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혜원 오
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1 대한안과학회지제 49 권제 6 호 2008 J Korean Ophthalmol Soc 49(6): , 2008 DOI : /jkos 배양된망막신경절세포주에서허혈전처치와 Protein kinase C 의역할 나경두 강성용 성공제 홍사민 전미진 김찬윤 연세대학교의과대학안과학교실, 시기능개발연구소 목적 : Staurosporin 으로분화시킨 retinal ganglion cell (RGC)-5 세포에서허혈전처치의산화스트레스에대한세포보호효과와 protein kinase C (PKC) 아형발현과의관계를알아보고자하였다. 대상과방법 : RGC-5 를 in vitro 로배양하면서 Staurosporin 처리농도와시간을바꾸어가면서 RGC-5 를형태학적으로충분히분화시키는최소농도와시간을결정하였다. 여기서얻어진조건으로분화시킨 RGC-5 세포에 800 µm 과산화수소수 (H 2O 2) 를 15 시간처리하여산화스트레스를야기하여세포독성을일으켰다. 이때 0.3% 산소허혈로시간을달리하면서허혈전처치를시행하여허혈전처치의산화스트레스에대한세포보호효과특성을알아보았다. 그리고가장보호효과가큰허혈전처치를시행한후시행전, 후 1 시간, 2 시간, 15 시간 24 시간후의 PKC 아형효소 α, β, γ, δ, ε, ζ 의 mrna 와단백질의변화를관찰하였다. 결과 : Staurosporin 처치후 RGC-5 의축삭돌기가증가하여형태상신경세포와유사해지는것을관찰할수있었고, 이러한변화가충분히일어나는 staurosporine 의최소처리농도와처리시간이 2 µm, 1 시간임을확인하였다. 이후 800 µm 과산화수소수를이용한산화스트레스를가했을때 8 시간의허혈전처치시 LDH assay 에서가장큰세포보호효과가있음을확인할수있었다. 이때허혈전처치전후의 PKC 아형효소의 mrna 와단백질발현에서의변화는 PKC α, ε 에서허혈전처치 2 시간후허혈시행전에비해증가소견을보였다. 결론 : Staurosporin 으로분화시킨 RGC-5 세포에서허혈전처치가산화스트레스에대한세포보호효과를가짐을확인할수있었고이러한허혈전처치전후의 PKC α, ε 아형효소발현이증가하는것으로미루어허혈전처치의세포보호효과가 PKC α, ε 아형효소와연관이있을가능성이있음을시사한다고생각한다. < 한안지 49(6): , 2008> 녹내장은전인구의 0.5~3% 에서발생하여전세계적으로 9 천만명가량의환자가있는주요한실명원인중의하나이다. 1-4 안압의상승은녹내장의발병과관련이있는위험요인들중에서가장자세히알려진요인이고안압을낮추면시야결손의진행을늦출수있다는사실이알려졌기때문에, 지난수십년간의녹내장치료및연구는주로안압의하강에초점이맞추어져있었다. 5,6 하지만안압이적절한수준으로떨어진후에도시야손상이계속진행하는환자들의수가있으며, 전 < 접수일 : 2008 년 5 월 13 일, 심사통과일 : 2008 년 6 월 5 일 > 통신저자 : 김찬윤서울시서대문구신촌동 134 연세대학교신촌세브란스병원안과 Tel: Fax: kcyeye@yuhs.ac 연세대학교의과대학 2006 년도장기해외연수연구비의지원을받았음 체녹내장환자의 20~50% 는정상범위의안압을유지하면서도녹내장성시야손상이진행되는것이알려져있다. 6,7 안압이외의다른요인에의해진행하는녹내장환자들의치료를위해최근에는녹내장의가장주요한병태생리학적특징인망막신경절세포층의선택적이고점진적인손상을방지하기위한신경보호기전을규명하는데에관심이모아지고있다. 신경보호기전에대한이해를통하여궁극적으로신경을직접보호하는약물을개발하고자하는것이다. 7,8 세포가죽음에까지이르지않는약한자극을받게되면세포내의여러가지방어기전이활성화되어연이어가해지는더심한자극에내성을가지는특성을가지고있다고알려져있다. 이러한현상이저산소상황에서야기되는것을 ischemic tolerance 또는허혈전처치 (ischemic preconditioning) 라고부르는데이러한현상은신경세포등을포함한여러가지세포들에서나타난다고알려져있다 마우스나쥐를사용한녹내장동물모델실험에서도다른뇌신경세포와마 979

2 나경두외 : 허혈전처치와 PKC 의역할 찬가지로약한자극을미리가하면연이어주어지는큰자극혹은허혈에의한세포손상을줄이는허혈전처치의효과가망막내에도존재함이알려져왔다 중풍후의뇌손상을감소시키는새로운치료방법을개발하는것과마찬가지로, 동일하지는않지만, 허혈이손상의큰역할을담당하는녹내장에서도이러한허혈전처치기전을이용한치료방법을개발하기위한일환으로그기전을연구하는노력이있어왔다. 하지만불행히도망막시신경절세포의허혈전처치의기전에대해서는알려진바가많지않다. 조직이허혈상태에빠지게되면여러가지단백활성효소들과신호전달체계에변화가일어나게된다. 그러한대표적인것으로는 calcium/calmodulin-dependent protein kinase II, mitogen activated protein kinase (MAPK), extracellular signal-regulated kinase (ERK), protein kinase B (Akt), 그리고 protein kinase C (PKC) 등이알려져있다 그중에서도 PKC 의활성은허혈후심장, 간, 신장, 뇌등여러조직에서변화하는것이알려져있다 그러나 PKC 가이러한허혈후손상을매개하는지혹은허혈손상후단순히이차적으로나타나는변화인지에대해서는아직도이견이있다. 또한 PKC 는 10 가지가량의아형이존재하는데이러한아형중특히 PKC ε 는뇌신경세포의허혈전처치현상에관여한다고알려져있다 그래서본연구에서는배양된망막신경절세포 에서저산소시발생한다고알려져있는허혈전처치를분리된망막신경절세포단독배양에서확인하고이때발생하는허혈전처치와여러가지 protein kinase C (PKC) 아형들의발현과어떤연관관계가있는지를알아보고자하였다. 대상과방법 RGC-5 세포배양및분화 (differentiation) 쥐의망막신경절세포를선택적으로분리한후여기에 ψ-virus 를감염시켜망막시신경절세포의특성은유지하며무한증식하는 RGC-5 세포주를실험에사용하였다 세포수는 6 well flask 의각 well 에 80,000 개씩을분주하고 24 시간동안 10% Fetal Bovine Serum (FBS, Omega, Australia) 을포함한 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Low Glucose 1, GIBCO, USA) 에서배양하였다. 그후단백인산화효소억제제의하나인 staurosporine (staurosporine, Sigma, UK) 을투여하여 RGC-5 를분화시켰다. 적절한 staurosporine 의농도와처리시간을정하기위해 0, 0.5, 1, 2 µm 의 4 가지농도를 1, 2, 6, 24 시간처리하고 RGC-5 의모양을관찰하였다 (Fig. 1). 그결과 1 µm 농도와 2 시간처리시간이최종분화정도에이르는최소농도와시간임으로판단되었다. 그래서본실험의 RGC-5 세포의분화는모두 1 µm staurosporine 을 2 시간처리하였다. 허혈전처치 (ischemic preconditioning) 와산화스트레스유발 상기방법으로배양된 RGC-5 세포에대한허혈전처치가 H 2 O 2 에의한산화스트레스에대한세포보호효과가있는지알아보기위해 O 2 0.3%, H 2 10%, N 2 89% 의기체조건을가지는저산소배양기 (Anaerobic chamber, Forma Scientific) 에서 0, 2, 4, 6, 8, 15, 24 시간동안허혈전처치를시행하고 12 시간후 800 µm H 2 O 2 를 15 시간동안처리하여산화스트레스를유발하였다. 세포생존은 LDH assay 를사용하여평가하였다. LDH assay 망막신경절세포를저산소배양하면서배양액으로유리되는 LDH 의양을 colorimetric assay system (Calbiochem Novabiochem Corporation, USA) 을이용하여측정한후, 전체세포를 deep freezing 하여사멸시킨후측정한 LDH 의양과비교하여세포사멸의정도를평가하였다. 허혈전처치후 PKC 아형들의 mrna, 단백질발현변화 (1) Real-time PCR 허혈성전처치후시간에따른 PKC 아형들의 mrna 변화를알아보기위해 real-time PCR 을시행하였다. SuperScript. III First Strand Synthesis System for RT PCR (Invitrogen, USA) 을사용하여제작자의권장메뉴얼에따라추출한 total RNA 로부터 cdna 를합성하였다. 간략하게서술하면배양한망막신경절세포를 trypsin 을사용하여부양시킨후 RNeasy Mini Kit (Quiagen, USA) 을사용하여 total RNA 를추출하였다. 추출한 total RNA 3 ng, 50 µm oligo (dt) 2 µl, 10 mm dntp mix 1 µl 와 DEPC-treated water 를혼합하여 65 C 에서 5 분간배양하고여기에 10X RT buffer 2 µl, 25 mm MgCl 2 4 µl, 0.1 M DTT 2 µl, RNaseOUT (40 980

3 대 한 안 과 학 회 지 제 49 권 제 6 호 2008년 Figure 1. The assessment of optimal level and duration in staurosporine treatment for differentiation of RGC-5: The shape of RGC-5 cell changes from fibroblast-like shape to neuron-like shape showing axon and multiple synapse with treatment of staurosporine. Staurosporine 1.0 µg for 2 hours seemed to be the minimum duration and the level for the appropriate morphological differentiation. Staurosporine 0 µg: 1 hr (A), 2 hr (B), 6 hr (C), 24 hr (D); Staurosporine 0.5 µg: 1 hr (E), 2 hr (F), 6 hr (G), 24 hr (H); Staurosporine 1.0 µg: 1 hr (I), 2 hr (J), 6 hr (K), 24 hr (L); Staurosporine 2.0 µg: 1 hr (M), 2 hr (N), 6 hr (O), 24 hr (P). U/µL) 1 µl, SuperScript III RT (200 U/µL) 1 µl를 가하여 모두 혼합하였다. 그 후 50 에서 50분간 배양하고 85 에서 5분간 배양하여 cdna를 합성한 후 1 µl의 RNase H를 넣어 남아있을 수 있는 RNA 를 제거 하였다. Real-time PCR은 QuantiTect SYBR Green PCR Kit (Quiagen, USA)를 사용 하여 혼합액을 만들어 시행하였다. 각 검체의 cdna 100 ng, 2가지 20 µm primers 1 µl, master mix 25 µl, DEPC treated water를 혼합하여 총 50 µl 혼합액을 만든 후 Biorad사의 cycler를 사용하여 반 응시켰다. 사용한 primer sequence는 Table 1에 기 재하였다. 반응시간과 온도를 다음과 같이하여 realtime PCR을 시행하였다. [5 for 3 minutes, Cycle 2 (50 cycles; Step 1 : 95 for 10 seconds, Step 2 : 55 for 45 seconds, Data collection and real time analysis), Cycle 3: 95 for 1minute, Cycle 4: 55 for 1minute] 각 mrna level은 reference house keeping gene으로 β-actin을 사용하여 Ct 값을 기반으로 ΔΔCt 2방법을 사용하여 계산하였다. (2) Western blot SDS-PAGE는 10~15% SDS-polyacrylamide gel을 만들어서 각 well에 cell lysate 50 µg을 loading한다. 전기영동 후 Immobilon-P Transfer membrane (Millipore, USA)에 200 ma하에 2시간동안 electro transfer하였다. 3% BSA (AMRESCO #0332, USA)를 사용하여 비특이적 결 합을 억제하였다. 그 후 1차 항체를 처리하여 실온에서 1시간 배양한 후(Table 2), 2차 항체를 사용하였다. 1 차 항체의 숙주동물에 따라 ECL TM peroxidase labelled anti rabbit (Amersham, USA) 혹은 981

4 나경두외 : 허혈전처치와 PKC 의역할 Table 1. Primer sequences for real-time PCR (F=forward; R=reverse) Gene name Sequence PKC α F 5'- ATG ACT TCA TGG GCT CCC TTT CCT -3' R 5'- ATT CAC CCT CCT CTT GGT TGA GCA -3' PKC β F 5'- CCA ACA AGT TGG CCG TTT CAA GGA -3' R 5'- TCA GGT CAC GGT AAA TGA TGC CCT -3' PKC γ F 5'- CAG CCT CCT CCA GAA GT -3' R 5'- TCA GAG ATA TGC AGG CGT -3' PKC δ F 5'- CAA AGG CAG CTT TGG CAA GGT ACT -3' R 5'- ATC GTC GAT CAA CAC CAC GTC CTT -3' PKC ε F 5'- AGG AAG GGA TTC TGA ATG GCG TGA -3' R 5'- AAG TCG TCC TCG TTG TCA GCT TCA -3' PKC ζ F 5'- AGG CCT CAC ACG TCT TGA AAG GAT -3' R 5'- TCG GAA GAA GGC ATG GGA CTT GAT -3' β actin F 5'- AGA TGA CCC AGA TCA TGT TTG AGA -3' R 5'- ACC AGA GGC ATA CAG GGA CAA -3' Table 2. Antibodies used in this study Gene name Company Host animal Size PKC α abcam Mouse 80.6 kda PKC β abcam Rabbit 80 kda PKC γ abcam Rabbit 84 kda PKC δ abcam Rabbit 81kDa PKC ε abcam Mouse 88.4 kda PKC ζ abcam Rabbit 71 kda β-actin Sigma Mouse 42 kda ECL TM peroxidase labelled anti-mouse (Amersham, USA) 을사용하여역시 1 시간동안배양한후 Amersham ECL Western Blotting Detection Reagents (Amersham, USA) 를사용하여감광시켰다. 결 과 허혈전처치에의한망막신경절세포주에서의세포보호효과 형질변환된망막신경절세포주인 RGC-5 cell line 을사용하여단독배양시허혈전처치발생을확인하였다. 망막신경절세포주인 RGC-5 는좀더신경세포적인특성을갖도록하기위하여 staurosporine 을처치하여분화시켰다. 분화를위한최적의 staurosporine 의농도와시간은세포모양을보고신경세포와유사하게여러축삭을보이는최소시간과농도로결정하였다 (Fig. 1). Staurosporine 1.0 µg 에서 2 시간처치가신경세포의형태학적인특성을가지는최소농도, 최소처리시간임을확인할수있었다. 허혈전처치는 0.3% O 2 의저산소환경에서 0 에서 24 시간동안시간을변화하면서배양하여발생시키고 15 시간동안 800 μm H 2 O 2 를사용하여산화스트레스를가하여세포손상을야기하였다. LDH assay 를시행하여산화스트레스에의한망막신경절세포의세포사멸의정도를평가하였다. 그결과허혈전처치시대조군에비해모두생존이증가하였고 (p<0.05 by Mann Whiteny U test), 2, 4, 15, 24 시간의허혈전처치에서의세포보호효과에있어서 6, 8 시간의허혈전처치에비해서보호효과가적었다 (p<0.05 by Mann Whiteny U test), 통계적으로유의한차이를보인 6, 8 시간의허혈전처치중 8 시간의허혈전처치가비록통계적유의성은없었으나 (p>0.05 by Mann Whiteny U test) LDH assay 에서가장적은세포독성을보였다. 즉, 8 시간의허혈전처치가가장큰세포보호효과를나타내는것을확인할수있었다 (Fig. 2). 허혈전처치에의한망막신경절세포주의세포효과시 PKC 아형들의발현변화 상기실험에서확인한최적의허혈전처치인 8 시간 0.3% O 2 의저산소환경처치시처치전과처치후시간에따른 PKC 아형 (α, β, γ, δ, ε, ζ) 의 mrna 와단백질의변화를 real time PCR 과 Western blot 으로각각확인하였다. 그결과 mrna 에서는 PKC β 를제외한 PKC 들이대체로발현이증가되었고그중 PKC α 는허혈전처치 2 시간이후부터그리고 PKC ε 는허혈전처치직후부터증가하는것을알수있었다 (Fig. 3). 단백질발현의변화는 PKC α, ε 에서변화가두드러졌는데 PKC ε 은허혈전처치직후부터증가하고 2 시간 982

5 대한안과학회지제 49 권제 6 호 2008 년 Cytotoxicity (%) Preconditioning time (hours) Figure 2. Cytotoxicity of ischemic preconditioning (0.3% oxygen state) against oxidative stress (800 µm H 2O 2 for 15 hr) in differentiated RGC-5 as demonstrated with LDH assay. With prolonged duration of ischemic preconditioning, RGC-5 survival increased up to 8 hrs of ischemic preconditioning after which cytotoxicity increased. Cytotoxicity after oxidative stress was statistically significantly decreased at 2 to 24 hours of ischemic preconditioning when compared to control ( p<0.05 by Mann-Whitney U test). Norm Flurescence PKC α PKC B PKC γ PKC δ PKC ε PKC ζ B-PC PC0hr PC1hr PC2hr PC15hr PC24hr Figure 3. Changes of PKC iso-enzyme mrna before and after ischemic preconditioning (B-PC, before preconditioning; PC0hr, just after the preconditioning; PC1hr, 1 hour after preconditioning; PC2hr, 2 hours after preconditioning; PC15hr, 15 hours after preconditioning; PC24hr, 24 hours after preconditioning); We can see the elevation of level of PKC α, β, γ, δ, ε mrna 1 or 2 hours after PC (preconditioning, 0.3% oxygen 8 hrs). The elevations are decreasing with time after PC. 이후감소한데반하여 PKC α 는 15 시간이후증가하는양상을보였다. 이러한증가는 2 시간이후 PKC α 의 mrna 가증가하는경향과유사한변화로보였다 (Fig. 4). 하지만 mrna 에서큰변화를보인 PKC γ 와 δ 는단백질발현에서는변화를보이지않았다 (Fig. 3, 4). PKC α PKC β PKC γ PKC δ PKC ε PKC ζ β-actin B B Figure 4. Changes of PKC iso-enzyme protein before and after ischemic preconditioning (B, before preconditioning; 0, just after the preconditioning; 1, 1 hour after preconditioning; 2, 2 hours after preconditioning; 15, 15 hours after preconditioning; 24, 24 hours after preconditioning). PKC ε increased until 2 hours after the preconditioning, and PKC α increased from 15 hours after the preconditioning. These changes are relatively correlated with increasing tendency of mrna. 고 찰 본연구에서는먼저허혈전처치가망막신경절세포단독으로일어나는지를조사하여보았다. 본실험결과특수한조건에서분화된망막신경절세포주는허혈전처치시 H 2 O 2 를이용한산화스트레스에대하여세포보호효과가있음을확인할수있었다 (Fig. 2). 이러한결과는향후허혈전처치기전을이용한약제나치료수단개발시훌륭한적용모델이될수있을것으로기대된다. 물론이것이 vivo 상태의허혈전처치기전이나반응과일치하지는않을수도있다고사료된다. 실제상태에서는아교세포등여러가지다른신경세포들과공존하고있기때문에허혈전처치가존재하더라도그양상과기전이상이할수있을것으로사료된다. 하지만본연구의목적은방어기전의이해와이의응용을통한새로운치료수단의개발이궁극적인목적이므로그러한방향을위한연구로본연구는모델과후보방어기전의탐색이라는목표를충족시킬수있을것으로사료된다. 실제발견한망막신경절세포주내의허혈전처치발생후의 PKC 아형의발현을살펴보면대체로기존의중풍에서의허혈발생시의 PKC 아형들의발현변화와일치하는결과를보이는것으로사료된다. 허혈시 PKC γ 는 NMDA 수용체를활성화하고 PKC δ 는미토콘드리아에서의 cytochrome 유출을증가시켜세포손상을야기하는방향으로작용한다고알려지고있고 PKC ε 는 983

6 나경두외 : 허혈전처치와 PKC 의역할 NMDA 수용체를통한 Ca 2+ 유입을차단하고 ERK (extracellular signal-regulated kinase) 를통하여미토콘드리아의세포막을안정화시키는역할을하여세포손상을차단하는방향으로작용한다고알려져있다 망막신경절세포만을단독으로이용한이번실험에서도허혈전저치후이러한 PKC 아형들의발현이이전의보고와거의유사하게일어나 mrna, 단백질발현상 PKC α, ε 가증가가두드러졌고세포보호효과와연관되는 PKC ε 의증가가허혈전처치의세포보호효과와연관이있을수있다는것을암시하는결과로사료된다. 오히려세포손상을야기하는데관여하는 PKC γ 와 δ 는 mrna 상에서는증가양상을보였지만단백질상에서는허혈전처치전후에큰변화를보이지않았다. PKC γ 와 δ 의단백질에변화가없었던이유는확실하지않아추가연구가필요할것으로사료되나, 결국단백질발현의변화가없는것으로보아 PKC γ 와 δ 의발현은억제되어보호효과가한층강화될수있음을시사하는결과라고사료된다. 물론이러한결과는시간적으로 PKC 의발현만관찰한것으로이것이직접적으로허혈전처치의결과인지아니면허혈전처치의결과로나타나는다양한양상의일부인지, 또는이차적인현상인지이연구만으로는확실하지않다. 하지만분화한 RGC-5 단독배양에서허혈전처치가세포보호효과가있음을확인하여이것을허혈전처치연구에이용할수있는세포모델을확립하였고, 기존의다른세포에서허혈후나타나는 PKC 아형효소의변화와유사한결과를망막신경절세포에서도허혈전처치후발생하는것을확인할수있었다. 그리고이러한 PKC 아형효소변화중세포보호효과에관여한다고알려지고있는 PKC ε 의발현증가가 mrna, 단백질발현상모두확인되는것으로미루어이것이허혈전처치의세포보호효과와연관이있음을시사하는결과라고생각된다. 이러한직접적인연구는 sirna 등을사용하여추후연구가필요할것으로사료된다. 참고문헌 1) Goldberg I. How common is glaucoma worldwide? In: Weinreb RN, Kitazawa J, Krieglestein GK, eds. Glaucoma in the 21st Century. Landau, Germany: Mosby; 2000:1-8. 2) Giuffrè G, Giammanco R, Dardanoni G, Ponte F. Prevalence of glaucoma in a population, Acta Ophthalmol Scand 1995;73: ) Cedrone C, Culasso F, Cesareo M, et al. Prevalence of glaucoma in Ponza. Ophthalmic Epidemiol 1997;4: ) Owsley C, McGwin G Jr, Ball K. Vision impairment, eye disease, and motor vehicle crashes in the elderly. Ophthalmic Epidemiol 1998;5: ) The Advanced Glaucoma Intervention Study (AGIS): 7. The relationship between control of intraocular pressure and visual field deterioration. The AGIS Investigators. Am J Ophthalmol 2000;130: ) Collaborative Normal-Tension Glaucoma Study Group (CNTGSP). Comparison of glaucomatous progression between untreated patients with normal tension glaucoma and patients with therapeutically reduced intraocular pressures. Am J Ophthalmol 1998;126: ) Chen JZ, Kadlubar FF. A new clue to glaucoma pathogenesis. Am J Med 2003;114: ) Flammer J, Haefliger IO, Orgül S, Resink T. Vascular ysregulation: a principal risk factor for glaucoma damage? J Glaucoma 1999;8: ) Dowden J, Corbett D. Ischemic preconditioning in 18 to 20 month old gerbils long term survival with functional outcome measures. Stroke 1999;30: ) Kristian T, Siesjö BK. Calcium in ischemic cell death. Stroke 1998;29: ) Chen J, Simon R. Ischemic tolerance in the brain. Neurology 1997;48: ) Hawaleshka A, Jacobsohn E. Ischemic preconditioning: mechanisms and potential clinical applications (Review). Can J Anaesth 1998;45: ) Kitagawa K, Matsumoto M, Tagaya M, et al. Ischemic tolerance phenomenon found in the brain. Brain Res 1990;528: ) Paratt JR. Protection of the heart by ischemic preconditioning: mechanisms and possibilities for pharmacological expression. Trends Pharmacol Sci 1994;15: ) Barone FC, White RF, Spera PA, et al. Ischemic preconditioning and brain tolerance. Stroke 1998;29: ) Zhu Y, Ohlemiller KK, McMahan BK, et al. Constitutive nitric oxide synthase activity is required to trigger ischemic tolerance in mouse retina. Exp Eye Res 2006;82: ) Ozbay D, Ozden S, Muftuoglu S, et al. Protective effect of ischemic preconditioning on retinal ischemia reperfusion injury in rats. Can J Ophthalmol 2004;39: ) Sakamoto K, Yonoki Y, Kuwagata M, et al. Histological protection against ischemia reperfusion injury by early ischemic preconditioning in rat retina. Brain Res 2004;1015: ) Matsumoto S, Shamloo M, Matsumoto E, et al. Protein kinase C-gamma and calcium/calmodulin-dependent protein kinase II alpha are persistently translocated to cell membranes of the rat brain during and after middle cerebral artery occlusion. J Cereb Blood Flow Metab 2004;24: ) Speechly Dick ME, Mocanu MM, Yellon DM. Protein kinase C. Its role in ischemic preconditioning in the rat. Circ Res 1994;75: ) Piccoletti R, Bendinelli P, Arienti D, Bernelli-Zazzera A. State and activity of protein kinase C in postischemic reperfused liver. Exp Mol Pathol 1992;56:

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8 나경두외 : 허혈전처치와 PKC 의역할 =ABSTRACT= Ischemic Preconditioning and the Role of Protein Kinase C in Cultured Retinal Ganglion Cell Line Kyoung Doo Na, M.D., Sung Yong Kang, M.D., Gong Je Seong, M.D., Ph.D., Samin Hong, M.D., Mi-Jin Chun, Ph.D., Chan Yun Kim, M.D., Ph.D. Department of Ophthalmology, Yonsei University College of Medicine, The Institute of Vision Research, Seoul, Korea Purpose: To investigate the cellular protective effects of hypoxic preconditioning against oxidative stress in a staurosporine-differentiated RGC-5 cell line and the relevance of protein kinase C subtype expression. Methods: The minimum staurosporine concentration and exposure time necessary to morphologically fully differentiate RGC-5 cells were determined. Cytotoxic injury was provided by oxidative stress with 800 µm hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) for 15 hours to morphologically fully-differentiated cells. The cytoprotective effect of hypoxic preconditioning was found by exposing the cell line to 0.3% oxygen for different periods of time. Quantifiable changes in the expression of mrnas and proteins of the isoenzymes α, β, γ, δ, ε, ζ of protein kinase C were determined before and after 1, 2, 15, and 24 hours of hypoxic preconditioning. Results: Axonal growth in RGC-5 cells after the induction of differentiation with staurosporine caused these cells to resemble neurons. The minimal concentration and exposure time to staurosporine that evoked full differentiation of RGC-5 cells was exposure to 2 µm staurosporine for 1 hour. An LDH assay demonstrated that hypoxic preconditioning had neuroprotective effects against hydrogen peroxide-induced oxidative stress. Protein and mrna levels of PKC isoforms α and ε increased after preconditioning. Conclusions: Hypoxic preconditioning of staurosporine-differentiated RGC-5 cells had a cytoprotective effect against oxidative stress. The associated increase of mrna and proteins of PKC isoenzymes α and ε suggest some functional relevance of these isoenzymes to the cytoprotective effects conferred by hypoxic preconditioning. J Korean Ophthalmol Soc 49(6): , 2008 Key Words: Ischemic preconditioning, Oxidative stress, Protein kinase C, RGC-5 Address reprint requests to Chan Yun Kim, M.D., Ph.D. Department of Ophthalmology, Severance Hospital, College of Medicine, Yonsei University #134 Shinchon-dong, Seodaemun-gu, Seoul , Korea Tel: , Fax: , kcyeye@yuhs.ac 986

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Æ¯ÇãÃ» '' - 1 - - 2 - - 3 - - 4 - - 5 - ' - 6 - - 7 - - 8 - - 9 - - 10 - - 11 - Super-Bio Co., Ltd. KWON, Suk-Tae Thermostable DNA Polymerase-encoding Gene from Thermus sp. X-1 an d Amino Acid Sequence