 황기, 당귀, 적작약, 금은화를분쇄하여사용한다. 이들분쇄물을황련 30중량부, 황백 20중량부, 황금 10중량부, 황기 10중량부, 당귀 10중량부, 적작약 10중량부, 금은화 10중량부를순환추출장치에넣은다음추출용매로서에틸알코올또는물을넣고침적 ( 沈積 ) 시킨후에 50~80 온도에서 2~4시간동안추출한다. 상기추출방법과달리황련 30중량부, 황백 20중량부, 황금 10중량부, 황기 10중량부, 당귀 10중량부, 적작약 10중량부, 금은화 10중량부를각각계량한후에순환추출장치에넣어추출한후에얻어진추출물을혼합하여복합추출물을얻을수도있다. 이어서상기에서얻은복합추출물을원심분리기 (VS24SMT, Vision Sci. Co., Korea) 에서 8000rpm x 20min(4 ) 으로원심분리하였으며, 이를종이필터로여과한후에진공회전증발기로 100ml로농축하여복합추출물을제조할수있다. 상기에서추출용매로는물, 알코올또는이들의혼합용매를사용하는것이바람직하다. 상기추출에서황련, 황백, 황금, 황기, 당귀, 적작약, 금은화는용매에대해 5~30중량부가되게하는바람직하며, 이때황련, 황백, 황금, 황기, 당귀, 적작약, 금은화가 5중량부미만의경우는과량의용매를사용하게되어경제성및농축의어려움이있고, 30중량부를초과하는경우황련, 황백, 황금, 황기, 당귀, 적작약, 금은화가용매에충분히함침되기어려워추출이잘되지않는다. 상기침적온도는 50 내지 80 이며, 보다바람직하게는 70 인데, 이온도범위에서황련, 황백, 황금, 황기, 당귀, 적작약, 금은화의변색및변취의예방에가장효과적이며, 50 미만에서는추출시간이오래걸리게되고, 80 를초과하면황련, 황백, 황금, 황기, 당귀, 적작약, 금은화의변색및변취의문제가발생된다. 상기침적시간은 3시간이바람직한데, 2시간미만에서는원하는성분의추출이미흡하며, 4시간이넘게되면추출성분의변화가없고추출물이변색된다. 상기의방법으로수득한추출여액을 300mesh 여과포로고형분을제거하고, 0.5~0.1μm필터로써여과하여상층액을감압농축하여에탄올추출물을얻을수있다. 상기와같이얻어진황련, 황백, 황금, 황기, 당귀, 적작약, 금은화의복합추출물은항산화및항염증활성이우수하며, 또한세포독성인 MTT Assay, NO 분비억제효능등생리활성이우수한것으로나타났다. 본원발명의시료는황련, 황백, 황금, 황기, 당귀, 적작약, 금은화복합추출물은화장료조성물의총중량에대하여 중량 % 를유효성분으로함유하는여드름치료용화장료조성물을제공하는데, 이때추출물의함량이조성물총중량에대하여 0.05중량 % 미만인경우에는기대하는항염및항균작용이취약할뿐만아니라피부자극의완화효과기미흡하고, 30.0중량 % 를초과한경우에는제형화에어려움이있고변색, 변취등의화 - 5 -

6 장료로서갖추어야할제형의조건을충족시키기어렵게된다. [0033] [0034] 마지막으로본발명의황련, 황백, 황금, 황기, 당귀, 적작약, 금은화의복합추출물을유효성분으로함유하는화장료조성물은화장품, 의약품, 식품, 섬유, 생활용품등다양한제품에포함될수있고, 특히, 화장품, 의약품등으로사용이바람직하다. 예를들면, 용액, 겔, 고체또는수상에유상을분산시켜얻은에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고형태로제공될수있다. 상기화장료조성물은더구체적으로피부에사용되는것으로서, 수렴화장수, 유연화장수, 크림, 영양에센스, 화운데이션, 선크림, 비비크림, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액중에서선택된등의제형을가질수있다. 이하, 본발명의구성및작용에대해하기실시예에서더욱상세히설명하지만, 본발명의권리범위가하기실시예에만한정되는것은아니고, 이와등가의기술적사상의변형까지를포함한다. [0035] [0036] 실시예 1 복합추출물의제조복합추출물의원료로사용되는황련, 황백, 황금, 황기, 당귀, 적작약, 금은화는국내에서채취한것을사용하였으며, 채취한상기약초를각각깨끗이씻고이물질을제거하여건조한후에분쇄하여 10mesh로여과하여사용한다. 건조된황련 30g, 황백 20g, 황금 10g, 황기 10g, 당귀 10g, 적작약 10g, 금은화 10g을얻어잘혼합한후에각각용매 ( 에탄올 : 증류수 = 70 : 30) 1l에침지시켜 70 순환추출장치에서 3시간동안추출시켰다. 이어서얻어진추출액을원심분리기 (VS24SMT, Vision Sci. Co., Korea) 에서 8000rpm x 20min(4 ) 으로원심분리하였으며, 이를실온으로냉각시키고종이필터로여과하여여과액을취한후에얻어진여과액을진공회전증발기로농축시켜복합추출물 100ml을수득하였다. 농축한복합추출물은실험실용동결건조기 (Ilshin lab. co., Ltd, korea) 를사용하여분말로제조할수있었는데, 그결과복합추출물분말 23.8g을회수할수있었으며, 이를사용하여샘플을제조하였다. [0037] 실시예 2 실시예 1 에서추출용매로서 70% 에틸알콜을사용하는대신에증류수를사용하는것을제외하고는동일한방법 으로하여복합추출물을얻었다. [0038] [0039] [0040] < 비교예 > 잘건조된황련, 어성초, 은행을각각 100g씩분쇄한후, 70% 에틸알코올 1l에넣어상온에서 5일동안침적시키고, 300 메쉬에서여과하여 1주일간방치한다음침전물을와트만 5번여과지로여과하였다. 이어서진공감압농축기를이용하여 80 에서농축건조하여분말형태의복합추출물을얻었다. 상기실시예 1, 2에서얻은복합추출물에대하여총당, 환원당, 단백질함량, 플라보이드화합물의함량등에관한성분을분석하였다. [0041] [0042] < 실험예 1> 총당량상기복합추출물의총당량을측정하기위해서 Dubois, M. 등 (1956) 이사용한페놀-황산법을사용하였다. 실시예 1, 2에서얻은복합추출물용액 0.2ml를시험관에넣고 5%(v/v) 페놀용액 0.2ml를첨가한후, 황산 1.0ml를반응액에서서히적하시킨후에혼합하여실온에서 20분간방치한다음 490nm에서흡광도를측정하며, 표준당으로는 D(+)-glucose(glucose 10mg +DW 20ml ) 를사용하여검량곡선을작성한후비교하여총당량을계산하였고, 그결과를 [ 표 1] 에나타내었다

7 표 1 [0043] [0044] 상기 [ 표 1] 로부터총당함량은주로열수추출물인실시예 2 가알코올추출물인실시예 1 보다높은것으로확 인되었다. [0045] [0046] < 실험예 2> 환원당량실시예 1, 2 추출물의환원당량을측정하기위해福井 (1969) 이사용한 DNS(3,5-Dinitrosalicylic acid) 법을사용하였다. DNS 용액은 1) DNS 0.75 g/100ml, 2) NaOH 1.4g/100ml, 3) Potassium sodium tartrate tetrahydrate 21.62g/100ml, 4) 페놀 0.54 g/100ml, 5) Na2S2O5 0.59g/100ml을조제하여사용하였으며, 540nm 흡광도값을측정하였고, 그결과를 [ 표 2] 에나타내었다. 표 2 [0047] [0048] 상기 [ 표 2] 로부터실시예 2 가실시예 1 보다환원당량이높은것으로확인되었다. [0049] [0050] < 실험예 3> 단백질정량상기실시예 1, 2에서제조된복합추출물의단백질정량을위하여브래포드 (Bradford) 법을사용하였는데, Bradford 시약은 0.1g briliant blue G-250 in 50ml메탄올 ( 고순도 ) 100ml, 85% 인산 50ml증류수에녹인후여과하여냉장보관하며, 595nm에서흡광도를측정하였으며, 그결과를 [ 표 3] 에나타내었다. 표 3 [0051] - 7 -

8 [0052] 상기 [ 표 3] 으로부터실시예 2 가실시예 1 보다단백질함량이높은것으로확인되었다. [0053] [0054] < 실험예 4> 플라보노이드화합물분석실시예 1, 2의복합추출물의총플라보노이드분석을위하여 Woisky, R. G. 등 (1998) 이사용한플라보노이드- AlCl3+ 법을사용하였다. 이것은플라보노이드류와 AlCl3+ 가반응하여생성된노랑색의착체를측정하는방법으로, 0.5ml탕약 (1mg/ ml ) 에 0.5ml 2% AlCl3(in EtOH) 를넣고반응시켜 1시간동안실온에방치한후에 420nm에서흡광도를측정하였으며, 표준물질로는루틴 (Rutin) 을사용하였다. 표준물질은에탄올 1ml에루틴 1mg을넣고용해시킨후에희석하여검량곡선을만들어총플라보노이드화합물의함량을분석하였으며, 그결과를 [ 표 4] 에나타내었다. 표 4 [0055] [0056] 상기 [ 표 4] 로부터실시예 1 이실시예 2 보다총플라보노이드함량이높은것으로확인되었다. [0057] [0058] [0059] < 실험예 5> 항여드름균 MIC 분석 1) MIC 방법실시예 1, 2 및비교예의복합추출물에대한표준균주 4종의최소발육억제농도 (MIC) 는배양기에서 24시간배양한배양액의탁도를플레이트리더 (Plate Reader) 로측정, 균을접종하지않은배지와오차범위 (5%) 내에서균이생장하지않는것을기준으로결정하였다. 대조군으로는 1,2-헥산디올 (hexanediol) 을사용하였으며, 사용균주는 Propionibacterium acnes KACC 11946, Staphylococcus epidermidis KCTC 1917, Staphylococcus aureus KCTC 3881,Candida albicans KCTC 7965를사용하였으며, 배지는항균실험에사용했던것과동일한배지를사용하였고, 그결과를 [ 표 5-1] 내지 [ 표 5-4] 에각각나타내었다. 표 5 [0060] - 8 -

9 [0061] 상기 [ 표 5-1] 로부터각시료별 Propionibacterium acnes KACC 균에대한 MIC농도는실시예 1은 2%, 실시예 2는 4% 로확인되었으나, 비교예의경우이보다훨씬높은수치를나타내었다. Propionibacterium acnes KACC 11946는혐기성균주로서주로모낭속에상주하면서여드름및염증을유발하는데, 연구결과실시예 1, 2 의복합추출물의최적농도는각각 2%, 4% 인것으로확인되었다. [0062] [0063] 상기 [ 표 5-2] 로부터 Staphylococcus epidermidis KCTC 1917 균주는혐기성균주로서외모낭모낭중간에상주하는균으로서여드름과염증을유발하는것으로알려져있다. 연구결과최적 MIC농도는실시예 1은 2%, 실시예 2는 5% 로각각확인되었으며, 비교예는이보다훨씬나쁜결과를보였고, 항균에센스의경우실시예 1이실시예 2보다전반적으로항균활성이높았으며, 실시예 1의 MIC가 2% 로가장적합하였다. [0064] [0065] 상기 [ 표 5-3] 으로부터 Staphylococcus aureus KCTC 3881은호기성으로피부표면에상주하는균으로서여드름과염증을유발하는것으로알려져있다. 연구결과최적 MIC농도는실시예1은 1%, 실시예 2는 2% 로확인되었으며, 대조군에비해항균활성이높았고, 비교예는이보다훨씬나쁜결과를보였으며, 실시예 1의최적 MIC는 1% 로대조군과유사한농도의 MIC 값을가지는것으로확인되었다. [0066] [0067] 상기 [ 표 5-4] 로부터 Candida albicans KCTC 7965 는호기성으로피부표면에상주하는균으로서여드름과염증을 유발하는것으로알려져있다. 연구결과최적 MIC 농도는실시예 1 에서만 4% 로확인되었으며, 실시예 2 의경우 10% 이하에서는 MIC 값이확인되지않았고, 비교예는이보다훨씬나쁜결과를나타내었다

10 [0068] [0069] < 실험예 6> 생리활성분석 상기실시예 1, 2 및비교예의복합추출물에대하여항산화활성, 항염증활성, 세포독성등에관한성분을분석 하였다. [0070] [0071] 1) 항산화 (DPPH method) 활성전자공여능 (EDA: electron donating ability) 측정법으로 Blois의방법을변형하여측정하였고, DPPH radical 제거효과는추출물의 DPPH에대한전자공여효과로시료의환원력을측정하는방법에의하여측정하였다. 시료용액 10μl (control : 99.5% ethanol) 에 0.1mM DPPH (in 99.5% ethanol) 용액을 190μl를가하고, vortex mixer 로 10초간진탕하여 37 에서 30분동안반응시킨후에 Microplate Reader(Bio-Tek, USA) 를이용하여 517nm에서흡광도를측정하였다. 음성대조군으로는시료대신메탄올을 10μl첨가하여반응시키고, 양성대조군으로는 L-ascorbic acid, caffeic acid를사용하여같은방법으로측정하였다. 각시료의항산화작용은대조군에비하여감소된흡광도로부터 radical 제거율을계산하였고, 그결과를 [ 표 6] 에나타내었다. [0072] [0073] [0074] Sample O.D. : 시료를가한시험액의흡광도 Control O.D. : 시료를가하지않은시험액의흡광도 표 6 [0075] [0076] 상기 [ 표 6] 으로부터각추출물에대한항산화효능분석결과실시예 1 은 68.24%, 실시예 2 는 34.52% 의항산화 효능이있는것으로확인되었으며, 비교예는이보다훨씬나쁜결과를보였다. 실시예 1 은대조군인 BHA 의 78.23% 와동등한정도의효능을가져항산화기능을통한피부노화예방에도움을줄수있을것으로판단된다. [0077] [0078] 2) 항염증활성실시예 1, 2에대한항염증효능분석을 COX-2(Cyclooxygenase-2) 의저해활성으로측정하였다. 96 well plate의 2 well에 10μl heme, 10μl assay buffer(100mm Tris-HCl, ph 8.0) 그리고 10μl용매 (inhibitor를녹였던용매 ) 를첨가하였다. Background well에는 2 well에 10μl heme, 10μl assay buffer 그리고 10μl의용매를첨가하고, 100% initial activity 측정을위해 2 well 에 10μl heme, 10μl효소 (COX-2) 그리고 10μl의용매를첨가하였다. 샘플 (inhibitor) 의 COX 저해활성측정을위해 2 well에 10μl heme, 10μl효소 (COX-2), 그리고 10μl의샘플을첨가하였다. Standard inhibitor로는인도메타신 (Indomethacin) 을디메틸설폭사이드 (dimethyl sulfoxide) 에녹여처리하였고, 샘플은 100mM Tris-HCl(pH 8.0) 에녹여농도별로처리하며, 모든 well에 200μl의 assay buffer를첨가하여실온에서반응시킨후에발광분석기 (Spectra Max L, Molecular devices, USA) 에부착되어있는 2개의 dispenser를이용하여하나의 dispenser로모든 well에 10μl의 chemiluminescent substrate를첨가하고, 즉시다른하나의 dispenser를이용하여 50μl의아라키돈산을첨가한후 Relative Luminescent Units(RLU) 를발광측정기로측정하였으며, 그결과를 [ 표 7] 에나타내었다 (Vane, J.(1987), Dawson, W.(1985), Seibert, K.(1994), Flattery, M.P(2005), Kortz, F.(2005), Linton, M.F.(2004))

표 7 [0079] [0080] 상기 [ 표 7] 로부터추출물에대한 COX-2 저해활성을분석한결과, 실시예는 99.87%, 실시예 2 는 92.45% 확인되 었으며, 비교예는이보다훨씬나쁜결과를나타내었다. 이는대조군인인도메타신의 90.89% 보다높은것으로 실시예 1, 2 모두고른항염증활성을가지는것으로확인되었다.

11 표 7 [0079] [0080] 상기 [ 표 7] 로부터추출물에대한 COX-2 저해활성을분석한결과, 실시예는 99.87%, 실시예 2 는 92.45% 확인되 었으며, 비교예는이보다훨씬나쁜결과를나타내었다. 이는대조군인인도메타신의 90.89% 보다높은것으로 실시예 1, 2 모두고른항염증활성을가지는것으로확인되었다. [0081] [0082] [0083] [0084] 3) 세포독성분석실시예 1, 2 및비교예의복합추출물에대한세포독성과항염증과관련성이있는 NO 억제효능을 Raw 세포를사용하여분석하였다. 1 세포독성분석 (MTT assay) Raw 세포를사용하여, 시료를농도별로처리하고세포배양 20시간이지난후에 5mg / ml의 MTT 시약을이용하여 0.1mg MTT/(200μl ) well에넣고 2시간동안배양하였다. 각실험군당 well 수는 3으로하고, 배양후에상등액을제거하고, 200μl의 PBS로세척한다음, 100μl의 DMSO를가하여 MTT의환원에의해생성된 formazan을용해시킨후에, ELISA microplate reader(model: MQX200R, BioTek, USA) 를이용하여 570nm에서흡광도를측정하였다. 세포생존률은 control cell에대한백분율로표시하였고, 그결과를 [ 표 8] 에나타내었다 [i.e. viability (% of control) = 100 (absorbance of treated sample)/(absorbance of control)]. 표 8 [0085] [0086] 시료의농도가 1.0 mg / ml에서 Raw 세포에대한독성을분석한결과, 실시예 1, 2 모두 80% 이상이생존하 는것으로확인되어세포독성이없는것으로확인되었으며, 비교예는이보다훨씬나쁜결과를나타내었다. [0087] [0088] 2 NO 분비억제효능측정 Raw 세포로부터생성된 NO의양을 LPS 처리한후, 20시간에있어서측정하며, 각실험군당 well 수는 3으로한다. 96 well plate에세포배양상등액 100μl와 Griess시약 (1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid + 1% α-naphthylamide in H2O) 150μl를혼합한후에, 5분동안반응시켜 ELISA microplate reader(model: MQX200R,

BioTek, USA) 를이용하여 540 nm에서흡광도를측정하고, 그결과를 [ 표 9] 에나타내었다. 표 9 [0089] [0090] [0091] 상기 [ 표 9] 로부터 NO 분비억제효율을분석한결과실시예 1, 2 모두 NO 분비억제효율이 90% 이상으로그효 능이우수한것으로확인되었으며, 비교예는이보다훨씬저조하였다.

12 BioTek, USA) 를이용하여 540 nm에서흡광도를측정하고, 그결과를 [ 표 9] 에나타내었다. 표 9 [0089] [0090] [0091] 상기 [ 표 9] 로부터 NO 분비억제효율을분석한결과실시예 1, 2 모두 NO 분비억제효율이 90% 이상으로그효 능이우수한것으로확인되었으며, 비교예는이보다훨씬저조하였다. 상기실시예 1 에서제조한복합추출물을함유한화장료를여러가지제형으로하여하기와같이제조하였다. [0092] [0093] < 제조실시예 1> 에센스실시예 1, 2의복합추출물을이용한항균에센스제조는물에녹는수상과점증제원료, 미생물발효천연계면활성제 (BEF) 를넣고 70 에서가온용해한후에 60 에서유상원료를넣어 45 로서냉시킨다음중화제로중화하고나서 2,000rpm으로 5~10분간분산시켰다. 이어서복합추출물과향을넣어 3,300rpm으로 10분간교반하여최종적으로 35 로냉각시켜에센스를제조하였다 ( 표 10 참조 )

13 표 10 [0094] [0095] [0096] < 제조실시예 2> 스킨세럼스킨세럼의제조는물에녹는수상과점증제원료, 미생물발효천연계면활성제 (BEF) 를넣고 65 에서가온용해한후에 45 로냉각하고, 중화제로중화한다음 2,000rpm으로 5~10분간분산시킨후에마지막으로복합추출물과향을넣어 3,300rpm으로 10분간교반하여최종적으로 35 로냉각시켜제조하였다 ( 표 11 참조 )

14 표 11 [0097] [0098] [0099] < 제조실시예 3> 크림크림제조는물에녹는수상과점증제원료, 미생물발효천연계면활성제 (BEF) 를넣고 70 에서가온용해한다음에 60 에서유상원료를넣어 45 로서냉시킨후에중화제로중화하고나서 2,000rpm으로 5~10분간분산시켰다. 이어서복합추출물과향을넣어 3,300 rpm으로 10분간교반하여최종적으로 35 로냉각시켜제조하였다 ( 표 12 참조 )

15 표 12 [0100] [0101] 본발명은상기와같은실시예에한하여설명하였으나, 본발명의기술적사상을벗어나지아니하는범위내에 서는얼마든지다양하게변경하여실시할수있음은물론이다

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Journal of Life Science 2011 Vol. 21. No. 8. 1120~1126 ISSN : 1225-9918 DOI : http://dx.doi.org/10.5352/jls.2011.21.8.1120 μ μ μ α β Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No. 8 1121 μ μ 1122 생명과학회지 2011,