제출문 농림수산식품부장관귀하 이보고서를 황칠나무수액을이용한고부가가치기능성물질개발연구 과제의 보고서로제출합니다. 2009년 04 월 24 일 주관연구기관명: 건국대학교 주관연구책임자: 세부연구책임자: 세부연구책임자: 세부연구책임자: 이재석이임순조명환최용범 연구원: 박선하

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민찬 함
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1 보안과제 ( ), 일반과제 ( ) 과제번호 황칠나무수액을이용한고부가가치기능성물질개발연구 (Development of high quality and functional material using on Dendropanax morbifera sap) 건국대학교 농림수산식품부

2 제출문 농림수산식품부장관귀하 이보고서를 황칠나무수액을이용한고부가가치기능성물질개발연구 과제의 보고서로제출합니다. 2009년 04 월 24 일 주관연구기관명: 건국대학교 주관연구책임자: 세부연구책임자: 세부연구책임자: 세부연구책임자: 이재석이임순조명환최용범 연구원: 박선하 연구원: 김세현 연구원: 박갑주 연구원: 조동회 협동연구기관명 : 주) 커머스플리닛 협동연구책임자: 이고운

3 요약문 Ⅰ. 제 목 황칠나무수액을이용한고부가가치기능성물질개발연구 Ⅱ. 연구개발의목적및필요성 황칠수액은전통적으로뛰어난기능성소재로서사용되어왔다. 그러나산업화에 따른값싼인공합성도료의개발로인해황칠의맥은끊어진상태이며그동안우리 는급속한경제개발욕구에따른산업화의와중에서다른나라에비해우리의전통 천연도료기술복원을등한시하여왔고따라서현재는그사용이매우제한되고있 는실정으로이의과학적연구를통한복원작업이시급한실정이다. 특히황칠은 전통도료로서의가치뿐만이아니고본연구팀의예비연구결과기능성피부노화방지제로서의가능성이강력히시사되고있어이의과학적기술개발필요성이강력히대두되고있는실정이다. 이에본연구는황칠나무자원화를위한대량육묘및번식방법의개발연구, 세포주를이용한황칠수액의독성및기능성효과연구, 황칠수액기능성화합물의 분리, 분석및구조확인연구, 급성, 아급성, 독성연구를통한인체안전성연구, 황 칠나무의생장촉진및황칠수액의분비촉진방법개발연구, 인체를대상으로 한황칠수액의피부미백효과및항노화효과에대한연구등을통하여 1) 국내산 천연자원을이용한인체생리활성기능생물소재개발에관련된동물취급기술, 천연물성분의분석기술등을당해분야관련연구소나대학의연구소에서실험적 교육을통해널리확산시키고, 2) 산림천연자원추출물을이용한기능성화장품개 발의노하우를농가, 화장품및의약관련회사에보급하여소득향상을꾀하며, 3) 우리천연자원에대한과학적이고체계적인접근방법을확립하여국가의기능성생 물소재개발기술수준을한단계높이고, 4) 식물자원을이용한화장품제제개발 의표준방법을제시하는데목적이있다. i

4 또한황칠나무추출액은최근몇가지실험실연구에서피부의멜라닌합성을 억제하고주변환경에의해손상된피부장벽기능을다시회복시키는효과가입증 되어기능성화장품으로의개발가능성으로인해주목받고있다. 추출액속에는 안식향, 세르퀴테르펜같은생리활성물질이들어있으며예로부터궁중무희들의 색조용화장품으로이용되어왔다. 최근세계적인추세인자유무역기조로인해점 점경쟁력을잃어가는농업분야에서황칠나무의미백효과와항노화효과를이용한기능성화장품을개발함으로써농가수입보전효과와고부가가치산업인화장품산업을농업과접목함으로써선진적인농업구조를우리나라에정착시키는데에도도움이되고자본연구를시행하였다. Ⅲ. 연구개발내용및범위 황칠나무의분포지역및생육중심지의식생학적조사 생육중심지의입지환경분석및황칠나무의생리생태적요인분석 수액생산량증대를위한황칠채취시기및생육입지별채취량분석 황칠나무의대량증식방법개발 유효농경지( 논) 의황칠나무재배적합지로의응용연구 Human fibroblast 및 Melanocyte 세포주를이용한항피부노화기능성효과연구 Human foreskin fibroblast cell line 을이용한광외인성피부노화억제기능성연 구 구조확인된 target 기능성물질의계대세포주를이용한항피부노화기능성연구 천연물질인황칠나무수액의정제방법연구 정제된황칠나무수액으로부터기능성화합물추출의최적화연구 추출된황칠수액의기능성물질구조확인연구 천연기능성기초화장품및색조화장품시제품개발연구 황칠수액의급성독성연구 황칠수액의아급성독성연구 황칠나무의생장촉진및황칠수액의분비촉진관련토양미생물분리및동정 ii

5 토양미생물을이용한황칠나무의식물생장및수액분비촉진방법개발 황칠나무에토양미생물의접종법을이용한 Field test 와식물생장및수액분비 관련토양미생물개발 및유용유전자확보 인체를대상으로한항피부노화기능성연구 황칠수액의피부미백작용과항노화효과에대한인체에서의유효성평가 피부첩포실험을통한황칠수액추출액의안전성확보 Ⅳ. 연구개발결과 1. 제1 세부연구과제: 황칠나무자원화를위한대량육묘및번식방법의개발 연구 - 황칠나무군락의식생학적특징및분포중심지, 칠액생산량 황칠나무는주로제주도를비롯한완도, 보길도, 거문도, 고흥등의섬지역과 해안이인접한지역으로대체로부락으로부터떨어져인간에의한교란이적은 습하나물빠짐이양호한지역에서자생지가확인되었다. 황칠나무생육지는크게 구실잣밤나무군과서어나무군으로구분되었으며, 서어나무군보다비교적저위도지 역과낮은해발고에분포하는구실잣밤나무군은상록활엽수종인구실잣밤나무와 모밀잣밤나무를비롯하여참지네고사리, 예덕나무, 일엽초등에의해구분되었다. 서어나무군은낙엽활엽수림대에주로분포하는서어나무와당단풍을비롯하여조 릿대, 비목나무, 사람주나무등에의해구분되었다. 생육지군락상태는전반적으로 흉고직경 5cm 미만의개체수빈도가전체의 71.0% 로가장높게나타났다. 특히 서어나무군의경우, 5cm 미만의유목과유묘의개체수빈도가 94.2% 로대부분을 차지하였으나, 구실잣밤나무군에서는 5cm 미만이 54.2% 로높게나타났다. 황칠나무의생육지현지조사및분포와식재에대한문헌조사, 기상자료를통 해추정한황칠나무생육가능지역은연평균기온이 12 이상, 강수량 1,344mm, 일 최저기온이 7.4 이상인지역은우리나라에서는주로남서부해안에인접한넓 은지역에서생육이가능할것으로추정되었다. 한편, 황칠나무의칠액은곡부가 iii

6 사면부에비해약 2 배가량높게생산되었으며, 직경급이클수록빠르게분출되며, 분출량도많은것으로조사었다. - 삽목을통한황칠나무의개체증식실험 삽수의발근율은 2년생묘목의당해연도성장가지를삽수로사용한것이 100% 의발근율을보였고발근상태에있어서도가장양호한결과를얻었다. 본실 험에서삽수에 IBA만의처리를통한발근성공율을대조구의 8.4% 에서 86.2% 로 약 6 배정도향상되었으며, 발근된근수또한 IBA는 12.8개로대조구보다약 3 배정도로높았다. 또한발근된뿌리의근장에서 IBA는 16.9cm 를보여, 삽목에의 한황칠나무의묘목생산에서는 IBA를처리하는것이가장효율적인방법으로조 사되었다. - 종자를이용한묘목생산 황칠나무종자를이용한묘목생산기술확립을위해, 채취된과실자체, 건냉 및습냉처리, 저온처리기간, 파종방법등다양한종자발아특성을실험하였다. 이러한실험결과를정리하면, 황칠나무로부터 11월말에서 12월초순경까지과실을 채취하여, 과육을제거한후, 물이빠진정도의습기를가진모래에파묻어약 4 의온도조건이유지되는냉장고에저온처리하고약 3~4개월이지난 3월말 경에잡균에오염되지않은토양에파종하여약 75% 의차광된그늘의약 10~1 5 온도조건하에발아시키는것이가장많은묘목개체를얻을수있는조건으 로조사되었다. - 토양수분함량에따른황칠나무생장반응 논토양에대한토양수분함량조절실험에서황칠나무의줄기신장은토양수부 함량 11~15% 에서가장높은값을보였으며, 기저면적즉, 기저직경의부피생장 은토양수분함량 20% 에서가장높은값을보였다. 이러한줄기신장과기저면적 증가치를통해계산한생장량은토양수분함량 10~20% 범위에서매우높게나타 났으며, 회귀식을통해계산한최적생장량을보인토양수분함량을 17.4% 로나타 났다. 토양수분이최적생장범위보다높아질경우, 당해연도신엽발생량이현저히 낮아질뿐만아니라엽록소함량도현저하게낮아지며, 1년생및 2년생의잔존율 도낮아지는것으로나타났다. 이와같이토양수분함량증가는개체의광합성체 계를파괴시켜생장을크게저하시켰으며, 이러한생장저해는토양수분함량이낮 은경우보다더심각한영향을주는것으로나타났다. iv

7 2. 제2세부 1 연구과제 : 세포주를이용한황칠수액의독성및 기능성효과연구 - 황칠원액에의한쥐흑색종양멜라닌생성량변화를측정한실험에서흡광도를 이용한정량적인분석방법으로황칠원액의미백기능확인하고인간섬유아세포 세포주를이용한 MMP (matrix metalloproteinase) 저해활성검색계확립을위 한실험에서 UV 노출조건에서황칠원액이 MMP1 활성화를저해하는효과를확 인하였다. 또한섬유아세포를배양하여황칠분획물을처리하고 MTT assay를 수행하여부분정제된분획물들의세포독성범위를측정함. - 황칠의멜라닌감소기능에대한분자유전학적인기전연구에서, 부분정제분획 물의타이로시나아제발현감소에의한미백효과확인. - 황칠의광피부노화에대한분자유전학적인기전연구에서, 부분정제분획물의 MMP 감소효과확인. - 천연기능성기초화장품시제품개발을위한기능성화장품의시장성및성분과 효과자료조사 3. 제2세부 2 연구과제 : 황칠수액기능성화합물의분리, 분석및구조 확인연구, 급성, 아급성, 독성연구를통한인체 안전성 - 황칠수액엑스를 liquid-liquid partition법에의해서분리하여 GC/MASS, IR 분광 기를이용하여미백작용을하는유기화학작용기, 즉 -OH, -COOH, -OCH 3 등을 확인하였고, 또한 1 H NMR 와 13 C NMR 을이용하여분리된물질을분석한결과 한가지물질을얻기는어렵지만, -COR, -COOR, -OCOR 를확인하여미백작용 을하는물질을확인하였다. 한예로미백작용을가지는것으로판단되는 hydroxyl작용기를가지는화합물중 2-isopropenyl-4A,8-dimethyl-1, 2,3,4,4A,5,6,7 -octahydronaph-thalene, decahydro-4a-methyl-1- methylene-7-1 (1-methylethyl),octahydro-1,4,9,9-tetramethy),isocaryophillene, 1H-cyclopropeazulene, ursodeoxycholic acid 등이확인되었고이러한화합물들 에의해서미백작용이나타나는것으로사료된다. - 황칠수액의급성독성연구를 SD계웅성흰쥐를대상으로 1차년도에실시한결과 v

8 급성독성이나타나지않은것으로확인되었다. 황칠수액에대한아급성독성 검사연구를 SD계웅성흰쥐를대상으로 2, 3 차년도에실시한결과황칠수액은 동물에아급성독성을나타내지않는것으로확인되었다. 4. 제3 세부연구과제: 황칠나무의생장촉진및황칠수액의분비관련토양 미생물분리및동정 - 1차년도실험에서황칠수액의분비량이가장많은것으로나타난 Site C ( 전라남 도완도군보길면민가자생황칠나무) 에서분리된 12개의토양미생물균주중 동정이끝난 9 개의미생물균주(9 개균주로표기) 가황칠종자의발아율, 생장특성, Root weight 증가및 phytopathogen에대한저항력에어떠한영향을미치는가를 측정한결과 Bacillus cereus strain H1439 균주, Paenibacillus agaridevorans균주, Paenibacillus ginsengagri균주, C2 - C11 균주를 mixture한군에서대조군에비 해비교적높은발아율을보여주었다. 또한식물종자의발아를저해하는 glyphosate 와계면활성제를각각 41% 와 51% 로섞어첨가해준후황칠종자의발아율을측 정한실험(1 차년도실험) 에서는 Paenibacillus agaridevorans균주와 C2 - C11 mixture균주가높은발아율을나타내어 Phytopathogen 에대한저항력이있는것으로 연구결과가나타났다. - 그후 1차년도에이들발아한황칠종자를무작위로각군당 20그루를선발하여나뭇잎의 수, 나무의크기( 수고), 뿌리의중량등을측정하여상기 9개균주가황칠나무의생장 에미치는영향을조사한결과, Bacillus cereus strain H1439, Paenibacillus ginsengagri, Bacillus bataviensis 균주가황칠나무의생장을촉진하는유의성있는 결과를나타내었고또한이들 9개균주가 Phytopathogen 에미치는저항력등그역학 관계를연구한결과, Bacillus cereus clone B305, Bacillus bataviensis 및 C2 - C11 mixture균주를첨가한군이 Phytopathogen 첨가에도불구하고황칠나무의생장을촉 진하는유의성있는결과를나타내었다. - 2차년도에실시한황칠종자의 Tube assay 에의한발아율측정결과, 이들 9개 균주중 Paenibacillus ginsengagri 균주, Paenibacillus ginsengagri 균주, Bacillus cereus strain H1439 균주와 C2 - C11 균주를 mixture한군이대조군에비해황 칠의종자발아를촉진시키는것으로결과가나타났다. - 2차년도에실시한황칠종자의 Pot test 에의한발아율측정결과, 이들 9개균주 vi

9 중 Bacillus cereus strain H1439 균주, Bacillus cereus clone B305 균주, Paenibacillus ginsengagri 균주및 C2 - C11 균주를 mixture한군이대조군에 비해높은발아율을나타내었다. 또한 Tube assay, Pot test 공히발아종자의생 장촉진관련생리학적특성연구에서는아직떡잎이너무어린관계로거의모든 군에서약 2.1mm~2.3 mm를나타내어아직확연한성장차이를구분할수없었다. 따 라서시간의경과에따라 3차년도연구과제와연계하여계속추적하여각군의 성장차이를규명하였다. - 3차년도에실시한황칠종자의토양미생물의접종법을이용한 Field test ( 생장특성 : 나무잎의수, 나무의크기, Root weight 증가측정) 에서는 Paenibacillus ginsengagri 균주및 C2 - C11 균주를 mixture한군에서정상대조군에비해유의적인증가를 나타내었다. - 결론적으로 1 차년도, 2 차년도, 3차년도연구는유사한실험결과를나타내었는데 1 차년도에실시한황칠나무에접종한토양미생물의종자발아율실험결과에서는 Bacillus cereus strain H1439 균주, Paenibacillus agaridevorans균주, Paenibac illus ginsengagri균주및 C2 - C11 균주를 mixture한군이대조군에비해황칠 의종자발아를촉진시키는것으로결과가나타났고, 2차년도에실시한 Tube assay 및 Pot test 연구에서는 C6, C7인 Paenibacillus ginsengagri균주, Paenibacillus ginsengagri균주, Bacillus cereus strain H1439 균주와 C2 - C11 균주를 mixture한군이대조군에비해황칠의종자발아를촉진시키는것으로결 과가나타났으며 3차년도의황칠종자의토양미생물의접종법을이용한 Field test ( 생장특성 : 나무잎의수, 나무의크기, Root weight 증가측정) 에서는 Paenibacillus ginsengagri균주및 C2 - C11 균주를 mixture한군에서정상대조군에비해유의 적인증가를나타내어 1 차년도, 2차년도및 3차년도실험에서공통적으로 C6, C7 인 Paenibacillus ginsengagri 균주, Paenibacillus ginsengagri 균주및 C2 - C11 균주를 mixture한 Cmix군이대조군에비해비닐하우스환경에서든 field ( 노지) 환경에서든상관없이황칠의성장을촉진하는것으로연구결과가나타났다. - 3차년도연구에서는 1차년도에분리된 9 개균주를대상으로 황칠생장및수액 분비관련토양미생물개발및유용유전자탐색 연구를실시하였는바, 기분리 된 9개균주의염색체가 Azospirillum brasilense의유전자중옥신분비를촉진하 는 Indole-3-Pyruvate Decarboxylase를코딩하고있는 ipdc 유전자및 vii

10 Gibberella fujikuroi 의지베렐린생합성유전자의일부분으로알려져있어식물 의생장을촉진하고식물수액의분비를자극하는토양미생물의유전자인 P450-Ⅱ 유전자를함유하고있는지여부를조사하였다. 그결과분리균주 Bacillus bataviensis 및 Paenibacillus agaridevorans가 1Kb 크기의 ipdc 유전자를함유하 고있는것으로확인되었다. Gibberella fujikuroi 의지베렐린생합성유전자인 P450-Ⅱ 유전자의 PCR 산물은발견할수없었다. 5. 제4 세부연구과제: 황칠수액의피부미백효과연구 - 황칠수액은인위적으로유발시킨색소침착에대하여대조군에비하여 colorimeter와 spectrophotometer 기법으로측정한피부색에서우월한미백효과 를보였으며 reviscometry 기법으로측정한피부탄력도에서도우수한피부탄력 성증진효과를나타냈다. - 아울러표피수분함유량과경표피수분손실량이반영하는피부장벽기능의개 선에도뛰어난효과를보였다. - 또한인체를대상으로한피부자극성시험에서도 5% 농도까지일체의자극반 응및알레르기성접촉피부염이나자극성접촉피부염의사례를보이지않아안 전성을확인할수있었다. Ⅴ. 연구성과및성과활용계획 1. 제1세부연구과제 : 황칠나무재배지조성을위한재배가능지역, 황칠나무과 실과종자의처리에따른발아반응, 삽목을통한삽수의호르몬처리효과, 토 양수분함량에따른황칠나무의생육반응과적절한토양수분관리등우량묘목 생산과생육관리를위한토양수분관리기술등을에필요한실험자료를학 술논문투고를통해관련전문가와지방농업기술센타등에전파하고, 황칠나무 묘목생산부터재배지관리에관한메뉴얼등을작성하여황칠나무묘목생산 농가등에보급, 경제적이고효율적인황칠나무묘목생산및재배지관리에 기여한다. viii

11 2. 제2세부 1연구과제 : 본연구에서는분자유전학적인연구방법을사용하여국내산천연자원을이용한미백및피부노화방지원료로서황칠의가능성을확립하였으므로향후황칠에포함되어있는기능성물질을순수분리해미백및피부노화방지연구를연속적으로수행하여발굴된신물질을이용한화장품제재개발및상품화에기여할계획이다. 3. 제2세부 2연구과제 : 본연구의결과들은전문학술지에투고하여체계적인기 능성화합물의분리, 분석및구조연구의체계를확립하고동물실험을통한황 칠수액의안전성확인및이결과를황칠재배농가에보급하여황칠수액관련 기능성상품을황칠나무재배농가들이안심하고생산할수있도록기여하고자 한다. 4. 제3세부연구과제 : 전문학술지에투고하여황칠나무생장및수액분비관련 토양미생물분리및동정결과를학계및관련산업계에보급하고이를재배 농가및관련지역농업기술센타에기술전파할예정이며이를통해분리미생 물의특성을보급하고황칠나무생장및수액생산증대에기여할예정이다. 또한, 황칠나무생장및수액분비관련토양미생물의유전자탐색기술보급 및관련지역농업기술센타에기술전파를통해황칠나무생장및수액생산 증대효과에기여할생각이며이결과역시관련학술지에논문투고할예정 이다. 5. 제4세부연구과제 : 황칠나무수액은인체의피부를대상으로한실험에서대 조군에비해우월한피부미백효과와탄력성회복효과및피부장벽기능의개 선효과를나타내었으며인체에적용시피부자극증상은없었다. 따라서현재 이용되고있는대표적인기능성물질인레티놀이나알부틴, 코엔자임 Q10 과 같이미백효과와주름개선을목적으로하는기능성화장품개발에황칠나무 추출액을이용할수있을것이다. 또한본연구에서는황칠나무수액의우월한 피부장벽기능개선효과를발견할수있었으며피부장벽기능의손상이주된 병인및악화요인으로작용하는피부질환인아토피성피부염, 건선, 건성습진, 피부건조증등에널리이용할수있는보습제의개발에도이용할수있을것 이다. 이상본연구로얻어진결과를바탕으로황칠수액을유효성분으로하는 미백및항노화기능성화장품및보습제개발에산업계와같이노력할계획 이다. ix

12 논문투고및계획 게재 연도 2009 논문명 황칠나무군락의식생학적특징과미기상학적분석을통한생육가능지역추정 주저자 저자교신 저자 In vitro Effect of Ecklonia stolonifera Okamura Extract on the Cell Growth in 2008 CCD-986sk Human Fibroblast 황은경박갑주 and Melanin Formation Inhibition in Clone M-3 Mouse Melanocyte Cell Line The Effect of Codiumfragile (Chlorophyta) Extract on the 2009 박갑주조명환 Hepatic Dysfunction and Hyperlipidemia in rats 토양수분함량차이에따른황 2009 칠나무의생장반응 공동 저자 학술지명 이은혜이재석박갑주전영문환경생물 조명환 박찬선 김명희 이은혜이재석장지혜박갑주 Vol. (No.) 투고중 국내외구분 환경생물 26(1) 국내 F o o d 황은경 S c i. 이재석투고중 Biotechn 박찬선 ol 환경생물투고예정 2010 황칠나무종자의발아특성이은혜이재석홍자람환경생물투고예정 호르몬처리를통한황칠나무 2010 이은혜이재석박갑주환경생물투고예정의삽수발근특성 SCI 구분 특허출원 발명의명칭출원번호발명자출원년도비고 1 황칠나무수액의항염및 아토피치료제로서의용도 박갑주외 특허출원중 x

13 SUMMARY Project 1. The natural habitat of Dendropanax morbifera is primarily located along the coastline and in islands including Jeju Island, Wan Island, Bogil Island, Geomoon Island and Goheung. This particular specie could be categorised into two groups of Castanopsis cuspidata var. sieboldii group and Carpinus laxiflora group, which is consistent with its site characteristics. The former inhabits in a relatively lower latitudes and sea-level terrain compared to the latter and the categorisation of the two can also be distinguished by examining surrounding species (the former is usually found with Castanopsis cuspidata var. thunbergii, Dryopteris erythrosora var. ambigens, Mallotus japonicus, Lepisorus thunbergianus and the latter with Acer pseudo-sieboldianum, Sasa borealis, Lindera erythrocarpa, Sapium japonicum). It is estimated that vegetation formation of Dendropanax morbifera can be found in the South-western coastline of Korean peninsula where the precise precondition (e.g. the average temperature of 12, the annual of 1,344mm and the average daily minimum temperature of 7.4 ) is reserved. Stream can produce approximately double amount of sap than slop and a diameter of Dendropanax morbifera is believed to be the key factor influencing the amount of Dendropanax morbifera sap. In cuttage experiment, the result suggests that the two-year-old young sapling would generate the most feasible outcome in uprooting rate turned out to be the finest among the samples. Similarly, IBA treatment would also affect on uprooting condition of stem, leading to good-quality results in uprooting rate (86.2%), new root number (12.8) and root length (16.9cm). The Dendropanax morbifera of experiments of seed germination reveals the most optimum condition to obtain many young plant. The subsequent process should be conducted in four stages: firstly, fruits of Dendropanax morbifera xi

14 should be extracted between late November and early December and pulp must be removed from those fruits; secondly, those fruits have to be refrigerated at the temperature of 4 in the watered sand for three to four months; around in late March, those then should be sow in non-polluted soil; and lastly, the soil should be kept in the shade (approximately 75 % shielded) with the temperature around 10 to 15. According to the experiment of manipulated soil moisture level with a rice field soil, it is concluded that the highest Dandropanax morbifera stem height was shown at 11~15 % of soil moisture level and likewise the maximized volume growth of base diameter was witnessed at 20 % of soil moisture level. Growth rate in the range between 10 and 20 % of soil moisture level was shown the highest in reference to the estimation of Dandropanax morbifera stem height and increase in base area. In the same context, 17.4 % of soil moisture level was selected to be the most ideal case to achieve ideal growth amount in regression analysis. It was also revealed that once soil moisture increases its degree, it would overwhelmingly lessen the quantities of new leaves, chlorophyll as well as the chances of survival for one or two-year-young plant. As noted above, the increase in soil moisture level terminates the photosynthesis process of Dandropanax morbifera in which the growth of Dandropanax morbifera is profoundly slowed. This impediment for growth was found in soil moisture level increase compared with soil moisture level decrease. Project 2-1 The goal of this project is to develop novel whitening and antiaging cosmetic ingredients from the tree sap of Dendropanax morbifera. We first analyzed the activity of the whole sap on the biosynthesis of melanin and the degradation of extracellular matrix to investigate its roles on whitening and antiaging process of skin, respectively. As a result, it was observed that the whole sap has not only a function to decrease the melanin synthesis by inhibiting the promoter activity of tyrosinase, but also a function to regulate the xii

15 degradation of extracellular matrix by enhancing the expression of MMP1 in vitro. Subsequently, we investigated the capacities of the partially purified fractions to further analyze the role of the sap. Interestingly, both of functionally active ingredients related to the regulation of tyrosinase and MMP activities were found in the same fraction extracted with ethyl acetate solvent. The ethyl acetate fraction did not show any sign of apoptosis at the concentration of 1ug/mL. In addition, the ethyl acetate fraction displayed the same effect on the regulation of tyrosinase and MMP activities in in vivo mouse experiment. Taken together, these results provide the effective purification method for the active ingredients of the sap of Dendropanax morbifera as well as the molecular basis of its effect on whitening and antiaging of skin. Project 2-2 Organic materials affecting whitening process such as -OH, -COOH, -OHCH3 are found in the process of liquid-liquid partition by using Dendropanax morbifera sap. The process includes the separation of materials while using GC/MASS, IR spectroscope. The finding suggests that it is unlikely to acquire one material, nevertheless, materials affecting whitening process are discovered with reference to the findings of COR, -COOR and OCOR. Likewise, the result of experiment using SD rat implies that Dendropanax morbifera sap is not poisonous, as the Dendropanax morbifera sap is neither acutely nor sub-acutely poisonous. Project 3. On the other hand, the research was conducted to monitor how bacteria could affect seed germination rate and growth characteristics of Dendropanax morbifera. 9 of 12 soil bacteria from Site C in Bogil island was used in this research. As a results, in seed germination rate research of first year experiment, tube assay and pot test of second year experiment and field test research of third year experiment, Paenibacillus ginsengagri strain(c6 group), xiii

16 Paenibacillus ginsengagri strain(c7 group) and C2- C11 mixture (Cmix group) promoted the growth of regardless of the location (whether the location is green house or open field). Also, the research to explore any useful gene in reference to Dendropanax morbifera growth and sap excretion was conducted against the separated nine bacterial strain from the first year experiment. The findings suggest that ipdc gene (which is the size of 1Kb) was found in Bacillus bataviensis and Paenibacillus agaridevorans, but PCR product of P450-II gene, gibberellin bio-synthetic gene of Gibberella fujikuroi, was not found. Project 4. The extract of Dendrofanax morbifera is known to have some efficacies of suppressing melanocytic activities and anti-aging on skin and expected to be an active ingredients of functional cosmetics having whitening and anti-aging effect. Korean agricultural competitiveness has been become weak day by day due to world-wide free trade agreements and the change of economic environments. Therefore, we have been trying to find out the possibility of developing skin whitening and anti-aging functional cosmetics using the extracts of Dendrofanax morbifera. We thought it helps a lot for restoring Korean farmer`s income and establishing an advanced agricultural structure by integrating agriculture with a higher value-added cosmetic industry. We conducted several experiments to reveal whitening and anti-aging effect of the extract of Dendrofanax morbifera. First, to evaluate skin whitening effect, we made artificial pigmentation using solar simulator on the upper arm of human volunteer and then, applied the extract of Dendrofanax on one side and vehicle on the other side. We checked skin color change using colorimeter and spectorphotometer according to time-course. Second, to evaluate anti-aging effect, the extract of Dendrofanax or vehicle were applied on volunteers upper arm and then, we measured the change of skin elasticity using reviscometer and also evaluated the change of skin hydration and trans-epidermal water loss xiv

17 using corneometer and TEWA meter on normal skin and sun-damaged skin. Finally to confirm the safety of the extract of Dendrofanax, we did patch test on volunteer`s back according to the guidelines of KFDA. We could find following results after testing skin whitening and anti-aging effect of the extract of Dendrofanax morbifera. 1. The parameters reflecting skin color such as ITA, melanin index and erythema index were improved more after application of the extract than vehicle. 2. Skin elasticity was increased more after application of the extract than vehicle. 3. Skin hydration and barrier function were improved after application of extract than vehicle. 4. After patch test of the extract of Dendrosofanax morbifera, we could not find any irritation sign or allergic/irritation contact dermatitis. We could find excellent whitening and anti-aging effect of the extract of Dendrosofanax morbifera on human skin. Therefore, like retinol, albutin or coenzyme Q10 which are currently available active ingredients of functional cosmetics, the extracts of Dendrosofanax can be used to develop skin whitening and anti-aging cosmetics. Also, the extracts was also effective on restoring skin barrier function which is responsible for the pathogenesis of atopic dermatitis, psoriasis and dry skin. We thought it can be possible to develop skin moisturizer using the extracts of Dendrosofanax morbifera which is useful for improving atopy, psoriasis and dry skin. xv

18 CONTENTS CHAPTER 1. OUTLINE OF THE RESEARCH PROJECT SECTION 1. CONSEQUENCE OF RESEARCH PROJECT SECTION 2. NECESSITY OF RESEARCH PROJECT CHAPTER 2. PRESENT STATUS OF TECHNICAL DEVELOPMENT IN DOMESTIC AND FOREIGN CHAPTER 3. CONTENTS AND RESULTS OF THE RESEARCH SECTION 1. PROJECT CONTENTS AND RESULTS AT FIRST YEAR CONTENTS AND RESULTS AT SECOND YEAR CONTENTS AND RESULTS AT THIRD YEAR SECTION 2. PROJECT CONTENTS AND RESULTS AT FIRST YEAR CONTENTS AND RESULTS AT SECOND YEAR CONTENTS AND RESULTS AT THIRD YEAR SECTION 3. PROJECT CONTENTS AND RESULTS AT FIRST YEAR CONTENTS AND RESULTS AT SECOND YEAR CONTENTS AND RESULTS AT THIRD YEAR SECTION 4. PROJECT CONTENTS AND RESULTS AT FIRST YEAR CONTENTS AND RESULTS AT SECOND YEAR CONTENTS AND RESULTS AT THIRD YEAR SECTION 5. PROJECT CONTENTS AND RESULTS AT FIRST YEAR CONTENTS AND RESULTS AT SECOND YEAR CONTENTS AND RESULTS AT THIRD YEAR CHAPTER 4. ACHIEVEMENTS AND CONTRIBUTION OF THE RESEARCH CHAPTER 5. OUTCOME AND PRACTICAL USE OF THE RESEARCH xvi

19 SECTION 1. PROJECT SECTION 2. PROJECT SECTION 3. PROJECT SECTION 4. PROJECT SECTION 5. PROJECT CHAPTER 6. FOREIGN INFORMATION ACQUIRED DURING DEVELOPMENT CHAPTER 7. REFERENCES xvii

20 목 차 제 1 장연구개발과제의개요 연구개발의중요성 연구개발의필요성 제 2 장국내외기술개발현황 제 3장연구개발수행내용및결과 제 제 제 제 제 1 절제1 세부연구과제 차년도연구결과보고서 차년도연구결과보고서 차년도연구결과보고서 절제2 세부 1연구과제 차년도실험내용및고찰 차년도실험내용및고찰 차년도실험내용및고찰 절제2 세부 2연구과제 차년도연구결과보고서 차년도연구결과보고서 차년도연구결과보고서 절제 3세부연구과제 차년도연구결과보고서 차년도연구결과보고서 차년도연구결과보고서 절제 4세부연구과제 차년도연구결과보고서 차년도연구결과보고서 차년도연구결과보고서 제 4 장목표달성도및관련분야에의기여도 xviii

21 제 5 장연구개발성과및성과활용계획 제 1절제1 세부연구과제 제 2절제2 세부 1연구과제 제 3절제2 세부 2연구과제 제 4절제3 세부연구과제 제 5절제4 세부연구과제 제 6장연구개발과정에서수집한해외과학기술정보 제 7 장참고문헌 xix

22 제 1 장연구개발과제의개요 제 1 절연구개발의중요성 1. 경제 산업적중요성 - 우리나라는현재농산물의수입개방으로농가에서는유망작목선택에어려움을 겪고있으며생물다양성협약에의해유전자원의중요성이그어느때보다크게 인식되고있다. 이러한시기에우리고유의자원인황칠나무의대량번식방법을개 발하여이를농가에전파하여다량의황칠수액을생산하고천연물질인황칠의기 능성에대한많은연구가이루어져황칠이목재, 섬유, 화장품, 약품등다양한재 료에응용될수있는신기능성물질로서개발된다면농가소득증대에일익을담당 할수있는훌륭한유망작목으로서기능할수있을것으로판단된다. - WTO 에의한농산물개방압력가중으로농가소득저하가우려되고있는실정에 서유휴농지의효과적인활용을통하여농가의고부가가치소득원이보급될경우, WTO 의개방에의한소득감소분을상쇄시킬수있다. - UR 을위한대책으로중국등으로부터천연자원의유입을막고국내임산자원및 식물자원부문에서국제적인물질특허획득기회를확대하여우리농산물의세계 화에크게기여할수있으며, - 국내에서자생하는임산자원으로부터피부노화방지기능성을갖는화장품개발 기술이정착된다면, 이분야에관심있는국내과학자들에게용이하게응용할수 있도록한다. - 본결과의여러과정및기술들을확대적용시키는사업들을국가나민간기업에 서지속적으로수행한다면국내산천연자원을이용한피부노화방지원료개발연 구가연속적으로이뤄질수있을것으로판단된다. - 세계적으로신기능생물소재기반기술은핵심산업기술로서확고한위치를굳 히고있으며신기능생물소재는기술주도제품으로기술개발에따라수요창출 이가능하다. 미국은 90년연방정부주도의생물소재관련연구비 34억달러를 투자하였고점차그비율을높여가고있다. 그리고앞으로도보다강화된지적 소유권보호정책에힘입어신기능생물소재기술개발의세계시장규모는연간 약 3조달러에달할것으로예상되며현재미국 일본등신기능생물소재기술 - 1 -

23 보유국들에의해관련기술개발이선도되고있어다수의신규의약, 식품용기능 성생물소재가상품화될것으로전망된다. 따라서본연구의성공적결과는우리 나라의고유임산자원을화장품용 BEAUTY 산업원료물질생물소재로자리매 김할수있고 BEAUTY 산업의연간국내시장이 5, 6조원에달함을감안할 때, 그에따른수입대체효과는연간수천억원에이를것으로예상된다. - 현재, 국내의경우도농촌노동력이감소하는경향을보이고있고휴경하는논이 늘고있는데황칠나무와같은새로운임산자원의논에서대량번식방법을개발하 고황칠수액등을이용한제품다양화기술을연구하여천연자원을이용한부가 가치산업을육성하면, 농가소득의향상은물론농수산물수입개방에따른국제 경쟁력제고에도일조할수있을것이다 - 현재우리농촌은세계적인자유무역주의에기인한시장개방압력속에서점점 경쟁력을잃어가고전반적인경제환경의변화로인해농가의수입원이감소해가 고있어전국가적인대책마련이필요한시점이다. - 국내기능성화장품시장규모는미백용화장품만을기준으로업계추정 4500억원을 작년에돌파했으며주름개선, 자외선차단용기능성제품을포함할경우 1조원을 상회할것으로추산하고있다. 이런시점에서황칠나무추출액에서기능성물질을 개발한다면농가에새로운고부가가치의대체수입원을창출해줄수있을뿐아 니라화장품산업과같은고성장성첨단산업을농업과접목함으로써우리농업구 조를선진화하는데에도크게기여할것으로판단된다 기술적중요성 난대상록활엽수에속하는두릅나무과의황칠나무는그추출액을전통적인황금 색도료로이용하여왔으며특히궁중무희들의색조화장품으로도고대로부터 사용되어왔다. - 황칠나무수액에는안식향, 세르퀴테르펜등과같은생리활성물질이들어있 는것이확인되었으며여러가지항균효과나확인되지않은약리작용을가지고 있다고알려져내려오고있고그학명인 Dendrofanax morbiferus 는그리스어로 병을가져가는만병통치약이라는뜻을가지고있다. - 최근몇몇예비실험에서황칠나무추출액의멜라닌생성억제효과가밝혀지 면서미백용기능성화장품으로개발하려는시도가있어왔으며황칠나무수액이 - 2 -

24 그로인해다시주목을받고있다. - 기능성화장품은식약청의규약에따르면다음의세가지기능을가지고있어야 한다. 첫째는피부를하얗게하는미백기능용제품이있고두번째로는주름개선 용제품이있고마지막으로자외선차단제를 기능성화장품이라고부를수있 다. 기능성화장품엔각각의효과를나타내는활성물질이함유되어있는데대표 적인피부기능성물질로는레티놀, 알부틴, 코엔자임큐텐, 녹차추출물질인 EGCG 등을들수있다 - 연구자는황칠나무추출액이피부에기능성성분으로작용할가능성을규명하고 자황칠추출액의미백기능, 피부탄력성개선기능, 피부장벽회복기능에대하여 인간의피부를대상으로직접효과를판정하고피부자극시험을통해안정성을 확립하고자하였다. 미백효과를판정하기위해연구자는피부에관련성분을도포 한후자원자나연구자가주관적으로판단하는방법을버리고인공광원을이용 하여자원자에게인위적으로색소침착을유도하여그부위에관련성분을도포 하게한후피부색을수치화할수있는 colorimeter와 spectrophotometry 기법을 이용하여피부색의개선정도를객관적으로수치화하여판정하였다. - 또한항노화효과즉피부탄력성의개선효과를판정하는데있어서도주관적인 판정기준을버리고 reviscometry라는새로운기법을적용하여관련성분을도포 하게한후피부의탄력성의개선정도를수치화하여판단함으로써주관적인요 소가배제될수있도록하였다. - 뿐만아니라최근사회적으로문제가되고있는아토피피부염이나건선, 피부 건조증등에중요한병인및악화요인으로작용하는피부장벽기능의개선여부 를 Corneometer와 TEWA meter를이용하여수치화하여개선효과를판정하였 다. Corneometer는피부각질층의수분함유량을측정할수있으며 TEWA meter 는경표피수분손실량즉피부에서증발하는수분량을계측할수있다. 피부장벽기능은피부의각질층과피부에서분비되는지질이같이작용하여형성 하는일종의보호막으로서외부의물질이피부로침투되는것을막고피부의수 분증발을막는중요한역할을담담하고있다. 이런피부장벽기능이손상되게되 면아토피피부염, 건선, 건성습진, 피부건조증과같은피부질환의유발및악 화요인으로작용하고피부의수분함량이떨어지게되면피부가건조해지고잔 주름을유발하는등피부노화도촉진시킬수있다

25 - 황칠나무추출액이피부에도포하였을경우자극반응이나알러지반응을일으키 는지를확인하기위하여마지막으로식품의약품안전청이정한기준에따라황 칠나무추출액의피부자극성검사를위해자원자를대상으로첩포검사를시행하 였다. 3. 사회문화적중요성 - 21세기에접어들면서국민소득이 2만불을넘어선우리나라는최근고도성장기를 지나서선진국초입에도달하였다. 국민의의식수준도값싸게대량생산한제품보 다는고가이더라도자연친화적이고몸에좋은웰빙형제품이소비시장의트렌드 로되어가고있으며화장품시장도예외는아니다. 최근한방화장품이나여러가 지자연산추출물을이용한기능성화장품이화장품시장에서종래의기초화장 품이나색조화장품들을밀어내고새로운시장의주류로자리잡고있는것도이 런맥락을반영한다고할수있다. - 황칠나무수액은기능성물질로개발된다면현재레티놀같은합성기능성물질 이대세를이루고있는기능성화장품시장에서자연친화적웰빙형천연기능성 제품으로크게자리매김할수있다고생각된다. 제 2 절연구개발의필요성 - 우리나라에는전통적인황금색도료인황칠이문화유산으로전해져내려오고있 다. 황칠은왕실의권위를나타내는황금색도료로쓰였던질좋은천연도료로서 갑옷, 투구왕실의궁궐대들보등을황금색으로도색하는데쓰였으며또한궁중 무희들의색조화장품으로사용되었던전통문화유산이다. - 황칠을만드는수액을생산해내는황칠나무(Dendropanax morbifera Leveille) 는 두릅나무과의난대상록활엽수로서내한성이약한반면, 내음성과내조성이강하 고계곡부위의토심이깊고비옥하고적윤한곳에다량으로자생하며, 동백나무, 후박나무, 사스레피나무와함께혼생한다. - 분포지는전남완도, 보길도, 대흑산도, 어청도, 제주도등지이며자생지의입지조 건을보면월평균최저기온이 2 이상이고지형은화산암으로산록~산복에분 포하고있었으며, 표고는 150~700m 에걸쳐생육하고있다. 특히제주도지역에 서는수악계곡보다서귀포돈내코계곡이생육조건이양호해종자결실이잘되었 - 4 -

26 을뿐만아니라황칠나무의분포가많았으며자생지의토양 ph는 4.9~5.8로약 산성이며수분함량이 16.5~27.4% 로비교적습기가많은곳에서생육하였다. - 황칠나무수액의분비시기는 5월부터 11월까지이나채취시기는옻칠과마찬가 지로더울때인 7월부터 9월사이이며수액의채취방법은수간에칼로 V자나 O 자형으로상처를내면유관에서황색의액이나오는데, 처음에는유백색의액이 나오나공기중에서서서히수분을잃고황색이된다. 그리고채취시기별로보면 8월하순부터 9월중순이가장많이분비되었으며최근에는파라코트처리나회 색고약병균 (Septobasidium sp.) 의접종등을통해접종구당 3~4배의수액을채 취하는등더많은양의황칠을생산해내는방법이개발되어그활용성이매우 증대되고있다. - 황칠나무수지액의물리적성질을보면수분함량이 19.5% 로높은편이었으며, 투 명도는 1차도포시 95%, 2차도포시 55% 로양호한편이며, 색상은황금색에 속했고, 점도는도장또는피부생리활성물질로개발하기에알맞은편이다. 그리 고황칠수액은비휘발성성분이 66.7% 이며 10.8% 의방향성성분을함유하고있 으며이방향성성분의주성분은세스퀴테르펜이며안식향등다량의인체에무 해한생리활성물질들을함유하고있어생칠가공을통해생산해내는황칠의신 규한기능성성질들을밝혀낼경우기존에주로사용되던도료로서의기능외에 그산업적이용이무궁무진할것으로예상된다. 표1. 황칠의주요성분 비휘발성분방향성성분수분함량고형분 66.7% 10.8% 8.1% 14.4% - 상기에서언급한바와같이황칠수액은전통적으로뛰어난기능성소재로서사용 되어왔다. 그러나산업화에따른값싼인공합성도료의개발로인해황칠의맥은 끊어진상태이며그동안우리는급속한경제개발욕구에따른산업화의와중에서다른나라에비해우리의전통천연도료기술복원을등한시하여왔고따라서현재는그사용이매우제한되고있는실정으로이의과학적연구를통한복원작업이시급한실정이다. 특히황칠은전통도료로서의가치뿐만이아니고본연 - 5 -

27 구팀의예비연구결과기능성피부노화방지제로서의가능성이강력히시사되고있어이의과학적기술개발필요성이강력히대두되고있는실정이다. - 황칠나무수액을이용한고부가가치기능성물질을개발하기위해인간의피부를대상으로황칠수액의미백효과및항노화효과의유효성을평가하고안전성을확립하는것이필요하다. - 기능성화장품이란식약청의분류에따르면피부에미백효과를가져오거나주름 개선효과를나타내는제품을의미하며여기에자외선차단제품을덧붙여크게 세가지종류로분류할수있다. 관련시장규모는미백제품만을기준으로할때 업계추산으로작년기준 선용제품을포함할경우 4500억원을상회했으며여기에자외선차단제와주름개 1 조원을상회할것으로추산된다. - 기능성화장품엔각각의효과를나타내는활성물질이함유되어있는데대표적인 피부기능성물질로는레티놀, 알부틴, 코엔자임큐텐, 녹차추출물질인 EGCG 등을들수있다. 이중가장널리이용되고있으며많은연구로그효과가입증 된레티놀은비타민 A의유도체로써여러가지세포내신호전달체계를통하여 피부에존재하는멜라닌색소의분포를고르게하고, 피부각질형성세포의증식 및분화를촉진하며피부탄력성분인콜라겐합성을증가시킴으로써대표적인기 능성물질로인정받고있다. - 이렇게효과가입증된활성성분은기능성화장품을개발하는원천기술이될뿐 아니라관련산업에대한파급효과도상당하다고할수있지만아직까지국내에 서는물질개발및연구가부족하고대부분이거대다국적화장품업체에의존하 고있는실정이다. 또한기능성물질의유효성을평가하고인정하는기준이명확하 지않으며평가항목도거의연구자개개인에의존하고있으므로신뢰성이떨어 지며평가항목을선정하는데에도난점이있다. - 현재의기능성화장품신소재연구개발동향을크게미백, 주름개선, 자외선차단 용제품에대하여살펴보도록하겠다. - 미백용기능성화장품소재개발동향 : 피부는표피와진피층으로구분되어있으 며피부색의밝고어두움은주로표피층의변화에기인한다. 표피층을구성하고 있는세포는각질형성세포와멜라닌형성세포가주를이루고있는데그중멜라 닌형성세포에서만드는멜라닌이란색소가사람의피부색을결정하며기미나 주근깨같은색소성질환의원인이된다. 멜라닌은멜라닌형성세포에서만들어져 - 6 -

28 서각질형성세포에전달되어멜라닌소체의형태로존재한다. 인종에따른피부색 의차이는멜라닌세포의많고적음이아니라멜라닌소체의크기와수에따라 결정된다. 멜라닌외에피부의밝고어두움을결정하는중요한요소로각질층을 들수가있는데각질층은각질형성세포의마지막분화단계로서피부의수분증 발을막고외부물질의침투를막는방어막역할을하게된다. 이각질층이외부 환경과접하면서주위의분진이나피부에서분비되는피지와반응하여착색이되 면서피부가어둡거나건강하지못하게보이는원인이된다. 따라서기능성미백 소재의개발은주로멜라닌생성의억제, 각질층용해에맞추어져발전해왔다. 그중멜라닌생성의마지막단계에효소로작용하는타이로시나제를억제하는 arbutin이나 kojic acid 등이개발되어활용되어왔다. 하지만이들활성물질들이 세포내로의침투능력등에의문이제기되어왔고대부분의개발물질들이 in vitro 상에서는우수한활성을나타내지만 in vivo 상에서는결과가뚜렷하지않 은경우가대부분이기때문에유념할필요가있다. 최근에는화학적공정을거친 합성물질보다는자연친화적인바람이불면서약용식물로부터소재를찾고자하 는경향이강하며이렇게개발된제품들이시장의주류를이루고있다. - 항노화기능성화장품소재개발동향 : 피부의노화현상은크게내인성노화와 외인성노화로나눌수있다. 내인성노화는다른말로생리적노화현상이라고도 부르며우리몸은유전자에의해일정한수이상의세포분열을하면더이상세 포가증식하지못하고세포고사에빠지게되는데이를내인성노화라한다. 외 인성노화는자연법칙에의해정해져있는노화현상외에주변환경물질들에의 해서노화가촉진되는현상을말하는데피부에서는자외선에의해노화현상이촉 진되는광노화현상을들수있겠다. 비근한예로일생동안야외에서일한 60대 농부의얼굴과실내에서근무하는 60대사무직직원의얼굴차이를보면광노화 현상을미루어짐작할수있다. 피부의노화현상은나이가들어가면서자연적으로 피하조직을구성하는콜라겐, 엘라스틴같은피부탄력물질의양이줄어들면서피 부의탄력성이떨어지고주름이생기게되는현상을말하는데여기에자외선에 의한광노화현상이겹치게되면노화의정도는더욱심해지게된다. 따라서피부 노화방지기능성물질은줄어드는표피나진피조직의분화재생을촉진하거나, 콜라겐이나엘라스틴같은피부탄력물질의양을조절하거나활성산소를제거하는기전을가지는물질을개발하는쪽으로진행되어왔다. 대표적인기능성항노 - 7 -

29 화물질로레티놀, AHA, benzastatin 등을들수있으며최근에는소비자들의화 학합성물질에대한거부감과친환경소재에대한선호가겹쳐서자연추출물질에 서이런약리작용을발견하려는시도가계속되고있다. 또한주름개선용화장품에 주름개선만을위한활성성분뿐만아니라자외선차단성분및미백성분등을같 이혼합하는다기능성제품을추구하고있는데이는비단상업적인이유에서가 아니라광노화현상에대한이해가커지면서피부에주름을형성하는중요한요 인이자외선이라는것이밝혀지면서부터이다. - 본연구에서는미백효과를판정하기위해피부에관련성분을도포한후자원자나 연구자가주관적으로판단하는방법을버리고인공광원을이용하여자원자에게 인위적으로색소침착을유도하여그부위에관련성분을도포하게한후피부색을 수치화할수있는 colorimeter와 spectrophotometry 기법을이용하여피부색의개 선정도를객관적으로수치화하여판정하였다. - 또한항노화효과즉피부탄력성의개선효과를판정하는데있어서도주관적인 판정기준을버리고 reviscometry라는새로운기법을적용하여피부의탄력성의 개선정도를수치화하여판단함으로써주관적인요소가배제될수있도록하였다. 뿐만아니라최근사회적으로문제가되고있는아토피피부염이나건선, 피부건 조증등에중요한병인으로생각되는피부장벽기능의개선여부를 corneometer 와 TEWA meter 를이용하여수치화하여개선효과를판정하였다. - 본연구는연구결과뿐아니라어떤기능성제품의효과를판정하는데있어서객 관적기법을도입함으로서앞으로특정물질이기능성물질로유효한가의여부를 판정하는데있어방법론적인지침을마련한측면에큰의의를둘수있다고하겠 다. - 연구자는황칠추출액의피부미백효과및탄력성개선효과, 피부장벽기능의회 복효과를객관적인연구방법으로규명하였으며이런연구결과는앞으로황칠추 출액을이용한미백용화장품이나피부주름개선화장품을개발하는데이론적근 거를마련했다고할수있다. 뿐만아니라황칠추출액의피부장벽기능개선효 과즉피부각질층의수분함유량을높이고피부수분증발을막는효과를규명 해냄으로써피부의보습력을높일수있는보습제로의개발가능성과같은부수 적성과도얻을수있었다. 피부보습제는일반인뿐만아니라아토피피부염이나 건선, 피부건조증을앓는환자들까지관련시장규모가기능성화장품에거의필적 - 8 -

30 할만큼크다고할수있으며비교적관련기관의규제가작고제품을만들기도 수월하여보다빠르게상용화할수있다는장점이있을것이다

31 제 2 장국내외기술개발현황 - 황칠나무는우리나라특산수종이며중국, 일본에있는황칠나무는우리나라황칠 과는유사한종이나같지는않은것으로알려지고있어국외에서황칠수액에관 한연구는미미한것으로알려지고있다. 뿐만아니라그동안국내에서의황칠 연구는주로천연특수도료의원료개발및방부, 방음제개발, 최고급천연황칠 을이용한공예품개발등에국한되어황칠수액을고부가가치화하지못한것이 문제점이라할수있고따라서근래들어황칠수액을이용한천연의약품개발 (1998 년황칠항산화물질특허출원) 연구등이미미하게진행되고있는실정이다. - 고령화인구가증가하면서피부에대한관심도점차증대되고있으나국내의경 우의과, 약학대학에서주로염증과피부창상에대한상처치료분야를연구하고 있을뿐광노화의기전과항피부노화생리활성물질에대한연구는극히미미한 실정에있다. 뿐만아니라피부노화연구는실험재료의채취하기가쉽고시료채 취후에도계속적으로노화현상에대한연구를수행할수있어향후인체노와연 구의대표적 model 이될가능성이높다. 국내의경우는 retinoic acid를비롯해주 름형성을막거나개선시켜주는물질에대한연구가몇몇화장품업체및소수의 대학에서진행중에있으나황칠수액을이용한피부보호물질또는피부노화억 제물질에대한연구는거의진행되고있지않은실정이다. - 우리나라는현재농산물의수입개방으로쌀재배농가가도산상태에있으며따라 서농가에서는쌀을대체할유망작목선택에어려움을겪고있고생물다양성협 약에의해유전자원의중요성이그어느때보다크게인식되고있다. 이러한시기 에우리나라만의특산식물을탐색, 개발하여산업화하는것은환경보존형농업을 위해반드시필요할뿐만아니라애국적인국민정서함양에도필요한국가적인 사업이다. 또한, 자원식물은지역성, 계절성및환경에대한적응성이강하므로자 생지를중심으로집중적으로연구 개발하여특산화함으로써주요생산단지를조 성하고관광상품화하는것은매우바람직하며우리만의고유브랜드창출이가 능하다고할수있다. - 따라서논에서황칠나무의대량번식방법을개발하고이를농가에전파하여다량 의황칠수액을생산하고천연물질인황칠의기능성에대한많은연구가이루어져

32 황칠이목재, 섬유, 화장품, 약품등다양한재료에응용될수있는신기능성물질 로서개발된다면농가소득증대에일익을담당할수있는훌륭한유망작목으로서 기능할수있을것으로판단된다. (1) 세계적수준 개념정립단계 o 기업화단계기술안정화단계 (2) 국내수준 개념정립단계 o 기업화단계기술안정화단계 - 전문가들은 2009년한국경제가직면한대외환경은 2001년이후가장악화된상 황으로판단하고있어올해경기침체가본격화될것으로전망되는가운데체감경 기가더욱위축되는등최악의상황이예상되고있다. 이렇게외환위기와물가상 승등경제지표가바닥수준에서머물고있는가운데에도국내화장품산업경기 는 2008년 10.8% 의성장률을보이는등다른소비재상품군에비해높은성장률 을보이고있어국내화장품시장은지속적인성장을할것으로전망되고있다. 98년외환위기당시에도화장품시장은 -0.2% 하락에그쳤을만큼국내화장품 내수시장은튼튼하기때문에, 다른산업에비해서는경기의영향을덜받을것으 로예상된다. 그러나소비자들의구매패턴의변화로인해기업양극화는더욱심 화될것으로보이기때문에중소업체들은차별화에성공하지못한다면고전을면 치못할것으로예상된다. 그러므로이러한시장상황에서, 천연물을이용한기능 성화장품의개발은비용이나효과적인면에서매우전망이밝은연구분야이다 ( 최영, 2008). - 현재세계 100대화장품기업가운데한국기업이 5개나랭크되어있어한국의화 장품산업은기술적인측면에서는이미세계수준을뛰어넘고있다는평도있다. 화장품의품질을지배하는핵심원료부문중에서일부기술은세계에서가장앞 서고있으나화장품의선진국으로일컫는유럽이나미주 일본에비해서는다소 차이가있다. 그러나한국의화장품기술은날로발전하고있다. 세계화장품화학 자연맹(IFSCC) 를비롯해아시아화장품학회(ASCS) 에다수의논문을발표하는것 은물론원료관련학술대회에도다수의연구성과를제출하고있다. 또한기업별

33 - 기술보유현황도좋아지고있다. 아모레퍼시픽은이미세계 20위권의기업으로지 난해식물줄기세포가함유된화장품을개발해이미상용화하고있다. 또 2002년 과 2003 년연이어국산신기술인증을획득했다. LG생활건강도 LG생명과학과공 동개발한주름개선기능성신물질 메디민A 를이자녹스링클디클라인에적용해 국내최초주름개선기능성화장품으로인증받았으며국산신기술및장영실상을 수상했다. 최근에는 C-Kit 저해제를통한미백화장품개발 연구끝에기미에특 효가있는미백제인 디오스메틴 이라는성분개발에성공하고이자녹스화이트 브랜드에적용했다. 또한발효기술을통하여얻어진주름개선기능성성분 GABA 는 숨어메이징 브랜드에적용했다. 이외에도약재에서추출한미백기능 성성분 피토세리나, 피토클리어 EL-1( 속수자유래미백성분), 페오니플로린( 작 약유래주름개선) 및 안젤릭컴플렉스( 백지유래주름개선) 을개발상품화하는 등기능성주성분개발에성과를보이고있다. 바이오랜드는제주도에서자생하는 문주란에서추출한천연항염소재를비롯해굴피나무열매추출물을주름개선원 료로등재하였고효능은 IFSCC, ASCS 등화장품관련국내외학회및논문에 발표됐다. 바이오스펙트럼에서는제주에서자생하는 적설초 의탁월한재생성분으 로잘알려진 마데카솔(Madecasol), 즉 아시아티코사이드 를주름개선신소재로 개발하였다 ( 한국보건산업진흥원, 2008). 국내화장품산업은정밀화학제품중의약산업다음으로큰시장을형성하며국 가산업을지탱하고있다. 하지만위와같이이미국내에서도개발이활발히되고 있음에도불구하고, 현재화장품원료는 90% 이상을해외수입에의존하고있고 그수입증가율도점점가속화되고있는실정이다. 이는국제적으로경쟁력을가 질수있는신소재를확보하지못한데그원인이있다. - 앞으로의혁신적인기능성화장품개발을위하여, 국내의제도적인규제완화와 기술적인연구지원확대가필연적이다. 최근합리적인제도를속속도입하면서 각종규제를완화하고있지만아직은선진국들에비해서는국내화장품산업에대 한정부의지원의정도는미미한수준으로기업들대부분을만족시킬만한수준 이되지못하다( 식약청, 2008). 또기술발전을위한연구지원도미진해개발에 대한욕구를따라가지못하고있다는분석이다. 이에대해국내화장품기업들이 많은아쉬움을나타내고있는만큼정부의다양하고효율적인지원이필요하다는 지적이다. 최근보건복지가족부가화장품산업을뷰티산업으로확대시키는방안을 마련하고이를위한 R&D 지원확대, 수출활성화지원, 규제완화등의지원계획을 발표했고따라서장기적으로는화장품산업의발전을기대해볼수있을전망이지 만아직규제완화와연구지원확대등우선해결해야하는문제가많다

34 - 미백기능성화장품의개발소재들은주로타이로시나제의억제, 항산화제에의한 환원작용, 멜라닌의전이억제기작등으로다원화되었으나, 의외로기대하였던것 에비하여효과가크지못한것이현실이다( 유익동, 2005). 최근멜라닌세포의생 물학적조절에대한연구가진행됨에따라멜라닌세포와멜라닌세포의주위환경 의조절에의하여멜라닌생산을조절하려는노력이시작되고있고, 기능성화장품 특허현황이나승인현황을보더라도, 화장품소재분야에있어서 2004년부터는천 연물을이용한계면활성제, 보존료, 색소, 향등의개발이활발해지고, 위에서언 급된소재들이외에실제로응용가능한새로운미백제들이생약성분으로부터또 는합성방법으로계속개발될것으로보이며또한개발되어야한다. 따라서본 연구과제에서미백과노화방지에서기능을보이는것으로나타난황칠의경우 유효성분의분자유전학적인기능을밝힌다면, 국내시장뿐만아니라세계시장에 서국제경쟁력을가지고세계화장품시장에진입할수있을것이라기대한다

35 제 3장연구개발수행내용및결과 제 1 절황칠나무자원화를위한대량육묘및번식방법 의개발연구( 제1 세부연구과제) 1. 1 차년도연구결과보고서 가. 연구개발목표 1 차연도 황칠나무의대량증식방법개발 - 유효농경지( 논) 의황칠나무재배적합지로의응용연구 나. 연구개발수행내용 - - 황칠나무의식생학적자료수집및현지조사 생육중심지의추출 - 생육중심지의입지환경( 기상요인및토양의물리화학적요인) 분석을위한 관측기기설치및운용 - 수액생산량증대를위한황칠의채취시기별, 황칠나무생육입지조건별채취량 분석 다. 연구방법 (1) 황칠나무의식생학적자료수집및생육중심지의추출조사 당해연도조사에서는기존에알려진분포지들중에서고흥, 해남, 완도, 보길도 의지역을대상으로총 13개의방형구를선정하여 2006년 6월부터 2006년 10월까지 조사를실시하였다. 이와더불어황칠나무가분포가보고된지역및생육보고는 없었지만산림의보호정도및해발고도등을고려할때자생이예상되는지역을 선정하여현지조사를병행하였다. 황칠나무자생지역의조사지역내방형구설치는

36 식분이비교적균질한지점을선정, Braun-Blanquet(1964) 의식물사회학적연구방 법에의거하여조사를실시하였다. 방형구의크기는수고를참고하여 10m 10m, 15m 15m, 20m 20m 로적절히설정하였다. 조사구내에분포하는황칠나무의전개 체에대해서는매목조사를실시하였으며, 이와더불어방형구내의교목층, 아교목 층, 관목층, 초본층으로구분하여각각에대한우점종을기록하였다. 현지에서동정 이어려운종은일부를채취하여연구실내에서동정하였으며, 동정과학명의기재 는이(1996) 에따랐다. 조사된자료는일련의표조작(Mueller-Dombois and Ellenberg 1974) 을거쳐군 락을분류하였다. 각입지별분포종들의계층별우점도를파악하기위하여출현한 식물종들의양적( 피도), 질적( 빈도) 인측면을고려하여정량화된합성지수(Kim and Manyko 1994; 김등 1997) 인상대기여도(rNCD) 를이용하였다. 이계산식에서피도 값에대해서는평균피도백분율값(van der Maarel 1979) 을적용시켰으며산출식(1) 은아래와같다. NCD i ( 절대기여도) = C / N ni/ N (Cmin NCD C max ) 식(1) i rncd i ( 상대기여도) = NCD i / NCDmax 100 여기에서 C i 는식물군락내에서의 i 종의피도총합, n i 는 i 종이출현한조사구수, N 은하나의식생단위로정리되어식물군락표에합성된전조사구수이다. 황칠나무가분포하는식생과식생성립에관여하는환경인자들을보다정량적이 고객관적으로분석하기위하여 DCA ordination 분석을실시하였다. 본연구에사 용된자료는조사구중황칠나무가비교적높은개체수로생육하고있는총 13개의 조사구를대상으로하였으며, 전조사구에서출현빈도와중요치( 상대기여도) 가높은 47 종을선정하여실시하였다. 특히출현빈도에대한요인분석을위해 Braun - Blanquet(1964) 의우점도를 Maarel(1979) 의계급치로환산한후, Hill(1979) 의분석 기법을이용하여 DCA(detrended correspondence analysis) 를수행하였다. DCA의 결과를토대로가상의삼차원공간에방형구들을배열하여방형구들간의유연관계 를분석하였다

37 (2) 생육중심지의입지환경분석 문헌조사및현지조사를통해황칠나무는제주도를제외한육지및인접지역의 경우전라남도완도및보길도인근이현재가장자연성이높은군락을형성하고 있는것으로파악되었으며, 생육중심지의입지환경분석은이중가장큰자연성을 가지는곳으로조사된보길도의황칠나무군락지에대해기초적미기상자료를얻기 위하여관측기기를단기간시험설치운용하였다. 군락과나지의임상미기상자료 를비교하기위해나지에는연속적으로자동기록이가능한데이터로거에광량자밀 도(Li-Cor), 기온과지온( 열전대), 토양수분(TDR) 센서를연결하여연속적으로자료 를수집하였고, 군락에대해서는휴대형온습도계, 광량자계, 지온계를가지고해당 군락에서시간을기록하고신속히측정하였다. 측정한데이터는동일시간대의나 지데이터를발췌하여각군락의값과비교분석하였다. (3) 수액생산량증대를위한황칠의채취시기별, 황칠나무생육입지조건별 채취량분석 식생조사에서황칠나무는계곡과인접사면에주로분포하는것으로조사된바, 이를바탕으로계곡부개체군( 곡부) 과사면부개체군( 면부) 의 2개그룹으로구분하 였다. 계곡부는계곡가장자리에서 5m 이내에있는개체를, 면부의경우계곡가장 자리에서 5m 이외에위치한개체로구분하였다. 계곡부의경우비교적큰개체가 많아표준목선정에있어서도일반적인생육지상황을반영하기위해비교적큰개 체를, 면부의경우작은개체들이많아표준목도작은개체를선발하였으며, 결과 적으로면부에비해곡부의개체크기가상대적으로큰개체가많이선발되는원인 이되었다. 또한이러한개체선발에있어표준목수가 5개로제한된것은황칠나 무가곡부와면부로구분하여충분한표준목을선정할정도로많은개체가넓은지 역에걸쳐생육하지않았고곡부를중심으로한제한된분포형태를나타냈기때문 이다 ( 표 1-1). 구분된두개체군중직경 5cm 이상인표준목 5개체를선정하여황칠나무주간 ( 主幹 ), 지상에서 35cm 정도높이에폭 0.5cm, 길이 3cm로 2곳에박피를한후 7 일간격으로 2회 14 일간(2006년 9월 18일-10월 2 일) 에걸쳐채취하였으며, 칠액생 산량은생액의중량(fresh liquid weight) 으로계산하였다

38 표 1-1. 산칠량조사를위한표본목 번호직경 (cm) 수고 (m) 비고 곡부 m 지점분지 곡부 개천인접 곡부 암석많음 곡부 광조건양호 곡부 뿌리일부노출 면부 면부 면부 군락내위치 면부 급경사지 면부 광조건양호 나. 조사결과 (1) 황칠나무의식생학적특징및분포중심지 ( 가) 황칠나무군락의식생학적특징 조사한황칠나무분포지는크게구실잣밤나무군과서어나무군으로구분되었다 ( 표 1-2). 서어나무군보다비교적저위도지역과낮은해발고에분포하는구실잣밤나 무군은상록활엽수종인구실잣밤나무와모밀잣밤나무를비롯하여참지네고사리, 예 덕나무, 일엽초등에의해구분되었으며, 서어나무군은낙엽활엽수림대에주로분포 하는서어나무와당단풍을비롯하여조릿대, 비목나무, 사람주나무등에의해구분 되었다. 상록활엽수림대의표징종으로는황칠나무를비롯하여동백나무, 마삭줄, 사스레 피나무, 광나무, 붉가시나무, 생달나무, 자금우, 후박나무, 남오미자등이분포하였다. 구실잣밤나무군에서군락의평균수고와식피율은수관층이 11.9m와 90.3%, 아교 목층이 5.0m와 49.4%, 관목층이 1.7m와 18.1%, 그리고초본층이 0.5m와 23.8% 로

39 각각나타났으며, 평균출현종수는 25.4 종이다. 특히아교목층의높은식피율로인 하여관목층의식피는서어나무군에비하여비교적빈약하게나타났다. 서어나무군 에서평균수고와식피율은교목층에서 16.8m와 92.0% 를비롯하여아교목층이 7.0m와 36.0%, 관목층이 2.0m와 32.0%, 초본층이 0.7m와 23.0% 로각각나타났다. 군락의평균출현종수는 34 종이다( 표 1-3). 표 1-2. 황칠나무분포지에서그룹별군락구조의특징 요인 구실잣밤나무군 서어나무군 조사구수 8 5 출현종수 25.4± ±16.9 교목층의수고 (m) 11.9± ±3.4 교목층의식피율 (%) 90.3± ±4.5 아교목층의수고 (m) 5.0± ±1.2 아교목층의식피율 (%) 49.4± ±26.3 관목층의수고 (m) 1.7± ±0.5 관목층의식피율 (%) 18.1± ±14.0 초본층의수고 (m) 0.5± ±0.3 초본층의식피율 (%) 23.8± ±11.0 특히본서어나무군이구실잣밤나무군에비하여출현종수가높게나타났다. 이는 서어나무군의조사지가난온대수종이혼효하여분포하는입지영향에기인한것으 로사료된다. 표 1-3. 전라남도상록활엽수림대내황칠나무분포지의종조성표 Serial number Releve number Altitude (m) Slope ( Aspect NW 24 NW 32 NW 16 N NW 10 NE 44 NE 20 N NW 48 SE 64 NE 60 NE 56 NE

40 Quadrat size (m2) T1 Height (m) Coverage (%) T2 Height (m) Coverage (%) S Height (m) Coverage (%) H Height (m) Coverage (%) Number of species Differential species groups Castanopsis cuspidata var. sieboldii 구실잣밤나무 Dryopteris nipponensis 참지네고사리 Castanopsis cuspidata var. thunbergii 모밀잣밤나무 Mallotus japonicus 예덕나무 + + r Lepisorus thunbergianus 일엽초 Carpinus laxiflora 서어나무 Acer pseudo-sieboldianum 당단풍 Sasa borealis 조릿대 Lindera erythrocarpa 비목나무 Sapium japonicum 사람주나무 Character species of evergreen broad-leaved forest zone Camellia japonica 동백나무 Dendropanax morbifera 황칠나무 Trachelospermum asiaticum var. intermedium 마삭줄 Eurya japonica 사스레피나무 Ophiopogon japonicus 소엽맥문동 Ligustrum japonicum 광나무 Quercus acuta 붉가시나무 Cinnamomum japonicum 생달나무 Dryopteris bissetiana 산족제비고사리 Ardisia japonica 자금우 Kadsura japonica 남오미자 Machilus thunbergii 후박나무 Neolitsea aciculata 새덕이 Hedera rhombea 송악 Neolitsea sericea 참식나무 r Stauntonia hexaphylla 멀꿀 Elaeagnus macrophylla 보리밥나무 Pittosporum tobira 돈나무 Quercus glauca 종가시나무 Quercus salicina 참가시나무 Companions Cymbidium goeringii 보춘화 Callicarpa mollis 새비나무 + + r Smilax china 청미래덩굴 Viburnum erosum 덜꿩나무. +.. r Prunus sargentii 산벚나무 Cornus kousa 산딸나무 Rhus trichocarpa 개옻나무 Styrax japonica 때죽나무

41 Quercus serrata 졸참나무 Lemmaphyllum microphyllum 콩짜개덩굴 Paederia scandens 계요등 Meliosma myriantha 나도밤나무 Oplismenus undulatifolius 주름조개풀 Sorbus alnifolia 팥배나무 Meliosma oldhamii 합다리나무 Ampelopsis heterophylla 개머루 Dryopteris sp. 고사리 sp Desmodium oxyphyllum 도둑놈의갈고리 Euscaphis japonica 말오줌때 Elaeagnus umbellata 보리수나무.. r r... r..... Cephalotaxus koreana 개비자나무 Vitis thunbergii var. sinuata 까마귀머루 Asplenium incisum 꼬리고사리 Ainsliaea acerifolia 단풍취 Parthenocissus tricuspidata 담쟁이덩굴 Cocculus trilobus 댕댕이덩굴 Carex sp. 사초 sp Lindera obtusiloba 생강나무 r Pinus densiflora 소나무 Albizzia julibrissin 자귀나무 Grewia biloba var. parviflora 장구밥나무 Lophatherum gracile 조릿대풀 Ainsliaea apiculata 좀딱취 Dioscorea japonica 참마 Celtis sinensis 팽나무 Euonymus sachalinensis 회나무.. r r Oreorchis patens 감자난 r... Ilex integra 감탕나무 Lindera glauca 감태나무 r.. Cayratia japonica 거지덩굴 Philadelphus schrenckii 고광나무 Quercus variabilis 굴참나무 Persicaria amphibia 기생여뀌 Caulophyllum robustum 꿩의다리아재비 Viola dissecta var. chaerophylloides 남산제비꽃 Galium trachyspermum 네잎갈퀴 Zelkova serrata 느티나무 r Actinidia arguta 다래 Maackia amurensis 다릅나무 Commelina communis 닭의장풀 Ilex macropoda 대팻집나무 Polygonatum odoratum var. pluriflorum 둥굴레 Cornus walteri 말채나무 Petasites japonicus 머위나무 Viola selkirkii 뫼제비꽃 Solidago virga-aurea var. asiatica 미역취 Pinellia ternata 반하 r... Isodon japonicus 방아풀 r. Dioscorea nipponica 부채마... r Rhus chinensis 붉나무 Zanthoxylum schinifolium 산초나무 Paris verticillata 삿갓나물 Rubus corchorifolius 수리딸기 Quercus mongolica 신갈나무 Disporum smilacinum 애기나리 Rumohra miqueliana 왁살고사리

42 Ficus stipulata 왕모람 Actinodaphne lancifolia 육박나무 Pourthiaea villosa 윤노리나무 Callicarpa japonica 작살나무 Rubus hirsutus 장딸기 Mosla dianthera 쥐깨풀 Lastrea japonica 지네고사리 Rhododendron mucronulatum 진달래 Styrax obassia 쪽동백나무 Aster scaber 참취 Ficus erecta 천선과나무 Carex ciliato-marginata 털대사초 Chamaecyparis obtusa 편백 Buxus microphylla var. koreana 회양목 그림 1-1. 황칠나무분포지조사방형구들의 ordination. Stand ordination 의결과, 제 1축의 eigenvalue가 0.284로제 2축의 0.127, 제 3축 의 에비하여가장높게나타났다. 방형구들의배열은오른쪽에서왼쪽으로진 행함에따라서어나무군( 방형구번호: 3, 4, 5, 6, 10) 과구실잣밤나무군( 방형구번호: 1, 2, 7, 8, 9, 11, 12, 13) 으로구분되어지는경향을보였다( 그림 1-1). 주요특징종 들로는서어나무군에서서어나무, 당단풍, 조릿대, 졸참나무등이, 구실잣밤나무군에 서구실잣밤나무, 모밀잣밤나무, 생달나무, 참지네고사리등으로나타났다

43 상대기여도에의한우점도값은전체적으로동백나무(100), 붉가시나무(88.6), 구실 잣밤나무(55.4), 황칠나무(41.4), 마삭줄(23.8), 사스레피나무 (20.0), 광나무(11.5), 자금 우(8.0), 후박나무(7.2) 등상록활엽수가높은값을나타내었다. 그리고구실잣밤나무 군에서도구실잣밤나무 (100), 동백나무(72.8), 황칠나무(34.5), 붉가시나무(34.3), 사스 레피나무(22.6), 마삭줄(10.6), 모밀잣밤나무(9.3) 등상록활엽수의종들이주요종으 로분포하였다. 한편서어나무군에서는붉가시나무(100), 동백나무(53.7), 마삭줄 (22.3), 조릿대(19.0), 황칠나무(15.9), 광나무(13.5), 서어나무(12.4), 후박나무(9.2), 졸 참나무(6.4) 등주로상록활엽수가우점하고있으나부분적으로는낙엽활엽수가혼 생분포하는양상을보였다( 표 1-4). 표 1-4. 황칠나무분포지에서상대기여도(rNCD) 에의한우점도값. 상재도 10% 이상인 종을대상으로하였음 ) Differential species groups 학명국명 rncd 상재도 A B Total (%) Castanopsis cuspidata var. sieboldii 구실잣밤나무 Dryopteris nipponensis 참지네고사리 Castanopsis cuspidata var. thunbergii 모밀잣밤나무 Mallotus japonicus 예덕나무 Lepisorus thunbergianus 일엽초 Carpinus laxiflora 서어나무 Acer pseudo-sieboldianum 당단풍 Sasa borealis 조릿대 Lindera erythrocarpa 비목나무 Sapium japonicum 사람주나무 Character species of evergreen broad-leaved forest zone Camellia japonica 동백나무 Dendropanax morbifera 황칠나무 Trachelospermum asiaticum var. intermedium 마삭줄 Eurya japonica 사스레피나무 Ophiopogon japonicus 소엽맥문동 Ligustrum japonicum 광나무 Quercus acuta 붉가시나무 Cinnamomum japonicum 생달나무 Dryopteris bissetiana 산족제비고사리 Ardisia japonica 자금우 Kadsura japonica 남오미자 Machilus thunbergii 후박나무 Neolitsea aciculata 새덕이 Hedera rhombea 송악 Neolitsea sericea 참식나무 Stauntonia hexaphylla 멀꿀 Elaeagnus macrophylla 보리밥나무 Pittosporum tobira 돈나무 Quercus glauca 종가시나무

44 Quercus salicina 참가시나무 Companions Quercus serrata 졸참나무 Lemmaphyllum microphyllum 콩짜개덩굴 Cymbidium goeringii 보춘화 Oplismenus undulatifolius 주름조개풀 Pinus densiflora 소나무 Smilax china 청미래덩굴 Callicarpa mollis 새비나무 Prunus sargentii 산벚나무 Viburnum erosum 덜꿩나무 Styrax japonica 때죽나무 Cornus kousa 산딸나무 Paederia scandens 계요등 Meliosma myriantha 나도밤나무 Rhus trichocarpa 개옻나무 Sorbus alnifolia 팥배나무 Meliosma oldhamii 합다리나무 Lophatherum gracile 조릿대풀 Ampelopsis heterophylla 개머루 Dryopteris sp. 고사리 sp Desmodium oxyphyllum 도둑놈의갈고리 Euscaphis japonica 말오줌때 Cephalotaxus koreana 개비자나무 Vitis thunbergii var. sinuata 까마귀머루 Asplenium incisum 꼬리고사리 Ainsliaea acerifolia 단풍취 Parthenocissus tricuspidata 담쟁이덩굴 Cocculus trilobus 댕댕이덩굴 Carex sp. 사초 sp Albizzia julibrissin 자귀나무 Grewia biloba var. parviflora 장구밥나무 Ainsliaea apiculata 좀딱취 Dioscorea japonica 참마 Celtis sinensis 팽나무 Lindera obtusiloba 생강나무 ( 나) 분포중심지 황칠나무에대한조사가진행되어분포가기재된지역들은그림 2( 좌) 와같다. 우리나라에서황칠나무는제주도를비롯한완도, 보길도, 거문도, 고흥등의섬 지역이나해안이인접한지역에한정되어분포하는것으로조사되었다( 그림 1-2). 이러한분포지역은대체로부락으로부터떨어져있어토지의적극적이용에따른 인간의강한간섭으로부터배제된자연식생군락의성질을보이는산악지역들이다. 이와같은현분포지와기상요인을조합하여연평균기온을바탕으로분포가능한 지역을추정한것이그림 1-2( 우) 가된다. 현재의한정된분포지와는달리매우넓 은면적에서의생육이가능한것으로나타났다

45 그림 1-2. 황칠나무의분포지확인지( 좌) 및분포가능지역( 우). ( 다) 황칠나무의흉고직경급분포 전반적으로금번조사지에서흉고직경 로가장높게나타났다. 5cm 미만의개체수빈도가전체의 71.0% 특히서어나무군의경우, 5cm 미만의유목과유묘의개체수빈도가 94.2% 로대 부분을차지하였다 ( 그림 1-3, 1-4). 반면구실잣밤나무군에서는 5cm 미만이 54.2% 로높게나타나고있으나 5 10cm 급이 26.4%, 10cm급이상이 19.4% 로수령이높 은중소경목의개체수빈도가서어나무군에비하여높게나타났다. 한편흉고직경 급이큰개체들의분포비가높게나타난구실잣밤나무군에서, 평균분지수가 2.9개 로서어나무군의 1.1 개에비하여많은것으로조사되었다. 이는흉고직경급이큰개 체들의경우, 황칠수액채취와종자채종을위해가해진인위적인훼손이맹아의 출현으로인한분지에영향을미친것으로사료된다. ( 라) 생육중심지의입지환경( 기상요인및토양의물리화학적요인) 황칠나무분포지의현지와문헌조사에서밝혀진분포지에대한기상자료정리에

46 서황칠나무가분포하는지역의연평균강수량은 1, ,456.9mm 범위로평균 mm 로다소강수량이많은지역에속하였다. 지역이거나바다와인접한지역인것을감안한다면, 이들지역은바다로둘러싸인 이러한강수량의대부분은비 로내리는지역에해당된다. 분포지역의연평균기온은 범위로평균 13.7 로한반도에서는비교적온화한지역에속하는지역이다. 분포지역들중외연 도, 어청도, 홍도, 흑산도는지역특성상기상자료는얻기힘들어인근기상대인 <5.0cm > 빈도분포 (%) 구실잣밤나무군 서어나무군 전체 흉고직경 ( cm) 그림1-3. 황칠나무의흉고직경분포도

그림 1-4. 보길도의황칠나무. 무분별한종자채취로절단된가지( 좌), 무분별한 수액채취로인한상처( 우). 보령, 군산, 목포의값을사용한바분포지현지와는다소의차이를보일것으로 생각되지만, 대체적으로황칠나무의생육에는적어도연평균기온이 9 이상인곳 이어야하는것으로생각된다( 표 1-5).

온량지수는가장북쪽에위치한외연도( 보령) 가 85로가장낮은값을보였으 며, 분포지전지역평균은 104 로비교적온화한지역으로조사되었다. 일조시간의 경우 1,898hr~2,560hr으로일정한규칙성을보이고있지않아황칠나무의분포에는 크게영향을주지않는것으로생각된다.

47 그림 1-4. 보길도의황칠나무. 무분별한종자채취로절단된가지( 좌), 무분별한 수액채취로인한상처( 우). 보령, 군산, 목포의값을사용한바분포지현지와는다소의차이를보일것으로 생각되지만, 대체적으로황칠나무의생육에는적어도연평균기온이 9 이상인곳 이어야하는것으로생각된다( 표 1-5). 그러나문헌조사에서충남서산( 천리포수 목원), 전남순천, 전북전주, 함평, 광주등의지역에서식재된황칠나무가생육하 고있는것으로보아실제적으로는보다더저온에서생육이가능한것으로보인 다. 온량지수는가장북쪽에위치한외연도( 보령) 가 85로가장낮은값을보였으 며, 분포지전지역평균은 104 로비교적온화한지역으로조사되었다. 일조시간의 경우 1,898hr~2,560hr으로일정한규칙성을보이고있지않아황칠나무의분포에는 크게영향을주지않는것으로생각된다. 이와같은기후적요인을종합하면황칠 나무는연평균기온이적어도 12 이상, 강수량은 1344mm, 일최저기온이 7.4 이 상인지역은우리나라에서는남부해안에인접한지역이된다. 이러한조사지역들 은상록활엽수림대에속하는곳으로세계식물구계구에서는북대식물계 (Boreal kingdom), 중일구계역(Sino-Japanese region), 한국및남일본구계구(Korea and South Japan) 에속한다

그림 1-5. 전라남도완도군보길면소재 황칠나무노거수( 전라남도기념물 154 호). 현지의입지환경조사에서황칠나무는개체군이군락단위의집단으로분포하지 않고아교목상과교목상의모수가몇개체씩산생하며그주변부에유묘와유목이 나타났다. 주로계곡부주변부에, 그리고해남과보길도지역에서는전석지에서그 분포가조사되었다.

48 그림 1-5. 전라남도완도군보길면소재 황칠나무노거수( 전라남도기념물 154 호). 현지의입지환경조사에서황칠나무는개체군이군락단위의집단으로분포하지 않고아교목상과교목상의모수가몇개체씩산생하며그주변부에유묘와유목이 나타났다. 주로계곡부주변부에, 그리고해남과보길도지역에서는전석지에서그 분포가조사되었다. 분포지의사면은주로북동 북서사면지에걸쳐분포하였다. 위 의내용을토대로본다면황칠나무개체군은토양의수분환경과깊은관계가있는 것으로사료된다. 표 1-5. 황칠나무분포지의기상환경 분포지역 행정구역 연평균연평균강일최저일조시간온량지수기상대기온 ( ) 수량 (mm) 기온 ( ) (hr) (WI) 1: 외연도보령보령 , ,

49 2: 어청도군산군산 , , : 홍도, 4: 흑산도신안목포 , , : 소흑산도, 6: 우이도 7: 상조도, 8: 하조도, 9: 진도진도해남 , , : 해남해남해남 , , : 보길도, 12: 소안도, 13: 완도완도해남 , , : 주도, 15: 청산도, 16: 여서도 17: 거문도, 19: 금오도여수여수 , , : 외나로도, 21: 거금도고흥고흥 , , : 제주도제주제주 , , 표 1-7은자연조건에서황칠나무가생육하는생육지토양의물리화학적특성을 조사한결과이다. 토양함수량은 22.7% 에서 56.6% 까지의범위로평균 40.9% 로비교 적양호한수분조건을보였으며, ph는 4.76에서 6.05까지평균 4.96은산성토양으로 나타났다. 또한최대용수량은평균 81.6% 로토양의배수성이좋은토양으로나타났 으며, 유기물함량은평균 20.5% 로매우높은것으로나타났다. 이러한토양의특성 을볼때황칠나무는물빠짐이좋으나토양함수량이비교적높은곳이생육하기 적합한토양으로추측된다. 표 1-6. 황칠나무분포지역의토양특성 지역토양함수량 ph 최대용수량 (%) 유기물함량 (%) 보길도 보길도 보길도 보길도 보길도 보길도 보길도 두륜산 두륜산 두륜산 완도상황봉 평균

50 황칠나무군락의보다장기간의미기상분석을통하여자연군락에대한또는산 칠량이많은경우와그에상관성이높은지온, 기온, 일사량등과같은환경인자를 추출해낼필요가있다. (2) 생육입지조건별황칠의채취량 황칠나무의칠액생산량조사결과에서산칠량은계곡부와사면부모두저조한 생산량을보였다. 이러한원인은황칠나무의칠액생산이일반적으로약 6월부터시 작되어 7-8 월에가장많이, 그리고 10월에들어서그양이현저히감소하는생산 형태를감안할때, 본조사가시기적으로다소늦었기때문을분석된다( 표 1-8). 조 사구분구에무관하게황칠나무는직경이클수록산칠량이많은형태를보였고이 러한경향은사면부에서보다계곡부에서보다뚜렷하게나타났다( 그림 1-6). 전체적 으로곡부의경우평균 0.284g, 사면부는 0.138g으로곡부의경우가사면부보다약 2 배가량높은산칠량을보였다. 하지만이러한결과는두비교군의수령차이로 인한직경급즉, 크기의차가발생하므로크기의차이에서오는것인지아니면사 면과계곡의분포차이에서오는지는판단하기어렵다. 조사과정에서일반적으로계 곡부는표피에각인을하면적양이나마수액이빠르게분출되는것을확인하였고, 동직경급의개체를계곡부와사면의것을비교하여보면미소한차이일지라도계곡부개체가그리고작은직경급보다는큰직경급의개체가많은산출량을보이는경향을보였다. 표 1-7. 황칠나무의산칠량조사결과 번호 직경 (cm) 수고 (m) 산칠량 (g) 곡부 곡부 곡부 곡부 곡부 면부 면부

51 면부 면부 면부 곡부사면부 0.2 y = x R 2 = 산칠량 (g) 0.1 y = x R 2 = 직경 (cm) 그림 1-6. 생육지와직경급에따른칠액생산량

52 2. 2 차년도연구결과보고서 가. 연구개발목표 2 차연도 황칠나무의대량증식방법개발 - 유효농경지( 수전) 의황칠나무재배적합지로의응용연구 나. 연구개발수행내용 종자의채취시기와발아율측정 종자의휴면타파방법검색 호르몬처리에따른삽목재의발근및활착력시험 - 수전토양의통기율증진( 모래, 유기물, 배수로정비등) 을통한생육적합지로의 전환방법개발 다. 삽목을통한황칠나무의개체증식실험 (1) 연구방법 ( 가) 삽수의채취와제조 황칠나무는완도, 보길도, 어청도, 흑산군도, 제주도등의남서해안과그이남의 도서지역에한정적으로분포하는수종의상록활엽수이다. 이러한분포지중현재 가장자연적인군락이형성되어있으며, 가장큰개체가생육하고있는장소는보 길도인것으로조사되어있다. 실험에사용한삽수는자연적으로정착형성되어성립된황칠나무군락이 존재 하는전라남도완도군보길도에서 2008년 8월수령 년생, 직경 10 13cm, 수 고 5 6m의모수 5그루를선정하여당해연도형성된가지를위주로채취하여사 용하였다( 그림 1-7). 1년생가지의경우대개직경 4 7mm정도로당해연도기상 조건과영양조건에의해다소차이가있으나대개의경우가지끝에서 20 30cm

정도생육하게된다. 본실험에사용된삽수는일반적으로성장하는정도의크기의 것을채취하여사용하였다. 채취한삽목용가지는약 8m 정도의전정가위를이용하여줄기끝에서발생한 1 년생가지를선택절단하여건조되지않도록절단직후곧바로하단절단부를증 류수에담가상온상태에서약 12 시간에걸쳐실험실로운반하였다. 그림 1-7.

53 정도생육하게된다. 본실험에사용된삽수는일반적으로성장하는정도의크기의 것을채취하여사용하였다. 채취한삽목용가지는약 8m 정도의전정가위를이용하여줄기끝에서발생한 1 년생가지를선택절단하여건조되지않도록절단직후곧바로하단절단부를증 류수에담가상온상태에서약 12 시간에걸쳐실험실로운반하였다. 그림 1-7. 삽수를채취한모수( 전라남도완도군보길도). 실험실로운반된삽수용가지는 2 3장의잎이부착되도록하여절단부가 45도 각도로길이 10cm 로절단하였으며, 부착된잎은 2장만을남기고나머지는제거하였 으며, 삽수에부착된잎 2장도과도한수분손실에의한건조를방지하기위하여상 단부의반은절단하였고, 삽수간부착된잎의총엽면적에차이발생하지않도록 배려하였다

54 그림 1-8. 삽목용가지의제조. ( 나) 삽목실험처리구설정 삽수의발근실험은총 9 개의처리구로구성하였으며, 그중 7개처리구는 3개의 반복구, 각반복구는 20 개체의삽수로구분하여, 한개의처리구는총 60 개체의삽 수가사용되었다. 9개의처리구중 2개는모수로이용하는성목의활용성검증을 위해성목의당해연도성장한가지이외의 2년생가지로구성된 1개처리구의삽 수 10 개, 그리고 2년생의실생묘목에서당해연도성장한것을채취한삽수 10개를 대상으로발근여부조사에사용하였다. 이는종자로부터형성된 2년생실생묘목의 이식시, 그묘목의활착율을높이기위해줄기의상단부 1/2 정도( 주로당해연도 성장한부분) 를절단한후식재하는경우가많은데, 이때버려지는잘린가지를황 칠나무개체수증식을위한삽목재료로이용가능한지를검증하기위하여발근실험 항목에추가하였다. 2년생묘목과성목에서채취한 2 년생삽수의경우, 가능성만을 파악하는수준의실험이었기때문에 10 개체만을삽목하였다. 이와같은작업으로 총 9개의처리구가설정되었으며그구성은표 1-8 과같다. ( 다) 발근촉진제제조및처리 황칠나무의삽수발근에사용된발근촉진제로서는식물호르몬의일종인오옥신의 활성을높이기위해사용되는합성생장호르몬으로일반적으로이용되는발근촉진 제에해당하는 β- 인돌낙산(IBA) 과 α- 나프타린초산(NAA) 와삽수의종류에따라다

55 음으로많이이용되는 β- 인돌초산(IAA) 을선택하였다. 이러한 IAA, IBA, NAA의 발근촉진제로서의이용농도는일반적으로 실험에서도 60ppm 으로제조하여사용하였다. 60ppm의것을많이이용하기때문에본 표 1-8. 황칠나무삽목실험의처리구 1. Control 60 개체(20 개체 3 반복) 2. Gt IAA : 1% 포도당용액(20hr) + IAA 60ppm(12hr) 60 개체(20 개체 3 반복) 3. Gt IBA : 1% 포도당용액(20hr)+ IBA 60ppm(12hr) 60 개체(20 개체 3 반복) 4. Gt NAA : 1% 포도당용액(18hr)+NAA 60ppm(12hr) 60 개체(20 개체 3 반복) 5. Gnt IAA : IAA 60ppm(12hr) 60 개체(20 개체 3 반복) 6. Gnt IBA : IBA 60ppm(12hr) 60 개체(20 개체 3 반복) 7. Gnt NAA : NAA 60ppm(12hr) 60 개체(20 개체 3 반복) 8. 성목 2 년생가지, IBA 60ppm(12hr) 10개체 9 2 년묘목당해연도가지, IBA 60ppm(12hr) 10개체 일반적으로위와같은생장호르몬은호르몬자체가희석액인증류수에잘용해 되지않기때문에먼저소량의알콜에녹인용액을증류수에희석하는방법을이용 하여희석액을제조하였다. 제조된각각의발근촉진호르몬은변질되지않도록사용 시까지 4 의냉장고에서보관하였다. 포도당전처리실험에사용한개체는증류수에당을희석하여제조한포도당 1% 용액에하단절단부 3cm 정도를 20 시간침적시켰으며, 포도당전처리를하지 않은개체에대하여는동일시간동안증류수에계속침적시킨상태를유지하였다. 포도당전처리가종료된후에는삽수의침적된부분을증류수로잘씻어냈으며, 씻어낸것은곧바로각각에실험구에해당하는발근촉진용액에 12시간침적시켰 다( 그림1-9)

그림 1-9. 삽목용삽수의발근촉진호르몬처리. 발근촉진호르몬은플라스틱용기에촉진제를넣고삽목의 하단부가약 5cm 정도잠기도록처리.

20개체씩약 45 도각도로삽목하였으며, 삽목이완 료된삽수상자는빛이 50% 차광되는차광막이설치된묘묙상에배치하였다.

또한발근실험이진행되는동안에는기본 적인기상자료( 온도, 일사량) 를상시로측정하여기록하여발근과기상조건과의관

56 그림 1-9. 삽목용삽수의발근촉진호르몬처리. 발근촉진호르몬은플라스틱용기에촉진제를넣고삽목의 하단부가약 5cm 정도잠기도록처리. ( 라) 삽목상의관리 전처리가끝난삽수는 8cm의버미큐라이트를가득채운가로 50cm, 세로 35cm, 깊이 10cm의삽목상자에 20개체씩약 45 도각도로삽목하였으며, 삽목이완 료된삽수상자는빛이 50% 차광되는차광막이설치된묘묙상에배치하였다. 배치 후에는자동분무관수기를설치하여약 10분간하루에총 4차례에걸쳐삽목상이 건조되지않도록관수하였다( 그림 1-10). 또한발근실험이진행되는동안에는기본 적인기상자료( 온도, 일사량) 를상시로측정하여기록하여발근과기상조건과의관 계를파악하는기초자료로사용하였다( 그림 1-11). 그림 황칠나무삽목실험용삽목상( 좌: 포도당전처리, 우: 포도당무처리). 버미큐라이트로채운삽목상자를 50% 차광율을가진광조건하에배치하여관리

7/27 8/3 Air temp. 8/10 8/17 8/24 PPFD 8/31 0.5 0.4 0.

57 그림 황칠나무삽목상관리용기상측정기 Air temperature( o C) /20 7/27 8/3 Air temp. 8/10 8/17 8/24 PPFD 8/ PPFD(x100umolS -1 m -2 ) Time(day ) 그림 황칠나무삽목실험기간중의기상조건

58 (2) 삽목을이용한묘목생산 ( 가) 황칠나무삽수의발근율 삽수의발근율은 2년생묘목의당해연도성장가지를삽수로사용한것이 100% 의발근율을보였고발근상태에있어서도가장양호한결과를얻었다. 이와는 반대로성목의 2년생가지의경우한개체도발아하지않아삽수로서의이용가능 성은대단히낮은것으로평가되었다. 포도당전처리의경우, IAA는 15.4%, IBA는 78.5%, NAA는 63.3% 의발근율을 보였으며, 포도당무처리한삽목의경우는 IAA가 26.5%, IBA가 86.2%, NAA가 56.9% 로 IAA와 IBA의경우포도당포도당전처리한것이무처리한것이비해 IAA의경우 11.1%, IBA의경우 7.7% 발근율이낮아지는결과를얻었다. 하지만 NAA 의경우, 반대로포도당전처리가포도당무처리에비해 6.4% 높은발근율을 보여 IAA 및 IBA 와는반대의경향을보였다. 120 Rootting percentage (%) Cont IAA IBA NAA IAA IBA NAA 1y 2y Gt Gnt Tretment regime - 그림 삽목전처리에따른황칠나무삽수의발근상태

59 그림 발근처리에따른삽수의발근율. Gt: 포도당전처리, Gnt: 포도당무처리, Cont; 대조구, IAA; β- 인돌초산, IBA; β- 인돌낙산, NAA; α- 나프타린초산, 1y; 2 년생묘목채취삽수, 2y; 성목 의 2년생삽수 결과적으로본실험에서얻은결과만을놓고볼때황칠나무의삽목은 IBA만의 처리를통한발근성공율을대조구의 8.4% 에서 86.2% 로약 6 배정도향상되었으며, 이러한 IBA의처리가 2년생실생에적용될경우삽목발근율은 100% 로높아져더 욱확실한묘목생산이가능한것으로조사되었다( 그림 1-14)

60 ( 나) 발근된삽목의발근수 삽목성공의정성적판단의근거가되는발근수와활착된뿌리중 5개내외의 근장을측정하였다( 그림 1-15). 삽수개체당발근수는대조구의 4.3개에비해포도당전처리에서는 IAA가 4.2 개로차이가없었으며, IBA는 12.8개로약 3 배정도, NAA는 9.2개로약 2.1배정도 상승되었다. 하지만포도당전처리를하지않은 IAA는 7.1개로 1.6 배, IBA는 14.2개 로 3.3 배, NAA는 11.8개로 2.8배높아져포도당처리를하지않은것이발근수의 증가에도효과적인것으로조사되었다. 이와함께 2년생묘목에서채취한삽수의경 우평균 28 개의발근수를보여건실한묘목이생산됨을알수있었다. Number of root (No./indi.) C ont IAA IBA NAA IAA IBA NAA 1y 2y Gt Gnt Tretment regime 그림 발근된뿌리의평균수. Gt: 포도당전처리, Gnt: 포도당무처리, Cont; 대조구, IAA; β-인돌 초산, IBA; β- 인돌낙산, NAA; α- 나프타린초산, 1y; 2년생묘목채취 삽수, 2y; 성목의 2 년생삽수

61 ( 다) 발근된삽수의근장 발근된뿌리의길이는포도당전처리를하지않은실험군에서는 IBA가 16.9cm 로가장길게발근하였으며, IAA는 8.0cm, NAA는 10.4cm로 IAA와 NAA의경우 대조구에비해유의적인차이가없었으나, IBA의경우 2.3배유의적으로길게신장 하는것으로조사되었다. 포도당처리유무에따른실험에서는 IAA가포도당처리 보다처리하지않은경우가약 2 배정도길게신장하였고, IBA는포도당처리에따 른유의적인차는보이지않았다. NAA에있어서도포도당처리구에서 10.4, 무처리 에서 14.8cm로길게신장하는것으로조사되었으나유의적인범주에는속하지않았 다. 전체적으로는대조구와비교하여볼때, 포도당전처리보다는무처리가보다더 길게뿌리길이의신장에효과적이며, 그중에서도 IAA가가장효과가큰것으로조 사되었다( 그림 1-16) Root length (cm) Cont IAA IBA NAA IAA IBA NAA Gt Gnt Tretment regime 그림 발근된뿌리의평균길이. Gt: 포도당전처리, Gnt: 포도당무처리, Cont; 대조구, IAA; β-인돌초 산, IBA; β- 인돌낙산, NAA; α- 나프타린초산

62 ( 라) 발근된삽목의근직경 발근된뿌리의직경은전체적으로 0.7mm에서 1.1mm 사이였으며, 이러한차이는 발근이신장이덜진행된대조구및포도당전처리구의 IAA 의경우, 다소굵은경 향을, 신장이양호한 IBA와 NAA 의경우다소얇은경향을보였다( 그림 1-17). Root diameter (mm) Cont IAA IBA NAA IAA IBA NAA Gt Gnt Tretment regime 그림 발근된뿌리의평균직경. Gt: 포도당전처리, Gnt: 포도당무처리, Cont; 대조구, IAA; β-인돌초산, IBA; β- 인돌낙산, NAA; α- 나프타린초산. ( 마) 삽수의상태변화 그림 1-18 은삽목한삽수의상태변화를조사한것이다. 대조구포도당전처리 와무처리의 IAA는발근되지않은상태에서삽수가살아있는무발근생존율은 33.0%, 33.0%. 31.0% 로처리구에따라거의변화가없는결과를보였다. IBA의경 우포도당전처리구및무처리구에서각각 2.0% 로매우낮게나타났으며, NAA는 포도당전처리구및무처리구에서각각 9.0% 와 11.0% 로나타났다. 이러한결과는 황칠나무삽수가장기간에걸쳐무발근상태에서생명이유지되는특이한수종인 것으로밝혀졌으며, 이러한특징은삽수의발근상태를수시로모니터링하여발근 에적절한계속적인처리를통해최종발근율을높일수있는하나의기회를제공 하는것이라할수있겠다( 그림 1-18)

63 Rooting, non-rooting, dead-- 100% 80% 60% 40% 20% 0% Rooting No rooting Death Cont IAA IBA NAA IAA IBA NAA Gt Gnt Tretment regime 그림 삽목한삽수의발근, 무발근생존, 고사율. Gt: 포도당전처리, Gnt: 포도당무처리, Cont; 대조구, IAA; β-인돌 초산, IBA; β- 인돌낙산, NAA; α- 나프타린초산. 라. 종자를이용한묘목생산 (1) 연구방법 ( 가) 종자채집지의개황 황칠나무종자는전라남도완도군완도읍에서채취하였다. 완도지역의황칠나무 자생지는해발 30~280m 사이에분포하고, soil 경사도는 5~15 로완만한장소에서 생육하고있다. 황칠나무가자생하고있는방향은주로동남향에분포하고, 지형은 사면에자생하며, soil은유기물이풍부한 soil으로회색빛을띤적습한 soil 이다. 기상자료( 기상청한국기후표 1971~2000) 는실험실에서의파종시기를선택하기 위해완도와서울의기상조건을관련지어비교, 검토하였다. 완도는연평균기온이 14.0, 일최저기온 10.7 이며, 서울의연평균기온은 12.2, 일최저기온은 8.2 로

64 완도지역이서울에비해연평균기온은 1.8, 일최저기온은 2.5 높다. 온량지수 (WI) 는완도가 ㆍ month, 서울이 ㆍmonth 이고, 연강수량은완도가 mm, 서울이 mm 이다. 표 1-9. 서울과완도지역의기상요인 요소 기온 ( ) 평균최고최저 강수량 (mm) 평균습도 (%) 일조합 (hr) 서울 완도 자료) 기상청한국기후표 1971~2000 먼저크게종자를채종하여곧바로발아실험에실시하는미저온처리실험군과 저온처리후실험하는저온처리실험군으로구분되며, 저온처리전실험군은다시 과육을제거한실험군, 과육을제거하지않은실험군으로구분되고각각은다시토 양에파종한것과발아실험에사용되는필터페이퍼배지를사용한것으로나뉘며, 구분된모든실험군은 10, 15, 20, 25, 30 의온도처리구범위에서진행된다. 저온 처리실험군은습냉처리와건냉처리로구분되고각각은토양과필터페이퍼배지를 사용하여 10, 15, 20, 25, 30 의온도처리구에서의발아적온탐색을실시하고그 와더불어야외파종실험이추가된다. 이와함께과육을제거하지않은상태로저 온처리한종자를과육을제거하고파종한것과제거하지않고파종한것으로구분 하여과육의제거, 건습저온처리, 과육파종, 과육제거파종등다양한상황에서의황 칠나무종자의발아특성을파악하였다( 그림 1-19)

65 그림 황칠나무종자발아실험계획

( 나) 종자채취및선별 황칠나무의꽃은가지끝에 20-30 개의작은소화로구성된산형화서이며, 6월경 에개화하여대부분은그대로결실하여총상의과실이성숙된다( 그림 1-20).

이러한이유로실험이나묘목생산에사용할종자를채취하기위해서는결실율 을높이기위해일반적으로살균제를살포하는방법이이용되고있다. 살균제를살 포하지않을경우, 과실은장마기의종료즈음에많은부분세균에감염되어결실 율이현저히감소하게된다.

66 ( 나) 종자채취및선별 황칠나무의꽃은가지끝에 개의작은소화로구성된산형화서이며, 6월경 에개화하여대부분은그대로결실하여총상의과실이성숙된다( 그림 1-20). 하지만 자연상태에서종자는거의성숙이완료되기직전에여러가지곰팡이에의해결실 율이매우낮은관계로묘목생산이나실험에이용가능할정도의건실한종자를얻 는것은쉽지않다. 또한결실된과실도다양한새에의해피식되므로피식을방지 하기위한특별한보호수단이필요한것으로알려져있다. 그림 황칠나무의과실. 이러한이유로실험이나묘목생산에사용할종자를채취하기위해서는결실율 을높이기위해일반적으로살균제를살포하는방법이이용되고있다. 살균제를살 포하지않을경우, 과실은장마기의종료즈음에많은부분세균에감염되어결실 율이현저히감소하게된다. 본발아실험에사용된종자역시이러한종자채취를 위해살균제를처리하여얻은것으로수령 20년정도의모수에서 11월중순채취하 여사용하였다. 황칠나무종자는과육으로둘러싸여있으며한개의과실에는정상적으로여물 지않은볍씨정도크기의종자가 5(4) 개들어있다. 과육형태로채취된종자는과육 처리구용만을남기고나머지는과육을제거하였으며, 과육성분이묻은종자는흐르 는물로 3회정도수세하여남은과육성분을완전히제거한상태에서실험처리에 사용하기전까지건조를방지하기위해물을적신거즈로덮어 4 냉장고보관하 였다( 그림 1-21)

그림 1-21. 과육이제거된황칠나무의종자. 종자는길이약 9-11mm, 폭 3-4mm 정도의 크기로볍씨와흡사한모양을가짐.

67 그림 과육이제거된황칠나무의종자. 종자는길이약 9-11mm, 폭 3-4mm 정도의 크기로볍씨와흡사한모양을가짐. ( 다) 비저온습처리에대한발아능반응 채취된종자는과육상태의발아능력과과육제거후발아능력으로구분하여실험하 였고각각은다시필터페이퍼와토양을배지로이용한것으로구분하여총 4개의 처리구로구성되었고, 이것을각각 10, 15, 20, 25, 30 로유지되는암조건의 growth chamber 에파종하였다

종자의파종은필터페이퍼배지이용의실험의경우, 직경 9cm의 petri-dish에

68 그림 저온처리전의종자발아실험. 저온처리전발아실험은과육제거유무, 토양배지사용유무로구분하여실시. 종자의파종은필터페이퍼배지이용의실험의경우, 직경 9cm의 petri-dish에 필터페이터 2장을깔고종자를파종한후증류수 10ml을공급한후가각의처리온 도가유지되는 growth chamber 에서실시하였다. 파종한후에는종자가건조되지 않도록상시스프레이로물을분사하여보충하였다( 그림 1-22). ( 라) 저온처리가황칠나무종자의발아능력에미치는영향 1 습냉처리 2mm 체로친담수산모래를수돗물을이용하여 5번정도청결하게씻어불순물 을제거한모래 15리터를준비하여 17리터의플라스틱용기에담아습냉처리용매 립상을만들었다. 12월 12일매립상에준비한모래중 500ml을덜어과육을제거한

69 종자와제거하지않은과실상태의종자로두그룹으로나눠각각에대해모래와균 질하게섞은것을처리물이흩어지지않도록망사주머니에넣어매립상에남은모 래에깊이 8cm 정도에묻은후 4 가유지되는항온냉장고에처리하였으며, 처리 3 개월, 4 개월, 5 개월이지난후일부를꺼내발아실험에사용하였다. 2 건냉처리 과육을제거한종자중건냉처리할종자들은모래와같이두어물기를제거한 후모래를제거한종자만을종이봉투에담아 3개월간 4 냉장고에보관하였다. 건냉처리는일반적으로과육이황칠종자의발아를억제하는경우가문헌적으로 보고된바, 과육을제거한종자만을대상으로실시하였다. 수세한종자를건조시킨 후종이봉지에넣어 4 의냉장고에처리하였다. 3 저온처리한종자의발아습성 저온처리에사용한종자는기온이상승하기시작하는 4월생장실을이용한 10, 15, 20, 25, 30 온도조건에서의항온발아실험과함께야외의토양에직접파종하 여기상조건의변화에따른발아습성을파악하였다. 야외에서의종자파종은자연 군락상태의황칠나무가자체가매우어두운곳부터완전히노출된광조건에서발아 정착하기때문에광조건은노출지와차광막을이용하여 75% 광이차단된조건에서 실시하였다. 종자를파종할파종상은돌, 낙엽과같은이물질을제거하여고른토양 만이남은상태에서편평하고고른후종자를파종하고모래로덮어종자가안정성 을유지하도록한다음볏짚을덮어건조로부터보호하도록하였다. 가항온조건에서의발아특성파악 종자는암조건하의각각 10, 15, 20, 25, 30 의항온기에처리하였다. 이때각 온도별로 petri-dish에 filter paper를깔아잡균의오염이방지되도록처리한실험구 와 filter paper위에보길도의황칠나무생육지에서채취한토양을넣어파종한실험 구로구분하였다. 생육지의토양을처리한것은종자의잡균저항을파악하기위한 것으로야외파종의영향을파가하기위한처리였다. 각처리구당 25립씩 3반복하여 파종하였으며, 발아실험중종자가건조하지않을정도인 sprayer를이용하여 2일에 1 회수분을보충하였다. 발아율조사는육안으로보아유근이약 1mm 이상생장한 개체를발아한것으로간주하였다

70 나야외조건에서의발아습성파악 야외조건에서의발아습성파악을위한파종시기는완도에서일부일반농가들이 종자를파종하는시기인 3월중순의온도조건과일치하는서울기온을조사하여비 슷한온도대가시기인 3 월말로결정하였다. 과육이부착된상태로냉습처리한종 자를항온기에서꺼내 50% 는과육을제거하고, 나머지는과육이부착되어있는상 태로종자를 2008년 3월 30일에발아실험용배양포트에 1 차파종하였으며, 과육을 제거에따른발아특성을파악하기위해하여습냉처리한종자도동일한조건에파 종하였다. 또한저온처리한기간이발아능력에미치는영향을파악하기위해 5월 중순 2 차로저온처리를계속해온종자를파종하여발아율을조사하였다. 야외조건에서의파종은준비한종자를가로 45cm, 세로 28cm, 깊이 8cm의사 각형묘목배양포트에밭토양을채워, 충분히물을준후, 깊이약 1cm의구멍을뚫 은후한개의구멍에한개의종자를처리구당 50립씩 3 반복형태로파종하였다. 파종한포트는광노출구와 였다. 75% 차광구로구분하여수분이마르지않도록관리하 표 서울과완도지역의월평균기온 지역 시간 1월 2월 3월 4월 5월 6월 7월 8월 9월 10월 11월 12월 서울 완도 온도 ( ) 서울완도 월 2 월 3 월 4 월 5 월 6 월 7 월 8 월 9 월 10 월 11 월 12 월 시간 ( 월 ) 자료) 기상청한국기후표 1971~

71 그림 야외에서의황칠나무직파실험. 파종후조류에의한교란피해를 방지하기위해교란방지망을설치. 그림 발아된황칠나무종자. 항온조건에서의발아반응( 위), 야외조건에서의발아반응( 아래)

72 (2) 황칠나무종자의발아능력실험결과 ( 가) 항온조건에서의발아반응 1 과육의유무 실내실험에서과의유무에따른발아율측정결과황칠나무종자의과육을제거 한처리구의발아율이평균 6.5% 로과육을제거하지않은처리구의 0% 보다더높 게나타났으며, 과육을제거한처리구에서는배지가 filter paper인경우평균 10.6% 의발아율을보였다. 이중 10 의경우 27% 로가장높았으며, 25, 30 에서는발 아가이루어지지않았다. 배지가토양인경우, 평균 2.4% 의발아율을보였고, 20, 25 에서 6% 로가장높았으며나머지온도에서는발아가이루어지지않아, 토양이 발아율저하에영향이있은것으로나타났다. 100 Germination rate(% Temperature( ) 과육無과육有 그림 Filter paper 에서과육의유무에따른종자의발아율

73 100 Germination rate(% Temperature( ) 과육無과육有 그림 토양배지에서과육의유무에따른종자의발아율. 2 배지의종류 실내실험에서배지의종류에따른황칠나무종자의발아실험결과배지가 filter paper인처리구가발아율이평균15.5% 로배지가 soil인처리구의 1.4% 보다높게나 타났다. 이는건냉처리, 과육의유무, 습냉처리기간과같은다른조건들로인해발 아가이루어지지않은경우도포함된수치이며, 발아가이루어지지않은것들을제 외하고는배지가 filter paper인경우발아율이평균 31%, soil인경우 2.9% 였다. 앞 에서밝혔듯이건냉처리한처리구와비저온치러하고과육을제거하지않은처리구, 습냉처리기간이 5 개월된처리구(3 차파종) 는발아가이루어지지않았다. 비저온처리하고과육을제거한처리구의경우 filter paper에서는발아율이평균 10.6%, soil이평균 2.4% 였다. 배지가 filter paper에서는 10 에서 27% 로발아율이 가장높게나타났으며, 30 에서는발아가이루어지지않았다. Soil의경우 20, 2 5 가 6% 로가장높았으며나머지온도에선발아가이루어지지않았다. 냉습처리를 3 개월한처리구(1 차파종) 의경우 filter paper에서는발아율이평균 60.6%, soil이평균 0% 였다. Filter paper에서는 10 에서발아율이 87% 로가장높

74 게나타났으며, 30 가 23% 로가장낮았다. 냉습처리를 4 개월한처리구(2 차파종) 의경우 filter paper에서는발아율이평균 22%, soil이평균 6.2% 였다. filter paper에서는 15 에서발아율이 47% 로가장높게 나타났으며, 30 가 3% 로가장낮았다. Soil의경우 25 가 10% 로가장높았고, 3 0 에서는발아가이루어지지않아가장낮았다. 100 Germination rate(%) Soil Filter Paper Temperature( ) 그림 비저온처리및과육을제거한종자의배지의종류에따른발아율

75 Germination rate(%) Soil Filter Paper Temperature( ) 그림 비저온처리및과육을제거하지않은종자의배지의종류에따른 종자의발아율. 100 Germination rate(%) Soil Filter Paper Temperature( ) 그림 냉습처리(3 개월) 한종자의배지의종류에따른발아율

76 100 Germination(%) Soil Filter Paper Temperature( ) 그림 냉습처리(4 개월) 한종자의배지의종류에따른발아율. 100 Germination rate(%) Soil Filter Paper Temperature( ) 그림 냉습처리(5 개월) 한종자의배지의종류에따른발아율

77 Germination rate(%) Soil Filter Paper Temperature( ) 그림 건냉처리한종자의발아율. 3 저온처리유무 실내실험에서저온처리유무에따른황칠나무종자의발아실험결과저온처리 중습냉처리한처리구의종자의발아율이평균 60.6% 로비저온처리구가평균 10.6%, 건냉처리구가평균 0% 에비해가장높았다. 이는모두 filter paper에서실험 한결과이며 soil에서는발아가제대로이루어지지않아결과비교에사용하지않았 다. 비저온처리구의경우 10 가발아율 27% 로가장높았고, 25, 30 에서는발아 가이루어지지않아가장낮았다. 습냉처리의경우 10 에서발아율이 87% 로가장 높게나타났으며, 30 가 23% 로가장낮았다

78 Germination rate(%) 비저온처리한처리구습냉처리한처리구건냉처리한처리구 Temperature( ) 그림 저온처리유무에따른종자의발아율. 4 냉습처리후파종시기에따른발아특성 실내실험에서습냉처리한종자를시기별로꺼내파종한파종시기의차이에따른 황칠나무종자의발아실험결과습냉처리를 3 개월간진행한처리구(1 차파종) 종자 의발아율이평균 60.6으로 4 개월간진행한처리구(2 차파종) 22%, 5개월간진행한 처리구(3 차파종) 0% 에비해가장높게나타났다. 1차파종의경우 10 에서발아율 이 87% 로가장높게나타났으며, 30 가 23% 로가장낮았다. 2차파종의경우 15 에서발아율이 47% 로가장높게나타났으며, 30 가 3% 로가장낮았다. 3차파종 의경우발아가이루어지지않는것으로나타나다

79 차파종 2 차파종 3 차파종 Germination rate(%) Temperature( ) 그림 냉습처리기간에따른종자의발아율. ( 나) 야외파종실험( 차광유무과과육의차광유무에따른발아특성) 야외파종실험에대한광조건의영향을파악하기위한실험에서 3월말에파종 한 1차실험에서차광처리를한실험구에서과육을제거한후저온처리한종자의 경우 69.2% 로매우높게나타났으나, 과육이제거되지않은성태로저온처리한종 자의경우 15.0% 로과육을제거하여파종한것에비해 4.6 배나낮게발아하였다( 그 림 1-35). 광노출조건에서는과육을제거하지않은경우, 1.7% 로거의발아하지않 는상태를보였으며, 과육을제거한경우에도 9.2% 로매우낮은발아율을보였다. 한편장기간저온처리한종자, 즉늦게파종한 2 차파종기의경우, 과육을제거하지 않은경우에는광노출구의경우, 전혀발아하지않았으며, 차광구의경우에도 0.8% 로매우낮은발아율을보였다. 또한 2차파종기의경우에서과육을제거하여파 종한처리구에서는비차광처리구에서 1.7%, 차광처리에서 26.7% 로과육을제거하지 않은처리구에비해발아율이다소증가되는경향을보였다( 그림 1-36). 이러한결 과를정리하면, 황칠나무는야외파종에있어과육을제거하여저온처리한후정확 한파종시기에파종하고차광처리를해야하는것으로조사되었다

80 100 Germination rate(% 노출구차광구 과육有과육의有無 9.2 과육無 69.2 그림 차광의유무에따른종자의발아율(1 차실외파종실험). 100 Germination rate(% 노출구 차광구 과육有 과육의有無 과육無 그림 차광의유무에따른종자의발아율(2 차실외파종실험)

81 (3) 종자발아실험에대한결과고찰 과육의유무에따른발아율차이는그림 1-25 및 26 과같다. 실험결과과육을 제거하지않은종자에서는발아율이 0% 로발아가전혀이루어지지않았는데, 이는 과육에는하나이상의발아억제물질이존재하며( 김, 1998), 과육의존재는종배의 성장을억제하며, 종자휴면을일으키는중요한억제성분이함유되어있고, 황칠나 무종자는과육을붙인채파종하면발아가이루어지지않다( 김, 1998) 는이전의연 구결과와일치한다. 황칠나무의경우, 난온대성상록활엽수이며, 이러한지역은동 계라할지라도냉온대지역보다비교적온도가높은지역에속한다. 종자의동계에 발아될경우그생존력은매우낮을수밖에없기때문에동께의높은온도에서도 발아를억제하는기작은황칠나무의정착과군락형성에매우중요한요소로생각된 다. 황칠나무과실의과육은부드러운육질로되어있어 4 의저온상태에서도 3 개월정도기간에대부분분해되는특성을보였다. 이는황칠나무과실의과육이 동계에높은온도조건이형성된다고하여도발아를하지못하게유도하고그를통 해종자의생존력을높이려는기작으로보인다. 결국동계기간에만발아를억제시 키나온도가상승하기시작하는춘계에이르렀을때에는과실부패로인해발아억제물질에의한종자발아억제기능은상실되어일시에발아되는특성을보이는것으로판단된다. 이와함께황칠나무종자는다양한새들의먹이로이용되고있는데, 이러한이유로상업적으로황칠나무종자를채취하기위해서는새들로부터과실이 피식되는장치를갖춰야한다. 이러한상황으로판단할때황칠나무과실이새에게 먹히므로서과육이제거되고소화되지않는종자가다양한곳에퍼져다양한환경 에서동계동안자연저온처리되어이듬해춘계에발아되는생태적특성을가진것 으로판단된다. 배지의종류에따른발아율차이는그림 1-27~32 와같다. 비저온처리, 건냉처 리, 습냉처리한처리구의종자를모두 soil과 filter paper 두가지종류의배지에서 실험을진행하였다. 건냉처리한처리구의종자와습냉처리를 5개월이상진행한처 리구의종자등발아율이 0% 로발아가이루어지지않은경우를제외하고는 filter paper 에서발아실험을진행한경우가 soil 에서보다발아율이높았으며, soil의경 우발아가거의이루어지지않았다. 저온처리유무에따른종자의발아율차이는그림 1-33 과같다. 크게비저온처 리한종자와저온처리한종자로나누어실험하였으며, 저온처리는종자를마른상

82 태에서저온보관하는건냉처리와종자의수분을마르지않게유지해주고저온보관 하는습냉처리두가지를해주었다. 비저온처리한종자는채종후 4 냉장고에보 관한다음바로실험을진행하였는데, 실험결과( 그림 1-25, 26) 과육을제거하지않 으면종자의발아가이루어지지않아, 채종후 3개월저온처리를거친종자는과 육을제거한것만실험하였다. 그러므로과육을제거한종자의발아율을비교하였 다. 그결과건냉처리의경우발아율이 0% 로발아가하나도이루어지지않았으며, 냉습처리의경우비저온처리한종자보다발아율이높았다. 이는저온처리를하면 휴면타파에효과가크다( 최, 2001) 는것과일치한다. 냉습처리후파종시기에따른종자의발아율차이는그림 1-32 와같다. 비저온 처리와저온처리한종자의발아율을비교한결과( 그림 1-33) 냉습처리한종자의발 아율이가장높았다. 이실험결과를바탕으로저온처리중냉습처리를하였을경 우발아율이높다는사실을알수있었고, 냉습처리기간은어느정도가적당한지 알아보기위하여한달간격으로종자를파종하였다. 그결과냉습처리를 3개월진 행한종자가발아율이가장높았고, 냉습처리기간이오래될수록발아율이낮아졌 다. 그리고냉습처리기간이 5 개월을넘자발아가진행되지않았다. 이는냉장시간 이길어질수록발아가지연된다는( 김운섭, 2004) 기존의연구결과와일치한다. 차광의유무에따른종자의발아율차이는그림 1-34 과같다. 실험결과차광을 해준종자가빛에그대로노출된종자에비해발아율이높았다. 황칠나무는두릅나 무과에속하는식물이다. 빛과황칠나무종자의발아의상관관계를알고자두릅나 무과의식물들을찾아보았다. 대표적으로인삼을들수있는데, 인삼의경우직사광 선을막고온도와습도를관리해주기위하여해가림이란구조물을사용한다( 농진청, 2000). 그리고두릅나무과의또다른식물은음나무의경우도빛의종류와강도에 따라종자의발아에영향을받는다( 이성규, 2004). 이러한문헌들을볼때두릅나무 과의종자발아와발생에빛이영향을미치는것으로생각된다. 과육의유무에따른종자의발아율은그림 1-35 와같다. 실내실험과마찬가지로 과육을제가한종자의발아율이높았다. 하지만실외실험에서과육을제거하지않 은종자에서적은수지만발아가이루어졌는데, 이는실내실험의결과( 그림 1-24, 25) 을바탕으로과육이제거되기전에는종자의발아가힘들다고판단하여, 습냉처 리기간에는과육을제거하지않았으나파종직전과육을제거하였기때문으로생각 된다

83 실내실험에서모든처리구의종자들을 10, 15, 20, 25, 30 등각기다 른온도로나누어실험하였지만, 뚜렷한경향성을보이지않았다. 이는미생물에의 한종자의오염때문이라생각된다. 이러한결과들을종합해보았을때실내실험에서의주어진여러가지요인들이 황칠나무종자의발아에관여하는것으로생각되며, 과육을제거한상태에서 3개월 간습냉처리한종자를 filter paper에파종하는것이실외실험의경우역시주어진 요인들이황칠나무종자의발아에관여하는것으로생각되며, 과육을제거한상태 에서 3개월간습냉처리한종자를차광을해주어파종하는것이가장높은발아율을 얻을수있다. 이와같은실험결과는이번실험에서주어진여러조건들이종자의발아에영향 을미친다는것을보여준다. 그리고이것은본연구의목적인경제적가치가있으 나산업적으로육성하기어려운황칠나무의충분한물량확보를위해생산량을증 가시키고, 황칠나무자생지의분포와생육환경을파악하며, 증식방법과재배환경을 찾고자하는것에이연구결과가도움이될것이라는것을보여준다

84 3. 3 차년도연구결과보고서 가. 연구개발목표 3 차년도 황칠나무의대량증식방법개발 - 유효농경지( 논) 의황칠나무재배적합지로의응용연구 나. 연구개발수행내용 - 종자의채취시기와발아율측정 - 종자의휴면타바방법검색 - 호르몬처리에따른삽목재의발근및활착력시험 - 수전토양의통기율증진을통한생육적합지로의전환방법개발 다. 토양수분함량에따른황칠나무생장반응 토양의수분은토양공극율을결정하는중요한요소이자토양중의영양염류를식 물이흡수하여필요한장소에이동할수있도록하는중요한매질이며, 식물체내 에서다양한생리적기능을수행하는물질이다. 토양의과도한수분은토양공극율 의저하를유발, 대기에서토양으로유입되는기체의유입량을제한하게되며, 이는 식물근계의호흡에막대한지장을초래한다. 일반적으로야외환경에서는충분한 강우, 또는관개직후토양표층은일시수분으로포화되지만, 시간이경과함에따 라중력과모관력에의해포화대의물은건조한층을통해급속히하강하고, 그뒤 에축축한층을남긴다. 이러한축축한층에지속적으로수분이공급되면토양의 공극율은낮은상태를유지하고이는제한된식물( 통기조직이발달한식물) 이외에 의식물은정착, 생육할수없는토양환경으로남게된다. 이러한토양의수분환경 차이에따른특정식물의생장관계에대한자료는해당식물의생육관리에대한가 장기초적인자료가되며, 황칠나무의수액을안정적으로생산하기위한재배지의 확보와재배지의유지관리에있어매우중요한요소라할수있다. 또한이러한토 양수분와식물생장에관한기초자료는휴경논뿐만아니라밭에서의황칠나무의재

85 배관리기술확립에도매우유용한정보가될것이다. 본차년도의연구에서는토양 수분함량차이에대해황칠나무가어떠한생육양태를보이지에대한검증을통해 논토양에서의재배가능성및밭토양에서의물관리에필요한정보를제공하여황칠 나무재배지관리에대한효과적자료를제공함에있다. (1) 토양수분함량에따른논토양에서의황칠나무생존율 논토양의경우표층에는점토의함량이높아통기성이매우불량한경우가많기 때문에황칠나무의재배는매우어려운상황이다. 이러한경우통기성을증진시켜 황칠나무가생육할수있는최소한의토양수분함량이어느정도인가를파악하는것 이일적전제조건이다. 또한일반밭토양에서의황칠나무식재및관리에있어서 도토양의수분관리는황칠나무의생육에매우중요한요인이된다. 이러한황칠나 무의생육관리에있어최적의토양수분함량에대한자료가없어본실험에서는먼 저논토양을대상으로함수량을조절하여황칠나무가어떠한생장반응을보이는지 를조사하였다. 이러한연구는토양수분에민감한황칠나무의생육에적당한토양 수분함량의최적범위를도출하여휴경지의논과밭에재배면적을확대하여황칠수 액생산량의증대를위한기초자료로활용하기위함이다. (2) 논토양의수분함량별실험구및생장측정 수분함량실험구는실험토양을 5%, 10%, 15%, 20%, 30% 구로구분하였다. 구분 된실험구에는직경 210mm, 높이 262mm의포트를각처리구당 9 개, 총 45개를 준비하여토양을 20cm까지채운후각화분에 2년생황칠나무묘목 2그루를이식 하였다( 그림 1-37). 황칠나무이식용포트는수분 5% 처리구의경우, 포트의바닥에직경 5mm의구 멍 17 개를뚫어물빠짐과통기성이양호하도록하였으며, 10%, 15%, 20%, 30% 처 리구의경우포트의바닥에는배수구를뚫지않고바닥에서각각 4cm, 8cm, 12cm, 16cm 높이의측면에만직경 5mm의구멍 8 개를일정간격으로뚫었다. 이는바닥 에서구멍이있는높이까지의토양은배수구가없어배수가되지않기때문에항상 수분포화상태가유지되며포화저장된수분은구멍의상층부토양에원활히공급 되어처리에따라토양수분이조절되게된다. 이러한방법으로황칠나무의근권에 대한토양수분의차이를조성하며, 이러한실험방법은일반논토양및배수불량토

86 양에대해배수로를확보하여토양의지하수위조절을꾀하고그를통해황칠나무 의생육이가능한토양수분상태를유지하는데필요한방법개발하는데필요한기 초적자료가될것으로판단하여되어응용한것이다. 포트내토양의최상층부의 0 10cm의근권에는각처리구당 1개의수분측정센 서를설치, 상시토양의수분함량을측정모니터링하였다. 하지만강우가발생하였 을경우강우정도에따라모든실험포트는동일한토양수분환경이되지만, 강우 가끝난후에는점차원래의토양수분함량으로복귀하였다. 장마기의경우, 장기간 에걸쳐모든처리구에서과도하게수분이포화되는것을방지하기위해실험구전 체를비닐로덮어빗물을차단하였다. 이러한처리를통해토양수분 5% 의경우는 육안상으로도토양표면이견고하게건조되어있는상태를확인할수있었으며, 반 대로 30% 의경우는토양표면에수분기가비치는것을육안으로도확인가능한상 태였다. 이러한범위는휴대형토양수분함량측정기를이용하여벼농사를재배하지 일반논에서측정한토양수분범위와비슷한수준이었다. 실험포트의수분공급은각각의수분처리구에공급되는수분량에차이를두는 방법으로조절하였으며, 3월에서 5월까지는 3일 15 분, 6 9월까지는 3일 25분정도 자동급수되도록자동급수기를설치하였다. 자동급수기는타이머, 전자밸브, 유량 조절밸브로구성되며, 타이머에의해전자밸브가구동되면수분이실험구전체로 연결되며, 이때각실험구에별도로연결된유량조절밸브는정해진양만큼만각각 의실험포트에수분이공급되도록조절한다. 조절된양의수분은각처리구의개개 포트에연결된 2 개의점적관수용팁에의해직접포트의토양표면에점적된다. 이 러한수분관리와함께내부에위치한실험화분과외부에위치한실험화분간의 피음효과를제거하기위해 2 주에한번위치를교환하였다. 또한황칠나무가분포 하는현지의논토양에배수로를정비한것과정비하지않은처리구를조성하여토 양수분함량조절실험에대한현지적용성을검토하였다

그림 1-37. 토양의수분함량에따른황칠나무반응( 좌) 및수부조절용포트( 우). (3) 조사항목 생장량, 신엽발생량, 엽록소함량, 생존율을조사하여가장적당한조건의토양수 분함량조건을추출하였다.

신엽발생량은새로신장한가지에서발생된잎의엽신이 3cm 이상전개되었을 때를신엽으로보았으면 2주간격으로측정하여초기의부착된기존잎수를기준하 여변화율을계산하였다.

87 그림 토양의수분함량에따른황칠나무반응( 좌) 및수부조절용포트( 우). (3) 조사항목 생장량, 신엽발생량, 엽록소함량, 생존율을조사하여가장적당한조건의토양수 분함량조건을추출하였다. 생장속도는이식직후묘목의직경과높이를측정하여 초기치로사용하였고, 설정하고 2주간격으로하단부직경과수고를측정하여단위 시간동안의황칠나무줄기의체적증가량을생장량으로대신하였다. 신엽발생량은새로신장한가지에서발생된잎의엽신이 3cm 이상전개되었을 때를신엽으로보았으면 2주간격으로측정하여초기의부착된기존잎수를기준하 여변화율을계산하였다. 잎의엽록소함량은 1년생잎과 2 년생잎, 신엽으로구분 하여각각 5 장의잎을선별, 엽당 2 지점의엽록소함량(SPAD-502, minolta) 을 2주 간격으로측정하였으며, 함량은흡광도인 SPAD 값으로나타냈다. 이와함께황칠나 무생육과관련되어있는토양수분, 기온, 지온, 일사량의자료를 data logger를이 용하여수집을꾀하였다

그림 1-38. 배수로정비를통한수전토양에서의황칠나무생육실험. (4) 결과및고찰 ( 가) 토양수분함량에따른황칠나무의수고신장율 토양함수량에따른황칠나무의수고신장율은약 11% 의토양수분함량에서가장 높게나타났으며, 이보다토양수분함량이적어질경우수고생장은급격히저하되 는것으로나타났다.

88 그림 배수로정비를통한수전토양에서의황칠나무생육실험. (4) 결과및고찰 ( 가) 토양수분함량에따른황칠나무의수고신장율 토양함수량에따른황칠나무의수고신장율은약 11% 의토양수분함량에서가장 높게나타났으며, 이보다토양수분함량이적어질경우수고생장은급격히저하되 는것으로나타났다. 이러한최적신장범위의토양수분함량에서양측으로즉, 토양 수분함량이증가하거나감소하게되면줄기신장은크게감소하는것으로나타났 다. 황칠나무의수고신장은또한토양수분함량이 11% 를넘어서는구간에서는 11% 이하의구간에서보이는정도의강도보다는낮지만수고신장율이급격히낮아지는 결과를보였다. 토양수분함량 5% 의낮은토양수분함량은 20% 의경우와유사한신 장율을보였다. 실험결과에서황칠나무수고신장에적당한토양수분함량은 11 15% 범위로조사되었다

89 50 수고 (cm) y = x R 2 = 토양수분 (%) 그림 토양수분함량변화에따른황칠나무의수고신장율. ( 나) 토양수분함량에따른황칠나무의기저면적증가율 황칠나무의기적면적의증가는생장율과밀접히관련되어있다. 토양수분함량에 따른황칠나무의기저면적증가율을보면, 토양수분함량에무관하게시간경과에 따라일정한비율로증가하는경향을보였다. 토양수분함량과기저면적증가율과의회귀분석에서황칠나무의기저면적증가는 토양수분함량이 20.0% 에서가장높은것으로나타났다. 이러한최적범위를벗어난 토양수분함량 5% 부근에서는기저면적증가나타나지않았으며, 30% 이상에서도 매우낮은기저면적증가율을보였다

90 기저면적 (cm 2 ) % 11% 15% 20% 31% /30 4/13 4/27 5/11 5/25 6/8 6/22 7/6 7/20 8/3 8/17 8/31 9/14 9/28 10/12 날짜 (2008) 그림 토양수분함량에따른황칠나무의기저면적증가추이 기저면적증가율 (%) y = x x R 2 = 토양수분 (%) 그림 토양수분함량변화에따른황칠나무의기저면적증가율

91 ( 다) 토양함수량에따른황칠나무의생장량 논토양의토양수분함량차이에따른황칠나무의생장량은토양수분 20% 에서초 기치보다약 291% 의생장량증가하여처리구중가장높게나타났으며, 다음으로 토양수분 15% 에서 279%, 토양수분 11% 에서 243%, 토양수분 31% 에서 160%, 토양 수분 6% 에서 142% 순으로낮게나타났다. 이러한차이는실험개시초기에는큰 차이를보이지않았으나, 7월중반에들어서면서부터처리구간에확연한차이를 나타내었다. 11% 의경우 6% 와마찬가지로 7월중반까지는비슷한생장양상을보이 다가 8 월에접어들면서부터생장속도가빠르게증가, 최종적으로는 31% 보다높은 생장량을보였다. 이러한결과를바탕으로한생장량과토양수분과상관관계를분 석한결과에서는토양수분함량에따라황칠나무의생장은매우높은영향을받는 것으로나타났다. 실험결과에서최적의생장속도를보이는토양수분함량범위는 약 13% 에서 26% 인것으로나타났으며, 이러한범위에서황칠나무는실험초기치에 대해약 250% 이상의높은성장량을보였다. 또한황칠나무에있어생육에가장적 합한토양수분함량은 17.4% 로계산되었다. 이러한황칠나무의생장결과에서토양수분함량이황칠나무의생장에미치는영 향에서토양함수량이최적생장량범위보다낮아질경우, 줄기의신장은높아지는 경향이있는반면기저면적이증가하지않았으며, 반대로토양수분함량이높아질 경우, 기저면적은증가하지만수고신장이낮아지는결과를보였다. 이러한상반되 는두경우의결과로나타나는최종적인황칠나무의생장율은토양수분함량이약 17% 일때가장빠르게생장하는것으로조사되었다. 이러한결과들로볼때논토양의경우, 배수가양호하도록배수로를정비하여토 양수분함량을약 19% 정도로유지되도록할경우, 최적의생장량을보일것으로 판단된다

92 % 11% 15% 20% 31% 체적 (cm 3 ) /30 4/13 4/27 5/11 5/25 6/8 6/22 7/6 7/20 8/3 8/17 8/31 9/14 9/28 10/12 그림 날짜 (2008) 논토양의수분함량에따른황칠나무의체적증가 생장율 (%) y = x x R 2 = 토양수분 ( %) 그림 논토양의수분함량과황칠나무의생장관계

( 라) 논토양의수분함량과황칠나무잎의엽록소함량 1 2 년생잎의엽록소함량변화 2 년차잎의엽록소함량은시간경과에따라빠르게낮아지는결과를보였다. 실 험개시후약 3개월까지모든처리구에서엽록소함량은감소하는경향을보였지 만, 토양함수량 6%, 11%, 15%, 20% 처리구에서는감소속도가현저히완화되어거 의같은양을유지하였다.

93 ( 라) 논토양의수분함량과황칠나무잎의엽록소함량 1 2 년생잎의엽록소함량변화 2 년차잎의엽록소함량은시간경과에따라빠르게낮아지는결과를보였다. 실 험개시후약 3개월까지모든처리구에서엽록소함량은감소하는경향을보였지 만, 토양함수량 6%, 11%, 15%, 20% 처리구에서는감소속도가현저히완화되어거 의같은양을유지하였다. 토양수분함량 15% 처리구의경우, 그차이는크지않지 만엽록소함량이회복되는경향을보이기도하였다. 하지만토양수분함량 31% 처 리구에서는감소경향이지속되어실험개시후 5개월경과한시점에서는정상적인 식물잎에서찾아볼수있는녹색을거의찾아볼수없는정도로갈변한상태로 전환되었다. 실험개시후약 5개월이경과한시점에서의엽록소함량을보면 토양함수량 6%, 11%, 15%, 20%, 31% 의실험개시초기엽록소함량값은각각 32.4, 32.9, 35.5, 29.4, 29.4에서 5개월후각각 13.4, 12.8, 14.4, 10.2, 1.2로낮아져초기에 비해 41.3%, 39.0%, 40.6%, 34.9%, 3.9% 수준으로감소하는것으로나타났다. 이러 한수치는동일황칠나무묘목의 1년생잎과당해연도전개잎에비해현저하게낮 은수치로토양함수량차이에따른잎의활성저하가신엽보다는성숙잎에더큰 영향을주는것으로보여진다. 그림 토양함수량 30% 조건에서의황칠나무 2년생잎의엽록소함량 저하

94 % 11% 15% 20% 31% Measured SPAD vale /30 4/9 4/19 4/29 5/9 5/19 5/29 6/8 6/18 6/28 7/8 7/18 7/28 8/7 8/17 8/27 9/6 Date(2008) 그림 토양수분함량차이에따른 2 년생잎의엽록소함량변화. 2 1 년생잎의엽록소함량변화 1년생잎은 2 년생잎에비해비교적낮은엽록소감소경향을보였다. 실험개시 와함께 2년생잎에서보인경향과유사하게모든처리구에서엽록소함량이저하 되기시작했으나, 6 월중순에접어들면서감소경향은현저히완화되었고, 토양수분 함량 15% 의경우에서는 8월에접어들면서부터는오히려점차로증가하여실험초 기와의차이가현저히줄어드는결과를보였다. 하지만토양수분함량 31% 처리구의 경우, 실험개시약 4개월이경과한 7월말부터는엽록소함량이그속하게감소되 어 8 월말에는황변하여줄기에서이탈되었다. 토양함수량 6%, 11%, 15%, 20%, 31% 의처리에대해실험개시초기엽록소함량(SPAD vale) 은각각 33.0, 31.1, 36.4, 28.6, 29.3 이었으나, 실험개시 5개월후인 9월초에는 20.0, 23.9, 27.1, 15.9, 0 낮아졌으며, 이를백분율로계산하면초기수준의 60.6%, 76.8%, 74.8%, 55.4%, 0% 에해당하는수치이다

95 Measured SPAD vale % 11% 15% 20% 31% 5 0 3/30 4/9 4/19 4/29 5/9 5/19 5/29 6/8 6/18 6/28 7/8 Date(2008) 7/18 7/28 8/7 8/17 8/27 9/6 그림 년생잎의엽록소함량변화. 3 당해연도신엽의엽록소함량 당해연도전개한신엽의경우, 신엽이전개와함께엽록소함량은빠르게증가하 여실험개시 5개월후의시점에서는토양함수량 6%, 11%, 15%, 20%, 31% 의처리 구에서의엽록소함량(SPAD vale) 은각각 50.8, 50.9, 49.4, 42.5, 25.1로토양수분함량 31% 처리구를제외한모든처리구에서높은값을보였다. 토양수분함량 31% 처리 구의경우, 실험개시약 3개월후까지는다른처리구와유사한경향으로증가하는 양상을보였지만, 3개월이경과한시점에서는거의증가하지않는상태를유지하였 다

96 % 11% 15% 20% 31% Measured SPAD vale /30 4/9 4/19 4/29 5/9 5/19 5/29 6/8 6/18 6/28 7/8 7/18 7/28 8/7 8/17 8/27 9/6 Date(2008) 그림 당해연도신엽의엽록소함량변화. ( 마) 토양함수량처리에따른 1 년생, 2년생잎의잔존율및신엽의전개 토양함수량처리에따라 1년생및 2년생잎의잔존율은모든처리구에서빠르게 감소하였다. 1 년생잎의경우, 실험개시약 5개월이경과한시점에서는황칠나무 묘목의잎수는토양함수량 61.9%, 42.6%, 0% 로감소하였다. 6%, 11%, 15%, 20%, 31% 의처리구에서각각 43.6%, 2 년생잎의경우, 43.3%, 35.9%, 40.8%, 40.2%, 8.0% 로모든처리구에서약 60% 정도가탈락했으며, 특히, 토양수분함량 31% 의처리구에서는 8% 의잎만이탈락되 지않고잔존하는결과를보였다. 하지만이러한 1년생및 2년생잎의탈락은노지의묘목을실험용포트에이식 한당해연도실험인관계로탈락의정도가높은결과를보인것으로판단되면, 이 러한토양수분함량의정확한결과를위해서는지속적인관찰이필요할것으로판단 된다. 토양수분함량에따른단위식물체적( 바이오매스) 당신엽전개율은토양함수량

97 6%, 11%, 15%, 20%, 31% 의처리구에대해각각 14.5, 18.1, 13.1, 9.3, 5.5로토양함 수량 11% 처리구에서가장높게나타나, 토양함수량증가가신엽발생을억제하는 것으로나타났다 % 11% 15% 20% 31% Leaf number/biomass /30 4/9 4/19 4/29 5/9 5/19 5/29 6/8 6/18 6/28 7/8 7/18 7/28 8/7 8/17 8/27 9/6 Date(2008) 그림 토양함수량차이에따른황칠나무의 2 년생잎잔존율

98 Le af n u m be r/biom as % 11% 15% 20% 31% 3 /3 0 4 /9 4 /1 9 4 /2 9 5 /9 5 /1 9 5 /2 9 6 /8 6 /1 8 6 /2 8 7 /8 7 /1 8 7 /2 8 8 /7 8 /1 7 8 /2 7 9 /6 Data(2008) 그림 토양함수량차이에따른황칠나무의 1 년생잎잔존율 % 11% 15% 20% 31% Leaf number/biomass /30 4/9 4/19 4/29 5/9 5/19 5/29 6/8 6/18 6/28 7/8 7/18 7/28 8/7 8/17 8/27 9/6 Date(2008) 그림 토양함수량차이에따른황칠나무의당해연도신엽발생율

99 2 0 잎수 / 식물체적 (No./ cm 3) y = x R 2 = 토양함수량 ( %) 그림 토양함수량차이에따른황칠나무의식물체적에대한잎의수. 토양함수량차이에대해황칠나무는토양함수량이높아질수록단위식물체적당 신엽발생율및전개한잎의엽록소함량저하, 그리고기존 1년생및 2년생잎의탈 락율증가, 엽록소함량의급격한저하를통해성장의기반이되는묘목개체의광 합성체계가현저하게약화되며, 그로인해성장량이저하되고, 결국고사하는것으 로조사되었다. 현지의논토양에이식한실험에서물고랑을깊이파배수를양호하게처리한실 험구에서는그림에서보는바와같이생육상태가개선되는효과를얻었다. 따라서 위치적으로자연배수가불량한논의경우를제외한일반적인논에서의경우, 배수 가양호하도록배수로를깊게정비하는것만으로도충분히황칠나무의재배가가능 하리라판단된다. 하지만, 토양수분조절실험에서나타난바와같이토양의수분함 량증가는잎의엽록소함량저하, 신엽전개억제등의결과를초래하므로토양수 분함량이약 17% 정도로유지되도록토양관리가필요하다. 밭에서의경우도, 마찬 가지로황칠나무가최적성장을보이도록하기위해서는토양수분의관리에주의할 필요성이제기된다. 특히, 토양수분관리에있어서는건조한상태보다는습한상태 가더욱치명적인성장저해결과를가져오므로토양수분함량이최대 않도록관리할필요가있다. 25% 를넘지

100 그림 논에서의배수불량( 좌) 과배수가양호한토양( 우) 에서의 황칠나무생육차이

101 제 2 절세포주를이용한황칠수액의독성및기능성효 과연구 ( 제2세부 1 연구과제) 1. 1 차년도실험내용및고찰 가. 연구개발목표 1 차연도 Melanocyte 세포주를이용한황칠원액의미백효과연구 - 인간섬유아세포세포주를이용한황칠원액의광외인성피부노화저해효과연구 나. 연구개발수행내용 - 섬유아세포배양및황칠의세포독성측정실험: 황칠원액을세포에처리하고 배양하여 MTT 분석수행 - 쥐흑색종양세포주배양과멜라닌생성량측정: 쥐 melanoma에황칠원액을 처리하고배양하여변화한멜라닌양을흡광도로분석 - Human foreskin fibroblast cell line을이용한 MMP (Matrix Metallo proteinase) 1,2 저해활성검색계확립 - 멜라닌감소에대한황칠의분자유전학적인기전연구: 황칠에의한 타이로시나아제(tyrosinase ) 의발현변화측정 다. 연구방법 (1) 세포주배양 미백기능성을분석실험에서사용된세포는인간신장상피세포인 Melanocyte B-16 F1, F2 세포주, 293T과마우스 노화기능성효과연구에사용된세포는인간 fibroblast 를사용하였다. 위의모든세포들은 Dulbecco s Modified Eagle's Medium (DMEM)(Gibco, Grand island, USA) 에서배양하였으며, Penicillin-Streptomycin (Welgene) 항생제를 100 μg/ ml농도로처리하였고, fetal bovine serum(gibco) 을 10%(v/v) 의배지조건을만들었다. 이배지를이용하여세포는배양온도 37, 95%air/ 5% CO₂의조건하의 CO₂incubator 에서배양되었다. 세포를배양하여

102 100mm flask에포화상태가되면 1x Phosphate Buffered Saline(Sigma-Aldrich, Missouri, USA) 를가하여세척하고 Trypsin으로세포를 flask에서떼어세포를수 확한후새배지에넣어계대배양하였다. (2) 시약처리 성숙한세포를이용하여미백효과를알아보기위하여 80% 에탄올추출물에서 동결건조한황칠 powder를 mg/ml의비율로 DMSO에녹여각각의농도별로처리 하였다. Hydroquinone(HQ) 을 Et-OH에용해시켜 0.5M HQ stock solution을만들 고 working concentration으로 50uM, 100uM의 HQ과 Linoleic acid(la, 18:2n-6) 도 Et-OH에녹여서 50mM의 LA stock solution을만들어 -20 에보관하여 working concentration으로 25uM, 50uM의 LA을각각 control 로사용하였다. (3) 세포 UV 조사법 인간 fibroblast 세포는시약전처리전, cell cycle을맞추기위하여세포를 를 100mm dish 분주하고 16시간배양후 1x PBS 로세척하였다. UV-B를각각 100, 150J/Cm 2 노출시킨후, 각시간대별로배양한다. Medium 을제거후, 1x PBS 로세척하여 cell scraper를이용하여세포를걷어내고 200ul의 RIPA lysis buffer로 lysis 한다. 13,000rpm, 4 에서 10분동안원심분리하여 supernatant 를옮긴후, Bradford assay 를이용하여단백질정량을하였다. (4) 멜라닌양측정법 각세포는 HQ과황칠을처리하여 2일동안 37 로배양하였다. 세포 pellet은 ph7.5, 2mM EDTA, 150mM NaCl, 1% Triton-X 100으로만들어진 50mM Tris buffer인 1,0ml extraction buffer 에서용해하였다. 상층액은 BCA protein assay kit 로실행되는 protein assay 에사용되었고, 1.0ml extraction buffer에서 melanin pellet은 30분동안 20% DMSO를포함한 0.5ml 2 N NaOH 으로추출하였다. 그리고 ELISA plate reader(model 550 microplate reader, Bio-Rad Laboratories, CA) 로 450nm에서각샘플의 optical absorbance 를측정하였다. (5) 일시적유전자도입법 (DNA transfection) 세포내에서일시적인유전자발현을보기위하여 Calcium Phosphate 유전자도 입방법을사용하였다. 인간신장세포인 293T의경우 6well multiplate에 3~5 10 ⁵ cell/well, final volume 2ml 로세포를분주하고, DMEM 성장배지로배양하였다

103 유전자도입 3시간전에새로배지를교체하여주고 Mock을제외한나머지 well에 internal control로 prl-sv40 50ng과함께 reporter 인 TYR wt-gfp를도입하였 다. Total DNA 총량의보정을위하여 reporter 활성과상관없는관계가없는 pcdna 3.1를함께넣어각 well당총 DNA를 2 μg로고정시키고각 well 마다 reporter DNA 는다른비율로넣었다. DNA에 DMEM 72μl와 2.5M Cacl 2 8 μl 섞어 100 μl를만들고 2X HBS 100 μl와섞어서침전완충용액을만들어실온에서 10~20분놓아두었다가각 well에천천히떨어뜨리면서잘섞어준다음 37 에서 12 시간동안배양한뒤새로배지를교체하면서 100uM HQ과 10ug/ml 황칠을처 리하였다. 유전자도입 48~72 시간이후에형광현미경관찰을수행하였다. (6) Green Flurorescent protein 양측정 Transient transfection을통하여 Tyrosinase promoter로부터발현되는 Green Flurorescent protein을관찰하기위하여유전자도입 48~72 시간동안배양된세 포를 1x PBS로세척하여 200x 배렌즈배율조건에서형광현미경으로관찰하였다. (7) MTT assay 96well plate에 , , , 각각의 cell을분주하여 18시간배양한 후, solvent 를적정농도로준비하여첨가한다. 6 시간배양후, tetrazolium salt MTT solution을 10v/v 되도록첨가한다. 1~4시간동안반응시켜 450~470nm wavelength 에서 ELISA assay 를실행한다. (8) SDS-PAGE 및 MMP1 단백질웨스턴분석법 세포획득후 1x PBS 로씻은다음, RIPA buffer(santa Cruz, California, USA) 로세포를융해하여 4 13,000 rpm의원심분리기에서 5분을돌려추출물을얻는 다. 이때, 1x PBS, 1% Nonidet P-40, 0.5% Sodium Deoxycholate, 0.1% SDS가 포함되어있는 RIPA buffer는 10 mg/ ml PMSF, 100mM Sodium orthovanadate, Protease Inhibitor 를따로첨가해사용하였다. 단백질은 Bovine Serum Albumin(BSA) 을표준곡선으로사용하여 Bradford법을이용하여단백질정량을하 였다. 최종단백질을 150μg으로 2x sample buffer 로희석한후, 100 에서 5분동안 열을가하고, 염색약을 2 μl넣어주어젤에넣어줄시료를준비한다. 최종준비된시 료는 10% SDS-polycarylamide 젤에넣어져전기영동에의해크기에따라분리된 다. 그후젤을 Hybond-P' PVDF membrane(amersham Bioscience UK, Buckinghamshire, England) 으로상온에서 2 시간동안옮긴다. 옮긴후, 0.1%

104 Tween-20이첨가된 1x TBS-T에 5% BSA(Santa Cruz) 를녹여상온에서 1시간동 안 Blocking 을실시하고, 1x TBS-T 로씻어준다. 그후각실험마다 1x TBS-T로 1/1000 희석시킨첫번째항체 Human α-mmp1를 1 시간동안붙여준뒤, 1x TBS-T로 3번정도 10 분을씻어준다. 마찬가지로 1/1000으로희석시킨 Horseradish Peroxidase(HRP) 가붙은두번째항체를붙여준뒤, 1x TBS-T 로씻어준다. 단백 질검출은 Western Blotting Luminol Reagent (Santa Cruz) 을이용하여 Agpafilm ECL 에노출시킴으로시행하였다. Blot은 Anti-β actin 항체(1/1000 으로희석, Sigma) 로단백질의정량을대조시켰다. (9) Matrix MetalloProteinases1(MMP1) 의활성도 ELISA분석 UV-B 100J/Cm 2 조건에서노출시킨 Human fibroblsast 세포를분주하고각각의 solvent 를처리한후, 대략 48~72시간배양한세포의배양액을획득하여 Bradford assay 를통하여정량하였다. Matrix Metalloproteinases를확인하기위하여 Human active MMP1 항체가고정된 96well plate를이용하여 ELISA assay 를실행하였다. 라. 결과 (1) 세포주를이용한미백기능성효과연구 ( 가) 황칠용액의멜라닌합성도저해분석결과: spectrophotometer를이용한 melanin 량측정 피부미백과관련하여 melanocyte로부터형성되는멜라닌의변화량이조절되는 기작에는크게 2 가지로, melanocyte로부터형성되는멜라닌분비량을저해시키는것 과이미형성된멜라닌에의해피부의착색화가진행되지않는기작이다. 본연차 의연구에서는미백기능과관련하여황칠추출용액의멜라닌형성저해능력을알아 보기위하여, 황칠용액을처리한 B16 melanocyte 세포주의멜라닌합성도변화를 관찰하였다. 실험에서타이로시나아제 promoter의활성을저해하여 mrna 수준에 서멜라닌합성을조절하는것으로보고되어있는 Hydroquinone(HQ) 을 control로 사용하였다. 72시간동안황칠원액을처리하고세포를배양한후 cell pellet의색변화 를확인한결과, 황칠처리전멜라닌합성으로검은색을띄던 melanocyte의색깔 이확연하게옅어짐을관찰할수있었다( 그림 2.1-1)

그림 2.1-1. 293T와 B16 세포주에 10ug/ml 황칠과 100uM HQ 처리후, 멜라닌합성정도의변화. B16-melanocyte 세포주에황칠을처리한경우, 멜라닌합성정도 가줄어들어세포 pellet 의색이옅어짐을관찰하였다. 다음실험에서, 눈으로확인된멜라닌합성도변화를정량적으로분석하기위하 여세포의 pellet을 lysis 하여세포내멜라닌함량을측정하였다.

105 그림 T와 B16 세포주에 10ug/ml 황칠과 100uM HQ 처리후, 멜라닌합성정도의변화. B16-melanocyte 세포주에황칠을처리한경우, 멜라닌합성정도 가줄어들어세포 pellet 의색이옅어짐을관찰하였다. 다음실험에서, 눈으로확인된멜라닌합성도변화를정량적으로분석하기위하 여세포의 pellet을 lysis 하여세포내멜라닌함량을측정하였다. 세포내에이미합 성된멜라닌을용출시키기위하여세포를 lysis한후원심분리하고멜라닌 pellet과 cell supernatant 로분리하였다. Supernatant는 Bradford assay 로정량하고, 멜라닌 pellet은 extraction buffer로녹인다음 470nm 파장에서 ELISA reader로분석하였 다( 그림 2.1-2). 그결과, 10uM HQ 에서의멜라닌합성량은 (O.D 0.08 수치: 17%), 10ug/ml 황칠에서는 O.D 값 (O.D 0.03 수치: 9%) 으로두경우모두 85% 이상멜라 닌합성량이감소하였다. 여기서흥미로운결과는이미미백기능성물질로보고된 HQ보다도황칠액이멜라닌합성량을 8% 더감소시킨사실이다

106 그림 HQ 과황칠원액을처리한후, 각세포로부터용출 된멜라닌을측정한 O.D 값측정. 마우스 B16세포주에 10uM HQ과 10uM 황칠액을처리한후일정 시간이후의 pigmentation된멜라닌합성량을측정하여수치화 시켰다. 그결과, 황칠용액을처리한군에서멜라닌합성량이현 저하게감소하는결과를확인하였다. ( 나) 황칠용액의 tyrosinase promoter 활성도저해효과측정 생체내에서멜라닌생합성은여러단계에서조절이가능하지만특히 tyrosinase 발현및활성과관련하여많은조절기전연구가진행되어있다. 본연구에서는황 칠용액이 tyrosinase의발현을조절하는 promoter에어떠한영향을미치는지살펴 보기위하여 tyrosinase promoter로부터 Enhanced Green Fluorescent Protein(GFP) 발현벡터DNA(pTryP.PYRwt-GFP) 를 293T와 B16 세포주에 Transient transfection 을하였다( 그림 2.1-3). Human epithelial 293T는 transfection 효율이높 아일반적으로많이사용하는세포주로마우스 B16 세포주에대한 control로사용 되었다. 이러한두세포주에 target DNA를 transfection 하고황칠을처리한후발 현되는 GFP 를형광현미경으로확인한결과, 세포주에서발현된 GFP는세포의 cytosol 부위에서발현되었다( 그림 2.1-4)

107 그림 Tyrosinase promoter로부터 EGFP 발현이가능한 plasmid Map. Tyrosinase 프로모터로부터 Tyrosinase가발 현되면서 C-terminal부분에 Enhanced GFP가 위치하여 Green Fluorescence를발현시키므로 형광현미경으로의관찰이용이하다. 이미보고된논문들에의하면, HQ은 tyrosinase promoter의발현을억제시켜멜 라닌합성을줄인다는결과를볼수있다. 이에본실험에서는 tyrosinase promoter 의발현을억제시키는 positive control 시료로 HQ 을사용하였다. 또한, promoter의 활성을정량화하기위하여 prl-sv40 사용하여세포내주입된 GFP 발현벡터의세 포내도입효율을보정하였다. GFP 발현을나타낸세포의수를정량화하여수치로 나타낸결과, tyrosinase promoter 의발현이낮은경우, HQ보다황칠원액이 tyrosinase promoter 를억제시켜멜라닌합성을더효율적으로감소시킴을알수있 었다( 그림 2.1-5). 하지만 tyrosinase promoter의발현이높은경우 HQ보다황칠원 액이 tyrosinase promoter를억제시키는효율이더높은것으로확인되었는데이러 한현상이실제로인체적용시나타날효율성과어떤연관성이있을지에대하여는 더욱심도있는연구가필요하다

108 그림 현미경을통한 293T 세포에서의 GFP 발현. Transient transfection 후, 세포의 cytosol 부분에서 GFP 발현을확인하였다

그림 2.1-5. 황칠및 HQ 처리에따른 tyrosinase promoter 활성도 의측정. 각용액의처리후발현된 GFP 발현세포수를측정하였다. HQ처리군 에비하여황칠처리군에서의 인된다.

109 그림 황칠및 HQ 처리에따른 tyrosinase promoter 활성도 의측정. 각용액의처리후발현된 GFP 발현세포수를측정하였다. HQ처리군 에비하여황칠처리군에서의 인된다. GFP발현세포의비율이낮은것으로확 (2) 세포주를이용한노화기능성효과연구 ( 가) UV 조사에의한 p53발현의유도 외부조건에서 UV에노출된피부는노화현상과밀접한관련이있음은많은자료 를통하여알수있다. UV는체내에서 vitamin D의합성에결정적인역할을하며 피부질환과많은관련이있음이보고되었는데, 그중하나는세포내 DNA double strand의 break를나타내어피부암을유발하는등 DNA damaging agent로보고되 어있다( 그림 2.1-6). 먼저 DNA damage가나타나면세포내에서는손상을인지하고 복구하려는 pathway가활성화되는데그중에서도 p53이 repair pathway의활성화 가증가된다. 또한 p53의 phosphorylation이나타나면세포손상으로인한피부암유 발이높아진다고보고되어있다. 이에 UV 조사후, DNA damaging 반응의변화를 관찰하고자 p53 단백질발현율을 western 분석법을통하여관찰하였다( 그림 2.1-7)

그림 2.1-6. UV로부터유도되는 DNA damaging pathway.

cycle regulation으로연결되는신호 전달체계가활성화된다 <Ref; Cell signalling>. 그림 2.1-7.

110 그림 UV로부터유도되는 DNA damaging pathway. DNA stress가유발되면일차적으로 phospho-kinase 성화로부터 p53의 phosphorylation이유발되어 cell apoptosis 또는 활 cell cycle regulation으로연결되는신호 전달체계가활성화된다 <Ref; Cell signalling>. 그림 UV-B 조건에서시간차에 따른 p53 단백질변화. Cell cycle에관여하는 p53 유전자는 UV조 사후, 6시간에서 p53의유도가가장뚜렷 하게확인되었다. 그결과, UV조사후 3시간이되면서부터 p53이유도되어 6시간이되면서가장 많은양이발현됨을확인하여광외인성피부노화억제관련실험을위한조건을확

111 인하였다. 이에본실험에서는위의조건을바탕으로광외인성노화에관련한기능성실험을수행하고자한다. ( 나) MTT assay 293T, B16 세포주를이용하여 UV 조사후세포증식에대한황칠용액의영향을 확인하기위하여 MTT assay 를수행하였다. 실험에서 96well plate에 의세포 를분주하고각용액의세포증식의효과를보기위하여 50uM HQ, 25uM Linoleic acid, 1ug/ml 황칠원액을처리하였다. 대조군으로용매만을처리한세포를사용하여 각물질들의세포증식효과를분석한결과, 세가지의물질중두세포모두에서 세포증식의효과를나타낸경우는황칠원액뿐인것으로관찰되었다. HQ의경우 세포주에따라증식증가를효과적으로유도하지못하는경우가나타나기도한반 면, 황칠의경우두세포주에서모두 UV에의한손상을효과적으로회복시켜세포 증식을유도함을알수있었다( 그림 2.1-8). 그림 T 및 B16 세포주의 MTT 분석결과. ( 다) 황칠용액에의한 MMP 1의활성화저해효과 MMP(matrix metalloproteinase protein) 는 embryogenesis, tissue remodeling,

112 wound healing, inflammation, cancer의과정에서중요기능을가지며 extracellular matrix의구성요소를 turnover하는 endopeptidases family 에속한다. 이러한 MMP 는 organic mercurial reaction 또는다양한단백질분해효소에의해 activation되는 데, 그중 MMP1(interstitial collagenase, vertebrate collagenase, fibroblast collagenase and collagenase Ⅰ이라언급됨) 은 extracellular matrix remodeling의기 능을갖는 fibrillar collagen의분해에중요한역할을하는것으로발현이증가될경 우피부의노화가빠르게진행됨을의미한다고알려져있다. 이에 UV 노출조건에 서, UV에의하여유도된 MMP1의발현이황칠을처리하였을경우변화되는현상 을살펴보기위하여 MMP1 의정량분석을수행하였다. 먼저, UV를노출시킨상태에 서 MMP1 증가를유도하고각각의시료들을처리하여 MMP1 단백의발현변화를 웨스턴분석법으로확인하였다( 그림 2.1-9). 또한분비된 MMP1의량을 ELISA kit(sandwich enzyme immunoassay methods) 를이용하여정량하였다( 그림 ). 그림 MMP1 induction을확인한 western 분석. 100J/cm 2 UV 를노출시킨후, 각각의시료를첨가하여배양하 여그로부터분비되는 MMP1 의양을측정하였다. 웨스턴결과, UV에노출시킨세포에서유도된 MMP1 의발현이, 실험에사용된 모든용액(HQ, LA, 황칠) 들에서감소됨이관찰되어 positive control로사용된용액 뿐아니라황칠용액도 UV 에의한노화방지효과의가능성을확인할수있었다. 방출되는 MMP1의양의변화를측정하기위한 ELISA 실험결과, UV 노출에의하 여용액으로방출되는 MMP 의량이증가됨이관찰되었으며, UV 미처리군과함께 UV 처리군의경우에도 Mock의경우에서보다각각의시료를첨가한군에서 MMP1 의양이저하되었음을확인하였다. 특히황칠의경우 UV 노출군에서황칠의억제 효과가가장높아그값이 0.18값차이를보이면서확연히줄어드는현상이나타났 다. 이러한결과는, 황칠또한 MMP1의분비를저하시켜상피세포의 collagen층이 파괴되는것을억제시킴으로써노화를방지하는기능을가질수있다는가능성을 암시한다

그림 2.1-10. UV 노출후, 각각 DMEM, Hyroqinone, Linoleic acid, 황칠을처리한군으로부터유도된 MMP1 의정량분석. 마. 고찰 당해년도의연구목표는황칠이미백효과와광외인성피부노화억제등에효과 를나타내는지연구하여천연식물성화장품원료로서황칠의기능을확립하는것 이다. 본연구에서는우선분획하지않은황칠원액을세포주를이용하여황칠의 기능을알아보았다.

113 그림 UV 노출후, 각각 DMEM, Hyroqinone, Linoleic acid, 황칠을처리한군으로부터유도된 MMP1 의정량분석. 마. 고찰 당해년도의연구목표는황칠이미백효과와광외인성피부노화억제등에효과 를나타내는지연구하여천연식물성화장품원료로서황칠의기능을확립하는것 이다. 본연구에서는우선분획하지않은황칠원액을세포주를이용하여황칠의 기능을알아보았다. 황칠의기능을알아보기위한실험내용으로쥐흑색종양세포주를배양하고멜 라닌생성량변화를측정하였으며, 또한인간섬유아세포주를이용하여황칠의피부 노화억제기능연구를위한 MMP 의저해활성검색계를확립하였다. 황칠원액을사용하여멜라닌생성량변화를측정한결과, 황칠은세포내멜라닌 합성을저해시킬수있는기능을가진물질을함유하고있으며, 기능은이미미백기능성물질로보고된 황칠원액의미백 HQ 보다오히려더높은효율로나타났다. 특히본연구에서는황칠이포함하고있는미백물질이 tyrosinase 활성도를저해시

114 킬수있음을확인하였다. 또한황칠용액이 UV에의한노화방지효과가있는지 가능성을확인한결과황칠의경우다른대조군물질들보다 MMP1을억제효과가 높았다. 이는황칠에는 MMP1의분비를저하시켜상피세포의 collagen층이파괴되 는것을억제시킴으로써노화를방지하는기능을가진물질이포함되어있음을암 시한다. 위의결과는황칠의기능을분자수준에서최초로밝힌것으로황칠을기능성 천연물로개발하기위한기본실험으로서의 1차년도연구는성공적으로수행되었다 고사료된다. 특히황칠성분이미백과피부노화방지물질을모두포함한다는사 실은매우고무적이다. 이로써천연식물성화장품원료로서황칠의기능을확립되 었으며이를바탕으로차년도연구에서는황칠액을각각의유기용매로분리추출하 고어느분획물에미백과노화방지기능성을나타내는물질을포함하는지연구하였 다

115 2. 2 차년도실험내용및고찰 가. 연구개발목표 2 차 연도 용매추출법을이용하여분리된황칠분획물을세포주에처리하 여세포독성및미백기능성연구 - 세포독성평가: 배양하여 섬유아세포에각각의황칠분획물을첨가하고 MTT assay를수행 - 쥐흑색종양세포주배양과멜라닌생성량측정: 쥐 melanoma 에분획물질을넣고배양한후, 변화를측정 흡광도이용하여멜라닌양의 나. 연구개발수행내용 - 섬유아세포배양및세포독성측정실험 : 인간섬유아세표에분획물을처리하여 MTT assay 수행 - 쥐흑색종양세포주배양과멜라닌생성량측정 : melanin stimulating hormone 으로멜라닌의합성을유도한후황칠분획물을처리하고멜라닌함량및 tyrosinase 발현변화를 RT-PCR로측정 다. 연구방법 (1) 마우스 B16 Melanoma 세포 Melanoma 세포주는 B-16 F1 세포주를이용하여 Dulbecco s Modified Eagle's Medium (DMEM)(Gibco, Grand island, USA) 에서배양하였으며, Penicillin-Streptomycin(Gibco) 항생제를 100 μg/ ml농도로처리, fetal bovine serum(gibco) 을 10%(v/v) 의배지조건을만들었다. 세포는배양온도 37, 5% CO ₂에서배양되었다. melanin세포를배양하여 100mm flask에포화상태가되면 1x PBS를가하여세척을해주고 Trypsin으로세포를 flask에서떼어세포를수확한 후새배지에넣어세포계대배양하였다. (2) 용매추출법으로분리된 Target 물질 성숙한세포를이용하여황칠액의미백기능성을알아보기위하여 Hexane, Et-OH, Ether, Chloroform, Ethyl acetate의 5 가지유기용매로부터추출된황칠분획

116 물 (50mg/ml) 을각각의농도별로처리하여사용하였다. 대조군으로각각의유기용 매를같은양으로처리하였다. (3) 멜라닌형성을유도하는 Melanine stimulating hormone( α-msh) 의처리 마우스 Melanocyte의 Melanosome으로부터형성되는 Melanine 형성을유도하기 위하여 α-msh 을처리하였다. 이는장기간배양된 B16 Melanoma 세포로부터 Melanine 형성이줄어드는현상이나타나기때문에 melanine 형성을안정적으로유 도하기위하여 α-msh 을처리하였다. 우선, B16 세포배양과정에서 6uM/ml α -MSH를처리하여 Melanin 형성정도를측정한후멜라닌형성이안정적으로나타 나는 α-msh 농도를선택하여 Tyrosinase 의발현변화정도를측정하였다. (4) 여 멜라닌양측정법 각 sample 의멜라닌형성정도는현미경으로관찰후, 각 digital image를이용하 Image-pro plus(version 3.0, Media Cybernetics, silver spring, MA) 로분석한 다. original image와 extracted back ground 사이의구분은멜라닌색소로판단되 고, 각색소와농도의범위를정확히측정한다. 세포내멜라닌함량정도를측정하기 위하여 24well plate에 되도록분주하고 24시간후각물질을농도별로첨가 하여배양한다. 72시간이지난후 1,200rpm에서 5분동안원심분리하여 정 도의세포를획득하여 1x PBS로 2 번세척한다. 상등액을제거하고물에불용성을 나타내는멜라닌을액화시키기위하여 1 N NaOH/10% DMSO를첨가하여 65 조 건에서 2 시간동안반응시킨다. 이후 450~470nm에서 optical absorbance를측정하 고 synthetic melanin을이용한 standard curve 와비교하여멜라닌함량을정량한 다. B16 melanoma에서 α-msh를처리한것과 melanin이유도되는세포로부터각 각의 였다. target 물질을처리하였을때나타나는멜라닌합성의상대적변화량을조사하 (5) MTT assay B16 세포를 96well plate에 , 분주하고황칠분획물을각각의농도별 로처리하였고, control로유기용매인 ethyl acetate 를사용하였다. 12시간배양후 세포를 1차세척하고 cell apoptosis를확인하기위해 tetrazolium salt MTT solution을 10v/v 비율로세포에반응시켰다. 37 에서약 4시간동안 incubation을 거쳐 470nm파장을이용하여 ELISA assay 를실행하였다

117 (6) 일시적인 DNA 유전자도입법 세포내로특정유전자를도입하여일시적인과발현현상을살펴보기위하여 Calcium Phosphate 유전자도입방법을이용하였다. 마우스 B16 melanoma 세포를 6well plate에 세포를분주하고배양하였다. 유전자도입 4시간전에새로배 지를교체하여주고 mock을제외하고 internal control로 prl-sv40 50ng과함께 reporter DNA는확인하고자하는 activity 갖는 DNA TYR wt-gfp 를사용하고, total DNA 총량의보정역할갖는 DNA pcdna 3.1 를함께넣어주어, 각 well당 다른비율이되지만모든 well 의최종 DNA농도가 2 μg되도록넣어준다. DNA에 DMEM 72μl와 2.5M Cacl 2 8 μl섞어 100 μl를만들고 2x HBS 100 μl와섞어 서침전완충용액을만들어실온에서 10~20분놓아두었다가각 well에천천히떨 어뜨리면서잘섞어준다음 37 에서 12시간동안배양한뒤새로배지를교체하면 서 100uM HQ과 10ug/ml 황칠을처리하였다. 유전자도입 48~72시간이후에 Dual Luciferase assay 를수행하였다. (7) Green Flurorescent protein 양측정 Transient transfection을통하여 Tyrosinase promoter로부터발현되는 Green Flurorescent protein을관찰하기위하여유전자도입 48~72시간동안배양된세포 를 1x PBS로세척하여 200x 배렌즈배율조건에서형광현미경으로관찰하였다. (8) cdna 합성및 Tyrosinase specific RT-PCR 각각의 solvent, target 물질을처리한 B16 melanocyte 세포를수득하여 1x PBS로 2 번세척한다. Total RNA는 Trizol reagent로 cell lysis 한뒤, manufancture's instructions 으로추출하였다. RNA integrity는 1.5% agarose gels 상에서확인한후, absorbance는 260과 280nm에서 concentration 을확인한다. 다음 으로 cdna합성과정으로 1ug의 Total RNA에 200pmole의 Oligo dt 16 을첨가하여 70 에서 5분간 denaturation 시킨후, Reverse transcription 을수행한다. M-MLV 5X Reaction buffer 5μl, 1.25μL의 10mM datp, 1.25μL의 10mM dctp, 1.25μL의 10mM dgtp, 1.25μL의 10mM dttp, 25units의 Recombinant RNasin, 0.5μl의 M-MLV RT Taq (Promega) 의조건에서 25μl reaction 한다. Tyrosinase forword primer: 5'-CATTTTTGATTTGAGTGCCT-3', reverse primers: 5'-TGTGGTAG TCATCTTTGTCC-3' 를이용하여 PCR 반응을수행하였다. PCR반응조건은 den aturation은 94 에서 1min, annealing 56 에서 1min, extension 72 에서 1min으 로 25cycles 수행한뒤, 1.5% agarose gel에서 PCR product를 analysis 하였다

라. 결과 (1) 황칠분획물의세포독성연구 ( 가) 분획된황칠용액에의한 cell apoptosis analysis 1 차년도실험에서미백과노화방지에대한황칠원액의기본기능이확인되었으 므로, 2차년도실험에서는 5가지유기용매 Hexane, Et-OH, Ether, Chloroform, Ethyl Acetate를이용하여 Column Chromatography

118 라. 결과 (1) 황칠분획물의세포독성연구 ( 가) 분획된황칠용액에의한 cell apoptosis analysis 1 차년도실험에서미백과노화방지에대한황칠원액의기본기능이확인되었으 므로, 2차년도실험에서는 5가지유기용매 Hexane, Et-OH, Ether, Chloroform, Ethyl Acetate를이용하여 Column Chromatography 방법으로분획된황칠분획물 을세포에처리하고세포증식과멜라닌합성에미치는영향및변화정도를측정하 였다. 먼저, B16 melanoma 세포주에각각의분획된황칠용액이세포손상(apoptosis, necrosis, cell stress) 없이반응할수있는농도범위를찾기위하여적정수의세포에 최소 0.5ug/ml에서부터최대 50ug/ml의농도범위를구획하여 MTT assay를실행 하였다( 그림 ). hexane 분획물의모든희석액과 Et-OH 분획물 0.5 ug/ml 희 석액에서세포독성이관찰되었다. 그림 황칠분획물처리한 B16세포의 apoptosis 를측정. (1) Mock. (2) Hexane 50ug/ml, (3) Hexane 5ug/ml, (4) Hexane 0.5ug/ml, (5) Chloroform 50ug/ml, (6) Chloroform 5ug/ml, (7) Chloroform 0.5ug/ml, (8) Eethyl-Acetate 50ug/ml, (9) Eethyl-Acetate 5ug/ml, (10) Eethyl-Acetate 0.5ug/ml, (11) Et-OH 50ug/ml, (12) Et-OH 5ug/ml, (13) Et-OH 0.5ug/ml, (14) Aceton 50ug/ml, (15) Aceton 5ug/ml, (16) Aceton 0.5ug/ml, (17) 황칠 원액 1ug/ml, (18) 황칠원액 5ug/ml, (19) 황칠원액 10ug/ml 처리하였다. 위의 cell proriferation O.D 수치는각각의용매만을처리한 control cell proliferation 수치로보정한값이다

(2) 세포주를이용한미백기능성효과연구 ( 가) Melanine stimulating hormone( α-msh) 의처리후, melanin 합성량변화 마우스 Melanocyte B16 세포를장기간배양한결과, melanin형성을유도하는효 소활성화가떨어져멜라닌합성이급속히줄어드는현상이나타났다.

119 (2) 세포주를이용한미백기능성효과연구 ( 가) Melanine stimulating hormone( α-msh) 의처리후, melanin 합성량변화 마우스 Melanocyte B16 세포를장기간배양한결과, melanin형성을유도하는효 소활성화가떨어져멜라닌합성이급속히줄어드는현상이나타났다. 이렇게멜라 닌합성이저해되면이는다시회복되기어려울뿐만아니라세포의 characterization이변하여실험에이용될수없기때문에 B16 라닌합성정도를측정하기위해서는반드시 세포주를이용한멜 Melanogenesis stimulating hormone을 처리하여계대하였다. 이에본실험에서는 1 차적으로, B16 세포에서안정적으로멜 라닌합성이유도되는되는지를측정하기위하여기본배지만으로배양한것을 control, α-msh 를첨가후배양하여멜라닌합성정도를측정하였다. Melanogenesis stimulating agent 인 α-msh를처리하고 48시간후현미경으로관 찰하였다. 그결과 α-msh 저농도에서큰변화가없었지만, 0.4mM에서처리농도가 높아질수록세포밀도는감소하였으며그증식속도도점차느려짐을확인할수있 었고, 또한 cell dendrite 길이가길어지고수가증가하는현상을관찰하였다 ( 그림 ). 그림 a B16 α-msh처리에의한 B16 세포주의변화. 세포를배지에서만장기간계대배양한것으로멜라닌활 성이낮아진경우, b 멜라닌활성도를높이기위하여배양액에 12mM α-msh를처리하여 48시간배양한것으로세포내멜라닌 합성정도가증가한양상을관찰할수있다. 또한, α-msh에의해생성유도된멜라닌농도의 O.D 값(405nm 흡광도) 은 control 에비해 0.190에서 로증가하였으며( 그림 ), 이는세포를원심분리한뒤 pellet의색을관찰한결과 α-msh에의한멜라닌합성증가를육안으로확인하였다

( 그림 2.1-14). 이러한현상은 α-msh 수용체가활성화되어세포내 camp의증가 에따라 tyrosinase 관련효소들의발현양이증가하여 Golgi내 glycosylated tyrosinase는 melanosome 으로이동하여나타나는것이다.

120 ( 그림 ). 이러한현상은 α-msh 수용체가활성화되어세포내 camp의증가 에따라 tyrosinase 관련효소들의발현양이증가하여 Golgi내 glycosylated tyrosinase는 melanosome 으로이동하여나타나는것이다. 또한동시에 melanosome 표면의 tyrosinase들은 PKC 에의해활성화되어멜라닌합성을시작하고, 세포내 actin filament, cytoskelecton 의 rearrangement가되면서결국 dendrite가많은수 지상세포로변하여생성된멜라닌의방출을용이하게하는것으로앞으로진행될 멜라닌합성저해능을측정하는데있어정확한대조군이될수있음을증명한다. 그림 α-msh에의해 stimulated Melanogenesis 측정. B16 세포에 α-msh를 48 시간처리한후, 세포내 melanogenesis에의한멜라닌합성정도를 하여수치화하였다. O.D값으로측정

그림 성도. 2.1-14. α-msh에의한 B16 멜라닌합 배양된세포를 1차세척하여 pelleting 하였다. a control, b 0.4mM α-msh를 48시간동안 처리, c 4mM α-msh, 0.4mM과농도차를갖 지만합성정도를구분하기에는어렵다. d 12mM α-msh처리한경우에는현미경상에서 의결과와같이확연히합성정도의차이를나 타낸다.

121 그림 성도 α-msh에의한 B16 멜라닌합 배양된세포를 1차세척하여 pelleting 하였다. a control, b 0.4mM α-msh를 48시간동안 처리, c 4mM α-msh, 0.4mM과농도차를갖 지만합성정도를구분하기에는어렵다. d 12mM α-msh처리한경우에는현미경상에서 의결과와같이확연히합성정도의차이를나 타낸다. ( 나) Melanogenesis 과정에따른 tyrosinase promoter 활성도측정 Tyrosinase 는멜라닌생성정도를측정하는데중요한정보를제공하는데, 세포내 melanosom으로부터 tyrosine을산화시켜 dopa oxidase, tyrosine hydroxlase의효소 를형성시켜최종적으로멜라닌을합성하는데주요효소로작용한다. 그러므로본 실험에서는 Melanogenesis 가일어나는시작단계인 tyrosinase promoter에대한황 칠분획물의영향을측정하고자하였다. 먼저, B16 세포주에 α-msh 를처리하고, tyrosinase promoter로부터 Enhanced Green Fluorescent Protein(GFP) 발현이가능 한 plasmid( 그림 ) 와 internal control로세포내 transfection 효율을측정하도 록 prl-sv40 Luciferase 유전자를 cotransfection 한다. 이는세포내주입된 tyrosinase-gfp 발현정도를 prl-sv40로보정하기때문에발현 efficiency를비교 할수있게된다. 유전자도입후, 48~72시간동안배양하고세포내 GFP 발현을형 광현미경으로관찰후, 세포를 lysis 하여 Luciferase assay 를수행하였다

그림 2.1-15. Tyrosinase promoter EGFP 유전자를 tagging한 recombination plasmid DNA.

122 그림 Tyrosinase promoter EGFP 유전자를 tagging한 recombination plasmid DNA. Tyrosinase promoter로부터 tyrosinase가발현되면서 C-terminal 부분에 Enhanced GFP 하기때문에 형광단백질 Green Fluorescence 에 sequences가위치 로, 형광현미경으로의관찰이용이하다. 발현시키므 그림 세포내도입된 Tyrosinase promoter로부터발현 된 GFP 의발현관찰. α-msh를처리하지않은경우형광이나타 나지않아그림에서제외하였다

123 α-msh를각각 4mM, 12mM 처리한상태에서세포내 GFP 발현정도를형광현미경 으로통하여관찰한결과, control에비하여 α-msh를처리한실험군에서 GFP 발 현정도가확연히높은것으로확인이되었다( 그림 ). GFP 발현변화차이를 수치화하여정량화안경우에도육안으로확인한결과와동일하게측정되었다( 그림 ). B16 세포주는일반적으로 transient transfection에사용되는 293T(human epithelial cell), HeLa(human cervical cancer cells) 비하여세포내 GFP 발현정도는월등히높은것으로확인되었다. 세포에비하여효율이낮은데 그림 GFP 발현세포를비교한그래프. GFP를발현하는세포를 counting하여이를 transient transfection efficiency 수 치로보정하였다. 4mM α-msh를처리한실험군에서 tyrosinase promoter가활 성화되었음을확인할수있다. ( 다) 분획된황칠용액처리에따른 melanine 합성도저해분석결과 : Spectrophotometer 를이용한멜라닌활성억제효과 In vivo 에서의멜라닌생합성과정은 tyrosinase를기질로하여 DOPA 물질을 형성하고다시 L-dopaquinone 으로산화시키는연속의과정을통하는데, 이때각 과정에서의산화생성물들이중합반응을하여최종산물로멜라닌이형성된다. 이에 1차년도에서는황칠용액이 Tyrosinase promoter를억제시켜멜라닌합성을감소시 키는결과를얻었다. B16 melanoma 세포에 5가지분획물을 50ug/ml, 5ul/ml,

0.5ug/ml의 3가지농도로처리하고 48시간배양한다음멜라닌생성농도를측정하 였다. 대조군으로는각각의유기용매만을처리하였다. 그결과, hexane과 chloroform 분획물에서는농도가높아짐에따라오히려멜라닌합성양이증가하였 다. 반면 ethyl acetate 분획물그룹에서는분획물의농도에따라멜라닌합성정도가 확연히낮아짐을확인할수있다( 그림 2.1-18).

124 0.5ug/ml의 3가지농도로처리하고 48시간배양한다음멜라닌생성농도를측정하 였다. 대조군으로는각각의유기용매만을처리하였다. 그결과, hexane과 chloroform 분획물에서는농도가높아짐에따라오히려멜라닌합성양이증가하였 다. 반면 ethyl acetate 분획물그룹에서는분획물의농도에따라멜라닌합성정도가 확연히낮아짐을확인할수있다( 그림 ). 그밖에용매에의하여분획된황칠 분획물은농도에따른멜라닌합성억제에일정한효과를나타내지못하였다. 미백 효과작용이이미입증된 HQ보다멜라닌합성저해도가높은것으로 1차년도실험 결과에서관찰된황칠원액을분획하여사용한결과이므로, 위의결과는특히 ethyl acetate 분획물이황칠의미백효과관련물질을포함하는확률이높음을의미한다. 이에 3차년도실험에서는 ethyl acetate 분획물을다시분획하여관련성분에대한 조사및다양하고세부적인실험을수행하였다. 그림 황칠분획물을처리한 B16세포의멜라닌생성 량측정. (1) B16 mock, (2) 번부터 (22) 까지는분획된황칠용액으로각각 을 0.5ug/ml, 5ug/ml, 50ug/ml의농도로처리하여멜라닌합성 량을측정하였다. (2)~(4) Hexane, (5)~(7) Chloroform, (8)~(10) ethyl acetate, (11)~(13) Et-OH, (14)~(16) Aceton 분획물. 위의 Relative Melanine O.D값은 control 화하였다. 합성량으로보정하여수치

( 나) Tyrosinase 발현억제효과 5가지유기용매에의한황칠분획물중어느분획물이황칠원액의 tyrosinase promoter 의활성저해물질성분을포함하는지를알아보기위하여황칠분획물을처 리하여 tyrosinase mrna 변화량을 RT-PCR 로분석하였다( 그림 2.1-19). 1 2 3 4 5 6 7 8 그림 2.1-19. 분획된황칠용액에의한세포내 Tyrosinase 발현량 의변화.

125 ( 나) Tyrosinase 발현억제효과 5가지유기용매에의한황칠분획물중어느분획물이황칠원액의 tyrosinase promoter 의활성저해물질성분을포함하는지를알아보기위하여황칠분획물을처 리하여 tyrosinase mrna 변화량을 RT-PCR 로분석하였다( 그림 ) 그림 분획된황칠용액에의한세포내 Tyrosinase 발현량 의변화. 1 α-msh를처리하지않은 B16, 2 melanin을형성하는 B16(mock), 3 Hexane, 4 Chloroform, 5 ethyl acetate, 6 Et-OH, 7 Aceton 분획물 8 10ug/ml 황칠원액을처리하였다. 1은 α-msh를처리하지않은멜라닌비생산 B16 세포주로서 negative control 세포주로사용하였으며이후의세포들은멜라닌을생성하고있는 B16를사용하여 실험하였다. 2에서의발현되고있는 tyrosinase 발현량이 5과 6, 즉 ethyl acetate 와 Et-OH 분획물을세포에처리한경우, 감소하는것을확인할수있다. 이러한 결과는 Et-OH ethyl acetate 분획물의경우에는전실험의결과를지지하는결과이지만 분획물의경우예상치못한결과로서앞으로의연구가필요하다. 8번의 10ug 황칠용액( 분획되기전단계의용액) 에서도 tyrosinase 발현량이감소함을확인 하였다. 마. 고찰당해연도의연구목표는용매추출법으로황칠원액으로부터분리된황칠분획물을세포주에처리하고어느분획물에서황칠의미백과광외인성피부노화억제효과들이나타나는지확인하여천연식물성화장품원료로서기능을가지는황칠성분의정제에필요한기반을확립하는것이다. 그러므로본연구에서는황칠분획물들을세포주를처리하여황칠의두기능을나타내는성분들이어느분획물에포

126 함되어있는지살펴보았다. 실험을위하여배양한쥐흑색종양세포주에분획물들을각각처리하고우선각 분획물들의세포독성농도를측정하였으며처리후멜라닌생성량변화를관찰하였 다. 또한섬유아세포주를이용하여황칠의피부노화억제기능연구를위한 MMP 의활성검색계의변화를관찰하였다. 일반적으로멜라닌세포가멜라닌을생성하는주요기전에는 melanocyte 의증식, melanogenesis 의증가, tyrosinase 활성도의증가등에대한보고가주요내용이다. 이미 1차년도실험을통하여황칠원액에 tyrosinase 활성화를감소시키는기능을가 진물질이있음을확인한바있으므로황칠을분획하여 2차년도연구에는각분획 물중어느분획물에활성저해물질이포함되어있는지를조사하였다. 우선섬유아 세포를이용하여세포독성이나타나지않는각분획물들의농도를구하였다. Murine B16 melanoma세포에서 melanine stimulating hormone으로멜라닌의합성 을유도한뒤적정농도의각분획물을처리하여어떤분획물이 tyrosinase의 mrna 발현을감소시키는기능이있는지살펴보았다. 특히 ethyl acetate 분획물이 광범위한농도에서세포독성을나타내지않으며또한멜라닌합성과 tyrosinase의 mrna 발현을일관되게감소시키는사실을확인하였다. 이는, 황칠원액과황칠 ethyl acetate tyrosinase 분획물에포함되어있는저해물질은 melanogenesis 과정중에서도 발현량을감소시켜그활성도를낮추어최종산물인멜라닌생합성을억 제시키는물질일것으로추론할수있다. 위의결과는용매추출법으로황칠원액으로부터분리된황칠분획물을세포주 에처리하고 ethyl acetate 함되어있음을시사하는것이다. 분획물에황칠의미백과항노화기능을가진물질이포 이로써천연식물성화장품원료개발을위하여 황칠을성공적으로부분정제하였고분획물들에서황칠의기능을다시확인한 년도의연구는성공적으로수행되었다고사료된다. 앞으로의실험에는황칠분획물들의물질분석을통하여활성을갖는요소를찾 고, 구조분석을통하여멜라닌생성기전과어떠한관련이있는가를진행해야할것 이다. 이에 3차년도과정에서는앞서높은효율을나타낸 ethyl acetate로분리된분 획물을다시세밀하게분획하여피부미백에기능성을나타내는물질을확인하는 정제법을확립하는데필요한실험을수행할것이다. 2차

127 3. 3 차년도실험내용및고찰 가. 연구개발목표 3차연도 천연기능성기초화장품시제품개발연구 나. 연구개발수행내용 - - 유효물질의정제법확립 기능성화장품의시장성및성분과효과에대한자료조사 다. 연구방법 (1) 용매추출법으로분리된황칠분획물 멜라닌세포를이용한미백효과를알아보기위하여 ethyl acetate 유기용매로분 획추출한황칠분획물 ethyl acetate A와 B, 황칠원액을각각의농도별로처리하여 실험에사용하였다. 실험대조군은유기용매인 ethyl acetate 를처리하였다. (2) 세포주배양및시약 실험에서는마우스 Melanoma(Murine melanocyte cell line) 세포주 B-16 F10과 human embryonic fibroblast 세포주 MRC-5, F4-1207(KCLB, Seoul, Korea) 에서 분양받아사용하였다. 멜라닌생성세포는 Dulbecco s Modified Eagle's Medium (DMEM)(Welgene) 으로배양, 섬유아세포는 Minimum Essential Medium(MEM), RPMI1640 (Welgene) 으로배양하였다. Penicillin-Streptomycin(Welgene) 항생제를 100 μg/ ml농도로처리하였고, fetal bovine serum(gibco) 을 10%(v/v) 의배지조건을 만들었다. 이배지를이용하여세포는배양온도 37, 95%air/ 5% CO₂의조건하 의 CO₂incubator 에서배양하였다. 세포를배양하여 100mm dish에포화상태가되 면 1x PBS를가하여세척하고 Trypsin으로세포를 flask에서떼어세포를수확한 후새배지에넣어계대배양하였다. (3) MTT assay B16 세포를 96well plate에 , 분주하여황칠분획물을각각의농도별

128 로처리하였고, control은유기용매인 ethyl acetate 를사용하였다. 12시간배양후 세포를 1차세척하고 cell apoptosis를확인하기위하여 tetrazolium salt MTT solution을 10v/v 조성으로세포에반응시켜 37 에서약 4 시간동안반응후, 45 0~470nm파장을이용하여 ELISA assay 를하였다. (4) B16 melanoma 세포주에황칠분획물처리 3 차년도과정에서는미백기능에가장효과적인황칠분획물을선별하여마우스 melanocyte 에처리한후, 멜라닌합성을저해시키는정도를확인하였다. 60mm dish 에 2 10⁵ 세포를분주하고 12 시간배양후, 다음날 control인 ethyl acetate와 ethyl acetate A, ethyl acetate B는 1x, 0.5ug/ml, 0.05ug/ml 농도로처리하였으며또한 1 차년실험결과에미백효과작용이이미입증된 HQ을 positive control로 1x(1500µM), 0.5x(750µM), 0.1x(150µM) 농도로처리하였다. (5) 멜라닌양측정법 세포내멜라닌함량정도를측정하기위하여 60mm dish에 2 10⁵개가되도록 분주하고 24시간배양후각물질을총 4 회에걸쳐처리하며계대배양하였다. 그 후 1,200rpm에서 5분동안원심분리하여 정도의세포를획득하여 1x PBS로 2 번세척하고, 상등액을제거하였다. 물에불용성을나타내는세포내멜라닌을액 화시키기위하여 1 N NaOH/10% DMSO 버퍼로녹여 65 조건에서 2시간동안 반응시켰다. 이후 490nm 파장을이용하여 ELISA assay 를하였다. (6) 마우스동물실험 동물실험은 4마리의 6주령 male albino hairless mice : Skh-1(Orient Bio) 를이 용하였다. 먼저 animal acclimating을위하여 1주일간먹이와물을공급하여적응시 킨후실험을실행하였다. (7) 세포및마우스의 UV-B처리 각각의세포는 60mm dish 에 FBS를넣지않은배지에일정세포를분주하고 1 2~20 시간배양한다. 배지를 1x PBS로교체후일정파장으로 100mJ/cm 2 ~150mJ/cm 2 UV-B 양이되도록노출시킨다. UV-B (Sankyo Denki, Tokyo,Japan) 램프는길이 588.5mm, 직경 32.5mm로 280~360nm의파장대로최대 피크파장 306nm 을갖는다. 이에 UV-B radiation양은 4.2J/sec로각각의 hairless mice의 dorsal skin에노출되도록하루 1 시간, 3시간을 3 일동안을처리하였다

129 (8) Reverse transcription Polymerase chain reaction (RT-PCR) 각각의 solvent, target 물질을처리한세포는 세포를수득하여 1x PBS 로 2 번세척한다. 또한마우스피부조직은지름 1Cm 크기의 pucnching하여준비하 였다. 각각의 sample로부터 Total RNA는 Trizol reagent로세포와마우스조직을 lysis 한뒤, manufancture's instructions 으로추출하였다. RNA integrity는 2% agarose gels 상에서확인한후, absorbance는 260과 280nm에서 concentration을확 인하였다. 다음으로 cdna합성과정으로 1ug의 Total RNA에 200pmole의 Oligo dt 16 을첨가하여 70 에서 5분간 denaturation 시킨후Reverse transcription을수 행한다. M-MLV 5x Reaction buffer 5μl, 1.25μL의 10mM datp, 1.25μL의 10mM dctp, 1.25μL의 10mM dgtp, 1.25μL의 10mM dttp, 25units의 Recombinant RNasin, 0.5μl의 M-MLV RT Taq (Promega) 의조건에서 20μl 반응한다. cdna syntehsis는 95 에서 3 분, 45 에서 60 분, 94 에서 5분으로반응후 1.5% agarose gel 에서확인하였다. 1μl의 cdna 반응액과 50pmole의 specific primers를첨가하고 2μl의 10x buffer, 0.8μl의 MgCl2 (25mM), 2μl의 dntp (0.2mM), 1μl의 primer (50pM), 15U의 Taq polymerase를첨가하여 PCR 반응을수행한다. 각각의 PCR반응 조건은 denaturation은 94 에서 40sec, annealing 57 에서 40sec, extension 94 에서 40sec으로 25cycles 반응후 2% agarose gel 에서확인하였다. (9) SDS-PAGE 및 Western analysis 세포획득후 1x PBS 로씻어준다음, RIPA buffer(santa Cruz, California, USA) 로세포를융해하여 4 13,000 rpm의원심분리기에서 5 분을돌려추출물을 얻는다. 이때 RIPA buffer는 10 mg/ ml PMSF, 100mM Sodium orthovanadate, Protease Inhibitor 를따로첨가해사용하였다. 단백질은 Bovine Serum Albumin(BSA) 을표준곡선으로사용하여 Bradford법을이용하여단백질정량을하 였으며최종단백질을μg으로 2x sample buffer 로희석한후, 100 에서 5분동안 열을가하고, 염색약을 2 μl넣어주어젤에넣어줄시료를준비한다. 최종준비된시 료는 10% SDS-polycarylamide 젤에넣어져전기영동에의해크기에따라분리된 다. 그후젤을 Hybond-P' PVDF membrane(amersham Bioscience UK, Buckinghamshire, England) 으로상온에서 2 시간동안옮긴다. 옮긴후, 0.1% Tween-20이첨가된 1x TBS-T에 5% BSA(Santa Cruz) 를녹여상온에서 1시간동 안 Blocking 을실시하고, 1x TBS-T 로씻어준다. 그후각실험마다 1x TBS-T로 1/1000 희석시킨일차항체를 1 시간동안반응시킨뒤, 1x TBS-T로 3번정도 10분

130 을씻어준다. 마찬가지로 1/1000으로희석시킨 Horseradish Peroxidase(HRP) 가붙 은이차항체를반응시키고 1x TBS-T 로씻어준다. 단백질검출은 Western Blotting Luminol Reagent(Santa Cruz) 을이용하여 Agpafilm ECL에노출시킴으로 시행하였다. Blot은 Anti-β actin 항체(1/1000 으로희석, Sigma) 로단백질의정량을 대조시켰다. (10) Hamatoxylin and Eosin (H&E) stain section 마우스조직은파라핀블록으로샘플링하고 7μm두께로잘라 poly-l-lysine coated glass slide 절편을제작하여건조시킨다. 유기용매를이용하여탈파라핀 (Deparaffinization) 화시켜파라핀을제거, Harris Hematoxylin solution에 2분정도 반응시킨후에흐르는물에 15분간세척한다음 acid Et-OH에서 5~10초반응시켜 흐르는물에이차세척을하였다. 그다음 Eosin Y sol. Counterstain(Alcoholic or Alcoholic with Phloxine) 으로 1 분간반응후, 70%, 80%, 90% 95%, 100% absolute Et-OH, AX(100% ethanol : 100% xylene = 1:1), 100% xylene 에서 gradient dehydration을수행하고 Canada-Balsam으로 mounting 한다. 이렇게준비된샘플을 light microscope(bh-2, Olympus, Tokyo,Japan) 으로확인하였다. (11) Immunohistochemisty 파라핀에포매된조직을 7μm두께로연속절편하여 probe on plus 슬라이드 (Fisher, U.S.A.) 에부착하여실험에사용하였다. xylene으로파라핀을제거 (Deparaffinization) 한다. Et-OH과 distilled water를이용하여 hydration 시킨후, 조 직내존재하는내재성과산화효소을활성을억제시키기위하여 0.3% hydrogen peroxide을첨가한 Me-OH 용매에 30분간처리하고 1x PBS 로세척하였다. 비특이 적인반응을방지하기위하여 2% Horse serum(vectastain Elite ABC Kit, VectorLaboratories, Burlingame, CA) 으로 20분간 blocking 시키고, 1/100로희석한 일차항체 anti-mouse MMP3(Abcam, Cambridge, UK) 를처리하고 4 에서 12~16 시간반응시켰다. 1x PBS로 1 번세척후, 이차항체인 avidin-biotin peroxidase complex(vectastain Elite ABC Kit, Vector Laboratories, Burlingame, CA) 를 처리하여 Immunolocalization 하였다. 그다음 DAB substrate solution을 3분간처 리후, 1x PBS로세척하고 light green으로 counterstaining 하였다. 준비된샘플은 light microscope(bh-2, Olympus, Tokyo, Japan) 으로확인하였다. 라. 결과

(1) 유효물질의정제법확립 ( 가) Ethyl acetate 분획물에의한 apoptosis 분석 2차년도의연구에서황칠분획물들을처리한결과 5개의분획물가운데 ethyl acetate 분획물이미백기능이있으면서독성효과가없는것으로나타났다. 따라서 ethyl acetate 분획물을다시정제하여 A와 B 분획물로나누고미백과독성효과를 다시측정하였다.

131 (1) 유효물질의정제법확립 ( 가) Ethyl acetate 분획물에의한 apoptosis 분석 2차년도의연구에서황칠분획물들을처리한결과 5개의분획물가운데 ethyl acetate 분획물이미백기능이있으면서독성효과가없는것으로나타났다. 따라서 ethyl acetate 분획물을다시정제하여 A와 B 분획물로나누고미백과독성효과를 다시측정하였다. 우선 ethyl acetate A와 B 분획물을 B16 melanoma 세포주에 10ug/ml, 5ug/ml, 1ug/ml, 0.5ug/ml, 0.05ug/ml 농도로적정수의세포에처리하고 MTT assay를수행 하였다. 1ug/ml, 0.5ug/ml, 0.05ug/ml 로낮은농도의범위에서는세포수, morphology, cell dendrite 수와길이를유지하며유사한비율로증식되었지만, 10ug/ml, 5ug/ml 조건에서는증식속도가느려지고 cell dendrite 수의감소, apoptosis 반응이나타나는것이관찰되었다( 그림 ). ethyl acetate A와 B 분 획물모두의경우 10ug/ml와 5ug/ml에서는세포의손상정도가높은것으로나타났 기때문에차후의실험에서는적정농도로 처리하였다. 1ug/ml, 0.5ug/ml 0.05ug/ml를세포에 그림 황칠분획물처리한 B16세포의 apoptosis 를측정. 세포손상없이분획물을처리하기위한적정농도를알아보았다. 1 ethyl acetate A 2 ethyl acetate 3 황칠원액이며농도는 10ug/ml, 5ug/ml, 1ug/ml, 0.5ug/ml, 0.05ug/ml 로처리하였다

( 나) Ethyl acetate 황칠분획물 A와 B의미백효과 Ethyl acetate 황칠분획물의미백효과를알아보기위하여세포가정상적으로성 장가능한최고농도를적정처리농도 1ug/ml 로정하고( 그림. 2.1-20), B16 melanoma 세포에 1ug/ml, 0.5ug/ml, 0.

132 ( 나) Ethyl acetate 황칠분획물 A와 B의미백효과 Ethyl acetate 황칠분획물의미백효과를알아보기위하여세포가정상적으로성 장가능한최고농도를적정처리농도 1ug/ml 로정하고( 그림 ), B16 melanoma 세포에 1ug/ml, 0.5ug/ml, 0.05ug/ml의농도로황칠분획물과대조군인 Ethyl acetate, 1차년도에미백효과가이미입증된 HQ 을처리하였다. 4일동안에 4 번의황칠분획물을처리하고세포의색깔을관찰하였다. 그결과 ethyl acetate A 와황칠원액은 Mock과비교해서미백의효과가있음을알수있었으나 ethyl acetate B 는효과를볼수없었다( 그림 ). 이러한결과를정확한수치로알아 보기위하여세포내멜라닌량을 ELISA 로측정하였다. 그결과육안으로확인한 바와같이미백효과를보인 ethyl acetate A와황칠원액은 Mock과비교하여수치 가확연히줄어든것을볼수있으며 ethyl acetate B는약간의수치만줄었음을알 수있었다( 그림 ). 이와같이황칠원액과함께황칠분획물중에서도 ethyl acetate A 가미백효과작용이크다는사실을확인할수있다. 그림 황칠분획물처리에의한 B16 미백효과. 황칠분획물에의한 B16 의미백효과는육안으로도구분이가능하였다. 1 Mock(B16) 2 ethyl acetate 3 ethyl acetate A 4 ethyl acetate B 5 HQ 6 황칠원액을처리한세포만 down 시켰다. 그결과 3 ethyl acetate A는 Mock 보다멜라닌합성량이현저히줄어듦이관찰된다

그림 2.1-22. 황칠분획물처리에의한 B16의멜라닌 B16세포에 ethyl acetate 생0 성변화. 분획물과황칠을처리하고일정시간 배양후형성된 melanin을 ELISA 로측정하여수치화하였다.

133 그림 황칠분획물처리에의한 B16의멜라닌 B16세포에 ethyl acetate 생0 성변화. 분획물과황칠을처리하고일정시간 배양후형성된 melanin을 ELISA 로측정하여수치화하였다. ( 다) 황칠분획물에의한 Tyrosinase 발현억제 멜라닌생합성과정은 tyrosinase를기질로하여 DOPA 물질을형성하고다시 L-dopaquinone 으로산화시키는연속의과정을통하는데, 이때각과정에서의산화 생성물들이중합반응을하여최종산물로멜라닌이형성된다. 이에 2차년도에서황 칠분획물이 Tyrosinase 발현을저해하여멜라닌합성이감소한다는결과를바탕으 로 3차년도실험에서도 B16세포를 60mm dish에분주하고황칠분획물을 4일동안 처리하여 tyrosinase RT-PCR 로발현정도를알아보았다. Tyrosinase forword: 5'-CATTTTTGATTTGAGTGCCT-3 reverse: 5'-TGTGGTAGTCATCTTTGTCC

그림 2.1-23. 황칠분획물처리에의한 tyrosinase 발현변화. 1 Mock(B16) 2 황칠원액 (0.05ug/ml, 0.5ug/ml, 1ug/ml) 3 ethyl acetate A(0.05ug/ml, 0.5ug/ml, 1ug/ml) 4 ethyl acetate B(0.05ug/ml, 0.5ug/ml, 1ug/ml) 5 HQ(0.05ug/ml, 0.5ug/ml, 1ug/ml) 6 ethyl acetate (0.

134 그림 황칠분획물처리에의한 tyrosinase 발현변화. 1 Mock(B16) 2 황칠원액 (0.05ug/ml, 0.5ug/ml, 1ug/ml) 3 ethyl acetate A(0.05ug/ml, 0.5ug/ml, 1ug/ml) 4 ethyl acetate B(0.05ug/ml, 0.5ug/ml, 1ug/ml) 5 HQ(0.05ug/ml, 0.5ug/ml, 1ug/ml) 6 ethyl acetate (0.05ug/ml, 0.5ug/ml, 1ug/ml) 로처리하였다. 분획물 그결과, 멜라닌합성이저해되어미백효과를나타낸 ethyl acetate A와황칠원 액이 tyrosinase 발현양이감소하는것으로확인되었다. 황칠분획물의농도가 0.5ug/ml와 1ug/ml의 tyrosinase 발현량을비교해보면확실하게줄어든것을알수 있다. 그러나 ethyl acetate B는 tyrosinase 발현량에변화가없는것을볼수있었 다. 2차년도에 melanogenesis과정중에서도 tyrosinase 발현량을감소시켜그활성 도를낮추어최종산물인멜라닌생합성을억제시킨다고보았던것처럼이번결과도 황칠분획물을처리하면멜라닌합성이저해되고이로인해 소한다는사실을알수있다. tyrosinase 활성도가감 ( 라) 황칠분획물의피부노화억제기능탐색 피부노화는주름현상과같은표면적상태와연관이있는데, 이는 ultraviolet(uv) light, xenobiotics, hormonal 변화등다양한환경에의하여영향을받는다. 이러한 현상은 dermis layer에서두드러지는데이는 collagen type Ⅰ, Ⅲ 와 elastin, proteoglycan, fibronectin, extraceullar matrix protein(ecms) 등으로구성되어있다. 환경이나시간에의하여나타나는노화현상은이러한주요구성물질의 strength, resiliency, arrangement의불균열현상에의하여일어나며특히 UV는 premature skin aging, photoaging 의주요원인으로알려져있다. MMPs는체내에존재하는 4 대단백분해효소의한가지로, 세포외기질성분중적어도한가지이상을분해시 키며, 효소활성도에 Zn 이온이필수적이며비활성형으로분비되어활성화과정을 거쳐단백분해능을가진다. 또한 TIMPS( 선택적 MMPs 억제제인 tissue inhibitor of matrix-metalloproteiase) 에의해그기능이억제되며공통의아미노산서열을함 유한다. MMPs는 23개의종류가있으며 MMP-1, 2, 3, 9은 UV에의해유도되는것 으로알려져있다. 그러므로 UV에의하여나타나는피부노화현상을 MMPs 단백질

RT-PCR과 western 을통해분석하였다. MMP 합성량을 hmmp-2 forword: 5'-GGCCAAGTGGTCCGTGTG-3' reverse: 5'-GAGGCCCCATAGAGCTCC-3' 그림 2.1-24.

135 의발현량을통하여확인할수있다. 따라서본연구에서는 human fibroblast cell과 hairless mice dorsal skin을이용하여인위적으로일정시간의 UV-B 노출을주고, 연구과정에서분리된 target 관계가있는지를확인하였다. 황칠분획물을처리하여피부노화현상과어떠한상관 < 세포주를이용한 in vitro 실험 > Human fibroblast 세포인 MRC-5와 F cell을 60mm plate에깔고 UV를 처리하여자연적인노화상태를만든다음황칠분획물을처리하여 RT-PCR과 western 을통해분석하였다. MMP 합성량을 hmmp-2 forword: 5'-GGCCAAGTGGTCCGTGTG-3' reverse: 5'-GAGGCCCCATAGAGCTCC-3' 그림 MRC-5cell에황칠분획물처리에의한 mmp-2 발현량변화. RT-PCR 결과로서 1 Mock 2 negative(uv 만처리) 3 ethyl acetate 4 황칠원액1ug/ml 5 ethyl acetate A 1ug/ml 6 ethyl acetate B 1ug/ml 를처리하였다. 1 MRC-5 세포주

2 F4-1207 세포주 그림 2.1-25. 황칠분획물처리에의한 mmp-1, mmp-2 합성량변화. western 결과로서 1 Mock 2 negative(uv 처리만) 3 ethyl acetate 용매 4 황칠원액1ug/ml 5 ethyl acetate A 1ug/ml 6 ethyl acetate B 1ug/ml 을처리하였다.

136 2 F 세포주 그림 황칠분획물처리에의한 mmp-1, mmp-2 합성량변화. western 결과로서 1 Mock 2 negative(uv 처리만) 3 ethyl acetate 용매 4 황칠원액1ug/ml 5 ethyl acetate A 1ug/ml 6 ethyl acetate B 1ug/ml 을처리하였다. 황칠분획물의 MMP 유전자들의전사활성화억제가능성을살펴보기위한 RT-PCR 결과를보면 Mock보다는 negative(uv 만처리한세포) mmp2 mrna가 약간증가한것을볼수있으나미백효과가있었던황칠원액과 ethyl acetate A 리에의하여 mmp2 양변화가줄어드는것은볼수없었다( 그림 ). 또한 western 결과에서도 MRC-5 세포의경우 Mock보다는 UV 처리한세포의 mmp-1 발현량이증가하였지만, 황칠분획물을처리한세포에서는 mmp-1의발현량이줄어 드는것을볼수없었으며, mmp-2 또한큰변화가보이질않았다. 그러나 F 세포에서는 ethyl acetate A 황칠분획물에서, mmp1의경우와발현양이적기는하 나 mmp-2 경우모두합성양이다소감소함을관찰할수있었다( 그림 ). 이러한결과를통해 ethyl acetate A 황칠분획물에멜라닌생성을억제뿐아니라, 피부노화를방지하는데효과가있는물질이포함되어있음을알수있다. 처 < 마우스를이용한 in vivo 실험 > 1 Skin wrinkle: 황칠분획물을처리하기전에우선 UV light에의해나타나는 주름현상 wrinkle formation' 을확인하기위하여 UV조사량에차이를두고 skh-1 마우스 dorsal skin의피부변화를관찰하고자 UV를조사하지않은대조

137 군은 No.1, 1시간 UV를조사한 No. 2, 3시간 UV를조사한 No.4로샘플링하였 다. 그결과, dorsal skin보다는피부층이얇은 scruff skin( 목덜미부분) 에서피부 표피에존재하는각질층(corneum layer) 의분열로벗겨지는각질화현상이관찰 되었으며( 그림 ), 육안으로도확연히구분이되는주름현상이나타났다( 그 림 ). UV-B에의해유도된주름화는 1시간동안 1일을조사한후에는육 안으로관찰하기는힘들었으나, 2일째 UV조사전에는확연히나타나기시작하였 다. hairless 마우스의피부조직은얇은표피층(epidermis layer) 이육안으로관찰 되기때문에얇고미세한주름이보이지만, UV에의하여유도된주름현상은 control 보다두껍고굵게형성되는것을확인할수있었다. 이러한결과는장시 간의 UV에노출됨에따라 wrinkling 현상이유도되며피부의노화현상과도밀 접한관계가있음을말한다

그림 2.1-26. 피부층의단면도. UV 조사에의하여피부의외각상피층의각질화현상에의하여각질층의불균열로층이파 괴되는현상과 다. No.4 의결과에서는각질화현상이심하여떨어져나가는것을확인할수있 그림 2.1-27. 마우스 scruff skin 부분의주름화현상.

2 Skin thickening: skin thickening은 IR light에의해이미알려져있는현상으 로현재의실험진행과정에서도 UV-B의의한유사한결과가나타남을확인하고자 마우스피부조직을이용하여표피층의두께를확인하였고( 그림 2.

138 그림 피부층의단면도. UV 조사에의하여피부의외각상피층의각질화현상에의하여각질층의불균열로층이파 괴되는현상과 다. No.4 의결과에서는각질화현상이심하여떨어져나가는것을확인할수있 그림 마우스 scruff skin 부분의주름화현상. UV조사에의하여피부조직의 wrinkle formation 에따라피부조직의두께가두꺼워지며, 주름 상이나타난결과를확인할수있다. 2 Skin thickening: skin thickening은 IR light에의해이미알려져있는현상으 로현재의실험진행과정에서도 UV-B의의한유사한결과가나타남을확인하고자 마우스피부조직을이용하여표피층의두께를확인하였고( 그림 ), Hematoxylin and eosin(h&e) staining section 을실행하였다. 그결과, hairless mice dorsal skin 에서 ⅰ) 외각에존재하는각질층의균열이흐트러지며두께가증 가됨을확인하였다. ⅱ) UV-B에노출된피부조직의표피층을구성하는세포크기 가증가, 과립층(granulosum) 의배열이흐트러지고두께가증가되면서 thickness가 증가됨을확인하였다. ⅲ) 표피층의균열이흐트러지면서기저층도같이불균열되 는것이확인되었고, 진피층으로파고드는현상이관찰되었다. 이러한결과는일차 적으로 IR 에노출되어나타나는현상과유사한조건이주어졌음을의미하고, 이미

알려진보고와같이 IR light의 UV는피부조직의 collagen과 elastic fiber의증가를 유도함에따라피부층이두꺼워지는현상이라설명할수있다. 만성적인 UV에노 출에의하면진피의 mucin 발현률이높아지는데이는조직내수분함량을떨어뜨 리기때문에조직이굳어지는현상이나각질등의현상과도밀접한관련이있다. UV 그림 2.1-28. UV 에의한표피층의두께변화.

139 알려진보고와같이 IR light의 UV는피부조직의 collagen과 elastic fiber의증가를 유도함에따라피부층이두꺼워지는현상이라설명할수있다. 만성적인 UV에노 출에의하면진피의 mucin 발현률이높아지는데이는조직내수분함량을떨어뜨 리기때문에조직이굳어지는현상이나각질등의현상과도밀접한관련이있다. UV 그림 UV 에의한표피층의두께변화. 조사에의하여피부의외각층인표피의두께를확인한결 과, 하루에 3시간을 3일동안노출한실험군에서확연하게피 부층이두꺼워지는결과를확인할수있다. 3 황칠및분획물이 skin wrinkle & thickening 에미치는영향: 바탕으로피부노화가진행중인조건에서분리및정제한 target 위의결과를 황칠분획물을 처리하고피부조직의 wrinkle 현상과 thickening에어떠한영향을나타내는지확 인하였다. 3차년도실험과정으로분획된황칠물질은 ethyl acetate 분획물 A, B 를이용하였다. 마우스 dorsal skin을 4 부위로구획하고, 일정시간 UV-B에노출 시킨후각각의 target 물질을처리하였다. 먼저, 각각의실험군의 thickening정도 를확인하기위하여epidermis layer 두께를측정하여그래프로나타내었다( 그림 ). UV-B 조사량이 1시간실험군에서는표피층이 ethyl acetate A에의하 여 thickening가약 24% (45um 34um) 감소한것으로확인되었다. UV-B 조사 량이 3시간실험군에서는황칠원액의농도가 0.05ug/ml인경우약 10%(85um 76um), 0.5ug/ml에서는약 24%(85um 63um), 원액을바로처리한경우에서는 39%(85um 51um) 로확연한차이를나타내었다. 이러한사실은장기적으로 UV-B 노출에의해손상이된피부조직에황칠액과 Ethyl acetate분획물이피부

조직의 thickening 을감소시키는데중요한작용을한다는사실을뒷받침한다. 또한일상생활에서자연적으로접하게되는빛( 공기중의빛, 형광등빛등) 에 의한노화과정을나타내는 UV(-) 대조군에서도황칠액은 thickening 감소에기 여함을나타내었다. 그림 2.1-29.

140 조직의 thickening 을감소시키는데중요한작용을한다는사실을뒷받침한다. 또한일상생활에서자연적으로접하게되는빛( 공기중의빛, 형광등빛등) 에 의한노화과정을나타내는 UV(-) 대조군에서도황칠액은 thickening 감소에기 여함을나타내었다. 그림 UV 노출에의한표피층에황칠원액과분획물을 처리한후표피층의두께변화. UV(+) 조건에서표피층이두께가증가됨으로확인되었고, 분획물 처리후 ethyl acetate A 처리시에만두께감소가일어났다. 이러한사실은다음의 과에서도확인된다. Hematoxylin and eosin(h&e) staining section의조직결

그림 2.1-30. UV(-) 조건에서의 H&E staining section. UV negative 조건에서황칠액을처리한후관찰한결과로, (A) 는 Mock, (B) 0.05ug/ml ( 최 저) 농도의황칠원액을처리, (C) 1ug/ml ( 최고) 농도의황칠원액을처리하여 100x배율렌즈 로확인하였다. ⅰ) UV 노출을시키지않은조건( 그림 2.

141 그림 UV(-) 조건에서의 H&E staining section. UV negative 조건에서황칠액을처리한후관찰한결과로, (A) 는 Mock, (B) 0.05ug/ml ( 최 저) 농도의황칠원액을처리, (C) 1ug/ml ( 최고) 농도의황칠원액을처리하여 100x배율렌즈 로확인하였다. ⅰ) UV 노출을시키지않은조건( 그림 ) 에서황칠원액을처리한결과, 조직 단면도에서는최외각의상피층, 표피층, 진피층을확연히구분할수있다. (A) 는 황칠원액 control로 DMSO 를처리한외부공기접촉에의한자연조건, (B) 0.05ug/ml 황칠액을처리, (C) 1ug/ml 황칠액을처리하였다. (C) 의결과에서는 앞서말한것과같이자연적인조건에서황칠액에의한 침해주는결과라할수있다. thickening 감소를뒷받

그림 2.1-31. UV(+)-1시간노출조건에서의 H&E staining section. UV-B를 1시간 3 일노출시킨후황칠액을처리한것으로 (D) 는 Mock, (E) 0.05ug/ml 농도, (F) 1ug/ml 농도로처리하여 100x 배율렌즈로확인하였다. 그리고표피층에나타나는주름 화현상을정확하게확인하기위하여 400x 렌즈로확대한결과를나타낸다.

142 그림 UV(+)-1시간노출조건에서의 H&E staining section. UV-B를 1시간 3 일노출시킨후황칠액을처리한것으로 (D) 는 Mock, (E) 0.05ug/ml 농도, (F) 1ug/ml 농도로처리하여 100x 배율렌즈로확인하였다. 그리고표피층에나타나는주름 화현상을정확하게확인하기위하여 400x 렌즈로확대한결과를나타낸다. ⅱ) 다음은 UV-B 하루 1시간으로 3 일노출시킨후, 황칠원액을처리한결과이다 ( 그림 ). (D) DMSO를처리한 control로표피층이확연이두꺼워진것을 확인할수있다. 또한진피층내로함몰이일어나는현상과진피층내의과립조 직및세포내지방세포( 검은색화살표로표기) 의증가가나타나는현상은 UV노 출에의한노화과정에서발생하는결과로보고되어있다. 또한각질층바로밑의 표피층을자세히살펴보면주름이형성되는굴곡이나타남을관찰할수있다. 이 에각각의황칠액을처리한후의변화로 (F) 1ug/ml 황칠액을처리한것에서표 피층이 12%(45um 40um) 감소하였고, 진피층에서발견되는 skin wrinkle이확 연히줄어드는것을관찰할수있다

그림 2.1-32. UV(+)-1시간노출조건에서의 H&E staining section. UV-B를 1시간 3일노출시킨후 target 분획물을처리한것으로 (G) ethyl acetate A 1ug/ml 농도, (H) ethyl acetate B 1ug/ml농도로처리 하여 100x 배율렌즈로확인하였다.

143 그림 UV(+)-1시간노출조건에서의 H&E staining section. UV-B를 1시간 3일노출시킨후 target 분획물을처리한것으로 (G) ethyl acetate A 1ug/ml 농도, (H) ethyl acetate B 1ug/ml농도로처리 하여 100x 배율렌즈로확인하였다. 그리고표피층에나타나는주름화 현상을정확하게확인하기위하여 다. 400x 렌즈로확대한결과를나타낸 ⅲ) UV-B 하루 1시간으로 3 일노출시킨후, target 황칠분획물을처리한것으로( 그 림 ) (G) ethyl acetate A를처리한것에서 wrinkle formation의굴곡이일 부완화되는현상을나타내었고, 각질화현상은나타났지만표피층의두께는확 연히감소됨을확인하였다. (H) ethyl acetate B 분획물을처리한것에서는표피 층의 thickening 감소는나타내지않았고, 주름화현상이나타나는표피층의배 열이완만한정도는 ethyl acetate A 에비해서는아주약한것으로확인되었다. 4 황칠분획물에의한 MMP 발현량저해확인: 앞서피부 tickening에황칠액 중에서도 ethyl acetate A target물질이효과가있음을확인한상태에서분자수 준에서조절단계를확인하기위하여 RT-PCR 을수행하였다. 마우스 dorsal skin 부분에 UV-B 처리후황칠분획물을, 원액을 1/1000로희석한농도를 1ug/ml로고정한후각각을희석하여 0.05ug/ml, 0.5ug/ml, 1ug/ml로처리하였 다. 처리한마우스피부조직으로부터 cdna를합성한후 mouse MMP13 NCBI No. NM_ 유전자를증폭하였다. 그결과, UV(+) 1시간조건에서 target

144 물질의농도가높아짐에따라 MMP13의발현양이감소하는결과를확인하였다 <data not shown>. 다시말해, UV-B에의해유도되는 MMP13의발현양이 target 물질에의하여줄어드는것으로피부노화로진행되는과정에어느정도의 repair 기능을나타냄을유추할수있다. 하지만이것은분자수준에서확인한것 으로이러한현상이생체내단백질발현정도에서도유사한결과를나타내는지 확인이필요하다. 5 황칠분획물에의한조직에서의 MMP 발현량저해확인: 앞서황칠액중에 서도 ethyl acetate A 분획물이피부 thickening 감소에효과가있음을확인하였 다. 이러한사실을바탕으로각각의물질이단백질 level과조직에서도직접적으 로노화의정도를감소시키는지를확인하고자웨스턴방법과면역염색법를실행 하였다. 인간세포의경우마커단백질로 MMP1, 2 를이용하였지만, 마우스에서는 그와 homology가 50% 이상높고마우스특이성을갖는 MMP13과 MMP3가보 고되어있다. 본실험에서는 MMP3 를이용하였다. 3일간 UV에 1 시간노출후, 각각의시료를처리한마우스조직으로부터 MMP3 단백질웨스턴을실행한결 과 1ug/ml 황칠액과 ethyl acetate A 분획물을처리한경우뚜렷하게 MMP3 단 백질발현양이감소되었다( 그림 ). 이러한결과는인간세포주에서 MMP1, 2의단백질발현양이감소하는결과와동일하게 ethyl acetate A 분획물이피부 노화과정에저해기능을가지고있다는사실을나타낸다

단 발현량이감 다음실험으로, 이러한조절현상이실제로조직내에서도일어나는지를확인하기 위하여면역염색법을수행하였다. UV-B를조사하지않은상태에서황칠에의한 MMP3 단백질유도가저해되는지를관찰하였다( 그림 2.1-34).

145 그림 리후 UV(+) MMP3 western 결과. 조건에서황칠액처 UV(+) 1시간조건에서 1ug/ml 황칠액, ethyl acetate A, B를처리한후 MMP3 백질로검출한결과, 1ug/ml 황칠과 ethyl acetate A를처리한후 MMP3 소하였다. 단 발현량이감 다음실험으로, 이러한조절현상이실제로조직내에서도일어나는지를확인하기 위하여면역염색법을수행하였다. UV-B를조사하지않은상태에서황칠에의한 MMP3 단백질유도가저해되는지를관찰하였다( 그림 ). 조직내 endogenous 하게발현하는 MMP3 단백질은표피층에존재하는것으로살펴보면 (A), (B) 의검 출정도가비슷함으로일반적인조건의세포에서황칠이 치지않는것으로관찰된다. MMP3의발현에영향을미 그림 UV(-) 조건에서의 MMP3 Immunohistochemistry. UV negative 조건에서 1ug/ml 황칠액을처리한후관찰한결과로, (A) 는 Mock, (B) 1ug/ml ( 최고) 농도의황칠원액을처리하여 200x배 율렌즈로확인하였다

또한 UV-B 하루 1시간씩 3 일노출시킨후, 분획물을처리한결과( 그림 2.1-35), (C) 에서검출되는 MMP3 단백질발현량에비하여 (D) ethyl acetate A 와 (E) ethyl acetate B를처리한표피층에서 MMP3의전체적인발현량은감소하지만정량을하 였을경우 (D) ethyl acetate A 에서그양이현저하게감소하였다.

146 또한 UV-B 하루 1시간씩 3 일노출시킨후, 분획물을처리한결과( 그림 ), (C) 에서검출되는 MMP3 단백질발현량에비하여 (D) ethyl acetate A 와 (E) ethyl acetate B를처리한표피층에서 MMP3의전체적인발현량은감소하지만정량을하 였을경우 (D) ethyl acetate A 에서그양이현저하게감소하였다. 또한 UV에의해 증가하였던표피층의두께가감소함을확인하였다. 이러한사실은앞서모든결과 를뒷받침하며, ethyl acetate A분획물이 in vivo에서도광노화과정을저해시키데 효과적인기능성물질임을보여주는결과이다. 그림 UV(+)-1시간노출조건에서의 MMP3 Immunohistochemistry. UV-B를 1시간 3 일노출시킨후각각의분획물을처리한것으로 (C) Mock, (D) ethyl acetate A 1ug/ml 농도를처리, (E) ethyl acetate B 1ug/ml 농도로처리하여 200x배율렌즈 로확인하였다. (2) 기능성화장품의시장성및성분, 효과에대한자료조사 ( 가) 화장품산업전망 삼성경제연구소에따르면글로벌금융시장에대해앞으로현재와같은글로벌 금융위기는점차진정될것으로보고있다. 그러나미국을비롯한선진국경제의 침체와신흥국경제의둔화가본격화되면서하강국면에들어서있기때문에전문가 들은 2009년한국경제가직면한대외환경은 2001년이후가장악화된상황으로판 단하고있어올해경기침체가본격화될것으로전망되는가운데체감경기가더욱 위축되는등최악의상황이예상되고있다. 이렇게외환위기와물가상승등경제지표가바닥수준에서머물고있는가운데 에도국내화장품산업경기는 2008년 10.8% 의성장률을보이는등다른소비재상 품군에비해높은성장률을보이고있어국내화장품시장은지속적인성장을할 것으로전망되고있다. 2009년경제성장률이 2% 대로낮아지지만아모레퍼시픽에서 발표한 2009 화장품시장전망및트렌드 보고서에서는화장품내수시장은 6.2%

147 성장해시장규모가 7 조원을돌파할것이라고전망했다. 98년외환위기당시에도 화장품시장은 -0.2% 하락에그쳤을만큼국내화장품내수시장은튼튼하기때문 에, 다른산업에비해서는경기의영향을덜받을것으로예상된다. 그러나소비자 들의구매패턴의변화로인해부익부빈익빈의기업양극화는더욱심화될것으로 보이기때문에중소업체들은차별화에성공하지못한다면고전을면치못할것으로 예상된다. 그러므로이러한시장상황에서, 천연물을이용한기능성화장품의개발 은비용효과적인면에서매우매력적인연구분야라할수있다. ( 나) 기능성화장품의성분분석 기능성화장품은일반화장품에비해생리활성이강조된화장품또는기능이강 조된화장품을말한다. 2000년 7 월부터시행한국내화장품법( 제2 조제호, 동법시행 규칙제2 조) 에서는기능성화장품을피부멜라닌색소침착을방지하거나엷게하 는미백화장품, 주름개선제품, 일소및일소방지용제품으로정의하고있다. 2008년 10 월식약청은안전성 유효성이확보돼자료제출이생략되는기능성화장 품의성분함량허용기준이고정된특정수치에서일정범위의구간으로변경하였 다. 예를들면미백기능성화장품의알부틴함량이 2% 에서 2~5% 로, 에칠아스코빌 에텔함량이 2% 에서 1~2% 로변경되며, 주름개선기능성화장품의폴리에톡실레이티 드레틴아마이드함량은 0.2% 에서 0.05~0.2% 로바뀌었다. 이와같이정부에서는기 능성화장품을신속히개발할수있도록심사의절차적규제를개선하고있다. 다음은시판되고있는기능성화장품성분의종류와기능을분석한내용이다. 1 미백화장품성분 기미나주근깨와같이피부표면에침착되는멜라닌색소의합성은, 표피멜라닌 세포인멜라노좀이라는세포에서시작된다. 멜라닌의전구체인티로신이자연산 화하는생합성의초기단계인도파와도파퀴논을거치게되는데, 이때티로시나 제라는효소의작용에의해멜라닌이합성된다. 따라서티로신이도파와도파퀴 논으로산화하는과정에관여하는티로시나제의활성억제함으로써멜라닌형성 이억제되고, 이에의해피부미백의결과를가져올수있다. 또한, 항산화작용 을갖고있는물질을적용시켜산화형멜라닌을환원형으로되돌려산화를방지 함으로멜라닌의합성이저해되기때문에이러한경로들을차단하는많은화합 물과식물성추출물이현재개발보고되어있다

148 - 멜라닌(melanin) 색소환원 비타민C (Ascorbic acid): 신선한야채, 과일등에많이함유되어있으며강한 환원력으로체내항산화작용이있다. 인체에대해안전하지만체제의안전성이 나빠비타민C 유도체로개발하여사용하고있다. 비타민C 유도체: 산화방지를위해분자구조를변형한형태로사용하며아스코르 빅인산마그네슘, 비타민 C 팔미테이트, 비타민 C 디팔미테이트, 비타민 C 스테 아레이트, 비타민 C 마그네슘포스페이트등이있다. 순수비타민C에비해안전 성은뛰어나나효율성이떨어진다. 티로시나제효소작용억제 알부틴 (albutin): 월귤나무의잎, 우바우루시나무의잎등에다량존재하는화합 물질이며, 하이드로퀴논과포도당이결합한배당체 (hydroquinone-β -D-gluco-pyran oside) 형태로티로시나제효소의활성을억제한다. 2 코직산 (Kojic acid): 누룩에서발견된감마피론계( γ-pyrone) 계의화합물이며, 티 3 로시나제의구조내부에함유되어있는구리를제거하여티로시나제가산소와 결합하는것을도와주고티로신을도파(Dopa), 도파퀴논(Dopa quinone) 으로산 화시키는효소작용을억제한다. 기타천연물에서상백피추출물, 닥나무추출물, 감초추출물등플라보노이드계 물질이항산화효과가있어티로시나아제를비활성화시키는것으로밝혀지고 있다. - 각질층제거 1 AHA(Alpha-Hydroxy Acid): 글리콜릭산(glycolic acid), 젖산(lactic acid), 모노 카르복시산(monocarboxylic acid), 말릭산(malic acid), 디카르복시산 (dicarboxylic acid), 시트릭산(citric acid), 트리카르복시산(tricarboxylic acid) 등이있다. 알파위치에카르복시그룹이존재하는직쇄상의구조로수용성으로 각질층의이온결합을방해하여각질층에함유된멜라닌색소를제거한다. 자극유발, 자외선에대한민감성증가의문제점이있다. 피부 2 BHA(Beta Hydroxy Acids): 살리실산이대표적인화합물이다. 베타위치에카 르복시산을가지는유기방향족카르복시산으로지용성이다. 피부의각질을박리 함으로서각질층에함유된멜라닌색소를제거한다. - 자외선차단: 자외선차단물질은자외선차단화장품에속하며미백화장품에서는보조성분으로만사용한다

149 1 2 3 물리적차단제 ( 무기자외선산란제): 자외선이피부에흡수되지못하도록피부표 면에서빛을반사또는산란시켜차단한다. 산화아연, 이산화티탄, 탈크, 카올린, 산화마그네슘등을들수있다. 자외선차단제: 유해자외선을흡수하여열, 진동으로변동시키는화학적방법에 의해피부를보호한다. 벤조페논, 디옥시벤존, 옥틸디메칠파바, 옥틸매톡시신나 메이트, 부틸메톡시디벤조일메탄을들수있다. 화학적차단제 ( 유기자외선흡수제): 이산화티탄과산화아연등의무기분체는백 색의미세한분말로피복력, 착색력, 흡착력이우수하고자외선을반사시키는 성질이있어자외선차단제로쓰인다. - 선탠 태닝: 자외선A 는투과가되며, 선번을일으키는자외선B는흡수시키는성분을배합 하여사용한다. 피부각질층에함유된아미노산을갈색의색소로만들고피부 각질층윗부분에만작용하기때문에색소침착의우려가없다. 디히드록시아세 톤등이사용된다. - 멜라닌세포사멸 하이드로퀴논을사용하여멜라닌세포를사멸시키는방법은가장확실하게멜라닌 의생성을억제할수있으나피부적용시접촉성피부염을일으키고심하면백반 증을유발시킬수있어화장품배합금지원료이다. 판매되는크림에는 5% 미만사용되고있다. 약용으로병원이나약국에서 기능성미백화장품소재개발연구는멜라닌생합성저해, 자외선흡수및차단, 각질용해, 피부세포의활성부활등에초점을맞추어연구가진행되고있다. 그중 에서도특히멜라닌생합성율속효소로알려져있는 tyrosinase 생합성저해물질개 발에많은연구가집중되었고 arbutin이나 kojic acid 등이개발되어활용되어왔다. 그러나이들 tyrosinase 생합성저해물질이멜라노좀까지도달하여우수한활성을 보일수있을것인가에는많은의문점이제시되고있다. 따라서미백화장품소재 개발연구는멜라노좀까지의침투능력, 케라티노사이트와의상호관계, 표피세포의 분화재생능력등다각적인검토가필요하다. 실제 in vitro 상에서는 tyrosinase 효소저해활성이매우우수함에도불구하고동물실험또는 in vivo 을나타내지않는화합물이대부분이기때문에참고할필요가있다. 실험에서활성

150 2 노화주름방지화장품성분 노화방지화장품개발을위한연구의타깃은주로표피세포의분화재생분야, 포외기질(ECM) 응용분야, 또는활성산소(ROS) 제어분야이다. 세 - 표피세포의분화재생을조절하는항노화화장품성분 Retinoid, alpha-hydroxy acid (AHA), PHA, mevalonolacton - 세포외기질(ECM) 성분을조절하는항노화화장품성분 1 콜라겐대사제어성분 콜라겐은 3중구조를가진비교적안정한선유상의단백질로피부의탄력을유 지시켜주는대표적인물질이다. 콜라겐대사에는콜라겐분해효소인 MMP-1 단백질이관여한다. MMP-1의생산을촉진하는성분으로는 Pangamic acid의생 리활성성분인 DADA, 주름개선효과가인정되고있는 silicic acid 등을들수있 다. Silicic acid는콜라게나제의유도활성이외에도공유결합에의한 hyaluronic acid 등의 matrix 구조에관여하며, 또한표피세포의각화불용성막형성을촉 진하는효과가있다. 피부의탄성을증가시키는 N-methyl-L-serine(NMS) 등도 MMP-1 단백질의유도활성이있음이알려졌다. NMS는선유아세포의 hyaluronic acid 합성효소활성을촉진하는효과도있다. 또한주름은일상생활에 서 UV의노출로유도되는 MMP 단백질에의해서콜라겐이분해되어생기도한 다. 따라서 MMP-1 단백질합성저해제는주름개선소재로활용되고있으며 주름개선효과가강한것으로알려져있는 RA(retinoid) 는 MMP-1 단백질합성 을전사레벨에서제어함으로서기능을나타낸다. 그밖에 Fibroinpeptide, VitaminC, 울롤산벤질에스터등이있다. 2 엘라스틴대사제어성분 콜라겐과함께 ECM 단백질의일종인엘라스틴대사를제어하는물질들이기능 성항노화소재로개발이용되고있다. 엘라스틴은콜라겐에비하여 ECM에존 재하는량이적으나피부탄력성에크게기여하고있으며특히광노화피부에서 는변성엘라스틴이축적되는문제가중요하기때문에주름형성과엘라스틴을 함유하는탄성선유의미세구조변화와의관계에대하여도연구가진행되고있 다. 3 히아루론산대사제어성분 고분자다당으로피부에서중요한 ECM 성분으로주목을받고있는 hyaluronic acid 는높은수분보유기능이있어항노화소재로각광을받고있다. hyaluronic

151 acid 는표피, 진피, 각층등전부위에서작용하나콜라겐과는대조적으로수명이 짧은특징이있다. - 활성산소(ROS) 제거물질을이용한항노화화장품성분 알파-tocopherol, Co-enzyme Q10, 알파- 토코페롤, Vitamin C, Anti-aging ( 칼시 논,curcumin, 타우린) 등이활용되고있다. ( 다) 기능성화장품에대한자료조사 1 시판되고있는기능성화장품에대한자료조사 - 기능성화장품에대한식약청심사및승인현황 식약청에서는매년기능성화장품에대하여심사받은품목리스트를발표한다. 심 사품목이란, 화장품평가부에관련서류를제출하여일정기간심사를받아서기능성 화장품으로받는것으로서고시외성분들에대하여식약청에제출하는것을말 한다. 식품의약품안전청이발표한기능성화장품심사현황에따르면지난 2002년 기능성화장품이국내시장에첫선을보인후 2008년초까지출시된기능성화장 품은총1 만건이넘었다. 2008년식품의약품안전청은기능성화장품심사건은모두 3천여건이넘었다고공개하였으며이는 2006년 2206건보다약 29% 가증가한수 치다. 표 년기능성화장품심사현황 기능 심사건수 미백 819 건( 수입 77 건) 미백/ 자외선차단 102 건( 수입 8 건) 미백/ 자외선차단/ 주름개선 79 건( 수입 0 건) 미백/ 주름개선 298 건( 수입 5 건) 미백/ 주름개선/ 자외선차단 10 건( 수입 0 건) 자외선차단 905 건( 수입 171 건) 자외선/ 주름개선 44 건( 수입7 건) 주름개선 829 건( 수입 88 건) 주름/ 자외선차단 9 건( 수입 4 건) 특히미백과자외선차단, 주름개선등의기능을복합적으로심사받은복합기능성 화장품이대폭늘어 2005년 66 건, 2006년 202건에비해폭발적으로증가한 542건을

기록했다. 또한 3 중기능성화장품심사도많아미백& 자외선차단/ 주름개선이 79 건, 미백/ 주름개선/ 자외선단이 10 건으로나타났다. 이는 2005 년도미백/ 자외선차단/ 주름 개선 5 건과지난해미백/ 자외선차단/ 주름개선 1 건, 미백/ 주름개선/ 자외선차단 8건 에비교해큰폭의증가세다. 이러한 2~3 중기능성화장품의국내제조율도크게성장한것으로나타났다.

152 기록했다. 또한 3 중기능성화장품심사도많아미백& 자외선차단/ 주름개선이 79 건, 미백/ 주름개선/ 자외선단이 10 건으로나타났다. 이는 2005 년도미백/ 자외선차단/ 주름 개선 5 건과지난해미백/ 자외선차단/ 주름개선 1 건, 미백/ 주름개선/ 자외선차단 8건 에비교해큰폭의증가세다. 이러한 2~3 중기능성화장품의국내제조율도크게성장한것으로나타났다. 2006년 193건의 2중기능성화장품심사건중 13건이수입심사건에반해 2007년에 는수입심사건이 24건으로전체심사건수에비해수입화장품의심사건은크게늘 지않았다. 하지만전체수입화장품심사건은 360건으로 2006년 285건에비해증가 한것으로나타나글로벌수입사들의기능성화장품진출이늘고있음을나타냈다. 그림 효능, 효과별승인현황. 효능, 효과별승인현황을보면전체 1,957 품목중미백화장품이 789품목으로 40.3% 를차지하여가장큰점유율나타냈다. 다음으로자외선차단에도움을주는 화장품이 522품목을차지했고주름개선에도움을주는화장품은 499 품목이었다. 여 러가지기능을한제품에접목시킨복합기능성화장품의허가도큰폭으로늘었 다. 미백과자외선기능을동시에갖춘화장품이 43품목에달했으며미백과주름개 선기능을갖춘화장품도 92 품목이인증됐다. 주름과자외선차단기능을함께갖춘 화장품은 6개품목이었고미백과주름그리고자외선등세가지기능을동시에갖 춘복합기능성화장품도 6 개품목이식약청의인증을받았다. 연도별기능성화장품 승인현황을보면기능성화장품제도가처음으로시행된 2001년에는 477품목이었으나 이듬해인 2002년에는 775품목으로 62.5% 가늘어났다. 2003년에는 1,017품목으로전

153 년에비해 31.2% 가늘어나증가세가다소누그러지는양상을나타냈으나 2005년에 는한방기능성화장품시장진출의활성화등시장요인에의해전년대비 장을이루었다 50.8% 의성 - 특허출원현황 1990 년대이전에는기능성화장품에대한기술개발이미미하여특허출원건수가 저조하였으나 1990년대이후에들어와서는기능성화장품법이법제화되면서기능성 화장품기술개발이본격화됨으로서특허출원이활발하게되었다. 표 기능성화장품국내특허출원현황 구분 1990년이전 1990년이후 합계 비율 (%) 미백 주름개선 자외선차단 계 특허출원된미백화장품의핵심성분은천연추출물이 57% 로가장많은비중을 차지하였다. 그다음은신규유기화합물로 27%, 기존에알려진미백성분은비타 민C 유도체나코지산유도체, 레티놀유도체등이 16% 로나타났다. 이와같이미백 화장품원료개발은천연식물연구등우리나라전통의학에기반을둔원료개발이 식물성화장품에대한선호도가높은우리나라소비자들의요구와맞물려국내화 장품개발의주력분야가되고있다. 국내업체들의천연추출물성분을이용한미 백화장품특허동향에대해외국업체들은 90년대초까지만해도주로유기화합 물에대한출원이주류를차지하였으나, 90년대후반으로접어들며천연물을통한 새로운미백성분을집중적으로연구하고있는것으로나타나천연추출물미백화 장품성분연구가세계적인흐름으로정착될것으로전망되고있다

154 표 미백관련천연추출물특허출원현황 출원인 ( 주) 엘지생활건강 ( 주) 태평양 천연추출물의종류반하, 은행엽, 천동문, 백작약, 백합, 현삼, 여응향, 사삼, 백출, 백질려, 선학초, 지정, 와송, 모과초, 해백, 원화, 삼칠, 청과, 석고, 시체, 마발, 랄료목단피, 백교향, 금사도, 미인초닥나무, 상백피, 오배자, 안선약, 개자, 후박, 국화, 명일엽, 양강, 초장근, 소나무속식물, 대황, 백출, 포도, 쳔련자, 파고지, 오수유, 천련자, 익모초, 일당귀, 감초, 삼칠근, 무이, 학슬, 감송향, 대계근, 유근피, 삼내과 코리아나율피, 녹두+AHA, 낙엽송, 상지, 초피나무씨앗 나드리 쌀, 배양유산균 제일제당 실리, 아카시아, 송이+ 기린초, 황금+ 목단피+ 회화송 애경산업 죽내피, 바다제비집+ 알부틴 해태제과 소나무, 잣나무, 쑥 참존 창이자 개인 도토리, 대두흰생콩가루, 포도+ 인삼, 인삼알카로이드 산쇼오세이야쿠가부시키가이샤 태반, 간장추출물 암웨이 아세로라버찌, 애기월귤 로레알 뽕나무+ 골무꽃추출물+ 살리실산유도체 죤슨앤죤슨 콩과식물, 변성되지않은콩 시세이도 글리리시디아속, 브리켈리아속 유니레버 태반 표 노화방지관련천연추출물특허출원현황 출원인 ( 주) 코리아나 ( 주) 태평양 ( 주) 엘지생활건강주바이오랜드참존동양화장품 천연추출물의종류강낭콩, 빈랑자, 율피, 정향, 건칠, 초두구, 죽여, 인진호, 육계피, 가자, 울금, 소엽, 대황, 황백, 괴화, 금오구척, 우방자, 산사자인삼, 치마버섯, 황백, 정향, 당근, 녹차, 상황버섯, 사과, 파파야, 파인애플, 상륙, 토사자, 백강잠, 곽향, 첨호, 침향, 홍경천 ( ) 누에고치, 표고버섯+ 동충하초 창이자 목단피 제일제당 에뮤지방추출물, 송이추출물 라미화장품 도토리 나드리 한국형유산균 소망화장품 홍삼+ 상백피 개인 어성초, 유자씨저족+ 녹각, 파인애플+ 코코넛, 초두구, 오배자, 개자, 후박 암웨이 아세로라체리, 귀리 아도반스트스킨리서치 차조기과식물 라보라뚜와레밤바라넛, 오크라종자

155 - 기능성화장품에사용되는식물원료소재 현재사용되고있는기능성화장품식물원료의예를들어보면다음과같다. 1 Arnica 추출물; 아르니카는프랑스고산식물로타박상이나혹을치료하는데효 과적이다. 또한얼굴피부를부드럽게해주며햇빛으로부터의피부손상을막아 준다. 2 알로에; 있다. 피부보호화장품으로널리이용되고있으며피부손상의회복에효과가 3 Barberry 추출물; 주요성분이 berberine으로항박테리아성질을지닌알카로이드 이며뛰어난항염증작용이있다. Bromelain; 파인애플식물종류에서얻어지는단백질분해효소로서과도한피지 와각질을효과적으로제거하여피부를청결하게유지시키고폐쇄된모공을뚫 어줌으로서모공내에서의미생물번식을억제시킨다. 있다 피부보호와미백효과가 Calendula 추출물; 금잔화는염증예방에뛰어나고, 일반적인습진, 피부병및가 려움증을막아주며, 두피를진정시키고항균작용이있다 Asiaticoside; 탁월한항균력과세포재생효과를가진성분으로흉터방지약품의 주원료이기도하다. 항염증작용이있다 7 Camomile 추출물; 국화과인안테미스노빌리스의꽃머리에서추출한다. 곪는것 을막고진정제역할을하며항과민작용과항산화작용이있다 8 Echinacea 추출물; 국화과허브의일종으로면역기관의기능을강화하고감기 감염증에저항하는자연치유력과면역력을증강시키며항피부노화작용이있다. 9 Tea tree 오일; 호주의멜라루카(Melaleuca alternifoliatre) 의잎에서추출되며피 10 부에생기는여러가지상처에천연항생제와같은역할을하는성분으로많이 이용된다. 인도육계추출물; 계피의유효성분인 계피알데히드 가선천성면역계를억제하는 방법으로항암 항염증효과를보인다. 배양된세포에서계피알데히드가 Toll-like receptors의활성을억제해암과염증유발에관여하는 NFkB와 IRF의활성을 낮춘다. 피부보습효과가뛰어나다 11 Centipedaminima 추출물; Phytoplenolin으로피부상처회복에좋은효과를보 인다. 매년수십만의화상환자들이발생하므로이제품의시장성또한좋을것으 로판단된다. 12 Tea Polyphenol; 녹차추출물주요성분이며뛰어난항산화작용으로이미화장

156 품이널리이용되고있다. 이외약물성화장품으로이용되고있는식물추출물로는 Hamamelidis, Lithosp ermum, Peppermint 오일, Thyme 추출물, Borage seed oil, Oriental bittersweet, Tamarind 열매추출물, Pine bark 추출물, Anthocyanin, Gingko flavone 등이있으 며이상의제품들은식물성원료의일부에지나지않다. 미국의 2000년도식물화 장품원료 Reference handbook에수록된식물원료는 1000여종에이르고있어식물 원료에의한기능성화장품의개발전망은매우밝다고할수있으며, 황칠의경우 아직시장에알려져있지않고또한특허성분으로등록되지않아개발이시급하 다. 3 기능성화장품 R&D기술의개발동향및연구방향 약용식물로부터미백활성소재를탐색하고자하는연구는국내의많은연구자들 에의해서진행되고있다. 최근색소생성관련정보전달계유전자의기능에밝혀 지면서미백화장품신소재의개발연구도새로운양상을띄우고있다. 최근에는 tyrosinase 와관련된유전자발현기작이밝혀지면서멜라노사이트내에서의특이 적유전자의발현조절과관련된미백소재의연구가급속히발전하고있다. 그중 에서도 tyrosinase 유전자 family인 tyrosine-hydroxylase, DOPA-oxidase, TRP-1(tyrosinase related protein-1), TRP-2 MITF(microphthalmia-associated transcription factor) 및 전사인자인 등의유전자발현을저해 하는미백제의개발이급진전을보이고있다. 또한 MITF 이외에도 MC1R이나 c-kit 등싸이토카인수용체와관련된연구가활발히진행되고있다. 그결과 ellagic acid 및 flavonoid 계열의화합물이외에도 cinnamaldehyde, p-hydroxybenzoic acid, p-anicic acid 등도활성이있음이확인되고있다. 이들 화합물들은 tyrosinase 저해활성뿐만아니라온화한자외선흡수효과와함께항 산화활성등이강하여종합적으로미백활성을나타내는것으로판단된다. 최근에는백출로부터 있다. 또한 selina란물질을분리하여미백화장품개발에성공한예가 그밖에도멜라닌생합성에직접적으로관여하고있지는않지만, 멜라노좀구조 단백질인 Lamp family, 멜라노좀의형성에관여하며 G protein coupled receptor로 알려져있는 PAR-2, keratinocyte의 phagocytosis function을가지고있는 soybean trypsin inhibitor, SCF/c-kit, ET-1(endothelin-1), MSH, PI3-kinase, calnexin 등의

유전자발현조절을통한신개념의신소재연구도향후활발히진행될것으로주목 된다. 표 2.1-5. 화장품 R&D 기술의연구방향. (2006 년화장품연감자료참조( 기능성화장품 TRM)) 위 ( 표 2.1-5) 에서보는바와같이국내화장품기술의연구방향을보면향후 3 년은국가경쟁력확보에주력할때이다. 국내화장품산업은정밀화학제품중의 약산업다음으로큰시장을형성하며국가산업을지탱하고있다.

157 유전자발현조절을통한신개념의신소재연구도향후활발히진행될것으로주목 된다. 표 화장품 R&D 기술의연구방향. (2006 년화장품연감자료참조( 기능성화장품 TRM)) 위 ( 표 2.1-5) 에서보는바와같이국내화장품기술의연구방향을보면향후 3 년은국가경쟁력확보에주력할때이다. 국내화장품산업은정밀화학제품중의 약산업다음으로큰시장을형성하며국가산업을지탱하고있다. 그중에서도특 히기능성화장품시장은매년 도불구하고현재화장품원료는 8% 90% 이상의높은증가율을보이며성장하고있음에 이상을해외수입에의존하고있고그수입 증가율도점점가속화되고있는실정이다. 이는국제적으로경쟁력을가질수있는 신소재를확보하지못한데그원인이있으므로앞으로신소재개발을통한경쟁력 확보가최우선과제로서, 정부뿐아니라민간연구소의많은연구력과비용투자 의규모가앞으로의향장재료분야의전망을예측하는데필수적인요소가될것이 다

158 라. 고찰 3 차년도에는유효물질의정제법확립을위하여세분화한분획물을사용하여황 칠성분의미백효과와항노화기능을확인하는실험을수행하였고, 또한천연기능 성기초화장품및색조화장품시제품개발을위하여기능성천연화장품에대한자 료조사를수행하였다. 3 차년에걸친실험결과를바탕으로황칠은미백효과와함께광노화를방지하는 기능성화장품의원료로개발할가치가있음이확인되었으며. 황칠분획물중 ethyl acetate 분획물이 특히본연구에서는 in vitro 뿐아니라 in vivo 에서도효과가있 음을확인함으로서두가지기능에효과를나타내는물질을정제할수있는실험적 바탕을마련하였다. 이연구의결과는앞으로제품의순수기능성물질의정제법 확립및성능분석에기초가되어시제품생산연구에도움이될수있으리라기대 한다. 미백기능성화장품의개발소재들은주로티로시나제의억제, 항산화제에의한 환원작용, 멜라닌의전이억제기작등으로다원화되었으나, 기대하였던것에비하여 효과가크지못한것이현실이다. 이러한이유로많은개발품들이시중에판매되지 못하고사장되는경우가많다. 최근에는각단계별타겟에대한물질을개발하는 양상에서벗어나멜라닌생성세포의생물학적조절에대한연구가진행됨에따라 멜라닌세포와멜라닌세포의주위환경의조절에의하여멜라닌생산을조절하려는노 력이시작되고있기도하지만, 기능성화장품특허현황이나승인현황을보더라도, 당분간은화장품소재분야에있어서천연물을이용한계면활성제, 보존료, 색소, 향 등의개발이활발할것이며이에따라새로운미백제들이생약성분으로부터추출하 는방법으로계속개발될것으로보인다. 따라서본연구과제에서미백과노화방 지에서기능을보이는것으로나타난황칠의경우유효성분완전정제되고황칠로 부터정제된신물질의분자유전학적인기능을밝힌다면, 국내시장뿐만아니라세 계시장에서국제경쟁력을가지고세계화장품시장에진입할수있는기회를얻을 수있으리라기대한다

159 제 3 절황칠수액기능성화합물의분리, 분석및구조확 인연구, 급성, 아급성, 독성연구를통한인체안 정성연구 ( 제2세부 2 연구과제) 1. 1 차년도연구결과보고서 가. 연구개발목표 1 차 천연물질인황칠나무수액의정제방법연구 연도 황칠수액의급성독성연구 나. 연구개발수행내용 - - 컬럼을이용하여황칠수액의정제연구 황칠수액에대한급성독성검사연구 가 ) limit value test 나) LD 50 계산(Litchfield-Wilconxon 도해법) 다. 천연물질인황칠나무수액의정제방법연구 (1) 실험재료및방법 ( 가) 실험재료및분석기기 본실험재료로사용된황칠나무 (Dendropanox morbifera Lev.) 는우리나라남부 해안지역인완도와해남그리고제주도등에서자생하는두릅나무과에속하는상록 활엽교목이다. 황칠나무는학명에서뜻하는것과같이목본(Dendro) 전능약(panax) 이라는의미가있고, 황칠액의주성분은정유성분으로수액은도료로이용하고수 지는거풍습과활혈의약효가있다고보고가되어있다. 그러나황칠나무는약용으 로보다는우리나라고유의정통수지도료인황칠공예에주로사용되고있다. 이

160 와같이용도가다양한황칠은나무의수피에상처를내면유액이흘러나오는데이 유액이누런색이어서황칠이라는이름이붙어졌다고한다. 황칠나무에관한최초의 과학적연구는 1937년황칠의정유성분에대한연구로황칠은일종의정유성분으로 서주성분은 2중결합이 2 개있는쌍환성세스퀴테르펜이며그이외에알코올, 에테 르등의성분을함유하고있다고보고되었다. 그이외에도국내연구진에의해서 많은연구가이루어졌으나황칠수액에대한미백작용에체계적인화학연구는아직 미흡하다. 황칠수액을추출및정제하기위하여사용된시약으로는 Ethanol(J.T Baker, U.S.A), Ethyl Acetate(J.T Baker, U.S.A), n-hexane(j.t Baker, U.S.A), Acetone(J.T Baker, U.S.A), Chloroform(Aldrich Co. U.S.A) 등을사용하였다. 관크 로마토그래피법에사용된충진물은 silica gel 60 F 254 (Merck Co.) 를사용하였고, TLC plate는 silica gel F 254 를사용하였다. 황칠수액엑스를제조하기위하여사용 된증발농축기(Rotary Rotavapor RE 121, Bűchi Co., Switzerland) 를사용하였고, 황칠수액의분리및정제를위하여사용된 MPLC(middle pressure liquid chromatography, YAMAZEN 540) 를사용하였다. 무기물분석은유도결합플라스마 (ICP, Perkin Elmer 3300XL) 을사용하였다. ( 나) 황칠수액엑스제조및분획추출 1 황칠수액엑스제조 황칠나무에서얻은수지액은우유빛깔의액을분비하는데공기중에서산화하여 점차노란색으로변한다. 이렇게얻은황칠수지액의엑스추출은 2구플라스크에 수지액 5g 넣고환류냉각기를장착한후 의수욕조에서 100% 에탄올 100mL로 3시간씩 3회반복추출하고여과하여여액을합하여증발농축기에서감압 농축하여황칠수액엑스를제조하였다. 2 황칠수액의분말제조 황칠수지액의분말제조는 2구플라스크에수지액 5g 넣고환류냉각기를장착한 후 의수욕조에서 80% 에탄올수용액 100mL로 3시간씩 3회반복추출하 고여과하여여액을합하여증발농축기에서감압농축한후냉동건조기 (Freezing Dryer, Ilshin Engineering Co.,) 에서건조하여황칠수액의분말을제조하였다

161 그림 Fractionation of the extraction from Dendropanox morbifera Leveille. ( 다) 관크로마토그래피(Column Chromatography) 를이용한황칠추출수액의 정제 Chromatography 는고정상과이동상간의흡착(adsorption) 또는분배(partition) 를 이용한분리정제법으로, 일반적으로고정상이고체인경우는흡착형, 액체인경우 는분배형이다. 본연구에서는박층크로마토그래피(TLC, thin layer chromatog raphy) 를이용하여극성이작은것으로부터큰것으로변화시키면서극성이작은 물질을먼저용출시켰다. 박층크로마토그래피는 silica gel 흡착제를균일하게입혀 져있는 silica gel F 254 ( 두께 mm) 를사용하였다. 황칠수액을 1.3.2에의해서 추출된엑스를 TLC 를이용하여황칠수액을분리정제하였다. 이때사용된각각의 용매는정제하여사용하였고, Hexane : acetone의비율을변화시켜가면서분리능

을증대하여 R f 치를측정하였다. 최적의분리용매를선정한후 MPLC의기기장치 ( 그림 2.2-2) 를이용하여황칠수액을정제분리하였다. 그림 2.2-2. Instrument and system of MPLC.

162 을증대하여 R f 치를측정하였다. 최적의분리용매를선정한후 MPLC의기기장치 ( 그림 2.2-2) 를이용하여황칠수액을정제분리하였다. 그림 Instrument and system of MPLC. ( 라) 정제된황칠수액의무기물성분분석 황칠수액추출액중유기물을 500 전기로에서 5시간동안회화하여유기물을제 거하였고, 이것의일정량의무게를취하여질산용액에넣어무기물을파괴시켜유 도결합플라스마를이용하여황칠수지속에들어있는무기물을분석하였다. (2) 실험결과및고찰 ( 가) 황칠수액의관크로마토그래법에의한분리및정제 정확한추출및정제방법은사용하는식물의부위와수분함량에따라, 또는어 떤물질을추출하느냐에따라결정된다. 일반적으로알코올은추출용매로써가장

163 좋은용매이다. 본연구에서도알코올로수욕상에서 3시간동안 3회추출하여여과 하여추출물을얻었다. 이렇게추출된황칠수액엑스를에탄올 100mL에용해시켜 시료용액을제조하였다. 이때사용된용매는유전율이적은 n-hexane으로부터유 전율이큰 Acetone 으로변화시키면서, n-hexane : Acetone의농도변화에따라분 리능을조사하였고, 사용된발색제는자외선램프(254nm) 을사용하였고, 이때사용 된전개용매의농도변화에따른분리능및R f 값은표 2.2-1과그림 2.2-3에나타내었 다. 표 R f value of extract and resolution at varying development solvent in Dendropanox morbifera Leveille(referred to 그림 ) Development solvent. Ratio Spot No. R f Etc. n-hexane : Acetone 100 : 0 spot spot spot 그림 2,2-3(a) n-hexane : Acetone 90 : 10 n-hexane : Acetone 70 : 30 spot 1 ~ 5 n-hexane : Acetone 0 : 100 spot spot spot spot spot overlap spot spot spot 그림 2,2-3(b) Optimum Resolution 그림 2,2-3(c) 그림 2,2-3(d)

164 (a) (b) (c) (d) 그림 TLC spot of each fraction of extract. (TLC condition : n-hexane Acetone at varying development solvent) ( 나) 황칠수액엑스의 MPLC에의한분리및확인 상기에서추출된황칠수액엑스를에탄올 100mL에용해시켜시료용액을 MPLC 를이용하여황칠수액추출물속에포함되어있는유기산을분리하였고, 이때사용 된기기명및조건은표 와같다. 사용된이동상은유전율이적은 n-hexane(0.06) 로부터유전이큰 Acetone(5.40) 으로농도변화를하면서황칠수액 을정제분리하였다. 이렇게얻은 MPLC 크로마토그램은그림 2,2-4 에나타내었다. 각각의분리된성분은 TLC로 spot 을확인하였고, 이때황칠수액추출액속에가장 많이포함하고있는단일물질을분리하여진공증발기를이용하여용매를제거하 고, 남은결정은에탄올소량에열을가하여녹인후실온에서방치하여재결정법 을이용하여황칠수액을정제하였다

165 표 Operation condition of MPLC(Middle Pressure Liquid Chromatography) Model : YAMAZEN 540 Column : YAMAZEN (30mm 300mm), Merck silica gel 60 Mobile Phase : Hexane Acetone Ethanol Flow rate : 10mL/min Detector. : UV-254nm Chart speed : 1.25mm/min. (a) (b) (c) 그림 MPLC chromatogram of Dendropanox morbifera Leveille in hexane (a), n-hexane : acetone(b) and acetone(c) extract. 그림 2,1-4(a) 는 n-hexane를이용하여황칠수액엑스중비교적극성이적은물 질 2 가지를분리정제하였으며, 또한 TLC에 spot에대한 Rf값을구한결과를이 용하여극성의크기를이용하여 n-hexane : Acetone = 90 : 10의전개용매를이용 하여극성이큰물질 3 가지를얻었다. 마지막으로 Ethanol를이용하여컬럼내에있 는모두물질을추출하였으나 TLC spot는검출되지않았으므로그이후에는추출 물질없다고판단된다. 그러므로 2, 3차년도에는 pilot의개념을가지고양을증가시

166 켜정확한정제방법을다시한번확인하고, 이것에대한물질을 GC, GC/MASS, NMR, FT-IR 분광광도계등을이용하여미백작용에대한반응메카니즘을연구하 고자한다. ( 다) 황칠수액의무기물성분분석 기능성화장품에서무기물질은자외선에대한반사율도크고, 일소방지효과를 갖출뿐만아니라여러가지착색원료로써사용되고있다. 이와같은분말원료는 피부표면에부착하여피복하는것을주목적으로하므로, 부착하기쉽고, 피복성이 좋은것이어야하므로이에천연물속에포함되고있는무기물들에대한효과가클 것으로사료된다. 본연구에서황칠수액중에유도결합플라스마를이용하여무기물 분석한결과를표 에나타내다. 황칠수지속에포함된무기물은유기물을안전 하게유지하게할수있는안전성있는화합물을만들기도한다. 본황칠수액속에 1,121ppmn Ca 혹은 113.5ppm Mg이환원제로사용될수있는물질을안정하게할 수있는역할을한다. 또한 Hg 및 As 은검출되지않아서독성도없다. 표 Components of Dendropanox morbifera Leveille. Components Concentration(ppm) Na Fe Ca 1,121.0 P Mg Cu 1.1 Zn 9.4 Mn 27.3 Hg 불검출 As 불검출

167 라. 황칠수액의급성독성연구 (1) 실험재료및방법 ( 가) 실험동물 실험동물은체중이 200±10g인 Sprague-Dawley(SD) 계의 7주된웅성흰쥐를대 한실험동물센터에서구입하여 10 일간본대학의동물사육실에서적응시켰다. 적 응시키는동안에사육실의온도와습도는각각 22±2, 55±5% 로항온, 항습을유지 하였고식이는고형사료( 삼양사) 와물을자유롭게섭취하도록하였다. ( 나) 실험군의분류 10일간사육실에적응시킨체중이 300 g 전후의흰쥐 10마리를한군으로하여 정상대조군(Normal control group) 및실험군(Test group) 으로분류하였다. 정상대 조군은사료와물을자유섭식토록하였으며매일오전 11시 30분 1ml의증류수를 경구투여하였다. 실험군은사료와물을자유섭식토록하였으며매일오전 11시 30 분 1 ml의황칠수액희석액을경구투여하였다. 이때식이는삼양사의고형사료를 자유공급하였으며각군의처리는표 와같다. 표 Composition of Groups 군 (Group) 마리수 (No. of exam) No.1 (Normal control) 10 사료+ 음용수+ 증류수 1) No.2(Test group) 10 사료+ 음용수+ 황칠수액희석액 황칠수액희석액 1) ; 황칠수액원액을희석한시료. ( 다) 시료의제조및투여 황칠수액은 2006년 8월전남완도군보길면적자산에서지름 21cm의황칠나무로 부터채취하였으며이황칠원액을 1,350 mg/1 일/1인을투여량으로계산하여 300g의 랫트에게 28일동안매일 mg씩경구투여하였다

168 ( 라) 관찰및측정사항 1 관찰사항 가시료투여시일반상태이상유무관찰 매일적어도 2 회이상동물의일반상태를세밀히관찰하였다. 일반상태로서피 부, 피모, 안 점막, 배변, 운동및패턴등에대하여이상상태의발현시간, 정도, 지 속시간을관찰하였고또서로에대한공격성의증가유무, 자해유무, 조직의자기 융해등을면밀히관찰체크하였다. 그리고군마다의동물수를항상확인하여시 험동물의실종을체크하였다. 나부검후각장기의이상유무관찰 부검후에는복강내각기관들의색깔, 크기, 외형적변화등을육안으로관찰 하여이상유무를체크하고간장과신장은보존액에보존하였다. 3 측정사항 가사망률측정 (LD50 계산 ) 시료투여 28일간각군의랫트사망률을 Litchfield Wilcoxon 도해법을이용하 여측정하였다. 나 체중측정(1 회/1 주일) 체중은시료투여후 4 주동안일주일에한번씩같은시간에측정하였다. 다섭이량및섭수량측정 시료투여 28일간 1 회/1 일, 매일동일시간에각군의섭이량및섭수량을측정 하여이상유무를관찰하였다. ( 마) 통계처리 모든실험결과측정치는일변수분석법을사용하여통계처리하였으며 Student's T-test를이용하여 p<0.05 수준에서각실험군간의유의성을검증하였 다. 모든자료는 mean±standard deviation 으로나타내었다

169 (2) 실험결과및고찰 ( 가) 일반상태의이상유무관찰및사망률 시료투여후매일적어도 2회이상실험동물의일반상태를세밀히관찰하였는 바, 시료투여기간중시험물질에기인된특이한이상임상증상은관찰되지않았 다. 즉, 피부, 피모, 안 점막, 배변, 운동및패턴등에대하여이상상태가전혀관 찰되지않았으며상대동물에대한공격성및자신에대한자해, 조직의융해등 이상징후도전혀발견되지않았다. ( 나) 장기이상유무관찰 사육마지막날실험동물을 overnight로 16시간절식시키고 ether로 3 4분간마 취시킨상태에서부검후정상대조군과각각의실험군의심장, 폐, 간장, 신장, 비 장, 부신, 위, 정소의이상유무를관찰하였다. 각실험군의장기들은정상대조군의 장기들과비교하여모양및형태, 크기, 색깔등에서전혀외형적이상변화를나타 내지않았으며각장기의빛깔및형태가아주선명한것으로관찰되어투여시료에 기인한각장기의이상적특이증상은나타나지않는것으로사료되었다. ( 다) 섭이량, 섭수량및사망률 시료투여후 4주동안정상대조군및시험군의섭이량및섭수량은일정하였으 며전혀기복을나타내지않았고정상대조군과시험군을망라하여사망한실험동물 은전혀없었다. ( 라) 성장과체중변화량및장기중량변화 실험동물 Sprague-Dawley 계랫트( 수컷) 의시료투여후 4주동안의주간체중 변화량은표 2.2-5에나타난바와같이정상대조군과시험군간에거의차이를나타 내지않았다. 즉, 시료를투여한 4주간실험동물의주간체중변화량및총체중증 가량은시험군에서 ±10.48g, 정상군에서 ±10.26g 의비슷한수치를보임 으로써투여시료들이체중의증감에특별한영향을미치지않는다는연구결과를 나타내었다

170 표 Total body weight gains 군 (Group) Total body weight gains(g) Mean±S.D. No.1 (Normal control) ± ) No.2 (Test group) ± ) Each value represents the mean±s.d. of 10 rats. * Significant differences as compared with control : p<

171 2. 2 차년도연구결과보고서 가. 연구개발목표 2 차 연도 정제된황칠나무수액으로부터기능성화합물추출의최적화연구 - 황칠수액의아급성독성연구 나. 연구개발수행내용 - - 컬럼을이용하여황칠수액의정제연구 황칠수액에대한급성독성검사연구 가 ) limit value test 나) LD 50 계산(Litchfield-Wilconxon 도해법) 다. 정제된황칠나무수액으로부터기능성화합물추출의최적화연구 (1) 실험재료및방법 ( 가) 실험재료및시약 실험재료에사용된황칠나무 (Dendropanox morbifera Lev.) 는드릅나무과에속하는아열대성상록교목으로관상용분재로활용하거나우리의전통칠인황금색의황 칠을채취할수있는경제적이용가치가많은수목이다. 특히한국특산종인황칠 나무는한국난대림대및온대인서남부해안지역과도서지역에제한적으로자생하 고있는것으로알려져있다. 우리나라의분포지역은남부해안지역인완도와해 남그리고제주도등지에서자생하고, 황칠나무는그학명에서뜻하는것과같이 목본(Dendro) 전응약(panax) 이라는의미가있고, 황칠액의주성분은정유성분으로 수액은도료로이용하고수지는거풍습과활혈의약효가있다고보고가있다. 그러 나황칠나무는약용으로이용하기보다는우리나라고유의전통수지도료로황칠 공예주로사용되어왔다. 황칠나무에관한최초의과학적연구는 1937년황칠의 정유성분에대한연구로황칠은일종의정유성분으로서주성분은 2중결합이 2개

172 있는쌍환성세스퀴테르펜이며그이외에알코올, 에테르등의성분을함유하고있 다고보고되었다. 그이외에도국내연구진에의해서많은연구가이루어졌으나황 칠수액에대한조성및역할에대하여체계적인화학연구는아직미흡하다. 본실 험에사용된황칠수액은 2006년 8월전남완도군보길면적자산에서지름 21cm의 황칠나무수피에상처를내면우유빛깔의유액이흘러나오는데이것은라카아제라 는산화효소에점차산화하여노란색을변하게된다. 이유액이채취하여황칠나무 수액으로사용하였다. 채취한후곧바로실험실로운반하여황칠수액을냉장실에서 광차단용용기에보관하면서사용하였다. 이렇게얻어진황칠수액은환류냉각기부 착된추출플라스크에시료 30g에대하여 80% 에탄올 5배수에해당하는추출용매 를사용하여 6시간동안 3 회반복추출하였다. 얻어진각각추출물은감압증발농 축기로농축한후동결건조한뒤에사용하였다. 황칠수액을추출및정제하기위 하여사용된시약으로는 Ethanol(J.T Baker, U.S.A), Methanol(J.T Baker, U.S.A), n-hexane(j.t Baker, U.S.A), Acetone(J.T Baker, U.S.A), Chloroform(Aldrich Co. U.S.A) 등을사용하였다. 관크로마토그래피법에사용된충진물은 silica gel 60 F 254 (Merck Co.) 를사용하였고, TLC plate는 silica gel F 254 를사용하였다. ( 나) 추출장치및분석기기 본연구에서사용된황칠수액의중의유효성분추출하기위한장치는 Figure 1 과같다. 이렇게추출된황칠수액의유기용매제거및엑스를제조하기위하여증 발농축기(Rotary Rotavapor RE 121, Bűchi Co., Switzerland) 를사용하였고, 황칠수액의유효성분분리및정제를위하여 MPLC(middle pressure liquid chromatography, YAMAZEN 540) 를사용하였다. 추출된각각의물질들은적외선 분광광도계(FT-IR Spectrophotometer, JASCO, FT/IR-620) 를이용하여지문(finger printer) 영역을해석하여독특한유기작용기를해석하였다. 무기물분석은유도결합 플라스마(ICP, Perkin Elmer 3300XL) 을사용하였고, 화학적구조분석을하기위하 여 GC/MASS(HP GCD) 를사용하였다

그림 2.2-5. The apparatus of extracts of Dendropanax morbifera by water : ethanol(2:8). ( 다) 용매추출법에의한황칠수액의엑스및용해도차이를이용한추출 황칠나무에서얻은수지액은우유빛깔의액을분비하는데공기중에서산화하여 점차노란색으로변한다. 이렇게얻은황칠수지액의엑스추출은그림 2.

173 그림 The apparatus of extracts of Dendropanax morbifera by water : ethanol(2:8). ( 다) 용매추출법에의한황칠수액의엑스및용해도차이를이용한추출 황칠나무에서얻은수지액은우유빛깔의액을분비하는데공기중에서산화하여 점차노란색으로변한다. 이렇게얻은황칠수지액의엑스추출은그림 2.2-5와같 은장치를이용하였다. 250mL 플라스크에수지액 30g과 80% 에탄올 150mL를넣 고환류냉각기를장착한후 의온도를유지할수있는온도조절장치를장 착하여 6시간동안 3회반복추출하고여과하여여액을합하여황칠수액엑스를제 조하였다. ( 라) 황칠수액의분말제조 황칠수지액의분말제조는상기용매추출법에의해서제조된황칠수액엑스를 증발농축기에서감압농축한후냉동건조기 (Freezing Dryer, Ilshin Engineering Co.,) 에서건조하여황칠수액의분말을제조하였다. ( 마) 황칠수액엑스의 liquid-liquid partition에의한분획 혼합물에서각각의성분을분리하고, 불순물에서원하는화합물을분리하는비교 적간단한방법은추출과크로마토그래피를이용하여상분배의원리를이용한다. 물질은각상의안정도의비에따라용해도가다른혼합물을선택적으로분리하는 데사용된다. 이와같은분배과정은두가지로요약된다. 하나는서로섞이지않는 용매에서각성분의상대적인용해도의차이에바탕을둔 partition( 선택적용해) 과 둘째는, 고체상의표면에각성분의선택적인친화도에바탕을둔흡착( 크로마토그

174 래피법) 이있다. 상기에서얻은황칠수액의엑스를 liquid-liquid partition에의해서 그림 2,2-6과같은방법으로분말 5g을분액깔대기에넣고용매로써 n-hexane 25mL를넣고 30 분동안잘흔들어서방치하고, 이때가끔은분액깔대기안의코 크를열어가스를제거한다. 이와같은방법으로 3회하여여액을합하여증발농축 하여분획물을얻는다. 그림 Liquid-liquid partition of extracts of Dendropanax morbifera. 그림 에서얻은잔류물은클로르포름(CHCl 3 ) 및메탄올(CH 3 OH) 을각각의 유기화합물을이용하여그림 2,2-6 과동일한방법으로용매추출하여각각의 GC/MASS 및 FT-IR 분광광도기를이용하여각각의유효유기작용기를정성분 석하였다. ( 바) TLC에의한혼합용매선택 박층크로마토그래피(TLC, thin layer chromatography) 는 column chrom atography 와같은이론을갖는것으로고체흡착제가얇은막의플라스틱판위에 도포되어있다. 이때시료용액의판위에점적했을때전개용매가올라오게되면서 혼합물의각성분등을서로다른속도로분리하게된다. 본연구에서도황칠수액의

175 혼합시료는 5 에의해서추출된엑스를사용하였고, 혼합전개용매는표 2.2-6에나 타낸유기용매극성지수표를이용하여극성을비교, 변화하면서최적의혼합전개 용매를선택하여분리능의 R f 치를측정하였다. 이때사용된 TLC는 silica gel F 254 ( 두께 mm) 를사용하였고, 발색제는 254nm 의자외선램프를이용하였다. 황칠수액은 3에의해서추출된엑스를 TLC를이용하여황칠수액을분리정제하였 다. 표 Polarity Index of Chemical Substance Chemical Substance Polarity Index (P ) Pentane 0.0 1,1,2-Trichlorotrifluoroethane 0.0 Cyclopentane 0.1 Heptane 0.1 Hexane 0.1 Iso-Octane 0.1 Petroleum Ether 0.1 Cyclohexane 0.2 n-butyl Chloride 1.0 Toluene 2.4 Methyl t-butyl Ether 2.5 o-xylene 2.5 Chlorobenzene 2.7 o-dichlorobenzene 2.7 Ethyl Ether 2.8 Dichloromethane 3.1 Ethylene Dichloride 3.5 n-butyl Alcohol 3.9 Isopropyl Alcohol 3.9 n-butyl Acetate 4.0 Isobutyl Alcohol 4.0 Methyl Isoamyl Ketone 4.0 n-propyl Alcohol 4.0 Tetrahydrofuran 4.0 Chloroform 4.1 Methyl Isobutyl Ketone

176 Ethyl Acetate 4.4 Methyl n-propyl Ketone 4.5 Methyl Ethyl Ketone 4.7 1,4-Dioxane 4.8 Acetone 5.1 Methanol 5.1 Pyridine Methoxyethanol 5.5 Acetonitrile 5.8 Propylene Carbonate 6.1 N,N-Dimethylformamide 6.4 Dimethyl Acetamide 6.5 N-Methylpyrrolidone 6.7 Dimethyl Sulfoxide 7.2 Water 10.2 ( 사) MPLC에의한혼합용매를이용한분리및수율 높은분리도를얻기위하여황칠수액엑스의분리및정제의최종단계로서널리 사용되는 MPLC(Middle Pressure Liquid Chromatography) 를이용하여분리실험을 하였고, 이때시용된기기장치및조건은그림 2.2-7과표 에나타내었다. MPLC 의분리는액체상과고체상사이에서물질의분배를수반하며, 고체표면의 선택적인흡착에의해서고체상을통과하는액체의각성분들을분리한다. 이때컬 럼의충진제는활성화된 silica gel 을이용하여충진시킨다. 황질수액의엑스는컬럼 위에올려놓고이동상이컬럼을통해서시료용액을이동할때각성분의선택적흡 수에의한분리를이용하였다. 이때사용된이동상은극성지수가작은 n-hexane(0.1) 로부터유전이큰 Acetone(5.1) 으로농도및물질을변화하면서황 칠수액을정제분리하였다. 이렇게얻은 MPLC 크로마토그램을나타내었다. 각각의 분리된성분은 TLC로 spot 을확인하였고, 이때황칠수액추출액속에가장많이 포함하고있는단일물질을분리하여진공증발기를이용하여용매를제거하고, 남 은결정은에탄올소량에열을가하여녹인후실온에서방치하여재결정법을이용 하여황칠수액을정제한후수율을측정하였다. 각각의추출물에대한가장적합한 용매- 용매간의분배를설정하여극성별로각분획에대해저해활성을, 자외선가 시선흡수스펙트럼을측정함으로써멜라닌생성및피부노화에미치는자외선영

177 역에서의흡수스펙트럼패턴을조사하였다. 표 Operation condition of MPLC(Middle Pressure Liquid Chromatography) Model YAMAZEN 540 Column YAMAZEN (30mm 300mm), Merck silica gel 60 Mobile Phase Hexane Acetone Ethanol Flow rate Detector Chart speed 10mL/min UV-254nm 1.25mm/min. 그림 MPLC for the separation of mixture compounds of Dendropanax morbifera

178 ( 아) 황칠수액및분획물의성분분석 황칠수액의무기물은 1 차년도에발표를하였고, 유기물에대한정성분석도 GC/MASS 를이용하여유기작용기를분석하였다. 본연구에서는각각에서얻은분 획물을 IR spectrophotometer, UV-Vis spectrophotometer, GC/MASS, NMR등을 이용하여정성분석을하여, 이렇게얻은분획물의어떤화학적그룹이미백작용을 하는지에대한유기작용기에대한정성분석을하였다. (2) 실험결과및고찰 ( 가) 용해도차이에의해서혼합용매를이용하여분리물획득 사용된이동상용매는비극성용매로써 n-hexane( 극성지수 0.1) 부터 Acetone( 극 성지수 5.1) 농도비율을변화시키면서황칠수액중의비극성물질과극성물질을분리 정제하였다. 이렇게얻은 MPLC의크로마토그램의시료 group(1) (7) 까지분리한 결과를그림 에나타내었다. 7가지로분리된시료는진공증발기를이용하여 용매를제거하여 TLC로 spot 을확인하였고, 각각에대한수율을조사한결과를 그림 2.2-9, 표 에나타내었다. ( 나) MPLC의분리에의한 TLC 확인및수율 황칠수액엑스분말 10g을에탄올 100mL 에용해시켜시료용액을제조하였고, 이렇게제조된황칠수액을 MPLC를이용하여이동상의용매극성에따라유기물을 분리정제하였고각각의분리용액을증발농축하여수율을측정하였다. MPLC의 기기장치및조건은그림 2.2-7과표 에각각나타내었다. 7가지로분리된시 료는진공증발기를이용하여용매를제거하여 TLC로 spot 을확인하였고, 각각에 대한수율을조사한결과를그림 , 표 에나타내었다. 그림 에나 타낸크로마토그램에서 (1) 은 100% n-hexane 에의해서얻은결과이고, (2) 는 n-hexane : Acetone = 90 : 10, (3) 은 n-hexane : Acetone = 70 : 30, (4) 는 n-hexane : Acetone = 60 : 40, (5) 는 n-hexane : Acetone = 50 : 50, (6) 은 n-hexane : Acetone = 20 : 80, (7) 은 100% EtOH을이용하여각각의극성큰 7가 지의물질을얻었다. (7) 은마지막으로 Ethanol를이용하여컬럼내에있는모든물 질을추출하였으나 TLC spot는검출되지않았으므로그이후에는추출물질없다

고판단된다. 3차년도에는 pilot의개념을가지고양을증가시켜정확한정제방법 을다시한번확인하고, 이것에대한물질을 GC, GC/MASS, NMR, FT-IR 분광 광도계등을이용하여황칠수액중어떤물질혹은어떤작용기가미백작용에대한 반응메카니즘을연구하고자한다. 그림 2.2-8.

179 고판단된다. 3차년도에는 pilot의개념을가지고양을증가시켜정확한정제방법 을다시한번확인하고, 이것에대한물질을 GC, GC/MASS, NMR, FT-IR 분광 광도계등을이용하여황칠수액중어떤물질혹은어떤작용기가미백작용에대한 반응메카니즘을연구하고자한다. 그림 MPLC chromatogram of Dendropanox morbifera Leveille to the change n-hexane : acetone ratio and ethanol. 표 R f value of extract and yield(%) at varying development solvent in Dendropanox morbifera Leveille(referred to 그림 ) No Development solvent. Ratio Spot No. R f Yield(%). 1 n-hexane : Acetone 100 : 0 2 n-hexane : Acetone 90 : 10 3 n-hexane : Acetone 70 : 30 4 n-hexane : Acetone 60 : 40 5 n-hexane : Acetone 50 : 50 spot spot spot spot spot spot spot spot spot spot spot spot spot n-hexane : Acetone 20 : 80 spot

180 spot Ethanol 100 no spot - 0 그림 TLC spot of each fraction of extract. ( 다) 황칠수액엑스에대한추출물의분획및유기작용기분석 황칠수액엑스를그림 2.2-6에의한 liquid-liquid partition 방법에의하여분획된 각각의추출물에대한 0~13 에각각나타내었다. FT-IR Spectrophotometer에대한측정결과를그림

181 그림 2,2-10. IR spectrum of chloroform layer extract of Dendropanox morbifera Leveille. 그림 2,2-11. IR spectrum of n-hexane layer extract of Dendropanox morbifera Leveille

182 그림 2,2-12. IR spectrum of ethanol layer extract of Dendropanox morbifera Leveille. 그림 2,2-13. IR spectrum of powder of Dendropanox morbifera Leveille

183 그림 2,2-10~13에나타낸적외선스펙트럼은 3400cm -1 와 1400cm -1 에나타낸 peak로인하여 -OH 기를많이가지고있다는사실을알수있고, 2927~2856 및 1709cm -1 에서각각 C-H 및 C=O 신축진동에의해서스펙트럼을나타내었고, C=C 에대한스펙트럼은 692cm -1 와 1644cm -1 에서나타내었다. 또한 1102cm -1 에서 C-OH 에대한신축운동과 1730cm -1 에서포화 -COOH의강한 peak 가나타났다. 황칠수액 은불포화탄화수소를포함하고있는물질인데열및산화에의해서황칠수액의산 화및폴리머형태의수지를이루면서고체및반고체형태를이루게된다. 또한 2255cm -1 에서 C C-C C, 983cm -1 과 929cm -1 에는비닐기에대한 IR 스펙트럼이 나타났고, 2195, 2155, 2120cm -1 에서 C C-C=C에서컨쥬게이트시스템을나타내었 다. ( 라) 황칠수액의기능성물질확인을위한 GC/MASS 분석 황칠수액엑스의일부분을 ethanol에용해한후 GC/MASS을이용하여황칠수 액속에포함되어있는성분구성비및유기작용기를해석하였다. 이에대한결과 를그림 에나타내었다. 이때사용된 GC/MASS에대한조건은표 2.2-9와 같다

184 그림 GC/MASS spectrum of ethanolic extract( 부록 1). 표 Operation condition of GC/MASS Model : HP GC-MASS Column : capillary HP-5(30m 0.25 nm 0.25 nm) Carrier gas : He gas 1.5 ml/min Flow rate : 0.5ml/min Column Temp. : 150 Injection Volume : 50ul 자외선을흡수하는자외선흡수제에는일반적으로벤젠고리를가진유기화합물 이많고, 그작용기로써 -OH, -COOH, -OCH 3 등을포함하고있다. 본황칠수액의 GC/MASS의스펙트럼에연구결과를별첨 1 에수록하였다. MASS의조건으로는

185 이온화전압은 70eV이었고분자량의범위는 a.m.u. 이었다. 분리된각피크 는 gas 크로마토그램의머무른시간을확인한후개별유기산성분피크의동정을 위하여 mass spectrum을 Wiley's library 로확인하였으며, 이때 85% 이상의확률 에일치하는화합물로인정하였다. 별첨

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192 라. 황칠수액에대한아급성독성검사연구 (1) 실험재료및방법 ( 가) 실험동물 실험동물은체중이 200±10g인 Sprague-Dawley(SD) 계의 7주된웅성흰쥐를대 한실험동물센터에서구입하여 10 일간본대학의동물사육실에서적응시켰다. 적 응시키는동안에사육실의온도와습도는각각 22±2, 55±5% 로항온, 항습을유지 하였고식이는고형사료( 삼양사) 와물을자유롭게섭취하도록하였다. ( 나) 실험군의분류 10일간사육실에적응시킨체중이 300 g 전후의흰쥐 10마리를한군으로하여 정상대조군(Normal control group) 및실험군(Test group) 으로분류하였다. 정상대 조군은사료와물을자유섭식토록하였으며매일오전 11시 30분 1ml의증류수를 경구투여하였다. 실험군은사료와물을자유섭식토록하였으며매일오전 11시 30 분 1 ml의황칠수액희석액을경구투여하였다. 이때식이는삼양사의고형사료를 자유공급하였으며각군의처리는표 과같다. 표 2,2-10. Composition of Groups 군 (Group) No.1 (Normal control group) 마리수 (No. of exam) 10 사료+ 음용수+ 증류수 1) No.2 (Test group) 10 사료+ 음용수+ 황칠수액희석액 황칠수액희석액 1) ; 황칠수액원액을희석한시료. ( 다) 시료의제조및투여 황칠수액은 2007년 8월전남완도군보길면적자산에서지름 18~23cm의황칠나 무로부터채취하였으며이황칠원액을 4 냉장고에보관하면서사용하였다. 1,350 mg/1 일/1 인(1,350 mg/1day/60kg) 을투여량으로계산하여체중 300g 전후의랫트에게

193 35일동안매일 6.75mg의황칠수액을 1ml의 0.8% methanol에녹여주사기를이용하여경구투여하였다. ( 라) 측정사항 1 체중및대체중간비, 대체중신장비측정(1 회/1 주일) 체중은시료투여후 신장의무게는부검후측정하였다. 4주동안일주일에한번씩같은시간에측정하였고간및 2 뇨검사(pH, 뇨잠혈, 뇨단백, 뇨당, 뇨 ketone 의측정) 부검하기전날각군의실험동물을각각한마리씩에탄올로소독된깔짚이깔 려있지않은 cage 에넣고뇨를배출하기를기다린후, 배출된뇨를멸균된 cap tube 에담은후, 지시시험지(Serotech Korea Co. Ltd., Seoul) 법을이용하여각 각의실험동물의뇨pH, 뇨단백, 뇨당, 뇨ketone 및뇨잠혈의정도를검사하였다. 3 혈액학적검사(Hematological values 및 CBC differentiation 측정) EDTA tube에채워진혈액은곧바로잘흔들어균등질이되게하고 Coulter R JT(coulter electronics Inc, USA, PN B) 로 WBC(White Blood Cell, 백혈 구), RBC(Red Blood Cell, 적혈구), HGB(Hemoglobin, 헤모글로빈), HCT(Hematocrit, 혈액용적백분율), 혈소판(Platelet) 을측정하였다. 에탄올에 12 시간담근후깨끗이세척한 slide glass에면봉막대로혈액을도말하여공기중 에서건조한후 Wright stain(yong Dong pharm, Co. Kyungki, Korea) 액을 10 방울떨어뜨려 3분간고정염색하고 Wright 완충용액(Yong Dong pharm, Co. Kyungki, Korea) 10방울로충분히혼합시켜 5~6 분간염색하였다. 이때침사가 고착하지않도록유의하여검경에불편을최소화하였다. 이 slide glass는 spray 를사용하여삼차증류수로조심스럽게수세하고실온에서건조하였다. 충분히마 른후 oil immersion하에서 cover slide 를사용하지않고검경하였다. Manual WBC differential counter 를사용하여백혈구를종류별로구별하면서총백혈구 수백개를세어서백분율로분포를측정하고 granularcytes는 coulter 결과와이 중확인(double check) 하였다. 망상적혈구(reticulocyte) 빈도는 capillary를사용하 여 3차증류수에용해시켜여과후실온에보관중인 1% new methylene blue(sigma) 를혈액과동량으로잘섞어 3~5분방치하고깨끗이준비된 slide glass 에도말하였다. Reticuolcyte count는 1000개의적혈구를계수하는동안에

194 나타나는 reticulocyte 의빈도를백분율로나타내었다. 4 혈액생화학적검사 ( 총단백, 총cholesterol, albumin, AST, ALT, alkaline phosphatase, 총bilirubin 측정) EDTA freed tube에채워진혈액을 30분동안실온에방치한후 3000 g에서 15 분간원심분리하여얻은혈청의 Aspartate aminotransferase(ast) 활성치는 AST kit(boehringer Mannheim, Germany) 을사용하여자동생화학분석기 (Hitachi 747) 로측정하였다. Alanine aminotransferase(alt) 의활성치는 ALT(Boehringer Mannheim, Germany)kit 을사용하여자동생화학분석기 (Hitachi 747) 로측정하였다. Total cholesterol(t-chol.) 은 enzymatic coloimetric test를이용하여 T. chol. kit(boehringer Mannheim, Germany) 를사용하여자동생화학분석기(Hitachi 747) 로측정하였다. Albumin은 ph 4.2에서 BCG(Brom Cresol-Green) 과결합하 여화합물을형성하는데이때의흡광도를 ALB(Boehringer Mannheim, Germany)kit 을사용하여자동생화학분석기(Hitachi 747) 로측정하였다. Alkaline phosphatase(alp) 는 IFCC 검사원리하에 ALP(Boehringer Mannheim, Germany) Kit 을사용하여자동생화학분석기(Hitachi 747) 로측정 하였다. Total bilirubin(t-bil.) 은 DPD method 하에 Bil-T(Boehringer Mannheim, Germany) Kit 을사용하여자동생화학분석기(Hitachi 747) 로측정 하였다. Total protein(tp) 은 Biuret method 하에 TP(Boehringer Mannheim, Germany) Kit 을사용하여자동생화학분석기(Hitachi 747) 를이용하여측정하 였다. ( 마) 부검 사육마지막날동물을 overnight로 16 시간절식시키고체중을측정하였다. 체중 측정이끝난 SD계의랫트를 25 cm지름의데시케이터에넣고, 증류한 ether anhydrous(t.j. Baker Analized ACS reagent, USA) 로 3~4분간마취시킨후해부 대에서복부(ventral) 가보이도록놓고네다리를압핀(thumb tag) 으로고정하였다. 알콜로복부전면을소독한후 forcep으로복부피부를집어서해부가위로정중선을 따라서절제하고, 해부칼로장기가보이도록절개하였다. 0.85% saline(shinyo pure chemicals Co. LTD, Japan) 으로세척하고, 장기가마르지않도록충분히식염수를

195 뿌려주면서 EDTA를처리하지않은주사기와시험관을이용하여후대정맥에서 5~ 6ml의혈액을채취하여상온에서 30 분경과후, 3000 rpm에서 15 분간저온(4 ) 원 심분리하여혈청을얻었다. 이는 Aspartate aminotransferase(ast), Alanine aminotransferase(alt), alkaline phosphatase(alp), Total cholesterol, total protein, albumin, total bilirubin 분석에사용하였다. EDTA tube에혈액을따로채 혈하여얻은 EDTA 혈액을이용하여 hematological values 및 CBC differentiation 측정에사용하였다. 간, 신장을차례로절제하여무게를측정하고 buffered formalin 용액 (40% formaldehyde 10 ml, 0.65 g sodium phosphate monobasic, sigma, 0.4 g sodium phosphate dibasic, sigma/100 ml T.D.W) 에고정한후실온에보관하였다. ( 바) 통계처리 모든실험결과측정치는일변수분석법을사용하여통계처리하였으며 Student's T-test를이용하여 p<0.05 수준에서각실험군간의유의성을검증하였 다. 모든자료는 mean±standard deviation 으로나타내었다. (2) 실험결과및고찰 ( 가) 성장과체중변화량및장기중량변화 실험동물 Sprague-Dawley 계랫트( 수컷) 의시료투여후 5주동안의주간체중 변화량은표 에나타난바와같이정상대조군과거의차이를나타내지않았 다. 즉, 시료를투여한 5주간실험동물의주간체중변화량및총체중증가량은실 험군이 ±8.43g 으로정상군의 ±9.22g 과비슷한수치를보임으로써투여시료 들이체중의증감에특별한영향을미치지않는다는연구결과를나타내었다. 실험 동물의장기중량변화는표 에나타난바와같다. 실험동물의체중당간중 량비율은정상대조군에서 3.00±0.078% 의수치를나타내었고실험군에서는 2.99±0.102% 의수치를나타내었는바, 이역시실험군에서유의성(p<0.05) 있는차이를 나타내지않아투여시료가실험동물의장기중량에특별한영향을나타내지않는 결과를보여주었다. 실험동물의체중당신장중량비율역시 0.705±0.088% 의수치 를보인정상대조군에비해실험군의수치는 0.699±0.072% 를나타내어이역시유의성

196 (p<0.05) 있는차이를나타내지않았다. 표 Total body weight gains and the weight ratio of liver and kidney Total body weight Liver (% of body Kidney (% of body Group gains(g) weight) weight) Mean±S.D. Mean±S.D. Mean±S.D. No.1 (Normal control group) ±9.22 1) 3.00± ±0.088 No.2 (Test group) ± ± ± ) Each value represents the mean±s.d. of 10 rats. * Significant differences as compared with control : p<0.05. ( 나) 뇨생화학검사 각군(n = 10) 의실험동물로부터채취한뇨에대한 routine urinalysis 결과를표 타내었다. 통상검체의뇨의변화는신장, 뇨로계의병태를잘반영하므로 진단예후판정에유용하며아울러체액의변화를잘반영하므로대사장애, 당뇨 병, 간질환, 전해질의 unbalance 등의지표가된다. 1 뇨 ph 표 에나타난정상대조군및각실험군의뇨 ph는 를나타내정 상군과실험군사이에별다른차이를나타내지않는것으로나타났으며 urinalysis의기준치에도부합되어투여시료에기인한뇨 ph의특이사항은나타 나지않았다. 2 뇨단백 각실험동물의뇨단백은 urinalysis의기준치상 negative(-) trace(±) 를나타내

197 는것이정상이나본실험에서는정상대조군 10마리중 3마리에서 trace, 4마리에 서 1 positive, 1마리에서 2 positive 를나타냈으며, 황칠수액을투여한시험군에 서도 10개체중 3마리에서 trace, 5 마리에서 1 positive, 1마리에서 2 positive를 나타내는등많은실험동물에서뇨단백이검출되었다. 이와같이정상대조군과실 험군모두에서 positive 한결과가나타난것은투여시료가뇨단백이상을유발한 것으로는판단할수없다. 통상정상대조군의뇨단백이음성인데반하여시험군의 뇨단백이양성으로나타나는경우는투여약재에기인한사구체성단백뇨, 세뇨관 성단백뇨, 신정및신후성단백뇨등의병적단백뇨를의심할수있는데반하여정 상대조군및시료투여군모두에서단백뇨가검출될시는운동성단백뇨, 기능성단 백뇨등의생리적단백뇨( 비병적단백뇨) 로판단할수있다. 본실험에서정상대조 군과실험군모두에서단백뇨가검출된것은야행성인랫트에서야간에뇨를채 취함으로인해활발한운동성생리적단백뇨가검출된것으로판단되었으며부검 후신장에아무런이상징후를발견할수없었던점등도활발한운동으로인해운 동성생리적단백뇨가검출되었다는판단을뒷받침해주는것으로사료된다. 3 뇨당 검체의뇨에서당이검출되는것은당뇨병, 신성당뇨, 내분비질환, 췌장질환, 간경 변, 뇌종양등의징후를반영하는것이다. 표 에나타난바와같이정상대 조군및황칠수액을투여한시험군모두에서당이검출되지않은것으로연구결 과가나타나투여시료에기인한뇨당의이상상태는나타나지않은것으로사료되 었다. 4 뇨 ketone 표 에정상대조군과실험군각군의뇨 ketone 측정결과를나타내었다. 뇨 ketone은지방산산화항진여부를진단하는주요지표로써 ketone체는생체 energy 의존도가당질보다지방산으로기울때증가하며이의증가는인슐린의 결핍을반영한다. 따라서검체의뇨에서 ketone이검출되는것은검체가중증당뇨 병이거나또는당질섭취부족심한경우기아상태에직면해있음을나타낸다. 뇨 ketone에대한본실험의연구결과에서는정상대조군랫트 10마리중 3마리에서 1 positive 를나타내었으며, 실험군에서는 2마리의랫트에서 1 positive를나타내었 다. 상기와같이정상대조군과실험군모두에서 positive 결과가나타난것은투여 시료가뇨 ketone 체이상을유발한것으로는판단할수없다. 오히려실험동물들

198 이충분한식이를섭취한점과모든실험군에서뇨당이검출되지않은연구결과 로미루어볼때실험동물들이섭취한삼양사사료의조성( 조단백 22,2% 이상, 조지방 3.5% 이상, 조섬유 5.0% 이하, 조회분 8.0% 이하 ) 이상기와같은결과 를초래한것으로판단되었다. 즉정상대조군과실험군의랫트들이섭취한사료가 당질인조섬유의비율은지극히낮았고상대적으로조지방및조단백의비율은 조섬유의 5, 6 배에달할정도로높았기때문에뇨 ketone이증가한것으로판단 되었다. 5 뇨잠혈 뇨잠혈은요로의이상을진단하는지표로표 에정상대조군과실험군각 군의뇨잠혈측정결과를나타내었다. 각군모두에서뇨잠혈이검출되지않았으며 따라서투여시료에기인한뇨잠혈의이상상태는나타나지않은것으로판단되었 다. ( 다) 혈액학적검사 5주간황칠수액을투여후 hematological values 및 CBC differentiation을측정하 여투여시료에기인한혈액학적독성을검사하고자실험을시행하였고이실험은 현재진행중에있다. ( 라) 혈액생화학적검사 5 주간황칠수액을투여후혈액생화학적검사를실시하여총단백, 총cholesterol, albumin, AST, ALT, alkaline phosphatase, 총bilirubin value를검사한후이결 과를판독하여투여시료에기인한혈액생화학적독성을측정하고자실험을시행 하였고이연구는현재진행중에있다

199 표 Urinary analysis ph Protein(U) Glucose(U) Ketone(U) Blood(U) 7.5 Negative Negative Negative Trace(±) 8.5 Trace(±) Negative Negative Negative 8.5 1Positive Negative Negative Negative No. 1 (Normal control group) 8.5 2Positive Negative Negative Negative 8.0 Negative Negative Negative Negative 8.5 1Positive Negative 1Positive Negative 8.5 Trace(±) Negative 1Positive Negative 8.0 1Positive Negative Negative Negative 8.5 1Positive Negative 1Positive Negative 8.5 Trace(±) Negative Negative Negative 7.5 Trace(±) Negative Negative Trace(±) 7.5 2Positive Negative Negative Trace(±) 8.5 Negative Negative Negative Negative 8.0 1Positive Negative Negative Negative No. 2 (Test group) 8.5 1Positive Negative 1Positive Negative 8.5 1Positive Negative Negative Negative 8.5 Trace(±) Negative Negative Negative 8.0 Trace(±) Negative Negative Negative 8.0 1Positive Negative 1Positive Negative 8.5 1Positive Negative Negative Negative

200 3. 3 차년도연구결과보고서 가. 연구개발목표 3 차 추출된황칠수액의기능성물질구조확인연구 연도 황칠수액의아급성독성연구 나. 연구개발수행내용 - HPLC를이용한분리된성분의구조해석 - 기기분석을이용한화합물의구조확인 * HPLC, GC-Mass, NMR, IR * Uv,Vis Spec.etc - 황칠수액에대한아급성독성연구: SD rat에 4주간시료투여 * * 일반상태의이상유무관찰 장기이상유무관찰 * 섭이량, 섭수량및사망률 * * 뇨생화학검사 혈액학적검사 * 혈액생화학적검사등주요항목의결과로독성유, 무판단. 다. 추출된황칠수액의기능성물질구조확인연구 (1) 실험재료및방법 ( 가) 실험재료 본실험재료로사용된황칠나무 (Dendropanox morbifera Lev.) 는우리나라남부 해안지역인완도와해남그리고제주도등에서자생하는두릅나무과에속하는상록 활엽교목이다. 황칠나무는학명에서뜻하는것과같이목본(Dendro) 전능약(panax) 이라는의미가있고, 황칠액의주성분은정유성분으로수액은도료로이용하고수 지는거풍습과활혈의약효가있다고보고가되어있다. 잎은호생( 互生 ) 하며외형은

201 난형또는타원형인데유엽은 3 5 개의심파상을나타내기도한다. 산형화서이며 꽃은가지선단에착생하는데 6 월에개화한다. 열매는흑색으로 10월에성숙하며 핵과에속한다. 황칠수액은수피에상처를내어수액을채취해서천연도료로사용 하고있고, 수액은농황색으로일본에분포하는일본황칠나무에비하여수액의질 이양호하고색깔도짙어서상품가치가매우높은것으로알려져있다. 그러나황 칠나무는약용으로보다는우리나라고유의정통수지도료인황칠공예에의주로 사용되고있다. 이와같이용도가다양한황칠은나무의수피에상처를내면유액 이흘러나오는데이유액이누런색이어서황칠이라는이름이붙어졌다고한다. 황 칠나무에관한최초의과학적연구는 1937년황칠의정유성분에대한연구로황칠 은일종의정유성분으로서주성분은 2중결합이 2개있는쌍환성세스퀴테르펜이며 그이외에알코올, 에테르등의성분을함유하고있다고보고되었다. 그이외에도 국내연구진에의해서많은연구가이루어졌으나황칠수액에대한미백작용에체계 적인화학연구는아직미흡하다. 본실험에사용된황칠수액은전남완도군보길면적자산에서지름 21cm의황칠 나무수피에상처를내면우유빛깔의유액이흘러나오는데이것은라카아제라는 산화효소에점차산화하여노란색을변하게된다. 이유액이채취하여황칠나무수 액으로사용하였다. 채취한후곧바로실험실로운반하여황칠수액을냉장실에서 광차단용용기에보관하면서사용하였다. 이렇게얻어진황칠수액은환류냉각기부 착된추출플라스크에시료 30g에대하여 80% 에탄올 5배수에해당하는추출용매 를사용하여 6시간동안 3 회반복추출하였다. 얻어진각각추출물은감압증발농 축기로농축한후동결건조한뒤에기본물질로사용하였다. ( 나) 시약및분석기기 황칠수액을추출및정제하기위하여사용된시약으로는 Ethanol(J.T Baker, U.S.A), Ethyl Acetate(J.T Baker, U.S.A), n-hexane(j.t Baker, U.S.A), Acetone(J.T Baker, U.S.A), Chloroform(Aldrich Co. U.S.A), CH 2 Cl 2 (J.T Baker, U.S.A) 등을사용하였다. 관크로마토그래피법에사용된충진물은 silica gel 60 F 254 (Merck Co.) 를사용하였고, TLC plate는 silica gel F 254 를사용하였다. 본연구에서사용된황칠수액의중의유효성분추출하기위하여온도조절장치 가부착된추출장치를제작하여사용하였다. 이렇게추출된황칠수액의유기용매

202 제거및엑스를제조하기위하여증발농축기 (Rotary Rotavapor RE 121, Bűchi Co., Switzerland) 를사용하였고, 황칠수액의유효성분분리및정제를위하여 MPLC(middle pressure liquid chromatography, YAMAZEN 540) 를사용하였다. 추 출된각각의물질들은적외선분광광도계 (FT-IR Spectrophotometer, JASCO, FT/IR-620) 를이용하여지문(finger printer) 영역을해석하여독특한유기작용기를 해석하였다. 자외선- 가시선분광광도계(UV-Visble Spectrophotometer Hewlett Packard Co., HP 8452A) 를이용하여자외선흡수스펙트럼을측정하였다. 화학적구 조분석을하기위하여 GC/MASS(HP GCD) 및 1 H, 13 C NMR(Bruker Avance 400 MHz) 을사용하였다. ( 다) 황칠수액엑스및분획의추출 1 황칠수액엑스의자외선흡수스펙트럼측정 황칠수액의추출물로부터유효성분을찾기위해에탄올을이용하여유기용매에 녹는물질과수용성물질을모두추출하고, 헥산을이용하여비극성물질을분리 하였다. 또다른용매즉, ethyl acetate, ethylether, methylene chloride등다양한용매를사용하여각각의추출물에대한가장적합한용매-용매간의분배를하 여극성별로각분획에대해저해활성을, 자외선가시선흡수스펙트럼을측정 함으로써멜라닌생성및피부노화에미치는 UV-A와 UV-B 영역에서의흡수 스펙트럼패턴을조사하였다. 2 황칠수액엑스제조 황칠나무에서얻은수지액은우유빛깔의액을분비하는데공기중에서산화하여 점차노란색으로변한다. 이렇게얻은황칠수지액의엑스추출은 2구플라스크 에수지액 5g 넣고환류냉각기를장착한후 의수욕조에서 100% 에탄 올 100mL로 3시간씩 3회반복추출하고여과하여여액을합하여증발농축기에 서감압농축하여황칠수액엑스를제조하였다. 3 황칠수액의분말제조 황칠수지액의분말제조는 2구플라스크에수지액 5g 넣고환류냉각기를장착한 후 의수욕조에서 80% 에탄올수용액 100mL로 3시간씩 3회반복추출 하고여과하여여액을합하여증발농축기에서감압농축한후냉동건조기 (Freezing Dryer, Ilshin Engineering Co.,) 에서건조하여황칠수액의분말을제조

203 하였다. 4 황칠추출물의분획및기기분석을이용한화합물의구조확인 황칠수액과유기용매를각각의비율에맞추어 100mL 분액깔대기에넣고 30분 동안잘흔들어섞어방치한다. 이때분액깔대기안에가스에의한팽창을방지하 기위하여가끔중간밸브를열어준다. 층분리가잘일어나도록충분히방치후 동일방법을 3 회추출하여완전히분획되도록한다. 황칠수액을유기용매에의한분 획추출방법은 2차년도와같은방법으로 liquid-liquid partition 을하였다. 각용매에 대하여각각의분획이끝나면감압농축하여적외선분광광도계및가시선자외선 분광광도계로서유기작용기와자외선흡수스펙트럼을비교분석하였다. (2) 실험결과및고찰 ( 가) 황칠수액엑스의자외선흡수스펙트럼측정 황칠수액의추출물의건조중량에대한일정농도를자외선흡수스펙트럼을측 정함으로써멜라닌생성및피부노화에미치는 UV-A와 UV-B 영역에서의흡수 스펙트럼패턴을조사하였다. 그림 2,2-15. UV-Vis spectra of extract of Dendropanox morbifera Leveille

204 태양자외선은피부색소침착에큰영향을미친다. 피부가 UV-B( nm) 및 UV-A( nm) 로대별되는태양자외선에노출될경우, UV-B는주로피 부의표피층까지침투하고, UV-A 는진피층까지도달된다. 따라서 UV-B는염증을 일으키거나세포손상에관여하고, 또한색소침착을일으키는데참여한다. 즉 UV-B 는표피세포인케라티노사이트로하여금멜라민합성지령인자를방출토록 하여이인자들이멜라노사이트로활성화시켜멜라닌합성을유도하게된다. 한편 UV-A 는진피층에도달하여활성산소의생성을경유하여진피층에손상을준다. 특 히진피의결합조직인콜라겐등의단백질과글리코사미노글리칸등의물질들을파 괴함으로써주름생성을촉진시키는것으로보고되어있다. 따라서자외선으로부터 색소침착억제및주름생성억제를위해서는 UV-B 및 UV-A를차단시킬필요가 있다. 본연구에서는황칠수액의추출용매, 즉에틸알코올, 에틸아세테이트, 에틸에 테르를이용하여 UV-B 및 UV-A영역에서의흡수스펙트럼을측정한결과를그림 2,2-16 에나타내었다. 물질에전자파를통과시킬때흡수가일어나게된다. 가시선 과자외선의흡수는전자의들뜬상태에의하여생기므로들뜨기쉬운전자(π전자 또는 n 전자) 를가진물질에서일어난다. 따라서포화지방산, 유기산, 지방족아미노 산, 당등 2중결합이없는물질들은 UV 흡수가없으나공액 2중결합이많은화 합물은 nm 에서특징적인흡수피크를나타낸다. 본연구에서도 nm 영역에서강한흡수띠를나타내어구조결정에이용될수있다. 그리고그림 2,2-16 에여러종류의용매에서자외선영역에대한비교적큰흡광도를나타냈다. 그중 에서용매의경제성및추출효과를비교했을때특히에틸알코올이추출효과가자 외선영역에대한흡수능력이매우크게나타내었다. 이와같이자외선흡수능력 이큰추출물은색소침착을억제하는데혹은자외선으로부터피부세포를보호하는 데기여할수있다고사료된다. ( 나) 황칠수액의분말제조및 IR 스펙트럼해석 황칠수액의분말제조는실험방법 3.3 에의해서제조를하였고, 이렇게제조된황 칠수액의분말을 IR spectrophotometer 를이용하여유기작용기를해석하였다. 이때 시료는 KBr 법으로준비를하였고, 시료에적외선을쬐어분자의진동중쌍극자모 멘트의변화를일으키는진동에기인하는흡광을측정하여적외선범위에서가지는 진동스펙트럼을분석하여유기작용기의특징적인파장범위를측정하여미지유기화

205 합물의구조를해석하고유기작용기를정성분석하였다. 그결과는그림 2,2-16에 나타내었다. 그림 2,2-16. IR spectrum of powder of Dendropanox morbifera Leveille. 지어 그림 2,2-16 에나타낸적외선스펙트럼은단파장쪽(3400cm -1 ) 의센흡수와관련 -OH 의존재를예상할수있으며, 1025cm -1 및 1400cm -1 에센흡수띠로 -OH 기를많이가지고있는알코올계임을추정할수있다 및 1709cm -1 에서 각각 C-H 및 C=O 신축진동에의해서스펙트럼을나타내었고, 692cm -1 와 1644cm -1 의스펙트럼은 C=C 에대한작용기, 2255cm -1 에서 C C-C C, 983cm -1 과 929cm -1 에는비닐기에대한적외선스펙트럼이나타났고, 2195, 2155, 2120cm -1 에서 C C-C=C에서컨쥬게이트시스템을나타내어 2중결합및삼중결합을하고있는 불포화탄화수소를포함하고있는물질이라는것을알수있고, 이러한분포화탄소 가열및산화에의해서폴리머형태를형성함으로써끈적끈적한형태의수지를만 들게된다. 또한 1102cm -1 에서 C-OH 에대한신축운동으로알코올계의물질과, 1730cm -1 에서포화 -COOH의강한 peak로인한카르복실계를포함하고있다는것 을알수있고, 이러한작용기가황칠수액의미백작용을도와줄것으로사료된다

206 ( 다) 황칠수액엑스에대한추출물의분획및 IR 스펙트럼유기작용기분석 황칠수액엑스를 liquid-liquid partition 방법에의하여분획된각각의추출물에 대한 FT-IR Spectrophotometer에대한측정결과를그림 ~19에각각나타 내었다. 혼합물에서각각의성분을분리하고, 불순물에서원하는화합물을분리정 제하는비교적간단한방법에준하여상분배의원리를이용한 liquid-liquid partition 에의한황칠수액의극성에의한분획물을분리하여각각에서추출된유기 물의작용기를해석하기위하여 FT-IR Spectrophotometyr, GC/MASS를이용하여 정성분석하였다. 이때사용된용매는 n-hexane(0.1), CHCl 3 (4.1), MeOH(5.1) 의추 출용매극성의세기변화하여사용하였다. 이때각각의 FT-IR Spectrophotometry 에의한스펙트럼은그림 에나타내었다. 그림 IR spectrum of n-hexane layer extract of Dendropanox morbifera Leveille

207 그림 IR spectrum of chloroform layer extract of Dendropanox morbifera Leveille. 그림 IR spectrum of Methanol layer extract of Dendropanox morbifera Leveille

208 황칠수액엑스를 liquid-liquid partition 방법에의하여분획된각각의추출물을 KBr 법에의한적외선분광광도계를이용하여유기작용기를확인한결과를그림 에나타내었다. 비극성용매인 n-hexane을이용하여추출했을때적외선 스펙트럼은그림 과같다. 그림 에나타낸것과같이 3400cm -1 와 1400cm -1 에나타낸 peak로인하여 -OH 기를가지고있다는사실을알수있고, 지 문(finger print) 영역이라고하는 1200cm -1 이하에서는특이한적외선흡수스펙트럼 은나타나지않았다. 클로르포름을추출용매로사용했을때적외선스펙트럼에서는 -OH기를나타내는영역은그림 2,2-17 과같으나, 및 1709cm -1 에서각 각 C-H 및 C=O 신축진동에의해서스펙트럼을나타내었고, C=C에대한스펙트럼 은 692cm -1 와 1644cm -1 에서나타내었다. 그림 2,2-19는극성이세기가큰메탄올을 이용했을때적외선스펙트럼인데, 그림 과그림 에서와같은 -OH의 작용기는유사하나추출효과매우절대적인농도는확인하기어려우나상대적으로 흡광도의세기가크게나타내어경제성및추출효과를비교했을때매우큰것으 로사료된다. 또한 1102cm -1 에서 C-OH에대한신축운동과 1730cm -1 에서포화 -COOH의강한 peak 가나타났고이것이미백작용을할것으로예상된다. 2255cm -1 에서 C C-C C, 983cm -1 과 929cm -1 에는비닐기에대한 IR 스펙트럼이나타났고, 2195, 2155, 2120cm -1 에서 C C-C=C 에서컨쥬게이트시스템을나타내었다. 이와같 이황칠수액은불포화탄화수소를포함하고있는물질로써쉽게산화되어황칠수액 의폴리머형태의수지를이루면서고체및반고체형태를이루게된다. ( 라) GC/MASS에의한미백작용작용기해석 용매의극성에따른추출화합물의작용기분석및화학구조를적외선분광광도 법으로예측하였고, 이것을확인하기위하여 GC/MASS 의질량조각그래피(mass fragmentography, MF) 을분석하여같은유출시간을갖는화합물에서각각의다른 조각이온을갖는질량과하전의비(m/z) 에측정하여 library search를통해서미지 시료를확인을할수있다. GC/MASS는가스크로마토그래피에서단일물질로분리 된물질을빠른속도로가속된양이온을만들어이들의질량과하전의비(m/z) 에 따라분리하는원리를이용하는것으로이온스펙트럼을해석, 즉 1) 분자이온확인 2) 분자이온세기에의한이성질체확인 3) 스펙트럼의상관관계( 특징적인이온존재, 이온시리즈존재등) 4) 분자구조결정등을이용하여유기화합물의구조를해석

209 하였다. 본시료의황칠수액은각각의추출용매, 극성지수를이용하여 n-hexane(0.1), CHCl 3 (4.1), MeOH(5.1) 의추출용매극성의세기변화에따른유기물 의작용기를해석하였고, 이에대한 GC/MASS의스펙트럼을그림 에나타내 었다. 이때사용된 GC/MASS에대한조건은표 과같다. 기능성미백화장품 으로사용되는화합물, 알부틴(Arbutin) 의구조는 Hydroquinone일의유도체로카테 콜과레조시놀과수산기위치만다른이성질체에포도당을 1 개결합시킨물질이다. 이러한미백작용은태양광선가운데자외선이나스트레스, 대기오염등에노출되 면프리라디칼활성산소가발생그작용으로멜라노사이트( 색소세포) 가활성화된 다. 활성된멜라노사이트는멜라닌색소를만들어내는효소 Tyrosinase의작용을 활성화시켜멜라닌색소의생성을억제한다. 이와유사한구조를가지는미백작용 을하는 Selina 는백출(Atractylodis rhizoma alba) 추출물의 hexane분획에서높은 활성을가진다. 이러한구조는 selina-4(14),7(11)-dien-8-one 의형태구조를갖는다. 위결과를토대로 GC/MASS의분석결과모두 hydro-one의공통적인특징을가지 고있다. 표 Operation condition of GC/MASS Model Perkin Elmer clraus 600 Column Carrier Gas Flow rate J&W DB 35MS, length 30m, diameter 0.25mm, film thickness 0.25 µm He gas 1.0mL/min Column Temp. 100 (2min), 100 to 310 (15 /min), 310 (2min), Injection Volume 2mL Inlet Temp. 260 Source Temp. 250 Transfer Line Temp. 280 Mass range

210 그림 GC/MASS spectrum and library search of Dendropanox morbifera Leveille. (Reference 별첨 1)

211 * 그림 별첨

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217 그림 (* 별첨 1) 에는유기용매황칠수액을정제및분리하여미백작용을하 는그룹별화합물에대한 GC/MASS 에대한스펙트럼을일부분만나타내었다. MASS의조건으로는이온화전압은 70eV이었고분자량의범위는 a.m.u. 이 었다. 분리된각피크는가스크로마토그램의머무른시간을확인한후개별유기 산성분피크의동정을분석하였고, 이때약 90% 정도의확률에일치하는화합물 로인정하였다. 가스크로마토그램에서 retention time은비슷한것으로비추어보 아서추출효과는큰차이는없는것으로나타나며, 각각에대한 GC/MASS에대한 몇가지의 library search 를하였다. 각각의그래프에서 hydroxyl 그룹을가지는물 질들이매우많으므로, 이것이황칠수액의미백작용을하는것으로판단된다. 한예 로미백작용을가지다고판단되는 hydroxyl작용기를가지는화합물중 2-isopropen yl-4a,8-dimethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7-octahydronaphthalene, decahydro- 4A-methyl-1-methylene-7-1(1-methylethyl), octahydro-1,4,9,9-tetramethy), isocary ophillene, 1H-cyclopropeazulene, ursodeoxycholic acid 등이러한화합물 들의해서미백작용을하는것으로사려된다. 자외선을흡수하는자외선흡수제에는일반적으로벤젠고리를가진유기화합물 이많고, 그작용기로써 -OH, -COOH, -OCH 3 등을포함하고있다. 본황칠수액의 GC/MASS 의스펙트럼에연구결과를토대로화장품중에서미백작용을할수있 는유기화학작용기의 -OH 의존재를확인하였고, 이런종류의유기화합물들이스 스로산화가일어나, 환원제역할을함으로미백작용을하는것으로사료된다. ( 라) 1 H NMR 및 13 C NMR 를이용한분석및구조해석 상기에서얻은 IR 및 GC/MASS등의자료를토대로 1 H NMR 및 13 C NMR 를분 석하여미백작용을하는화합물그룹의화학적구조를밝히고저하였다. 분자중의 개개의 1 H는그수소핵주위의자기적환경영향때문에공명주파수가각각 chemical shift 를한다. 이와같은 chemical shift를이용하여분자구조를결정하한 다. 그러나시료의구조를알고있는상태에서는그화합물의기존의스펙트럼을 이용하여동정하기는쉬우나 NMR 스펙트럼만을가지고는해석하기어려움점도 있다. 본연구에대한기본적인해석은일반적으로 chemical shift가적은관계로 복잡한환구조로갖는것으로사려되고또한 ppm값이 부근에서 3.13부근에 서화학적이동이있는것으로보아 -COR, -COOR, -OCOR등의작용기를가질것

218 으로판단된다. 이와같이결론을내리수있는것도 IR 스펙트럼과 GC/MASS의 스펙트럼을비교분석하여얻을수있다. 그림 는비교적여러그룹을분리하 여얻은 1 H NMR 을나타낸것이다. 그림 H NMR spectrum of ethanolic extract in DMSO. 그림 H NMR spectrum of ethanolic extract in CDCl

219 그림 H NMR spectrum of ethanolic extract. 그림 C NMR spectrum of ethanolic extract in DMSO

220 그림 C NMR spectrum of ethanolic extract in CDCl 3. 그림 ~26까지는황칠수액의분말에대한 13 C NMR 에대한스펙트럼을나 타낸것이다. 13 C-NMR은 1 H NMR 과거의같은목적으로사용되나, 13 C chemical shift 는서로겹쳐지지않으며탄소골격의직접적인정보를주고, 작은 signal를적 분하여계산을할수있고탄소의상대수를얻을수있다. 본연구에서나타낸것 은 signal 강도는온도에따라다르고 NOE(Nuclear Overhouser Effect) 가존재하지 않기때문에 1 H 와같은정확한적분값을얻지는못한다. 그러나약 ppm 180부근에 서 chemical shift를가진것으로보아 -COR 혹은 -CHO 등의작용기, sp 3 의혼성궤 도함수를가질것으로사려되고, 일반적으로어떤치환기가부근의탄소의 ppm값에 영향을미치는것을조사하여판단한다. 여러가지물질이포함되어있어서어떤 화합물이라도단정할수는없으나, 그림 ~26에서보여준것과같이화합물 에대한화학구조는정확히알수없으나, 유기작용기중에서수산기에대한화학 이동을나타내었다

221 라. 황칠수액에대한아급성독성검사연구 (1) 실험재료및방법 ( 가) 실험동물 실험동물은체중이 200±10g인 Sprague-Dawley(SD) 계의 7주된웅성흰쥐를대 한실험동물센터에서구입하여 10 일간본대학의동물사육실에서적응시켰다. 적 응시키는동안에사육실의온도와습도는각각 22±2, 55±5% 로항온, 항습을유지 하였고식이는고형사료( 삼양사) 와물을자유롭게섭취하도록하였다. ( 나) 실험군의분류 10일간사육실에적응시킨체중이 300 g 전후의흰쥐 10마리를한군으로하여 정상대조군(Normal control group) 및실험군(Test group) 으로분류하였다. 정상대 조군은사료와물을자유섭식토록하였으며매일오전 11시 30분 1ml의증류수를 경구투여하였다. 실험군은사료와물을자유섭식토록하였으며매일오전 11시 30 분 1 ml의황칠수액희석액을경구투여하였다. 이때식이는삼양사의고형사료를 자유공급하였으며각군의처리는표 와같다. 표 Composition of Groups 군 (Group) No.1 (Normal control group) 마리수 (No. of exam) 10 사료+ 음용수+ 증류수 1) No.2 (Test group) 10 사료+ 음용수+ 황칠수액희석액 황칠수액희석액 1) ; 황칠수액원액을희석한시료. ( 다) 시료의제조및투여 황칠수액은 2007년 8월전남완도군보길면적자산에서지름 18-23cm의황칠나 무로부터채취하였으며이황칠원액을4 냉장고에보관하면서사용하였다. 1,350mg

222 /1 일/1 인(1,350 mg/1day/60kg) 을투여량으로계산하여체중 300g 전후의랫트에게 35 일동안매일 6.75mg의황칠수액을 1ml의 0.8% methanol에녹여주사기를이용하여 경구투여하였다. ( 라) 측정사항 1 체중및대체중간비, 대체중신장비측정(1 회/1 주일) 체중은시료투여후 신장의무게는부검후측정하였다. 4주동안일주일에한번씩같은시간에측정하였고간및 2 뇨검사(pH, 뇨잠혈, 뇨단백, 뇨당, 뇨 ketone 의측정) 부검하기전날각군의실험동물을각각한마리씩에탄올로소독된깔짚이깔 려있지않은 cage 에넣고뇨를배출하기를기다린후, 배출된뇨를멸균된 cap tube 에담은후, 지시시험지(Serotech Korea Co. Ltd., Seoul) 법을이용하여각 각의실험동물의뇨pH, 뇨단백, 뇨당, 뇨ketone 및뇨잠혈의정도를검사하였다. 3 혈액학적검사(Hematological values 및 CBC differentiation 측정) EDTA tube에채워진혈액은곧바로잘흔들어균등질이되게하고 Coulter R JT(coulter electronics Inc, USA, PN B) 로각각의군의 WBC(White Blood Cell, 백혈구), RBC(Red Blood Cell, 적혈구), HGB(Hemoglobin, 헤모글로 빈), HCT(Hematocrit, 혈액용적백분율), 혈소판(Platelet) 을측정하였다. 에탄올에 12시간담근후깨끗이세척한 slide glass에면봉막대로혈액을도말하여공기 중에서건조한후 Wright stain(yong Dong pharm, Co. Kyungki, Korea) 액을 10방울떨어뜨려 3분간고정염색하고 Wright 완충용액(Yong Dong pharm, Co. Kyungki, Korea) 10방울로충분히혼합시켜 5~6 분간염색하였다. 이때침사가 고착하지않도록유의하여검경에불편을최소화하였다. 이 slide glass는 spray 를사용하여삼차증류수로조심스럽게수세하고실온에서건조하였다. 충분히마 른후 oil immersion하에서 cover slide 를사용하지않고검경하였다. Manual WBC differential counter 를사용하여백혈구를종류별로구별하면서총백혈구 수백개를세어서백분율로분포를측정하고 granularcytes는 coulter 결과와이 중확인(double check) 하였다. 망상적혈구(reticulocyte) 빈도는 capillary를사용하 여 3차증류수에용해시켜여과후실온에보관중인 1% new methylene blue(sigma) 를혈액과동량으로잘섞어 3~5분방치하고깨끗이준비된 slide

223 glass 에도말하였다. Reticuolcyte count는 1000개의적혈구를계수하는동안에 나타나는 reticulocyte 의빈도를백분율로나타내었다. 4 혈액생화학적검사 ( 총단백, 총cholesterol, albumin, AST, ALT, alkaline phosphatase, 총bilirubin 측정) EDTA freed tube에채워진혈액을 30분동안실온에방치한후 3000 g에서 15 분간원심분리하여얻은혈청의 Aspartate aminotransferase(ast) 활성치는 AST kit(boehringer Mannheim, Germany) 을사용하여자동생화학분석기 (Hitachi 747) 로측정하였다. Alanine aminotransferase(alt) 의활성치는 ALT(Boehringer Mannheim, Germany)kit 을사용하여자동생화학분석기 (Hitachi 747) 로측정하였다. Total cholesterol(t-chol.) 은 enzymatic coloimetric test를이용하여 T. chol. kit(boehringer Mannheim, Germany) 를사용하여자동생화학분석기(Hitachi 747) 로측정하였다. Albumin은 ph 4.2에서 BCG(Brom Cresol-Green) 과결합하 여화합물을형성하는데이때의흡광도를 ALB(Boehringer Mannheim, Germany)kit 을사용하여자동생화학분석기(Hitachi 747) 로측정하였다. Alkaline phosphatase(alp) 는 IFCC 검사원리하에 ALP(Boehringer Mannheim, Germany) Kit 을사용하여자동생화학분석기(Hitachi 747) 로측정 하였다. Total bilirubin(t-bil.) 은 DPD method 하에 Bil-T(Boehringer Mannheim, Germany) Kit 을사용하여자동생화학분석기(Hitachi 747) 로측정 하였다. Total protein(tp) 은 Biuret method 하에 TP(Boehringer Mannheim, Germany) Kit 을사용하여자동생화학분석기(Hitachi 747) 를이용하여각군의 수치를측정하였다. ( 마) 부검 사육마지막날동물을 overnight로 16 시간절식시키고체중을측정하였다. 체중 측정이끝난 SD계의랫트를 25 cm지름의데시케이터에넣고, 증류한 ether anhydrous(t.j. Baker Analized ACS reagent, USA) 로 3~4분간마취시킨후해부 대에서복부(ventral) 가보이도록놓고네다리를압핀(thumb tag) 으로고정하였다. 알콜로복부전면을소독한후 forcep으로복부피부를집어서해부가위로정중선을 따라서절제하고, 해부칼로장기가보이도록절개하였다. 0.85% saline(shinyo pure

224 chemicals Co. LTD, Japan) 으로세척하고, 장기가마르지않도록충분히식염수를 뿌려주면서 EDTA를처리하지않은주사기와시험관을이용하여후대정맥에서 5~ 6ml의혈액을채취하여상온에서 30 분경과후, 3000 rpm에서 15 분간저온(4 ) 원 심분리하여혈청을얻었다. 이는 Aspartate aminotransferase(ast), Alanine aminotransferase(alt), alkaline phosphatase(alp), Total cholesterol, total protein, albumin, total bilirubin 분석에사용하였다. EDTA tube에혈액을따로채 혈하여얻은 EDTA 혈액을이용하여 hematological values 및 CBC differentiation 측정에사용하였다. 간, 신장을차례로절제하여무게를측정하고 buffered formalin 용액 (40% formaldehyde 10 ml, 0.65 g sodium phosphate monobasic, sigma, 0.4 g sodium phosphate dibasic, sigma/100 ml T.D.W) 에고정한후실온에보관하였다. ( 바) 통계처리 모든실험결과측정치는일변수분석법을사용하여통계처리하였으며 Student's T-test를이용하여 p<0.05 수준에서각실험군간의유의성을검증하였 다. 모든자료는 mean±standard deviation 으로나타내었다. (2) 실험결과및고찰 ( 가) 성장과체중변화량및장기중량변화 - 2차년도에연구완료 - ( 나) 뇨생화학검사 - 2차년도에연구완료 - 1 뇨 ph - 2차년도에연구완료 - 2 뇨단백 3 뇨당 - 2차년도에연구완료 - - 2차년도에연구완료

225 4 뇨 ketone - 2차년도에연구완료 - 5 뇨잠혈 - 2차년도에연구완료 - ( 다) 혈액학적검사 4주간정상대조군및시험군에각각의시험물질투여후 hematological values 및 CBC differentiation을측정한결과를표 에나타내었다. 정상대조군및황칠 수액추출물을투여한 Test group의 RBC, WBC, HCT, HGB, PLT, Reticulocyte, WBC diff. count 수치를측정한후 Student's T-test 에의해통계처리한결과, Test group 의결과치는정상대조군의결과치와비교하여유의적인차이(p<0.05) 를 나타내지않았다. 따라서황칠수액추출물투여에기인한혈액학적독성은전혀나 타나지않은것으로연구결과가관찰되었다

226 표 Hematological results No. 1 (Normal control group) No. 2 (Test group) RBC 7.98±0.27 1) 7.98±0.32 WBC 10.27± ±1.49 HCT 46.80±2, ±3.24 HGB 16.46± ±0.72 PLT 1096± ±20.45 Reticulocyte 3.28± ±0.27 Neutrophil Stab. - - Neutrophil Seq. 8.52± ±2.86 Lymphocyte 89.56± ±3.88 Monocyte 3.42±2, ±2.21 Eosinophil - - Basophil - - Normoblast - - Blast - - 1) Each value represents the mean±s.d. of 10 rats. * Significant differences as compared with control : p<0.05. RBC, red blood cell count (10 6 / mm 3 ); WBC, white blood cell count (10 3 / mm 3 ); HCT, hematocrit (%); HGB, hemoglobin (g/ dl); PLT, platelet (10 3 / mm 3 ) ( 라) 혈액생화학적검사 표 에 4주간시험물질투여후혈액생화학적검사를한결과를나타내었 다. 정상대조군및황칠수액을투여한 Test group의 TP, albumin, T-Bil., ALP, AST, ALT, T-Chol. 수치를측정하였고각각의결과를통계처리하였다. 그결과, 시험군은미미한차이를나타내었지만정상군의그것과비교하여유의적인차이 (p<0.05) 를나타내지는않았다. 따라서투여시료에기인한혈액생화학적독성은전

227 혀나타나지않은것으로판단되었다. 표 Blood biochemical values No.1 (Normal control group) No. 2 (Test group) TP 6.29±0.27 1) 6.30±0.22 Albumin 3.88± ±0.26 T-Bil. 0.1± ±0.00 ALP ± ±6.86 AST ± ±8.92 ALT 39.33± ±2.88 T-Chol ± ±5.38 1) Each value represents the mean±s.d. of 10 rats. * Significant differences as compared with control : p<0.05 TP, total protein ( mg/ dl); Albumin (g/ dl); ALP, alkaline phosphotase (u/ l); AST, aspatate aminotransferase (U/ l); ALT, alanine aminotransferase (U/ l); T-Chol., total cholesterol (g/ dl); T-Bil., total bilirubin ( mg/ dl)

228 제 4 절황칠나무의생장촉진및황칠수액의분비촉진 방법개발연구( 제 3 세부연구과제) 1. 1 차년도연구결과보고서 가. 연구개발목표 1 차 연도 황칠나무의생장촉진및황칠수액의분비관련토양미생물 분리및동정 나. 연구개발수행내용 - 황칠수지분비량이많고품종이우수한수종의뿌리(NRS, RS, RP) 에서토양미생물을분리 - 식물생장및수액분비촉진활성과관련된생리학적특성탐색 - Biochemical characteristics, PCR 등의방법을통한균동정 - 황칠나무에접종한토양미생물의 root colonization, root dry weight 증가, phytopathogen에대한항균력등을측정 다. 황칠수지분비량이많고품종이우수한수종의뿌리 (NRS, RS,RP) 에서토 양미생물을분리및동정, 생리학적특성연구 (1) 실험재료및방법 ( 가) 토양시료준비 본실험에사용된토양시료는전라남도완도군보길면의황칠수목주변에서채 취하였다. 총 4개군의토양을채취하였는데그 4개군은그특징에따라분리되 었다. Site A의경우현재전라남도기념물제 154호로등록된보호수목의뿌리 부위에서채취된토양인데생존기간을 150여년이상으로측정하고있는만큼수목

229 자체가크고수액생산량이많은수종이라는것을의미한다. Site B의경우는대조군사용목적으로채취하였으며수목에서채취할수있는황칠수액의양이가장적은수종의황칠나무뿌리에서토양을채취하였다. <Site A> <Site B> <Site C> <Site D> 그림 3-1. 각각의 site 의토양채취결과물

230 Site C 의경우에는이목을한수목의하부에서채취한토양이다. 이수목의경우 황칠수액분비의양이월등히많아토양미생물채취대상으로선정하였다. Site D의경우는앞서 3개의군과는달리보길도소재적자산에서자연서식하는황칠 수목을대상으로하여토양을채취한것이다. 이렇게총 4개의군에서토양을채 취하였고각각의황칠수목반경 2m 이내, 깊이 10~15cm 이내의토양을채취하였 으며, 채취시철저히멸균된기구( 모종삽등) 를사용하였다( 그림 3-1). ( 나) 토양미생물분리 토양미생물의분리는 D.W. 희석법을사용하였다. 각군에서채취한토양 5g 을 멸균된 3차증류수 50ml 에넣어 1차희석후 10-1 부터 10-6 까지멸균된 3차증류수 로희석하였다. 그후각희석시킨토양을 NA 배지(Difco 사) 에 100ul smear하여 3 7 와 28 incubator 에서 24~48 시간배양하였다. 배양후생성된 Colony 의외부형태적특성 으로분류하여각각다른균이라생각되는것을따로멸균된니들로채취하여 LB 배지 (Bacto 사) 로옮겨배양하였다. 배양된균을다시 NA 배지 (Difco 사) 에 Stricking 하여하나의균종인지 확인후균의동정에들어갔다. ( 다) 토양미생물의동정 일반적인미생물동정은크게두가지방법으로이루어진다. 그중하나는세균의외부적인 형태나염색의특징또는포자형성이나운동성, 화학적물질에대한반응등을보는생화학적 동정법을통한동정이고다른방법은대상균주에서 DNA 를추출하여염기서열확인을통한 균동정법이다. 본실험자의경우 DNA 염기서열조사를통한균동정을우선실시하였다. 균에서 DNA 를추출하기위하여 DNA Extraction Kit(G-spin Genomic DNA Extraction Kit, intron 사) 를사용하였고추출한 DNA는 DNA 증폭을위한 PCR의 주형 DNA 로사용되었다. 동정에사용된 DNA는 16S ribosomal DNA를채택하였 다. 16S ribosomal DNA는거의대부분의균이공통된 primer 부착염기서열을가 지고있어이곳에 primer를부착하여 DNA를증폭시킨후증폭된 DNA의염기서 열을분석하여각각의균주의종을동정할수있었다. 따라서 PCR을통하여 16S ribosomal DNA 단편을증폭시켜염기서열을분석하였고, PCR의주형 DNA로 는각각의균주에서추출한 DNA를사용하였고 Primer는 16S ribosomal DNA primer(forward primer : AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG, reverse primer : GGT TAC

231 CTT GTT ACG ACT T) 를사용하였다. 그리고 PCR 은 30cycle 을진행하였고 Tm값은 5 2 로설정하였다. (2) 실험결과및고찰 ( 가) 토양미생물의분리 각군에서채취한토양 5g을멸균된 3차증류수 50ml에넣어 1차희석후 10-1 부 터 10-6 까지멸균된 3 차증류수로희석하였고, 그후각희석시킨토양을 NA배지 (Difco 사) 에 100ul smear하여 37 와 28 incubator 에서 24~ 48시간배양하여 A-D 각군 의토양으로부터토양미생물을분리배양하였으며그결과를그림 3-2 에나타내었다. ( 나) 각군의미생물 DNA PCR (Polymerase Chain Reaction) 증폭 A-D 각군의토양으로부터분리배양된각각의토양미생물로부터 DNA 를추출하기위하여 DNA Extraction Kit(G-spin Genomic DNA Extraction Kit, intron 사) 를사용하여 추출하였으며, 추출한 DNA는 DNA 증폭을위한 PCR의주형 DNA 로사용되었다. PCR 은 30cycle 을진행하였고 Tm값은 52 로설정하였다. 분리된각각의균주의 PCR (Polymerase Chain Reaction) 증폭결과를그림 3-3 에나타내었다. 증폭된 band는거의동일하게 1.5kb의싸이즈를나타내었고이 DNA 를이용하여염기서열을분석하였다. ( 다) 각군미생물의 16S ribosomal DNA 염기서열분석에의한동정 각각의토양미생물의동정에는 16S ribosomal DNA 를채택, 사용하였다. 즉, PCR을통하여 16S ribosomal DNA 단편을증폭시켜염기서열을분석하였고, PCR의주형 DNA로는각각의균주에서추출한 DNA 를사용하였으며, Primer는 16S ribosomal DNA primer(forward primer : AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG, reverse primer : GGT TAC CTT GTT ACG ACT T) 를사용하였고이증폭된 DNA 의염기 서열을분석한결과를표 3-1 에나타내었다. 동정결과 A-D 총 4개의군에서검출된미생물 34개중토양미생물의대표라 할수있는 Bacillus속의균주가 16개로가장많았으며 paenibacillus, staphylococcus, pseudomonas, streptomyces, burkhoderia, dyella, ralstonia 속순으

232 로그수가많았다. 각군별로그결과를살펴보면 Site A의경우 bacillus 속이 3 균주과 streptomyces 속이두균주동정되었으며, paenibacillus 속과 staphylococcus속이한균주씩동정되었다. Site B의경우 bacillus속이 5균주 staphylococcus 속 3 균주, lysobacter속 2균주가동정되었고 burkhoderia속, pseudomonas속, streptomyces속이각각한균주씩동정되었다. Site C 에서는 bacillus 속이 5 균주, paenibacillus속이 4 균주, pseudomonas속이 3 균주, ralstonia속이 1 균주동정되었다. Site D의경우 bacillus속이 3균주 dyella속과 paenibacillus, staphylococcus, Burkholderia속이각각한균주씩동정되었다. 각군별결과에서도 전체결과와같이 bacillus 속이우점종으로나타났다

233 <A1> <A9> <A4> <A10> <A5> <A11> <A6> <B1>

234 <B3> <B13> <B4> <B14> <B7> <B16> <B11> <B17>

235 <B19> <C2> <B20> <C4> <B21> <C5> <B22> <C6>

236 <C7> <C11> <C8> <C12> <C9> <C15> <C10> <C16>

237 <C17> <D7> <D1> <D9> <D2> <D11> <D4> <D14> 그림 3-2. 미생물분리배양결과

238

239

240

241

그림 3-3. 16S ribosomal DNA PCR product 전기영동사진. 표 3-1.

GAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTT CATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAACGGTTTTATGAGA TTAGCTCCACCTCGCGGTCTTGCAGCTCTTTGTACCGTCCATTGTAGCACGT

242 그림 S ribosomal DNA PCR product 전기영동사진. 표 3-1. 각군미생물의 16S ribosomal DNA 염기서열분석결과 <A1> TCGCTACTCTAGGCCGGCGGCGGCTGGCTCCATAAAGGTTACCCCACCGACT TCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGG GAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTT CATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAACGGTTTTATGAGA TTAGCTCCACCTCGCGGTCTTGCAGCTCTTTGTACCGTCCATTGTAGCACGT GTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTC CTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTTAATGATGGCA ACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGA CACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCTCCCGAAGGAGAA GCCCTCTCTCTAGGGTTTTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCG CGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAA

243 TTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAAT GCGTTAACTTCAGCACTAAAGGGCGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCAT CGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCT TTCGCGCCTCAaGTGTCAGTTAMAGACMARAAAGTCGCCTTYgCCCACTGG TGTTCCTCCATATtCTCTACGCAtTTTCACCGCTACACATtGGAATTTCACTT TCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCCAGTTTCCAATGACCCTCCACGGTTGAGC CGTGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCACCTGCGCGCGCTTTACGCCCA ATAATTCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACG TAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTGAGGTACCGTCAAGGTGCCAGCTTATTCA ACTAGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGTTTTACGACCCGAAAGCCTTC ATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCC CTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCC GATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTC ACCAACTAGCTAATGCGACGCGGGTCCATCCATAAGTGACAGCCGAAGCCG CCTTTCAATTTCGAACCATGCAGTTCAAAATGTTATCCGGTATTAGCCCCG GTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTATGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCA CCCGTCCGCCGCTAACTTCTTGAGAGCAAGCTCTCAATCCATTCGCTCGACT GCATGTATACCACCGTAGG <Bacillus cereus clone B305 균의 16S ribosomal RNA gene과 97% 부분에서 99% 동일함을보임> <A4> TTCCGTGTCTTACCATGCAGTCGAACGATGGAAGCCCATTCGGGGTGGATT AGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTTCACTCTGGGAC AAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATAACACCGGCTTCCGCATGGGA GCTGGTTGAAAGCTCCGGCGGTGAAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTG TTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGG GCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAG CAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGT

244 GAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGA AAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCGGCAACCG CCCCCC CTATTTCCGCGACGATCTGTCCAAGGGGGTTGGTACCACCGGCTTCGGGTG TTACCGACTTTCGTGACGTGAGGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTA TTCACCGCAGCAATGCTGATCTGCGATTACTAGCAACTCCGACTTCATGGG GTCGAGTTGCAGACCCCAATCCGAACTGAGACCGGCTTTTTGAGATTCGCT CCGCCTCGCGGCATCGCAGCTCTTTGTACCGGCCATTGTAGCACGTGTGCAG CCCAAGACATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGAG TTGACCCCGGCGGTCTCTTTTGAGTCCCCATCACCCCGAT <Streptomyces zaomyceticus strain 균의 16S ribosomal RNA gene과 95% 부분에서 99% 동일함을보임> <A5> TATTTTGGTCGGCGGCTGGCTCCCTTGCGGGTTACCCCACCGACTTCGGGTG TTGTAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGACCCGGGAACGTA TTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCAATTCCGACTTCATGCAG GCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAGATCGACTTTGATAGGATTGGCT CCACCTCGCGGCTTCGCTTCCCGTTGTATCGACCATTGTAGTACGTGTGTAG CCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGT TTGTCACCGGCAGTCATCCTAGAGTGCCCACCCGAAGTGCTGGCAACTAAG ATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAG CTGACGACAACCATGCACCACCTGTCTTGAATGTTCCGAAGAAGGCACCTA TCTCTAGGTGTTGCATTCAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTG CTTCGAATTAAACCACATACTCCACTGCTTGTGCGGGTCCCCGTCAATTCC TTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAATGCTTAATGTGT TAACTTCGGCACCAAGGGTATCGAAACCCCTAACACCTAGgCATTCAaTCGt TTACGGCGTGGACTACCAGGGTATYTAATYCTGTTTGCTCCCCACGCTTTC GCGCCTCAGCGTCAGTTACAGCCCAGAGAGTCGCCTTCGCCcACTGGgTtGTT

245 CCTCCACMTCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCT TCTGCACTCAAGCCTTGCAGTTTCCAATGCGACCCAGGGTTGAGCCCTAGG TTTAAACACCAGACTTACAAAGCCGCCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAAT TCCGGACAACGCTTGCCCCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTA GCCGGGGCTTTCTTCTCAGGTACCGTCACCTTGAGAGCAGTTACTCTCCCAA GCGTTCTTCCCTGGCAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCA CGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTGCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCT GCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGTTCACCC TCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCCCACCAACTA GCTAATGCGCCGCAGGCCCATCTGTAAGTAGCAGATTGCTCCGCTTTTCCCA GCTCAGTCATGCGACCAAGCTGATTATTCGGTCTTAGCTACCGTTTCCGGT AGTTATCCCGATCTTACAGGCAGGTTGCCTACGTGTTTCTCACCCGTCCGCC GCTAAGTTATCCCCGAAGGAATAACTCCGCTCGACTGCATGTATACGAAAC TTG <Paenibacillus terrigena 균의 16S rrna gene과 98% 부분에서 98% 동일함을보 임 > <A6> CTCCGTTGGATACTGCAGTCGAGCGAACTTTTAAAAGCTTGCTCCCAAAAG TTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGACTGGG ATAACTTCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAATTCTTTTCTACACATGT AGGAAAGTTGAAAGATGGTTTCGGCTATCACTTACAGATGGGCCCGCGGCG CATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCG ACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTA CGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGC AACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGG GAAGAACAAGTACCGGAGTAACTGCCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAAA AAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAG CGTTGTCCGGAATCATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTCCTTAAATT

246 CTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAAGGGTCATTGGAAACTGGGG AACTTGGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCACGTTGTAGCGGTGAAT GCCTAGAGATGTGGAGGAAACCCCAGGGGGCGAAGGCAACTTTTCTGGGTC TGTAATTGACACCTGAGGCGCGGAAAGTG TTAACGGTACTCTATGCCCGCGACGGCTGGCTCCATAAGGTTAACCCCACCG AACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGC CCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGG CTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAGAATGGTTTTATG GGATTGGCTTAACCTCGCGGTCTTGCAGCCCTTTGTACCATCCATTGTAGC ACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCAC CTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTG GCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCA CGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTTATGCCCCCGAAGG GGAACCCCTCCTCTCTAGGGATGTCATAAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGT TCTTCGCGTTGCTTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCC CCGTCAATTCCTTTTGATTTTCAGACTTGCTACCGAACTC <Bacillus firmus strain AU9 균의 16S ribosomal RNA gene과 87% 부분에서 96% 동일함을보임> <A9> TTCTACGCCGTCTCTCTCTCGACGGCTAGCTCCAATGGTTACTCCACCGGCT TCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGACCCGG GAACGTATTCACCGTAGCATGCTGATCTACGATTACTAGCGATTCCAGCTT CATATAGTCGAGTTGCAGACTACAATCCGAACTGAGAACAACTTTATGGGA TTTGCTTGACCTCGCGGTTTCGCTACCCTTTGTATTGTCCATTGTAGCACG TGTGTAGCCCAAATCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTT CCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCAACTTAGAGTGCCCAACTTAATGATGGC AACTAAGCTTAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACG ACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGTCCCCCGAAGGGG

247 AAAACTCTATCTCTAGAGGGATCAGAGGATGTCAAGATTTGGTAAGGTTC TTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGTCCCCG TCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCT TAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCAC TCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGATCCCCA CGCTTTCGCACATCAACGTCAGTTACAGMCCAGAAAWGTtCGCCTTMGCCA CTGGTGTTCCTCCATATCTYTGCGCATTTCACCGCTACACATGGAATTCCA CTTTCCTCTTCTGCACTCAAGTTTTCCAGTTTCCAATGACCCTCcACGGTTG ASCCGTGGGCTKTCACATCARACTTAAAAAACSGCCtACGcCGCGCTTTACGC CCRATAATTCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCA CGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGATTAGGTACCGTCAAGACGTGCATAGTTA CTTACACATTTGTTCTTCCCTAATAACAGAGTTTTACGATCCGAAGACCTT CATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGGCTTTCGCCCATTGCGGAAGATTC CCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGGC CGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTAAGCCGTTACCT TACCAACTAGCTAATGCGGCGCGGATCCATCTATAAGTGACAGCAAAACCG TCTTTCACTATTGAACCATGCGGTTCAATATATTATCCGGTATTAGCTCCG GTTTCCCGAAGTTATCCCAGTCTTATAGGTAGGTTATCCACGTGTTACTCA CCCGTCCGCCGCTAACGTCAGAGGAGCAAGCTCCTCGTCTGTCGCTCGACTG CATGTATAGTCAGACAGCAAAGCGCA <Staphylococcus epidermidis strain KL-004 균의 16S ribosomal RNA gene과 97% 부분에서 98% 동일함을보임> <A10> CACTCGGGATACTGCAGTCGAGCGAACAGACGAGGAGCTTGCTCCTCTGAC GTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGATAACCTACCTATAAGACTGG GATAACTTCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAATATATTGAACCGCATG GTTCAATAGTGAAAGACGGTTTTGCTGTCACTTATAGATGGATCCGCGCCG CATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCAACGATGCGTAGCCG

248 ACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCT ACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAG CAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTCTTCGGATCGTAAAACTCTGTTATTAG GGAAGAACAAATGTGTAAGTAACTATGCACGTCTTGACGGTACCTAATCA GAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCA AGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGGTTTTTTAAG TCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGAA AACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTG CTGAGCGTTCACTCTATTTGGGCGACGGCTAGCTCCAAATGGTTACTCCAC CGGCTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGGGACGGGCGGTGTGTACAAGA CCCGGGAACGTATTCACCGTAGCATGCTGATCTACGATTACTAGCGATTCC AGCTTCATATAGTCGAGTTGCAGACTACAATCCGAACTGAGAACAACTTTA TGGGATTTGCTTGACCTCGCGGTTTCGCTACCCTTTGTATTGTCCATTGTA GCACGTGTGTAGCCCAAATCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCC ACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCAACTTAGAGTGCCCAACTTAATG ATGGCAACTAAGCTTAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATC TCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGTCCCCCGA AGGGGAAAACTCTATCTCTAGAGGGATCAGAGGATGTCAAGATTTGGTAA GGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGG TCCCCGTCAAATTCCTTTGAATTTCAACCTTTGCGGTCGTACTCCCCAGGGC GGAGTGCTTAATGCTTTGTCTGCAGCACCTAA <Staphylococcus epidermidis strain S09 균의 16S ribosomal RNA gene과 96% 부분에서 100% 동일함을보임> <A11> AAGATGTTACTGGTGCCCGTTTATATACTGCAAGTCGAGCGGACTAATGGG AGCTTGCTCCCGTTAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACC TACCTGTAAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATGAC ATAAAGGAACTCCTGTTCCTTTATTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTAC

249 AGATGGGCCCGCGGCGCATTAACTAGTTGGGGAGGTAACGGCTCACCAAGG GGACGAAGCGTAACCGAACTGAGAGGGTGATCGGCCACCCTGGGACTGAGA CCCGGCCCAAAATCCTACGGGAGGCAACAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGA CGAAAGTCTGACGGAACAACGCCGCATGAGCGATGA AAAACGGAACGACACTCTATGCCCGGCGGCGGCTGGCCCCTAAAAGGTTACC CCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTAC AAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGTGA TTCCGGCTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAATAGT TTTATGGGATTAGCTCCACCTCGCGGTCTTGCAACCCTTTGTACTATCCAT TGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCAT CCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTAA ATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAAC ATCTCACGACACGATTTTTTCGAAAC <Bacillus luciferensis 균의 16S rrna gene과 92% 부분에서 99% 동일함을보임> <B1> TGCCTTGTCGGCGGCTGGCTCCAAAAAGGTTACCCCACCGACTTCGGGTGTT ACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATT CACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCATGTAGGC GAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAACGGTTTTATGAGATTAGCTCCA CCTCGCGGTCTTGCAGCTCTTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCC AGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTT GTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTTAATGATGGCAACTAAGATC AAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTG ACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCTCCCGAAGGAGAAGCCCTATCT CTAGGGTTTTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTC GAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGA GTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAACT TCAGCACTAAAAGGGCGGAAACCCTCTAAACACTTAGCACTCATCGTTTAC

250 GGCGTGGAYTACCAGGGTATCTAATCCcTGTTTGCTCMCCACGCtTTTCGCG CCTCAGTGTCAGTTtACAGACCAGAAAGTCGCCcTTCGCCACTGGTGKTYCC TCCATATCTCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAATTCCACTTTCCTCTT CTGCACTCAAGTCTCCCAGTTTCCAATGAaCCCTCCACGGgTTGAGCCGTgG GCTTTCACATCARACTTAAGaAAACCACCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAA TTCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGT TAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCCAGCTTATTCAACTA GCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGTTTTACGACCCGAAAGCCTTCATCA CTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTAC TGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATC ACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCA ACTAGCTAATGCGACGCGGGTCCATCCATAAGTGACAGCCGAAGCCGCCTT TCAATTTCGAACCATGCGGTTCAAAATGTTATCCGGTATTAGCCCCGGTTT CCCGGAGTTATCCCAGTCTTATGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGT CCGCCGCTAACTTCTTGAGAGCAAGCTCTCAATCCATTCGCTCGACTGCAGT ATATAAAGGAG <Bacillus cereus strain Delaporte 균의 16S ribosomal RNA gene과 98% 부분에 서 99% 동일함을보임> <B3> CCCTTTGGATCTGCAGTCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAG TTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGG ATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAATATTTTGAACTGCATGG TTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCG CATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCG ACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTA CGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGC AACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTATG GAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTCACCAG AAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTA

251 AGGCCGGCGGCGGCTGGCTCCATAAAGGTTACCCCACCGACTTCGGGTGTTA CAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTC ACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCATGTAGGCG AGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAACGGTTTTATGAGATTAGCTCCAC CTCGCGGTCTTGCAGCTCTTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCA GGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTG TCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTTAATGATGGCAACTAAGATCA AGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGA CGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCTCCCGAAGGAGAAGCTCTATCTC TAGAGTTTTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCG AATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCCGTCAATTCCTTTGA GTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGAGTGCTTAATTGCGTTAA CTTCTTCACTA <Bacillus weihenstephanensis strain MC67 균의 16S ribosomal RNA gene과 98% 부분에서 99% 동일함을보임> <B4> TGATCGTTTGGTTCTCTTTGGATCTGCAGTCGAGCGGATTAATGGGAGCTT GCTCCCGTTAATTAGCGGCGGACGGGGGAGTAACACGTGGGCAACCTACCT GTAAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATGACACTGA GGAACTCCTGTTCCTTAGTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTACAGATG GGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACG ATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGG CCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAA GTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGCGATGAAGGCCTTCGGGTCGTAAAGC TCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTAAATAAGCTGGCACCTTGGCG GTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATA CG TTACGTCACTCTAGGCGGGCGGCGGCTGGCCTAAAAGGTTACCCCACCGACT TCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGAGGGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGG

252 GAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGTGATTCCGGCTT CATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAATAGTTTTATGGGA TTAGCTCCACCTCGCGGTCTTGCAACCCTTTGTACTATCCATTGTAGCACG TGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTT CCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTAAATGCTGGC AACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACG ACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGTCCCCGAAGGGAA CGCCCTATCTCTAGGGTTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTC GCGTT <Bacillus sp. CBD0119 균의 16S ribosomal RNA gene과 94% 부분에서 99% 동일 함을보임 > <B7> TAGGCCCGCGGTACCGTCCTCCCGAAGGTTAGACTAGCTACTTCTGGTGCA ACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTC ACCGCGACATTCTGATTCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCACGCAGTCG AGTTGCAGACTGCGATCCGGACTACGATCGGTTTTGTGAGATTAGCTCCGC CTCGCGGCTTGGCAACCCTCTGTACCGACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCA GGCCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGT CACCGGCAGTCTCCTTAGAGTGCCCACCATAACGTGCTGGTAACTAAGGAC AAGGGTTGCGCTCGTTACGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTG ACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCAATGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCT CTGGAAAGTTCATTGGATGTCAAGGCCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTC GAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTG AGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCAACTTAATGCGTTAGC TGCGCCACTAAAATCTCAAGGATTCCAACGGCTAGTTGACATCGTTTACGG CGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCtGKTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTC AGTGTCAGTATGAGCCCAaGGTGGTCGCCTTCSCCcACTGGTGgTTCCTTtCC TATATCTACGCATTTCACCGCTACACAGGAAATTTCCACCACCCCTCTGCCC

253 TACTCTAGCTCGCCAGTTTTGGATGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGATT TCACATCCAACTTAACGAACCACCTACGCGCGCTTTTACGCCCAGTAATTC CGATTAACGCTTGCACCCTCTGTATTACCGCGGCTGCTGGCACAGAGTGAG CCGGTGCTTATTCTGTCGGTAACGTCAAAACAGTTACGTATTAGGCAACTG CCCTTCCTCCCAACTTAAAGTGCTTTACAATCCGAAGACCTTCTTCACACA CGCGGCATGGCTGGATCAGGCTTTCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCT GCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGACTGATCATCC TCTCAGACCAGTTACGGATCGTCGCCTTGGTGAGCCTTTACCCCACCAACTA GCTAATCCGACCTAGGCTCATCTGATAGCGCAAGGCCCGAAGGTCCCCTGCT TTCTCCCGTAGGACGTATGCGGTATTAGCGTCCCTTTCGAGACGTTGTCCCC CACTACCAGGCAGATTCCTAGGCATTACTCACCCGTCCGCCGCTGAATCAGA GAGCAAGCTCTCTTCATCCGCTCGACTGCATGTGTACCAACGGAG <Burkholderia caryophylli 균의 16S rrna gene과 98% 부분에서 97% 동일함을 보임 > <B11> ATCCGGTTTACCATGCAGTCGAACGGCAGCACAGCAGTAGCAATACTGTGG GTGGCGAGTGGCGGACGGGTGAGGAATGCATCGGAATCTGCCTATTTGTGG GGGATAACGTAGGGAAACTTACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAA AGTGGGGGACCGCAAGGCCTCACGCAGATAGATGAGCCGATGCCGGATTAG CTAGTTGGCGGGGTAAAGGCCCACCAAGGCGACGATCCGTAGCTGGTCTGA GAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGA GGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGC CGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGTCCGGAAAGA AAAGCATTCGGTTAATAACCGGGTGTCATGACGGTACCGGAAGAATAACCA CCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTA CTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTCTGATG TGAAAGCCCTGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTGAATACTGGCTTACTAGA GTGCGGTAGAGGGTAAGCGGAATTCCCGGTGTAGCAGTTGAAATGCGTAGC

254 TGTACGATACTCTATTTTACCGACAGCGCCCTCCCGAAGGTTAAGCTACCT GCTTCTGGTGCAACAAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCC CGGGAACGTATTCACCGCAGCAATGCTGATCTGCGATTACTAGCGATTCCG ACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTGAGATGGGGTTTCT GGGATTGGCTCGCCCTCGCGGGTTTGCAGCCCTCTGTCCCCACCATTGTAGT ACGTGTGTAGCCCTGGCCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACC TTCCTCCGGTTTGTCACCGGCGGTCTCCTTAAAGTTCCCACCATTACGTGCT GGCAACTAAGGACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTC ACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTCACGGTTCCCGAGGG CGCCAATCCATCTCTGGAAAGTTCCGTGCATGTTGAGGCTAGGTAAGGTAC CTCCCGATGAAACCAAATACACCACAAAACTCCACCACTTGCCAGAG <Lysobacter sp. GH41-7 균의 16S ribosomal RNA gene과 96% 부분에서 97% 동 일함을보임 > <B13> CATGAGTGTTAATGTTCCCGTTTGGATCTGCAAGTCGAGCGGATTAATGGG AGCTTGCTCCCGTTAATTAGCGGCGGACGGGAGAGTAACACGTGGGCAACC TACCTATAAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATGAC ACTGAGGAACTCCTGTTCCTTAGTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTAT AGATGGGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGG CGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGA CACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGAC GAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGCGATGAAGGCCTTCGGGTCGTA AAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTAAATAAGCTGGGCACC TTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGAAGCCGCG GTAAT AAACCGTGCGTCACTCTATGCCTGTCGGCGGATGGCCCCTAAAAAGGTTAC

255 CCCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGAGGGGCGGTGTGTA CAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGTG ATTCCGGCTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAATAG TTTTATGGGATTAGCTCCACCTCGCGGTCTTGCAACCCTTTGTACTATCCA TTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCA TCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTA AATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGAACTTAACCCAA CATCTCACGACATTTTTTTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGTC CCCAAAAGCAACGCCCT <Bacillus luciferensis 균의 16S rrna gene과 94% 부분에서 97% 동일함을보임> <B14> TAAGTGTACAGTCCTTGTCGGTACCGTCCTCCCGAAGGTTAGACTAGCTAC TTCTGGTGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGG GAACGTATTCACCGCGACATTCTGATTCGCGATTACTAGCGATTCCGACTT CACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGGACTACGATCGGTTTTGTGAGA TTAGCTCCACCTCGCGGCTTGGCAACCCTCTGTACCGACCATTGTAGCACGT GTGTAGCCCAGGCCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCC TCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCCTTAGAGTGCCCACCATAACGTGCTGGT AACTAAGGACAAGGGTTGCGCTCGTTACGGGACTTAACCCAACATCTCACG ACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTCAGAGTTcCCGAAGGCAC CAATCCATYTYTGGAAAGTTCTCTGCATGTCAAGGCCTGGTWAGGTTYTT CGCGTTGCTTYGAAtTAAACCACATGCTCCACCGCTtGTGCGGGCCCCCGTCA AtTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCAACTTAAT GCGTTAGCTGCGCCACTAAAATCTCAAGGATTCCAACGGCTAGTTGACATC GTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGtTTTGCTCCCCACGCTT TCGCACCTCAGTGTCAGTATCAGTCCAGGTGGTCGCCTTCGCCACTGGTGTT CCTTCCTATATCTACGCATTTCACCGCTACACAGGAAATTCCACCACCCTCT ACCGTACTCTAGCTTGCCAGTTTtGGATGCAGTTCCCAgGTTGAGCCCGGGG

256 CTTTCACATCCAACTTAACAAACCACcTACGCGCGCTTTACGCCCAGTAATT CCGATTAaCGCTtGCACCCTtCTGTATWMCCGCgGCTGCTGGCACAGAGTTAG CMGGKGCTTtATTCTGTCGgTAACGTCAAAACAGCAAGGTATTAGCTTACT GCCCTTCCTCCCAACTTAAAGTGCTTTACAATCCGAAGACCTTCTTCACAC ACGCGGCATGGCTGGATCAGGCTTTCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGC TGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGACTGATCAT CCTCTCAGACCAGTTACGGATCGTCGCCTTGGTGAGCCATTACCTCACCAAC TAGCTAATCCGACCTAGGCTCATCTGATAGCGCAAGGCCCGAAGGTCCCCTG CTTTCTCCCGTAGGACGTATGCGGTATTAGCGTTCCTTTCGAAACGTTGTC CCCCACTACCAGGCAGATTCCTAGGCATTACTCACCCGTCCGCCGCTGAATC AAGGAGCAAGCTCCCGTCATCCGCTCGACTGCATGGTATGCAACTAG <Pseudomonas plecoglossicida strain R4 균의 16S ribosomal RNA gene과 97% 부분에서 98% 동일함을보임> <B16> AATTTTTCCTTATCCTCGTTTATACCATGCAGTCGAAGATGGTCCCATCGG TGGGGATTTGGTGCAACGGATGACTTCCACGTGCGTGATCTGCCCTTCCCTC TGGGACAAGCCCTGGGTACGGGGTCTAATAGGGGATACCACTACTTGTGGG ATGTGTGTGGGTTGAAAGCTACTGCGGATTGGGACGAACCCGTGGCCTATT AACCATGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCC TGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGG GAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCAAAAGCCTGATGCAGCGAC GCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAA TAATTTTAATTGACGGTACCTGCAGAAGTACGCCGGCTAAGTAAGTGCCAC CCCCCCGC AACGATAACGGTCAACTCTATGCCCGTCGACGCTCCCGTCCCAACAGAGGGG TTGCGTGCCACCGGCTTCGGGTGTTACCGACTTTCGTGACGTGACGGGCGGT GTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGCAATGCTGATCTGCGATTA CTAGCAACTCCGACTTCATGGGGTCGAGTTGCAGACCCCAATCCGAACTGA

257 GACAGGCTTTTTGACTTTCGCTCCACCTCACGGTATCGCAGCTCATTGTAC CTGCCATTGTAGCACGTGTGCAGCCCAAGACATAAGGGGCATGATGACTTG ACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCGGTCTCCTGTGAGTCCC CATCACCCCGAAGGGCATGCTGGCAACACAGGACAAGGGTTGCGCTCGTTGC GGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCACCACC TGTACACCGACCACAAGGGGGGCACCATCTCTGATGCTTTCCGGCGTATGT CAAGCCTTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCGTCGAATTAAGCCACATGCTCCG CTGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTA CTCCCCAGGCGGGGAACTTAATGCGTTAGCTGCGGCACCGACGACGTGGAA TGTCGCCAACAC <Streptomyces ciscaucasicus 균의 16S rrna geng과 90% 부분에서 99% 동일함 을보임 > <B17> AGTACTCTGTCGGCAGCGCCCTCCCGAAGGTTAAGCTAACTGCTTCTGGTGC AACAAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTAT TCACCGCAGCAATGCTGATCTGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAG TCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTGAGATGGGGTTTCTGGGATTGGCTC GCCCTCGCGGGTTTGCAGCCCTCTGTCCCCACCATTGTAGTACGTGTGTAGC CCTGGCCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTT TGTCACCGGCGGTCTCCTTAGAGTTCCCACCATTACGTGCTGGCAACTAAG GACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAG CTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTCACGGTTCCCGAAGGCACCAATCCA TCTCTGGAAAGTTCCGTGCATGTCAAGGCCAGGTAAGGTtCTtCGCGtTGCAT CGAATTAAACCACATACTcCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTtG AGtTTCAGTCTTGCGACCGTACTTCCCAGGCGGCGAACTTAACGCGTTAGCT TCGATACTGAGTGCCTAGTTGCAcCCAACATCCAGTTCGCATCGTTTAGGGC

258 GTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGTGCCTCA GTGTCAGTGCTGGTCCAGGTAGCCGCCTTCGCCACAGATGTTCCTCCCGATA TCTACGCATTTCACTGCTACACCGGGAATTCCGCTACCCTCTACCGCACTCT AGTAAGCCAGTATCCAATGCAGTTCCCAGGgTTGAGCCCAGGGCTTTCACA TCAGACTTAACAAACCACCTACGCACGCTTTACGCCCAGTAATTCCGAGTA ACGCTTGCACCCTTCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGAAGTTAGCCGGTGC TTATTCTTCCGGTACCGTCATGACACCCGGTTATTAACCGAATGCTTTTCT TTCCGGACAAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCACACACGCGGCA TGGCTGGATCAGGCTTGCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCC GTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGGCTGATCATCCTCTCAG ACCAGCTACGGATCGTCGCCTTGGTGGGCCTTTACCCCGCCAACTAGCTAAT CCGGCATCGGCTCATCTATCTGCGTGAGGCCTTGCGGTCCCCCACTTTCTCC CGTAGGACGTATGCGGTATTAGCGTAAGTTTCCCTACGTTATCCCCCACAA ATAGGCAGATTCCGATGCATTCCTCACCCGTCCGCCACTCGCCACCCACAGT ATTGCTACTGCTGTGCTGCCGTTCGACTGCATGGTATAAGCGTAAA <Lysobacter sp. GH41-7 균의 16S ribosomal RNA gene과 97% 부분에서 98% 동 일함을보임 > <B19> AATTCAGTGTAAGTGACCAGTTGTTGATCTGCAGTCGAGCGAATGATTGGG AGCTTGCTCCCATGATTTAGCGGCGGACGGGAGAGTAACACGTGGGCAACC TACCTGTAAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAAT TTCTTTTCTCGCATGAGAAGAGATGGAAAGACGGTTTCGGCTGTCACTTAC AGATGGGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGG CCACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGAC ACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGAC GAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGCGAAGAAGGCCTTCGGGTCGTA AAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCAAAGTAACTGCTGGTACCTTG ACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTT

259 ATCGGTACGCTCACTCTAAGCCCGTCGGCGATGGGCTCCTTGCGGTTACCTC ACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGAGAGAGGGGCGGTGTGTACAA GGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTC CGGCTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAATGGCTTT ATGAGATTCGCTTACCCTCGCGGGTTCGCAGCTCTTTGTACCATCCATTGT AGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCC CACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCCCCTTAGAGTGCCCAACTAAATG CTGGCAACTAAAATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATC TCACGACACATGCTGACAACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGTCCTCCAC AAAGAGAACCTCT <Bacillus asahii 균의 16S rrna gene과 90% 부분에서 97% 동일함을보임> <B20> CACAAGTTGTCAAGGTGACCGTTGAGATACTGCAAGTCGAGCGAACAGACG AGGAGCTTGCTCCTTTGACGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGT AACCTACCTATAAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGA TAATATTTCGAACCGCATGGTTCGATAGTGAAAGATGGCTTTGCTATCACT TATAGATGGACCTGCGCCGTATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCA AGGCAACGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGAACTG AGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAAT GGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTCTTCGGAT CGCAGAACTCTGTTATTAGGGAAGAAC CCACAGTAACGTGCACTCTATTCCGCGACGGCTAGCTCCAAAATGGTTACT CCACCGGCTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTAC AAGACCCGGGAACGTATTCACCGTAGCATGCTGATCTACGATTACTAGCGA TTCCAGCTTCATGTAGTCGAGTTGCAGACTACAATCCGAACTGAGAACAAC TTTATGGGATTTGCTTGACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTATTGTCCAT TGTAGCACGTGTGTAGCCCAAATCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCAT

260 CCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCAACTTAGAGTGCCCAACTTA ATGATGGCAACTAAGCTTAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAAC ATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTTTGTCCCC CGAAGGGGAAACTTCTATCTCTAGAAGGGTCAAAGGATGTCAAGATTTGG TAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGC GGGTCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTTG <Staphylococcus hominis 균의 16S rrna gene과 94% 부분에서 99% 동일함을보 임 > <B21> GTTTCTTGCTCGACGGCTAGCTCCATAAATGGTTACTCCACCGGCTTCGGG TGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGACCCGGGAACG TATTCACCGTAGCATGCTGATCTACGATTACTAGCGATTCCAGCTTCATGT AGTCGAGTTGCAGACTACAATCCGAACTGAGAACAACTTTATGGGATTTGC TTGACCTCGCGGTTTAGCTGCCCTTTGTATTGTCCATTGTAGCACGTGTGT AGCCCAAATCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCC GGTTTGTCACCGGCAGTCAACTTAGAGTGCCCAACTTAATGATGGCAACTA AGCTTAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACG AGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTTTGTCCCCCGAAGGGGAAAA CTCTATCTtCTAGaAGCGGTCAAAGGATGTCAAGATTTGGTAAGGTTCTTCG CGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGTCCCCGTCAA TTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAAT GCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCAT CGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGATCCCCACGCT TTCGCACATCAGCGTCAGTTACAGACCAGAAAGTCGCCTTCGCCACTGGTG TTCCTCCATATCTCTGCGCATTTCACCGCTACACATGGAATTCCACTTTCC TCTTCTGCACTCAAGTTTTCCAGTTTCCAATGACCCTCCACGGTTGAGCCG TGGGCTTTCACATCAGACTTAAAAAACCGCCTACGCGCGCTTTACGCCCAA TAATTCCGGgATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCgGCGGCTGCTGGCACG

261 TAGTTAGCCGTGGCTTTCTGATCAGGTACCGTCAAGATGTGCACAGTTACT TACACATTTGTTCTTCCCTGATAACAGAGTTTTACGATCCGAAGACCTTCA TCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGGCTTTCGCCCATTGCGGAAGATTCCC TACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGGCCG ATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGTATCGTTGCCTTGGTAAGCCGTTACCTT ACCAACTAGCTAATACGGCGCGGATCCATCTATAAGTGACAGCAAAGCCGC CTTTCACTATTGAACCATGCGGTTCAATATGTTATCCGGTATTAGCTCCGG TTTCCCGAAGTTATCCCAGTCTTATAGGTAGGTTATCCACGTGTTACTCAC CCGTCCGCCGCTAACGTCAAAGGAGCAAGCTCCTTATCTGTTCGCTCGACTT GCATTATAGCAATAGTGTG <Staphylococcus pasteuri의 16S rrna gene과 98% 부분에서 99% 동일함을보 임 > <B22> AGTTCTTGCTCGACGGCTAGCTCCATAAATGGTTACTCCACCGGCTTCGGG TGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGACCCGGGAACG TATTCACCGTAGCATGCTGATCTACGATTACTAGCGATTCCAGCTTCATGT AGTCGAGTTGCAGACTACAATCCGAACTGAGAACAACTTTATGGGATTTGC TTGACCTCGCGGTTTAGCTGCCCTTTGTATTGTCCATTGTAGCACGTGTGT AGCCCAAATCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCC GGTTTGTCACCGGCAGTCAACTTAGAGTGCCCAACTTAATGATGGCAACTA AGCTTAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACG AGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTTTGTCCCCCGAAGGGGAAAA CTCTATCTCTAGAGCGGTCAAAGGATGTCAAGATTTGGTAAGGTTCTTCcG CGTTgCYTCGAATTAAACCACATGCTCCcACCGCtTTGTGCGGGTCCCCGTCA ATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAA TGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCA TCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGATCCCCACGC TTTCGCACATCAGCGTCAGTTACAGACCAGAAAGTCGCCTTCGCCACTGGT

262 GTTCCTCCATATCTCTGCGCATTTCACCGCTACACATGGAATTCCACTTTC CTCTTCTGCACTCAAGTTTTCCAGTTTCCAATGACCCTCCACGGTTGAGCCG TGGGCTTTCACATCAGACTTAAAAAACCGCCTACGCGCGCTTTACGCCCAA TAaTTCCGGATAACGCtTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTA GTTAGCCGTGGCTTTCTGATCAGGTACCGTCAAGATGTGCACAGTTACTTA CACATTTGTTCTTCCCTGATAACAGAGTTTTACGATCCGAAGACCTTCATC ACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGGCTTTCGCCCATTGCGGAAGATTCCCTA CTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGGCCGAT CACCCTCTCAGGTCGGCTACGTATCGTTGCCTTGGTAAGCCGTTACCTTACC AACTAGCTAATACGGCGCGGATCCATCTATAAGTGACAGCAAAGCCGCCTT TCACTATTGAACCATGCGGTTCAATATGTTATCCGGTATTAGCTCCGGTTT CCCGAAGTTATCCCAGTCTTATAGGTAGGTTATCCACGTGTTACTCACCCG TCCGCCGCTAACGTCAAAGGAGCAAGCTCCTATCTGTTCGCTCGACTGCAT TATATAGTAGCTAC <Staphylococcus pasteuri strain LF-2 의 16S ribosomal RNA gene과 98% 부분에 서 99% 동일함을보임> <C2> TGTTCTTGTCGGCGGCTGGCTCCATAAAGGTTACCCCACCGACTTCGGGTGT TACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTAT TCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCATGTAGG CGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAACGGTTTTATGAGATTAGCTCC ACCTCGCGGTCTTGCAGCTCTTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCC CAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTT TGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTTAATGATGGCAACTAAGAT CAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCT GACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCTCCCGAAGGAGAAGCCCTATC TCTAGGGTTTTCAGAGGATGTCAAGACcTGgTAAGGtTCTTCGCGTTGCTTC GAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGA

263 GtTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAACTT CAGCACTAAAGGGCGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGC GTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCA GTGTCAGTTACAGACCAGAAAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCATAT CTCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAATTCCACTTTCCTCTTCTGCACTC AAGTCTCCCAGTTTCCAATGACCCTCCACGGTTGAGCCGTGGgCTTTCACAT CAGACTTAAGAAACCACCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGATAA CGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGgCT TTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCCAGCTTATTCAACTAGCACTTGTTCT TCCCTAACAACAGAGTTTTACGACCCGAAAGCCTTCATCACTCACGCGGCG TTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCC GTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGG TCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAAT GCGACGCGGGTCCATCCATAAGTGACAGCCGAAGCCGCCTTTCAATTTCGA ACCATGCAGTTCAAAATGTTATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTA TCCCAGTCTTATGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAA CTTCATAAGAGCAAGCTCTTAATCCATTCGCTCGACTTGCATGTATACCAA AAGTGTG <Bacillus cereus strain H1439 균의 16S ribosomal RNA gene과 98% 부분에서 99% 동일함을보임> <C4> AACAGTAACGGCACTCTATGTGTGTCGGCGGCTGGCTCCATAAAGGTTACC CCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTAC AAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGA TTCCAGCTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAACGGT TTTATGAGATTAGCTCCACCTCGCGGTCTTGCAGCTCTTTGTACCGTCCAT TGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCAT CCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTTA

264 ATGATGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAAC ATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCTCCC GAAGGAGAAGCCcTATCTCTAGAGTTTtCAGAgGATGTCAAGACCTGGTAAG GTtCTtCGCGTTGCTTCGAaTTAAACCACATGcTCCACCGCTtGTgGCGGGCCC CCGTCAATtcCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGAGTGC TTAATGCGTTAACTTCAGCACTAAAGGGCGGAAACCCTCTAACACTTAGCA CTCATCGTTtACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCA CGCTTTCGCGCCTCAGTGTCAGTTACAGACCAGAAAGTCGCCTTCGCCACTG GTGTTCCTCCATATCTCTACGCATTTCACCGgCTACACATGGAATTCCACT TTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCCAGTTTCCAATGACCCTCCACGGTTGAA CCGTGGGgCTTTYACATCAGACTTAARAAACCACCTGCGCGCGCTTTACGCC CAATAaTTCCGGATaACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGgCAC GTAGcTTAGCCGTGgCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCCAGCTTATTC AACTAGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGTTTTACGACCCGAAAGCCTT CATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTC CCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGC CGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCT CACCAACTAGCTAATGCGACGCGGGTCCATCCATAAGTGACAGCCGAAGCC GCCTTTCAATTTCGAACCATGCAGTTCAAAATATTATCCGGTATTAGCCCC GGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTATGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTC ACCCGTCCGCCGCTAACTTCTTGAGAGCAAGCTCTCAATCCATTCGCTCGAC TGCATGATCAAAAACTAGGTACCTGAGCATGCGAVT <Bacillus cereus clone B305 균의 16S ribosomal RNA gene과 96% 부분에서 99% 동일함을보임> <C5> AACCGTTACTGTCACTCTATGCGCGTCGACGGCTGGCCTCCTAAAAGGTTA CCCCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGT ACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGT

265 GATTCCGGCTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAATA GTTTTATGGGATTAGCTCCACCTCGCGGTCTTGCAACCCTTTGTACTATCC ATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTC ATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACT AAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCA ACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGTCC CCGAAGGGAACGCCCTATCTCTAGGGTTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGT AAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCACTTGTGCG GGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCG GAGTGCTTAATGCGTTAACTTCAGCACTAAAAGGGCGGAAACCCTCTAACA CTTAGCACTCATCGTTTACAGCGTGGAcTACCcAGGGTATMTAAaTCCTGTT TRCTcCCCCACGCTTTCGCGCCTCAgCGTCAGTTACAGACCAgAAAGTCGCCT TCGCCaCTGGTGTTCCTCCAAaTCTYtTACGCATTTCACCGCTACWCTTGgA ATTCCWCTTTCCTCTTCTGCACTCAARTTTCCCAgTTTYCAaTGACtCCTCC CCGGTtGAGCCGGGGgCTTTCACATCAgACTTAaGAAACCGCCTGCGCGCGCT TTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCT GCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCCA GCTTATTTAACTAGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGACCCG AAGGCCTTCATCGCTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCG GAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCC AGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGC CGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGCCCATCTGTAAGTGATAG CCGAGGCCATCTTTCAACTAAGGAACAGGAGTTCCTCAGTGTCATCCGGTA TTAGCTCCGGTTTCCCGAAGTTATCCCAGTCTTACAGGTAGGTTGCCCACG TGTTACTCTCCCGTCCGCCGCTAACTAACGGGAGCAAGCTCCCATTAGTCCG CTCGACTTGCAGTATAAAAACGGGGTACCTGTCCACCGATVT <Bacillus luciferensis균의 16S rrna gene과 95% 부분에서 97% 동일함을보임> <C6>

266 ATGTCTGGTCGGCGGCTGGCTCCTTGCGGTTACCCCACCGACTTCGGGTGTT ATAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGACCCGGGAACGTATT CACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCAATTCCGACTTCATGCAGGCG AGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAGACCGGCTTTGTTGGGATTGGCTCCA TCTCGCGATTTCGCAGCCCGTTGTACCGGCCATTGTAGTACGTGTGTAGCCC AGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTT GTCACCGGCAGTCTATCTAGAGTGCCCACCCGAAGTGCTGGCAACTAAATA TAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCT GACGACAACCATGCACCACCTGTCTCCTCTGTCCCGAAGGaAAAGATACATC TCTGTACCGATCAGAGGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTcTTCGCGTTGCT TCGAATTAAACCACATACTcCACTGCTTGTGCGGGTCCCCGTCAATTCCTTT GAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGTGTTAA CTTCGGCACCAAGGGTATCGAAACCCCTAACACCTAGCACTCATCGTTTAC GGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCC TCAGCGTCAGTTACAGCCCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCAC ATATCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCA CTCAAGTCACCCAGTTTCCAGTGCGATCCGGGGTTGAGCCCCGGGAaTTAAA CACCAGACTTAAATTACCGCCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGAC aacgcttgccccctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgggg CTTTCTTCTCAGGTACCGTCACCTTGAGAGCAGTTACTCTCCCAAGCGTTC TTCCCTGGCAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGC ATTGCTCCGTCAGGCTTTCGCCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCC CGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAG GTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAAT GCGCCGCAGGCCCATCCCCAAGTGACAGATTGCTCCGTCTTTCCAGTTTCCT TCAGGCGAAGAAAACAATTATTCGGTATTAGCTACCGTTTCCGGTAGTTGT CCCAAACTTGAGGGCAGGTTGCCTACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAAC GTATCAGAGAAGCAAGCTTCTCATCAAGTCCGCTCGACTGCAGTATACACA CGCGAGCCAVT <Paenibacillus pabuli균의 16S rrna gene과 97% 부분에서 99% 동일함을보임>

267 <C7> CGTCTTGTCGGTACCGTCCCCCCGAAGGTTAGACTAGCTACTTCTGGTGCA ACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTC ACCGCGACATTCTGATTCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCACGCAGTCG AGTTGCAGACTGCGATCCGGACTACGATCGGTTTTGTGGGATTAGCTCCAC CTCGCGGCTTGGCAACCCTCTGTACCGACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCA GGCCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGT CACCGGCAGTCTCCTTAGAGTGCCCACCATAACGTGCTGGTAACTAAGGAC AAGGGTTGCGCTCGTTACGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTG ACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCAATGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCT CTGGAAAGTTCATTGGATGTCAAGGCCTGGTAAGGTTCTYCGCGTTGCTtCG AAWTAAACCACATGCTcCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGA GTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCAACTTAATGCGTTAGCT GCGCCACTAAGAGCTCAAGGCTCCCAACGGCTAGTTGACATCGTTTACGGC GTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTCA GTGTCAGTATCAGTCCAGGTGGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTTCCTAT ATCTACGCATTTCACCGCTACACAGGAAATTCCACCACCCTCTACCATACT CTAGCTCGACAGTTTTGAATGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGCTTTCAC ATCCAACTTAACGAACCACCTACGCGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATT AACGCTTGCACCCTCTGTATTACCGCGGCTGCTGGCACAGAGTTAGCCGGTG CTTATTCTGTCGGTAACGTCAAAACACTAACGTATTAGGTTAATGCCCTTC CTCCCAACTTAAAGTGCTTTACAATCCGAAGACCTTCTTCACACACGCGGC ATGGCTGGATCAGGCTTTCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCC CGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGACTGATCATCCTCTCA GACCAGTTACGGATCGTCGCCTTGGTGAGCCATTACCTCACCAACTAGCTA ATCCGACCTAGGCTCATCTGATAGCGCAAGGCCCGAAGGTCCCCTGCTTTCT CCCGTAGGACGTATGCGGTATTAGCGTCCGTTTCCGAGCGTTATCCCCCACT ACCAGGCAGATTCCTAGGCATTACTCACCCGTCCGCCGCTCTCAAGAGGTGC

268 AAGCACCTCTCTACCGCTCGACTGCATGGTATGCATACTAG <Pseudomonas fluorescens strain 2P24 균의 16S ribosomal RNA gene과 97% 부 분에서 99% 동일함을보임> <C8> TTGACTTACAGTACCCTGTTTTTGATACTGCAAGTCGAGCGGACTTGATGG AGTGCTTGCACTCCTGATGGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGC AACCTGCCCTCAAGACTGGGATAACTACCGGAAACGGTAGCTAATACCGGA TAATTTATTTTGCAGCATTGTGAAATAATGAAAGGCGGAGCAATCTGTCA CTTGAGGATGGGCCTGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAACGGCCCAC CAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGAACGGCCACACTGGGAC TGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCA ATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGG ATCGTAAAGCTCTGTTGCCAAGGAAGAACGTCTTCTAGAGTAACTGCTAGG AGAGTGACCGTACTTGAGAAGAAAGCCCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCC GCGGTAATACGTAGGGGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCG CGCGCAGGCGGTTCTTTAAGTCTGGTGTTTAAACCCGGAGGCTCAACTTCG GGTCGCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAAAAGAGGAGAGTTGGAAT TCCACCTGTACTGGGA CCCAAAAGGTACTCTATGCCCGCGGCGGCTGGCTCCCTTGCGGGTTACCCCA CCGACTTCGGGTGTTGTAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAG ACCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCAATTC CGACTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAGACTGGCTTT TATAGGATTGGCTCCACCTCGCGGCTTCGCTTCCCGTTGTACCAGCCATTGT AGTACGTGTGTAGCCCAAGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCC CGCCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCATTCTAGAGTGCCCACCCAAAGT GCTGGCAACTAAAATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACAT CTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACCTCTGTCCCGA

269 AGGCCGCCTCTATCTCTAGAGGATTCAGAGGGATGTCAAGACTTGGTAAGG TTCTTCGCGTTGCTTCAATTAAACCACATACTCCACTGCTTGTGCGGGTCC CCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCAACCGTACTCCCCAGGCGGAAT GATTAAGGGTAACTT <Paenibacillus ginsengagri 균의 16S rrna gene과 95% 부분에서 99% 동일함을 보임 > <C9> AAGGATTGGACAGGGTATTTTTTTTTTAGTACTGCAAGTCGAGCGAATCA TATGAGGAGGCTTGCTCCTGTTATGATTAGCGGCGGATGGAGCGGGTAACA CGTGGGCAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACATCGGGAAACCGGAGCTAA TACCGGATAATCCTTTTCCACACATGTGGGAAAGCTGAAAGACGGTTTCGG CCCTTCACTTACAGATGGGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAC GGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACAC TGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCT TTCGCTATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACTCCGCGTGAGCGATGT AATCGTACGTGTCACTCTAGGTCCGCGGCAGCTGGCTCCTTACGGTTACCCC ACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGAGAGACAGGCGGTGTGTACAA GGCCCGGGAACGTATTCACCGCGTGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGAT TCCGGCTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAATGGTT TTATGGGATTGGCTAAACCTCGCGGTTTCGCAGCCCTTTGTACCATCCATT GTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATC CCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAA TGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACA TCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGTCCCCC GAAGGGGAAAGTCCTATCTCTAGGAGTGTCAAAGGATGTCAAGACCTGGTA AGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTT <Bacillus niacini균의 16S ribosomal RNA gene과 89% 부분에서 98% 동일함을보

270 임 > <C10> AGCTTCTTGTCGGCGGCTGGCTCCCTTGCGGGTTACCCCACCGACTTCGGGT GTTGTAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGACCCGGGAACGT ATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCAATTCCGACTTCATGCA GGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAGACTGGCTTTTATAGGATTGGC TCCACCTCGCGGCTTCGCTTCCCGTTGTACCAGCCATTGTAGTACGTGTGTA GCCCAAGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCGCCTTCCTCCGG TTTGTCACCGGCAGTCATTCTAGAGTGCCCACCCAAAGTGCTGGCAACTAA AATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGA GCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACCTCTGTCCCGAAGGCCGCCTCTA TCTCTAGAGGATTCAGAGGGATGTcCAAGACTTGGTAAGGTTCTTCGCGTT GCTTCGAATTAAACCcACATACTCCACTGCtTGTGCGGGTCCCCGTCAATTC CTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAATGCTTAATGTG TTAACTTCGGCACCAAGGGTATCGAAACCCCTAACACCTAGCATTCATCGT TTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTC GCGCCTCAGCGTCAGTTACAGCCCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCC TCCACATATCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTC TGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAGTGCGACCCGAAGTTGAGCCTCGGGgTT TAAACACCAGACTTaAAGAACCGCCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCC GGACAACGCTTGCCCCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCC GGGGCTTTCTTCTCAAGTACCGTCACTCTCCTAGCAGTTACTCTAGAAGAC GTTCTTCCTTGGCAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACG CGGCGTTGCTCCGTCAGGCTTTCGCCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGC CTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGTTCACCCTC TCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGGGCCGTTACCCCACCAACTAGC TAATGCGCCGCAGGCCCATCCTCAAGTGACAGATTGCTCCGCCTTTCATTA TTTCACAATGCTGCAAAATAAATTATCCGGTATTAGCTACCGTTTCCGGTA

271 GTTATCCCAGTCTTGAGGGCAGGTTGCCTACGTGTTACTCACCCGTCCGCCG CTAACCATCAGGAGTGCAAGCACTCCATCAAGTCCGCTCGACTTGCAGTAT ACCAAACGGAG <Paenibacillus ginsengagri균의 16S rrna gene과 98% 부분에서 99% 동일함을 보임 > <C11> ATGTTGTTGTCGGCGGCTGGCTCCTTACGGTTACCCCACCGACTTCGGGTGT TACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTAT TCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGGCTTCATGTAGGC GAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAATGGTTTTATGGGATTGGCTAAA CCTCGCGGTCTTGCAGCCCTTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCC AGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTT GTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATC AAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTG ACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGTCCCCCGAAGGGGAACGTCCTAT CTCTAGGAGTGTCAGgAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTtCTTCGCGTTGC TTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAAaTTCCT TTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGaAGTGCTTAATGCGTT AGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGtTTA CGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGC CTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAAAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCA CATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCGCTTTCCTCTTCTGCA CTCAAGTCCCCCAGTTTCcAATGACCCTCCACGGgTTGAGCCGTgGGCTTTC ACATCAGACTTAAAGGACCGCCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGG ACAaCGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGT tggctttctggttaggtaccgtcaaggtaccggcagttactccgatacttgt TCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGACCCGAAGGCCTTCATCGCTCACGCGG CGTTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCT

272 CCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTC AGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTA ATGCGCCGCGGGCCCATCTGTAAGTGACAGCCGAAACCGTCTTTCAGTTTT TCCTCATGAGAGGAAAAAGATTATCCGGTATTAGCTCCGGTTTCCCGAAGT TATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTGCCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCT AACCAATGGGAGCAAGCTCCCAAAGATTCGCTCGACTTGCATGTATCCAAA ACTAAT <Bacillus bataviensis균의 16S rrna gene과 98% 부분에서 99% 동일함을보임> <C13> AATCAATGCTCACGTGTCCCGTCGTTGTCTGCAGTCGAGCGGATCTTGTCC TTCGGGACAAGGTTAGCGGCGGACGGGTGAGAAAAACGTGGGTAACCTGCC CATAAGACTGGGATAACATTCGGAAACGAATGCTAATACCGGATACGCGAA TTGGTCGCATGGCCGAATCGGGAAAGGCGGAGCAATCTGCCACTTATGGAT GGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAACGGCTCACCAAGGCGACG ATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGG CCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAA GTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGC TCTGTTGCCAGGGAAAAACGCTTGCGAGAGTAACTGCTCGCAAGGTGACGG TACCTGAGAAGAAAGCCCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATA AATACGGTAAGTCACTCTATTCGGCGCAGCTGGCTCCTTGCGGTTACCCCAC CGGCTTCGGGTGTTGTAAACTCTCGTGGAGAAGAAGGGCGGTGTGTACAAG ACCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCAATTC CGACTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAGACCGACTTT GATAGGATTGGCTCCACCTCGCGGTTTCGCTTCCCGTTGTATCGGCCATTG TAGTACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCC CCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCATCCTAAAGTGCCCACCCAAAG TGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGC

273 <Paenibacillus agaridevorans균의 16S rrna gene과 88% 부분에서 95% 동일함을 보임 > <C15> CGTCCTCTCTTGGTATCGCCCTCCTTGCGGTTAGGCTAACTACTTCTGGCAA AACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGACCCGGGAACGTAT TCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGTAGTC GAGTTGCAGACTACGATCCGGACTACGATGCGTTTTCTGGGATTGGCTCCC CCTCGCGGGTTGGCAACCCTCTGTACGCACCATTGTATGACGTGTGAAGCCC TACCCATAAGGGCCATGAGGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTG TCACCGGCAGTCTCTCTAGAGTGCCCTTTCGTAGCAACTAGAGACAAGGGT TGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACA GCCATGCAGCACCTGTGTCCACTTTCCCTTTCGGGCAcCTAATGCATCTCTG CTTCGTTAGTGGCATGTCAAaGRGTAGGTAAGGtTTTTCGCGTTGCATCGAA TTAATCCACATCATCCACCGCTTGTGCGGGTCCCCGTCAATTCCTTTGAGT TTTAATCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGTCAACTTCACGCGtTAGCTACG TTACTGAAGAAATGAATCCCCAACAACTAGTTGACATCGTTTAGGGCGTGG ACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGTGCATGAGCG TCAGTAACGTCCCAGGGGGCTGCCTTCGCCATCGGTATTCCTCCACATCTCT ACGCATTTCACTGCTACACGTGGAATTCTACCCCCCTCTGACATACTCTAG CCTGACAGTCACAAGCGCCATTCCCAAGTTAAGCTCGGGGATTTCACGCCT GTCTTATCAAaCCGCCYGCGCACGCTTTACGCCCAGTAATTCCGAtTAACGC TCGCACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTtAGCCgGTGCTTAT TCTTCCGGTACCGTCATCCCCCCACCGTATTAGGGCGAAGGTTTTCTTTCCG GACAAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCACACACGCGGCATTGCT GGATCAGGGTTGCCCCCATTGTCCAAAATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGG AGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCTGATCGTCCTCTCAGACCAGC TACTGATCGTCGCCTTGGTAGGCTTTTACCCCACCAACTAGCTAATCAGAC ATCGGCCGCTCCTGTCGCGCGAGGCCTTACGGTCCCCCGCTTTCACCCTCAG

274 GTCGTATGCGGTATTAGCTAATCTTTCGACTAGTTATCCCCCACGACAGGG CACGTTCCGATGTATTACTCACCCGTTCGCCACTCGCCACCAGGCCGAAGCC CGTGCTGCCGTTCGACTGCATGTTAAGACGAAGCTAAGAATVT <Ralstonia sp. c308 균의 16S rrna gene과 97% 부분에서 99% 동일함을보임> <C16> CGTACTGTGCTAGTACCGTCCCCACCGCAAAGATTAGACTACGTCTACTTC TGGTGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGA ACGTATTCACCGCGACATTCTGATTCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCA CGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGGACTACGATCGGTTTTATGGGATT AGCTCCACCTCGCGGCTTGGCAACCCTCTGTACCGACCATTGTAGCACGTGT GTAGCCCAGGCCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTC CGGTTTGTCACCGGCAGTCTCCTTAGAGTGCCCACCATAACGTGCTGGTAA CTAAGGACAAGGGTTGCGCTCGTTACGGGACTTAACCCAACATCTCACGAC ACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCAAtGCTCCCGAAGGCACCAa TCCATCTCTGGAAAGtTCATTGGATGTCARGSCCTgGGTAAGGTTCTTCGCG TYGCTtCRAATTAAACCACATGCTCcACcGSTTGTGCGGGCCCCCGTYAATTC ATTtGAGTTTWAACCtTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCAACTTAaTGcGTT AGCTGCGcCCACTAAGAGCTCAAGGCTCCCAAMGGSTAGTTGACATCGTTtA SGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTtCGCA CCTCAGTGTCAGTATCAGTcCCAGGTGGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTT ccctatatctacgcatttcaccgctacacaggaaattccaccaccctctacc ATACTCTAGCTTGTCAGTTTTGAATGCAGTTCCCAGgTTGAGCCCGGGGCT TTCACATCCAACTTAACAAACCACCTACGCGCGCTTTACGCCCAGTAATTC CGATTAACGCtTGCACCCTCTGTATTACCGCGGCTGCTGGCACAGAGTTAGC CGGTGCTTATTCTGTCGGTAACGTCAAAATTGCAGAGTATTAATCTACAAC CCTTCCTCCCAACTTAAAGTGCTTTACAATCCGAAGACCTTCTTCACACAC GCGGCATGGCTGGATCAGGCTTTCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTG CCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGACTGATCATCCT

275 CTCAGACCAGTTACGGATCGTCGCCTTGGTGAGCCATTACCTCACCAACTA GCTAATCCGACCTAGGCTCATCTGATAGCGCAAGGCCCGAAGGTCCCCTGCT TTCTCCCGTAGGACGTTGCGGTATTAGCGTTCCTTTCGAAACGTTGTCCCC CACTACCAGGCAGATTCCTAGGCATTACTCACCCGTCCGCCGCTGAATCAGA GAGCAAGCTGCGTCTCCATCGCGACTCGACTAGCATGAGTACTGCCTAGCGC CCCCCCG <Pseudomonas putida strain PC16 균의 16S ribosomal RNA gene과 93% 부분에 서 98% 동일함을보임> <D1> TTACTATCGTCTCTCTTCTAGGCGGCTGGCTCCATAAGGTTACCCCACCGAC TTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCG GGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCT TCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAACGGTTTTATGAG ATTAGCTCCACCTCGCGGTCTTGCAGCTCTTTGTACCGTCCATTGTAGCACG TGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTT CCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTTAATGATGGC AACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACG ACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCTCCCGAAGGAGA AGCCCTATcTYTAGGGTYTTYAGAGgAYGTCMAGACCTGGTAAGGTTcTWc GCGTTGCTTCgAAWTAMAMCACAYGCTCCcACCGaCTTGTGcCGGGCCCCCG TCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCtTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTT AATGCGTTAaCTTCAGCACTAAAGGGCGGAAACCCTcTAACACTTAGCACTC ATCGtTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCcAC GCTTTCGCGCCTCAGTGTCAGtTTACAGACCAGAAAGTCGCCTTCGCCACTG GTGTTCCTCCATATCTCTACGCATTTCAcCCGCTACACATGGAATTCCACTT TCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCCAGTTTCCAATGACCCTCCACGGTTGAGC CGTGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCACCTGCGCGCGCTTTACGCCCA ATAATTCCGGATAaCGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGT

276 AGTTAGCCGTGgCTTTCTGGTtAGGTACcGTCAAGGTGCCAGCTTATTCAAC TAGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGTTTTACGACCCGAAAGCCTTCAT CACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCT ACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGA TCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCAC CAACTAGCTAATGCGACGCGGGTCCATCCATAAGTGACAGCCGAAGCCGCC TTTCAATTTCGAACCATGCAGTTCAAAATGTTATCCGGTATTAGCCCCGGT TTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTATGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCC GTCCGCCGCTAACTTCATGAGAGCAAGCTCCTCAATCCATTCGCTCGACTGC AGTATATCGACGCTAG <Bacillus cereus clone B305 균의 16S ribosomal RNA gene과 97% 부분에서 98% 동일함을보임> <D2> TATGCGGGTCGGCGGCTGGCTCCATAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTG TTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTA TTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGGCTTCATGTAG GCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAATGGCTTTATGGGATTCGCTT ACCTTCGCAGGTTTGCAGCCCTTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAG CCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGT TTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTAAATGCTGGCAACTAAGA TCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGC TGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGTCCCCCGAAGGGGAACGCCCT ATCTCTAGGGTTGTcAGAGGATGTCcAAGACCTGGTAAGgTTcTTCGCGTTG CTTCGAATTAAAcCACATGCTCCACCGCTTGTgCGGGCCCCCGTCAAtTTCCT TTGAGTTYCAGCCTTGCGGCCcGTMCTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTT AGCTGCAGCACTAAAGGGCGGAAAaCCCTCTAACACTTAGCACTCATCGTT TtACGGCGTGGACTACCMRGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTC GCGCCTCAGTGTCAGTTACAGACCAGAAAGTCGCCTTYGCCACTGGTGTTC

277 CTCCAAATCTCTACGCATTTCACCGCTACACtTTGGAATTCCACTTTCCTCT TCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCACGGgTTGAGCCGTGG GCTTTCACATCARACTTAAGGaACCACCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAAT TCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTA GCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTACCAGCAGTTACTCTGGTA CTTGTTCTTCCCTAACAACAGAACTTTACGACCCGAAGGCCTTCTTCGTTC ACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGC TGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACC CTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCATTACCTCACCAACT AGCTAATGCGCCGCGGGCCCATCTATAAGTGACAGCCGAAACCGTCTTTCC ATCTTCTCTCATGCGAGAAAAGAACGTATCCGGTATTAGCTCCGGTTTCCC GAAGTTATCCCAGTCTTATAGGCAGGTTGCCCACGTGTTACTCACCCGTCC GCCGCTAATCTCAGGGAGCAAGCTCCCATCGATTCGCTCGACTTGCATGTA TAAGAAACCGAGG <Bacillus sp. EP23 균의 16S rrna gene과 98% 부분에서 99% 동일함을보임> <D4> CGCGCTATCGATATACTGCAAGTCGAGCGAATGGATTGAGAGCTTGCTCTC ATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAG ACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAATATTTTGAACT GCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCC GCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCG TAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAG ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTG ACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGT TGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACC TAACCAGAAAGCCACGGCTaACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGG TGGCAAGCGTTATCCcGRAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTT CTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAA

278 CTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTG AAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTC TGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATAC CCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCG CCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAaGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCC GCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGC ATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGgACATC CTCTGAAAACTtCTAGAGATAGAGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGG TGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCG CAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTA AGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCAT CATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAG AGCTGCAAGACCGCGAGGTGGAGCTAATCTCATAAAACCGTTCTCAGTTCG GATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCG GATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTC ACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCTTTATGGAG CCAGCCGCCGACAAGTACA <Bacillus thuringiensis serotype H61 균의 16S ribosomal RNA gene과 98% 부분 에서 99% 동일함을보임> <D7> CGCAAACTGTTAATCTAAGTCTTGTCGGTGACCGTCCTCCTTGCGGTTAGA CTAGCCACTTCTGGTAAAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTAC AAGACCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGA TTCCAGCTTCATGCACTCGAGTTGCAGAGTGCAATCCGGACTACGATCGGT TTTCTGGGATTAGCTCCCCCTCGCGGGTTGGCAACCCTCTGTTCCGACCATT GTATGACGTGTGAAGCCCTACCCATAAGGGCCATGAGGACTTGACGTCATC CCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCCTTAGAGTGCTCTTGCGTA GCAACTAAGGACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCA

279 CGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTATCGGTTCTCTTTCG AGCACTCCCACCTCTCAGCGGGATTCCGACCATGTCAAGGGTAGGTAAGGT TTTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCACATCATCCACCGCTTGTGCGGGTCC CCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAATCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGTCA ACTTCACGCGTTAGCTACGTTACTAAGGAAATGAATCCCCAACAACTAGTT GACATCGTTTAGGGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCC CACGCTTTCGTGCATGAGCGTCAGTATTGGCCCAGGGGGCTGCCTTCGCCAT CGGTATTCCTCCACATCTCTMSGCATTTtCAcTGCTACASGTGGAATTYTAM CCCCCYTCTGCCATACTCTAGCCTGCCAGTCACCAATGCAgTTCCCAGGTTG AGCCCGGRGATTTCACATCGGKCTTARCAAASCGCCYGCGCACGCTTTtACG CCCAcGTAATTCCGAWTAACGCTCGCMCCCTACGTATTACCGCGGCTGCTG GCACGTAGTTAGCCGGTGCTTATTCTTCCGGTACCGTCATCCCCCGGCTGTA TTAGAGCCAAGGATTTCTTTCCGGACAAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCC TTCTTCACACACGCGGCATTGCTGGATCAGGCTTTCGCCCATTGTCCAAAA TTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGT GGCTGGTCGTCCTCTCAGACCAGCTACTGATCGTCGCCTTGGTAGGCCTTTA CCCCACCAACTAGCTAATCAGCCATCGGCCAACCCTATAGCGCGAGGCCCGA AGGTCCCCCGCTTTCATCCGTAGATCGTATGCGGTATTAATCCGGCTTTCG CCGGGCTATCCCCCACTACAGGACATGTTCCGATGTATTACTCACCCGTTCG CCACTCGCCACCAGGTGCAAGCACCCCGTGCTGCCGTTCGACCTGCATGGTA ATACAACGAG <Burkholderia cepacia strain ATCC 균의 16S ribosomal RNA gene과 97% 부분에서 98% 동일함을보임> <D9> CGTTCTCTGCTCGGTCGTCGCCCTCCTTGCGGTTAGGCTAACGGCTTCTGGA GCAACTCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGT ATTCACCGCAGCATAGCTGATCTGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCACGA AGTCGAGTTGCAGACTTCGATCCGGACTGGGATCGGCTTTCTGGGATTGGC

280 TCCACCTCGCGGTATTGCAACCCTCTGTACCGACCATTGTAGTACGTGTGT AGCCCTGGCCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCG GTTTGTCACCGGCAGTCTCCTTAGAGTTCCCACCATTACGTGCTGGCAACT AAGGACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACAC GAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTTCTGATTCCCGAAGGCACTCCC GCATCTCTGCAGGATTCCAGACATGTCAAGGCCAGGTAAGGTTCTtCGCGTT GCATCGAAtTAAACCACATACTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCC TTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGCGAACTTAACGCGT TAGCTTCGACACTGATCTCCGAGTTGAGACCAACATCCAGTTCGCATCGTT TAGGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCG TGCCTCAGCGTCAGTGTTGATCCAGATGGCCGCCTTCGCCACTGATGTTCCT CCCGATCTCTACGCATTTCACCGCTACACCGGGAATTCCACCATCCTCTATC ACACTCTAGCTTGCCAGTATCCATTGCCATTCCCAGGTTGAGCCCGGGGAT TTCACAACAGACTTAACAAACCGCCTACGCACGCTTTACGCCCAGTAATTC CGATTAACGCTTGCACCCTTCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGAAGTTAG CCGGTGCTTATTCCTCAGGTACCGTCAGCCCCATAGGGTATTAACCCATGG TATTTCGCTCCTGATAAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCACACA CGCGGCATTGCTGGATCAGGCTTGCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCT GCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCTGATCATCC TCTCAGACCAGCTATCGATCGTCGCCTTGGTGAGCCATTACCTCACCAACT AGCTAATCGAACATCGGTCCATCCAACCGCGCGAGGTCTTTCGATCCCCCGC TTTCTCCCGTAGGACGTATGCGGTATTAGCGTAAGTTTCCCTACGTTATCC CCCACGTCTGGGCAGGTCCCGATGCATTACTCACCCGTCCGCCACTCGCCAC CCACAGTATTGCTACTGTCTGTGCTGCCGTTCGACTTGCATGGTATACATA GGAAG <Dyella koreensis strain BB4 균의 16S ribosomal RNA gene과 98% 부분에서 99% 동일함을보임> <D11>

281 TGTACTCTCTCGACGGCTGGCTCCTTGCGGTTACCCCACCGGCTTCGGGTGT TGTAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGACCCGGGAACGTAT TCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCAATTCCGACTTCATGCAGG CGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAGATCGACTTTGATAGGATTGGCTC CACCTCGCGGCTTCGCTTCCCGTTGTATCGACCATTGTAGTACGTGTGTAGC CCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGT TTGTCACCGGCAGTCATCCTAGAGTGCCCACCCGAAGTGCTGGCAACTAAG ATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAG CTGACGACAACCATGCACCACCTGTCTTGAATGCTCCGAAGAGGGACCcTAT CTCTAGRTGTTtACATtCGaGATGTCAAGACCTGGTAAGGKTCtTCGCGTTGC TTCGAATTAAACCACATACTCCACTGCTTGTGCGRGTCCCCGTCAATTCCtT TGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAATGCTTAATGTGTTA ACTTCGGCACCAAGGGTATCGAAACCCCTAACACCTAGCATTCATCGTTTA CGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGC CTCAGCGTCAGTTACAGCCCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCA CATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCA CTCAAGCCTTGCAGTTTCCAATGCGACCCAGGGTTGAGCCCTAGGTTTAAA CACCAGACTTACAAAGCCGCCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGAC AACGCTtGcCCCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGGgC TTTCTTCTCAGGTACCGTCACCTTAAGAGCAGTTACTCTCCTAAGCGTTCT TCCCTGGCAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCG TTGCTCCGTCAGACTTGCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCC GTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGTTCACCCTCTCAGG TCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCCCACCAACTAGCTAATG CGCCGCAGGCCCATCTGTAAGTAGCAGATTGCTCCGCTTTTCCCAATTCGA TCATGCGATCAAATCGTGTATCCGGTCTTAGCTACCGTTTCCGGTAGTTAT CCCAGTCTTACAGGCAGGTTGCCTACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAAG TTATTCCCGAAGGAATAACTCCGCTCGACTTGCATGTATAGCAATAGCTA <Paenibacillus panaciterrae 균의 16S rrna gene과 98% 부분에서 99% 동일함을 보임 >

282 <D14> ACGGTCTCTCTTCGCGACGGCTAGCTCCAAATGGTTACTCCACCGGCTTCGG GTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGACCCGGGAAC GTATTCACCGTAGCATGCTGATCTACGATTACTAGCGATTCCAGCTTCATA TAGTCGAGTTGCAGACTACAATCCGAACTGAGAACAACTTTATGGGATTTG CTTGACCTCGCGGTTTCGCTACCCTTTGTATTGTCCATTGTAGCACGTGTG TAGCCCAAATCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTC CGGTTTGTCACCGGCAGTCAACTTAGAGTGCCCAACTTAATGATGGCAACT AAGCTTAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACAC GAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGTCCCCCGAAGGGGAAAA CTCTATCTCTAGAGGGRTCAGAGGATGTCAAGATTTGGTAAGGTTCTTCGC GTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGTCCCCGTCAA TTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAAT GCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCAT CGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGATCCCCACGCT TTCGCACATCAGCGTCAGTTACAGACCAGAAAGTCGCCTTCGCCACTGGTG TTCCTCCATATCTCTGCGCATTTCACCGCTACACATGGAATTCCACTTTCC TCTTCTGCACTCAAGTTTTCCAGTTTCCAATGACCCTCCACGGTTGAGCCG TGGGCTTTCACATCAGACTTAAAAAACcGCCTACGCGCGCTTTACGCCCAAT AATTCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGgCTGCTGGCACGTAG TTAGCCGTGGCTTTCTGATTAGGTACCGTCAAGACGTGCATAGTTACTTAC ACATTTGTTCTTCCCTAATAACAGAGTTTTACGATCCGAAGACCTTCATCA CTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGGCTTTCGCCCATTGCGGAAGATTCCCTAC TGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGGCCGATC ACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTAAGCCGTTACCTTACCA ACTAGCTAATGCGGCGCGGATCCATCTATAAGTGACAGCAAAACCGTCTTT CACTATTGAACCCTGCGGTTCAATATATTATCCGGTATTAGCTCCGGTTTC CCGAAGTTATCCCAGTCTTATAGGTAGGTTATCCACGTGTTACTCACCCGT

283 CCGCCGCTAACGTCAGAGGAGCAAGCTCCTCGTCTGTTCGCTCGACTTGCAG TATAGCAATAGCTAG <Staphylococcus epidermidis strain KL-004 균의 16S ribosomal RNA gene과 97% 부분에서 99% 동일함을보임> A1 <Bacillus cereus clone B305 균의 16S ribosomal RNA gene과 97% 부분에서 99% 동일함을보임> A4 <Streptomyces zaomyceticus strain 균의 16S ribosomal RNA gene과 95% 부분에서 99% 동일함을보임> A5 <Paenibacillus terrigena 균의 16S rrna gene과 98% 부분에서 98% 동일함을 보임 > A6 <Bacillus firmus strain AU9 균의 16S ribosomal RNA gene과 87% 부분에서 96% 동일함을보임> A9 <Staphylococcus epidermidis strain KL-004 균의 16S ribosomal RNA gene과 97% 부분에서 98% 동일함을보임> A10<Staphylococcus epidermidis strain S09 균의 16S ribosomal RNA gene과 96% 부분에서 100% 동일함을보임> A11 <Bacillus luciferensis 균의 16S rrna gene과 92% 부분에서 99% 동일함을 보임 > B1 <Bacillus cereus strain Delaporte 균의 16S ribosomal RNA gene과 98% 부분 에서 99% 동일함을보임> B3 <Bacillus weihenstephanensis strain MC67 균의 16S ribosomal RNA gene과 98% 부분에서 99% 동일함을보임> B4 <Bacillus sp. CBD0119 균의 16S ribosomal RNA gene과 94% 부분에서 99% 동일함을보임 > B7 <Burkholderia caryophylli 균의 16S rrna gene과 98% 부분에서 97% 동일함 을보임 > B11<Lysobacter sp. GH41-7 균의 16S ribosomal RNA gene과 96% 부분에서 97% 동일함을보임> B13<Bacillus luciferensis 균의 16S rrna gene과 94% 부분에서 97% 동일함을보

284 임 > B14<Pseudomonas plecoglossicida strain R4 균의 16S ribosomal RNA gene과 97% 부분에서 98% 동일함을보임> B16<Streptomyces ciscaucasicus 균의 16S rrna geng과 90% 부분에서 99% 동일 함을보임 > B17<Lysobacter sp. GH41-7 균의 16S ribosomal RNA gene과 97% 부분에서 98% 동일함을보임> B19<Bacillus asahii 균의 16S rrna gene과 90% 부분에서 97% 동일함을보임> B20<Staphylococcus hominis 균의 16S rrna gene과 94% 부분에서 99% 동일함을 보임 > B21<Staphylococcus pasteuri 의 16S rrna gene과 98% 부분에서 99% 동일함을 보임 > B22<Staphylococcus pasteuri strain LF-2 의 16S ribosomal RNA gene과 98% 부 분에서 99% 동일함을보임> C2 <Bacillus cereus strain H1439 균의 16S ribosomal RNA gene과 98% 부분에 서 99% 동일함을보임> C4 <Bacillus cereus clone B305 균의 16S ribosomal RNA gene과 96% 부분에서 99% 동일함을보임> C5 <Bacillus luciferensis 균의 16S rrna gene과 95% 부분에서 97% 동일함을보 임 > C6 <Paenibacillus pabuli 균의 16S rrna gene과 97% 부분에서 99% 동일함을보 임 > C7 <Pseudomonas fluorescens strain 2P24 균의 16S ribosomal RNA gene과 97% 부분에서 99% 동일함을보임> C8 <Paenibacillus ginsengagri 균의 16S rrna gene과 95% 부분에서 99% 동일 함을보임 > C9 <Bacillus niacini 균의 16S ribosomal RNA gene과 89% 부분에서 98% 동일함 을보임 > C10<Paenibacillus ginsengagri 균의 16S rrna gene과 98% 부분에서 99% 동일 함을보임 >

285 C11<Bacillus bataviensis 균의 16S rrna gene과 98% 부분에서 99% 동일함을보 임 > C13<Paenibacillus agaridevorans 균의 16S rrna gene과 88% 부분에서 95% 동 일함을보임 > C15<Ralstonia sp. c308 균의 16S rrna gene과 97% 부분에서 99% 동일함을보 임 > C16<Pseudomonas putida strain PC16 균의 16S ribosomal RNA gene과 93% 부 분에서 98% 동일함을보임> D1 <Bacillus cereus clone B305 균의 16S ribosomal RNA gene과 97% 부분에서 98% 동일함을보임> D2 <Bacillus sp. EP23 균의 16S rrna gene과 98% 부분에서 99% 동일함을보 임 > D4 <Bacillus thuringiensis serotype H61 균의 16S ribosomal RNA gene과 98% 부분에서 99% 동일함을보임> D7 <Burkholderia cepacia strain ATCC 균의 16S ribosomal RNA gene과 97% 부분에서 98% 동일함을보임> D9 <Dyella koreensis strain BB4 균의 16S ribosomal RNA gene과 98% 부분에 서 99% 동일함을보임> D11<Paenibacillus panaciterrae 균의 16S rrna gene과 98% 부분에서 99% 동일 함을보임 > D14<Staphylococcus epidermidis strain KL-004 균의 16S ribosomal RNA gene과 97% 부분에서 99% 동일함을보임> 라. 황칠나무에접종한토양미생물의종자발아율, 생장속도증가, root dry weight 증가, phytopathogen에대한항균력측정 (1) 실험재료및방법 ( 가) 황칠나무종자 황칠나무종자는 2006년 10월전라남도완도군보길면부황리야산및적자산에서 3kg을

286 채집하여냉장실에보관하면서실험에사용하였다. ( 나) 미생물의배양 본실험에서는황칠수액의분비량이가장많은것으로나타난 Site C( 전라남도 완도군보길면민가자생황칠나무) 에서분리된 12개의토양미생물균주가황칠 나무의생장및 phytopathogen 에어떠한영향을미치는가를조사하기위해실험을 실시하였다. 분리된토양미생물을각각 C1, C2, C13 등으로명명한후 100ml 의 NA배지에접종후 37 에서 24시간배양하고 Spectrophotometer 를이용하여균수를계 산한후실험에사용하였다. C site 에서분리된각균주의번호및명칭 C2 : Bacillus cereus strain H1439 C4 : Bacillus cereus clone B305 C5 : Bacillus luciferensis C6 : Paenibacillus ginsengagri C7 : Paenibacillus ginsengagri C8 : Bacillus bataviensis C9 : Paenibacillus pabuli C10 : Paenibacillus agaridevorans C11 : Pseudomonas fluorescens strain 2P24 ( 다) 실험군의분류 실험군은 1. 정상군(C : 황칠종자 bedding), 2. 실험군 Ⅰ(C2 : 황칠종자 bedding + C2, C4 : 황칠종자 bedding + C4, C5 : 황칠종자 bedding + C5, C6 : 황칠종자 bedding + C6, C7 : 황칠종자 bedding + C7, C8 : 황칠종자 bedding + C8, C9 : 황칠종자 bedding + C9, C10 : 황칠종자 bedding

287 C10, C11 : 황칠종자 bedding + C11, Cmix : 황칠종자 bedding + C2 - C11 mixture), 3. 실험군 Ⅱ(CA : 황칠종자 bedding + phytopathogen), 4. 실험군 Ⅲ (CA2 : 황칠종자 bedding + C2 + phytopathogen, CA4 : 황칠종자 bedding + C4 + phytopathogen, CA5 : 황칠종자 bedding + C5 + phytopathogen, CA6 : 황칠종자 bedding + C6 칠종자 bedding + C8 + phytopathogen, CA7 : 황칠종자 bedding + C7 + phytopathogen, CA8 : 황 + phytopathogen, CA9 : 황칠종자 bedding + C9 + phytopathogen, CA10 : 황칠종자 bedding + C10 + phytopathogen, CA11 : 황칠종자 bedding + C11 + phytopathogen, CAmix : 황칠종자 bedding + C2 - C11 mixture + phytopathogen ) 으로분 류하여황칠수액채취량이많은황칠나무의뿌리토양에서서식하는미생물이황칠 나무종자의발아, 생장및황칠나무에영향을미치는 phytopathogen 에대한항균력을 측정하였다. ( 라) 미생물처치및 Phytopathogen 처치후황칠종자의파종 황칠종자의발아실험에쓰인장소는전라남도완도군보길면의비닐하우스내 였으며( 그림 3-4) 실험환경의평균온도는 31, 습도는 47% 로유지시켰다. 각군에사 용된토지의면적은가로 20cm, 세로 20cm 였고 ( 이를각각 C, C2, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, Cmix site 로명명 ), 파종전토양을다진후( 그림 3-5 ) 파종을실시하였다( 그림 3-6). 파종실시전상기실험군의분류에서설명한바와같이가로 20cm, 세로 20cm 인각각 의 site 에각각의균주를 10-1 으로희석하여 100ml 씩을고르게첨가하였고그후가로 20cm, 세 로 20cm 인각각의 site 에각 site 당 100 개의종자를파종하였다. Phytopathogen 처치후황칠종자의발아율을측정하기위한실험도역시같은장소의비 닐하우스내에서실시하였고, 실험환경의평균온도역시동일하게 31 로유지, 습도는 47% 로유지시켰다. 이실험에사용된각군의토지면적역시가로 20cm, 세로 20cm 였고 ( 이 를각각 CA, CA2, C4A, CA5, CA6, CA7, CA8, CA9, CA10, CA11, CAmix site 로명명 ), 파종 전토양을다진후( 그림 3-5 ) 파종을실시하였다( 그림 3-6). phytopathogen 으로는식물의 발아및생장을저해하는 chemical 인 glyphosate와계면활성제를각각 41% 와 51% 로섞 어사용하였다. 즉, 이들혼합용액원액을 10-2 으로희석하여 CA - CAmix 각 site에 100ml씩첨가하여준후각균주를 10-1 으로희석하여 100ml 씩을고르게첨가하였고그 후가로 20cm, 세로 20cm 인각각의 site 에각 site 당 100 개의황칠종자를흩어뿌리기로파

288 종하고윗흙을덮어주었다( 그림 3-7). ( 마) 황칠종자의발아율및생장특성, Root dry weight 증가및 phytopathogen에 대한저항력측정 황칠종자파종후약 40일경과후각군당 100개의파종종자의발아율을측정하여황 칠종자발아에미치는미생물과 Phytopathogen 의영향을조사하였다. 발아율측정후발아한 황칠떡잎을노지의토양에이식하였으며이때무작위로각군당 20그루의떡잎을선발하 여 Root dry weight 증가율을조사하였고그후노지에서성장하는황칠나무의크 기, 잎의수, 가지의직경, 뿌리의건조중량등을측정하여황칠나무의생장과황칠 나무의뿌리토양에서분리한미생물및 Phytopathogen 과의역학관계를연구하였다. ( 바) 통계처리 모든실험결과측정치는일변수분석법을사용하여통계처리하였으며 Student's T-test를이용하여 p<0.05 수준에서각실험군간의유의성을검증하였 다. 모든자료는 mean±standard deviation 으로나타내었다

289 그림 3-4. 실험을실시한비닐하우스외부전경

290 그림 3-5. 파종전토양을다져논모습

291 그림 3-6. 정상군및실험군. Ⅰ, 실험군 Ⅱ, 실험군 Ⅲ에황칠종자를파종한모습

292 그림 3-7. 정상군및실험군 Ⅰ, 실험군 Ⅱ, 실험군 Ⅲ에황칠종자파종후윗흙 을덮은모습

293 (2) 실험결과 ( 가) 황칠종자의발아율, 생장특성, Root dry weight 증가및 phytopathogen에대 한저항력측정 황칠나무종자는 2007년 2 월에파종하였다. 황칠종자의발아실험에쓰인장소는전 라남도완도군보길면의비닐하우스내였으며실험환경의평균온도는 31, 습도 는 47% 로유지시켰다. 각군에사용된토지의면적은가로 20cm, 세로 20cm 였고실험군은 1. 정상군(C : 황칠종자 bedding), 2. 실험군 Ⅰ(C2 : 황칠종자 bedding + C2, C4 : 황칠종자 bedding + C4, C5 : 황칠종자 bedding + C5, C6 : 황칠종자 bedding + C6, C7 : 황칠종자 bedding + C7, C8 : 황칠종자 bedding + C8, C9 : 황칠종자 bedding + C9, C10 : 황칠종자 bedding + C10, C11 : 황칠종자 bedding + C11, Cmix : 황칠종자 bedding + C2 - C11 mixture), 3. 실험군 Ⅱ(CA : 황칠종자 bedding + phytopathogen), 4. 실험군 Ⅲ (CA2 : 황칠종자 bedding + C2 + phytopathogen, CA4 : 황칠종자 bedding + C4 + phytopathogen, CA5 : 황칠종자 bedding + C5 + phytopathogen, CA6 : 황칠종자 bedding + C6 칠종자 bedding + C8 + phytopathogen, CA7 : 황칠종자 bedding + C7 + phytopathogen, CA8 : 황 + phytopathogen, CA9 : 황칠종자 bedding + C9 + phytopathogen, CA10 : 황칠종자 bedding + C10 + phytopathogen, CA11 : 황칠종자 bedding + C11 + phytopathogen, CAmix : 황칠종자 bedding + C2 - C11 mixture + phytopathogen ) 으로분 류하였다. 파종전토양을다진후파종을실시하였는데가로 20cm 세로 20cm 크기인각각의 site 에각각의균주를 10-1 으로희석하여 100ml 씩을고르게첨가하였고각 site 당 100 개의종 자를파종하였다. Phytopathogen 처치후황칠종자의발아율및새장특성등을측정하기위한실험도역시 같은장소의비닐하우스내에서실시하였는데, 이실험에사용된각군의토지면적역시가 로 20cm 세로 20cm 였고파종전토양을다진후파종을실시하였다. phytopathogen 으로 는식물의발아및생장을저해하는 chemical 인 glyphosate와계면활성제를각각 41% 와 51% 로섞어사용하였는데즉, 이들혼합용액원액을 10-2 으로희석하여 CA - CAmix 각 site에 100ml씩첨가하여준후각균주를 10-1 으로희석하여 100ml 씩을고

294 르게첨가하였고그후가로 20cm, 세로 20cm 인각각의 site 에각 site 당 100 개의황칠종자를 흩어뿌리기로파종하고윗흙을덮어주었다. 황칠종자파종후약 40일경과한 2007년 4월경각군당 100개의파종종자의발아율 을측정하여황칠종자발아에미치는미생물과 를표 3-2, 3-3, 3-4와 3-5에나타내었다. Phytopathogen 의영향을조사하였고그결과 표 3-2, 3에나타난연구결과를살펴보면정상군(C : 황칠종자 bedding) 은 69% 평균발 아율을보인반면, Bacillus cereus strain H1439 균주를처리한 C2군은 82% 의발아 율을보였고 Paenibacillus agaridevorans 주를처리한 C10군은 89% 의발아율을 보여대조군에비해높은발아율을나타내었다. 또한 Paenibacillus ginsengagri균 주를처리한 C7 군은 81% 의발아율을보여대조군에비해높은발아율을나타내었 다. 한편 Bacillus cereus clone B305 균주를처리한 C4 군, Bacillus luciferensis 균주를처리한 C5 군, Paenibacillus ginsengagri균주를처리한 C6 군, Bacillus bataviensis균주를처리한 C8 군, Paenibacillus pabuli균주를처리한 C9군및 Pseudomonas fluorescens strain 2P24 균주를처리한 C11군은각각 59%, 68%, 71%, 72%, 63%, 69% 의발아율을나타내대조군과뚜렷한차이를나타내지않았다. C2 - C11 균주를 mixture한군역시 84% 의발아율을나타내어대조군에비해비 교적높은발아율을보여주었다. 즉실험군 Ⅰ(C2 : 황칠종자 bedding + C2, C4 : 황칠 종자 bedding + C4, C5 : 황칠종자 bedding + C5, C6 : 황칠종자 bedding + C6, C7 : 황 칠종자 bedding + C7, C8 : 황칠종자 bedding + C8, C9 : 황칠종자 bedding + C9, C10 : 황 칠종자 bedding + C10, C11 : 황칠종자 bedding + C11, Cmix : 황칠종자 bedding + C2 - C11 mixture ) 에서는 Bacillus cereus strain H1439 균주, Paenibacillus agaridevorans 균주, Paenibacillus ginsengagri균주및 C2 - C11 균주를 mixture한군이대조군 에비해황칠의종자발아를촉진시키는것으로결과가나타났다. 한편식물종자의발아를저해하는 glyphosate와계면활성제를각각 41% 와 51% 로 섞어첨가해준실험군 Ⅱ(CA : 황칠종자 bedding + phytopathogen) 는 56% 의발아율을 나타내어 Phytopathogen 인 glyphosate와계면활성제 mixture가황칠종자의발아를저 해하는효과가있음을나타내주었다. 실험군 Ⅲ (CA2 : 황칠종자 bedding + C2 + phytopathogen, CA4 : 황칠종자 bedding + C4 + phytopathogen, CA5 : 황칠종자 bedding + C5 + phytopathogen, CA6 : 황칠종자 bedding + C6 + phytopathogen, CA7 : 황칠종자

295 bedding + C7 칠종자 bedding + C9 + phytopathogen, CA8 : 황칠종자 bedding + C8 + phytopathogen, CA9 : 황 + phytopathogen, CA10 : 황칠종자 bedding + C10 + phytopathogen, CA11 : 황칠종자 bedding + C11 + phytopathogen, CAmix : 황칠종자 bedding + C2 - C11 mixture + phytopathogen ) 에서는 Paenibacillus agaridevorans 균주와 Phytopathogen 을 처리한 CA10군과 C2 - C11 mixture균주와 Phytopathogen 을처리한 CAmix 군이각 각 84% 와 85% 의발아율을나타내었을뿐나머지군은모두 50% 이하의발아율을 나타내어이들균주는 Phytopathogen 에대한저항력이없는것으로연구결과를나타내었다. 그후 2007년 8월발아한황칠종자를무작위로각군당 20 그루를선발하여나뭇잎의수, 나무의크기( 수고), 뿌리의중량등을측정하여황칠나무의뿌리토양에서분리한미생 물이황칠나무의생장에미치는영향을조사하고이들미생물이 Phytopathogen 에미 치는저항력등그역학관계를연구하였고그결과를표 3-4 과표 3-5 에나타내었다. 표 3-4 을살펴보면나무크기의평균치는정상군인 C의 5.68 ± 0.27에비해 cm C2군과 C8군이각각 5.98 cm ± 0.13, 5.72 cm ± 0.63로정상군에비해평균치가유의성있게증가한것으로 나타났으며나머지군들은유의성있는증가치를나타내지않았다. 황칠떡잎의나뭇 잎수는정상군에서 4.2 개 ± 0.22를나타내었는데실험군에서는유의성있는증가를 나타낸군이전혀없었다. 황칠뿌리는모든군에서건강한형태적모습을보였는데 정상군인 C의 2.76g ± 0.09 에비해유의성있는증가를나타낸군이전혀없었다. 한편, 한편식물종자의발아를저해하는 glyphosate와계면활성제를각각 41% 와 51% 로섞어첨가해준실험군 Ⅱ와실험군 Ⅲ의연구결과를살펴보면 ( Table 4), 나무크 기의평균치는 CA의 5.56 cm ± 0.43에비해 CA8 군과 CAmix 군이각각 5.93 cm ± 0.25, 6.01 cm ± 0.22 로정상군에비해평균치가유의성있게증가한것으로나타났으며나머 지군들은유의성있는증가치를나타내지않았다. 황칠떡잎의나뭇잎수는 CA군 과비교하여실험군 Ⅲ에서는유의성있는증가를나타낸군이없었다. 황칠뿌리는 실험군 Ⅱ와실험군 Ⅲ 역시모든군에서건강한형태적모습을보였는데 CA군의 2.58g ± 0.22에비해유의성있는증가를나타낸군은 CA4군이 2.71g ± 0.13을나 타낸것외에다른군은전혀유의성있는증가를나타내지않았다. 또한남은떡잎들은 2008년봄까지비닐하우스에서키운후 2008년 4월경노지

296 로옮겨심어노지에서 1 년키운후계속하여성장하는황칠나무의크기, 나무잎의 수, 뿌리의건조중량등을측정하여 3차년도연구과제인황칠나무종자에토양미생 물의접종법을이용한 Field test 에관한연구결과를도출하였다. 표 3-2. 정상군및실험군 Ⅰ의황칠종자발아율 : 각 Site의종자발아율 Site NO 종자발아율 ( 발아종자수/ 파종종자수) C 69% (69 개/100 개) C2 82% (82 개/100 개) C4 59% (59 개/100 개) C5 68% (68 개/100 개) C6 71% (71 개/100 개) C7 81% (81 개/100 개) C8 72% (72 개/100 개) C9 63% (63 개/100 개) C10 89% (89 개/100 개) C11 69% (69 개/100 개) Cmix 84% (84 개/100 개)

297 표 3-3. 실험군 Ⅱ와실험군 Ⅲ의황칠종자발아율 : 각 Site의종자발아율 Site NO 종자발아율 ( 발아종자수/ 파종종자수) CA 56% (56 개/100 개) CA2 49% (49 개/100 개) CA4 48% (48 개/100 개) CA5 50% (50 개/100 개) CA6 47% (47 개/100 개) CA7 51% (51 개/100 개) CA8 50% (50 개/100 개) CA9 41% (41 개/100 개) CA10 84% (84 개/100 개) CA11 47% (47 개/100 개) CAmix 85% (85 개/100 개)

298 표 3-4. 정상군및실험군 Ⅰ의성장측정실험결과 : 무작위로추출한발아개체 의성장률측정 Site NO 나무의크기( 수고) 평균치 나무잎의수평균치 뿌리의중량평균치 C 5.68 cm ± 개 ± g ± 0.09 * C cm ± 개 ± g ± 0.21 C cm ± 개 ± g ± 0.16 C cm ± 개 ± g ± 0.08 C cm ± 개 ± g ± 0.55 C cm ± 개 ± g ± 0.21 * C cm ± 개 ± g ± 0.22 C cm ± 개 ± g ± 0.25 C cm ± 개 ± g ± 0.16 C cm ± 개 ± g ± 0.27 Cmix 5.47 cm ± 개 ± g ± ) Each value represents the mean±s.d. of 10 rats. n = 20 * Significant differences as compared with control : p<

299 표 3-5. 실험군 Ⅱ와실험군 Ⅲ의성장측정실험결과 : 무작위로추출한발아개체 의성장률측정 Site NO 나무의크기( 수고) 평균치 나무잎의수평균치 뿌리의중량평균치 CA 5.56 cm ± 개 ± g ± 0.22 CA cm ± 개 ± g ± 0.20 CA cm ± 개 ± g ± 0.13 * CA cm ± 개 ± g ± 0.33 CA cm ± 개 ± g ± 0.33 CA cm ± 개 ± g ± 0.07 * CA cm ± 개 ± g ± 0.05 CA cm ± 개 ± g ± 0.24 CA cm ± 개 ± g ± 0.15 CA cm ± 개 ± g ± 0.21 * CAmix 6.01 cm ± 개 ± g ± ) Each value represents the mean±s.d. of 10 rats. n = 20 * Significant differences as compared with control : p<

300 2. 2 차년도연구결과보고서 가. 연구개발목표 2 차 연도 토양미생물을이용한황칠나무의식물생장및수액분비촉진 방법개발 나. 연구개발수행내용 - 토양미생물을한균주씩또는 mixed culture하여 seed treatment, Inoculation 처리 - tube assay - pot test 등에의한황칠나무의생장비교측정 - 황칠나무생장촉진관련생리학적특성측정 다. 토양미생물을한균주씩또는 mixed culture하여 tube assay 및생장촉진 관련생리학적특성연구 (1) 재료및방법 ( 가) 황칠나무종자 황칠나무종자는 2007년 10월전라남도완도군보길면부황리야산및적자산에서 3kg을 채집하여냉장실에보관하였다가 2007년 10월부터 2008년 2월까지발아율을높이기위해냉 습처리하였다. 즉, 냉장실의온도를 4 로유지하면서습기를충분히머금은축축한모래 로황칠종자를덮어 3개월동안유지하였고 3 개월후이종자를발아실험에사용하였다. ( 나) 식물생장촉진토양미생물분리 본실험에서는황칠수액의분비량이가장많은것으로나타난 Site C ( 전라남도 완도군보길면민가자생황칠나무) 에서분리된 12개의토양미생물균주중동정 이끝난 9개의미생물균주가황칠나무의생장에어떠한영향을미치는가를조사하

301 기위해실험을실시하였다. 먼저 Site C의황칠나무뿌리근처지표 cm의 Nonrhozospher soil (NRS), Rhizosphere soil (RS), Rhizoplane (RP) soil 에서무균 적으로 soil sampling 하고이 soil을채취용용기에담아운반한후 4 에보관하 며실험재료로사용하였다. 분리된토양미생물을각각 C2, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11 등으로명명한후 100ml의 NA배지에접종후 37 에서 24시간배양하 고 서 Spectrophotometer 를이용하여균수를계산한후이들균주를 15% glycerol 존재하에 -80 에보관하면서실험에사용하였다. ( 다) 사용배지 사용배지는 Bacillus, Paenibacillus, Pseudomonas 등의균주의특성에맞는배 지를선택사용하여균주의배양, 보관등에이용하였다. Bacillus를분리하기위한 기초배지로 Nutrient Agar(NA) 배지(BBL) 와 Nutrient Broth(NB) 배지(BBL) 를사 용하였고, 위상차현미경관찰, 아포와내독소단백질결정체분리, 생장곡선측정을 하기위하여 Glucose Yeast Salt(GYS) 배지(Nickerson et al., 1974) 를수정하여사 용하였다. 생화학적검사용배지로는 Cowan과 Steel 방법에명기된배지를사용하 였다. 분리균주를보관하기위해서는 Brain Heart Infusion(BHI) 배지(DIFCO) 를사 용하였으며, 사용한배지들은각실험방법에따라 121, 15lb에서 15분간가압습윤 멸균하고, 고온에영향을받는성분들은증류수에용해시켜여과지 (Whattman, 0.45 μm) 로여과하여사용하였다. C site 에서분리된각균주의번호및명칭 C2 : C4 : C5 : C6 : C7 : C8 : C9 : Bacillus cereus strain H1439 Bacillus cereus clone B305 Bacillus luciferensis Paenibacillus ginsengagri Paenibacillus ginsengagri Bacillus bataviensis Paenibacillus pabuli C10 : Paenibacillus agaridevorans

302 C11 : Pseudomonas fluorescens strain 2P24 ( 라) 실험군의분류 실험군은정상군( 황칠종자 + 배양액), 실험군(No. 1 : 황칠종자 + C2 균주배양액, No. 2 : 황칠종자 + C4 균주배양액, No. 3 : 황칠종자 + C5 균주배양액, No. 4 : 황칠종자 + C6 균주배양액, No. 5 : 황칠종자 + C7 균주배양액, No. 6 : 황칠종자 + C8 균주배양액, No. 7 : 황칠종자 + C9 균주배양액, No. 8 : 황칠종자 + C10 균주배양액, No. 9 : 황칠종자 + C11 균주배양액, No. 10 : 황칠종자 + C2, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11 mixture 균주배양액) 으로분류하여겨울동안정상적인발아를위해적절한수분과온도및 일사량이공급된황칠종자에각군의미생물균주배양액을분주한후 Tube assay 를통하여수액채취량이많은황칠나무의뿌리토양에서서식하는미생물우점종이 황칠나무의종자발아에미치는영향을측정하였다. ( 마) Tube assay 2008년 2월전라남도완도군보길도의해안가남향에있는밭에길이 20m, 넓이 7m의비닐하우스를 tube assay 를위해설치하여실험을실시하였다. 비닐하우스설 치후양쪽이열린멸균된 plastic tube (3 cm x 16.5 cm) 를 rack 에설치하고, 채로곱게거른후 80% 알코올을 spray하고약 30분동안공기건조하여무균상태 가된멸균된흙을 tube에 11 cm 깊이로채웠다. 그후각각의미생물균주를처리 한 2개의 seed를토양위에파종한후 2 cm 두께로 vermiculite를덮고충분한수 분을뿌려주었다. 그후평균온도 31-35, 습도 47-60% 로유지시킨비닐하우스내 에서배양하였다. Rack은 shoot 가나올때까지 3 mm 두께의플라스틱을덮어두 었다. 파종약 6 주후인 2008년 4 월발아율을조사하였는바, 정상군 5 개의튜브, No. 1 - No. 10까지의각각의실험군역시 5개의튜브에실험을실시하여각튜브 마다 2개씩총 10 개의종자를튜브에파종한후그결과를측정하였다.. ( 바) 발아종자의생장촉진관련생리학적특성연구 정상군 5 개의튜브 (10 개의종자파종), No. 1 - No. 10까지의각각의실험군역 시 5개의튜브에 tube assay 를실시하여 ( 각각의실험군역시 10 개의종자파종)

303 정상군및실험군황칠종자의발아율을측정한후발아된 plant는가장긴잎의끝에 해당하는 shoot 길이를측정하였다. 그후황칠떡잎이발아한실험군의떡잎은 3차년도 연구와연계하여노지의토양에이식하여노지에서성장하는황칠나무의크기, 잎의수, 가지의직경, 뿌리의건조중량등을측정하여수액채취량이많은황칠나무의뿌리 토양에서서식하는미생물이발아한황칠종자의생장촉진및생리적특성에미치는 영향을장기적으로조사할예정이다. 이는황칠나무의생장및수액분비촉진관련 생리적특성과황칠나무의뿌리토양에서분리한미생물과의역학관계를규명하는데중 요한 data 를제공할것으로사료된다. (2) 실험결과및고찰 ( 가) 황칠종자의 Tube assay에의한발아율측정결과 2008년 2월완도군보길면의해안가남향에있는밭에길이 20m, 넓이 7m의비 닐하우스를설치하여 tube assay 실험을실시하였다. 비닐하우스설치후비닐하우 스내부의흙을평탄하게하는평탄작업을실시하였고실험에이용된흙은채로걸 러고운흙만을모아실험에사용하였으며이흙은 80% 알코올처리하여무균처리 한후건조하여 tube assay 실험에사용하였고그과정은그림 3-8~17 과같다

304 그림 3-8. Tube assay 실험을위해설치한비닐하우스전경 ( 전라남도완도군 보길면에위치 )

305 그림 3-9. Tube assay 실험전비닐하우스안의토양을고르게정리하는평탄 작업을하는모습

306 그림 Tube assay 전경. 실험을위해토양이평탄하게정리된비닐하우스내의

307 그림 Tube assay 발아실험을위해 2007년 12월부터 2008년 2월까지냉 습처리된황칠나무종자

308 그림 Tube assay 발아실험을위해채로흙을곱게거른모습 : 이흙을 80% 알코올로 spray 하여무균처리한후건조하여실험에사용하였 다

309 그림 Tube Assay 실험을위해종자발아용 tube에무균처리된토양을 고르게채워넣은모습

310 그림 종자발아용 tube에무균처리된토양을고르게채워넣은후각각의 균주를처리한황칠나무종자를파종한모습

311 그림 종자발아용 tube에무균처리한토양을고르게채워넣은후각각의 균주를처리한황칠나무종자를파종하고그상단에버미큘라이트를 처리한모습

312 그림 비닐하우스내에동물로부터 tube assay 실험모델을보호할보호망 을설치한모습 ( 수직그림)

313 그림 비닐하우스내에동물로부터 tube assay 실험모델을보호할보호 망을설치한모습 ( 수평그림)

314 실험군은정상군( 황칠종자 + 배양액) 과실험군(No. 1 : 황칠종자 + C2 균주배양액, No. 2 : 황칠종자 + C4 균주배양액, No. 3 : 황칠종자 + C5 균주배양액, No. 4 : 황칠종자 + C6 균주배양액, No. 5 : 황칠종자 + C7 균주배양액, No. 6 : 황칠종자 + C8 균주배양액, No. 7 : 황칠종자 + C9 균주배양액, No. 8 : 황칠종자 + C10 균주배양액, No. 9 : 황칠종 자 + C11 균주배양액, No. 10 : 황칠종자 + C2, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11 mixture 균주배양액) 으로분류하였고, 각각의실험군의 tube assay 실험을위하여 2008년 2월전라남도완도군보길도의해안가남향에있는밭에길이 20m, 넓이 7m 의비닐하우스를설치하여실험을실시하였다. 즉, 양쪽이열린멸균된 plastic tube (3 cm x 16.5 cm) 를 rack 에설치하고, 채로곱게거른후 80% 알코올을 spray하고약 30분동안공기건조하여무균상태 가된멸균된흙을 tube에 11 cm 깊이로채웠다. 그후각각의미생물균주를처리 한 2개의 seed를토양위에파종한후 2 cm 두께로 vermiculite를덮고충분한수 분을뿌려주었다. 그후평균온도 31-35, 습도 47-60% 로유지시킨비닐하우스내 에서약 60일간배양하면서결과를관찰하였고, rack은 shoot 가나올때까지 3 mm 두께의플라스틱을덮어두었다. 파종약 4 주후발아율을조사하였는바, 그 결과를표 3-6 에나타내었다. 황칠종자는파종후약 1달뒤에발아하였는데대조군인 C group 의평균발아율은 70% 였으며 Paenibacillus ginsengagri균주를처리한 C6군은 100% 의발아율을보여대 조군에비해높은발아율을보였고마찬가지로 Paenibacillus ginsengagri 균주를처 리한 C7 군은 90% 의발아율을보여대조군에비해뛰어난발아율을나타내었다. 또한 Bacillus cereus strain H1439 균주를처리한 C2군은 80% 의발아율을보여이 역시대조군에비해높은발아율을나타내었다. 한편 Bacillus cereus clone B305균 주를처리한 C4 군, Bacillus luciferensis균주를처리한 C5 군, Bacillus bataviensis 균주를처리한 C8 군, Paenibacillus pabuli균주를처리한 C9 군, Paenibacillus agaridevorans 균주를처리한 C10군및 Pseudomonas fluorescens strain 2P24균주 를처리한 C11군은각각 60%, 70%, 60%, 70%, 70%, 70% 의발아율을나타내대조 군과비슷한양상을나타낸반면 C2 - C11 균주를 mixture한군은 80% 의발아율 을나타내어대조군에비해비교적높은발아율을보여주었다. 즉황칠수액의분비 량이가장많은것으로나타난 Site C ( 전라남도완도군보길면민가자생황칠나

315 무) 에서분리된 9개의미생물균주중 C6, C7인 Paenibacillus ginsengagri균주, Paenibacillus ginsengagri균주, Bacillus cereus strain H1439 균주와 C2 - C11 균 주를 mixture한군이대조군에비해황칠의종자발아를촉진시키는것으로결과가 나타났다. 이러한결과는 1차년도에실시한황칠나무에접종한토양미생물의종자발아율 실험결과와유사한연구결과를나타내었다. 즉, 1차년도에실시한황칠나무에접종 한토양미생물의종자발아율실험결과에서도 Bacillus cereus strain H1439 균주, Paenibacillus agaridevorans 균주, Paenibacillus ginsengagri 균주및 C2 - C11 균 주를 mixture한군이대조군에비해황칠의종자발아를촉진시키는것으로결과가 나타나 2차년도연구결과와유사한경향의연구결과를나타내바람직한현상으로 사료된다. 표 3-6. 각군에대한 Tube Assay 발아율실험결과지 Groups 종자 No. 발아유( ) 무( ) C C2 Ca Cb Cc Cd Ce Cf Cg Ch Ci Cj C2a C2b C2c C2d C2e C2f C2g

316 C4 Groups 종자 No. 발아유( ) 무( ) C5 C6 C5a C5b C5c C5d C5e C5f C5g C5h C5i C5j C6a C6b C6c C6d C6e C6f C6g C6h C6i C6j C7 C7a

317 C7b C7c C7d C7e C7f C7g C7h C7i C7j Groups 종자 No. 발아유( ) 무( ) C8 C9 C10 C8a C8b C8c C8d C8e C8f C8g C8h C8i C8j C9a C9b C9c C9d C9e C9f C9g C9h C9i C9j C10a C10b C10c C10d

318 C10e C10f C10g C10h C10i C10j Groups 종자 No. 발아유( ) 무( ) C11 Cmix C11a C11b C11c C11d C11e C11f C11g C11h C11i C11j Cmixa Cmixb Cmixc Cmixd Cmixe Cmixf Cmixg Cmixh Cmixi Cmixj

319 ( 나) 발아종자의생장촉진관련생리학적특성연구 2008년 2월전라남도완도군보길도의해안가남향에있는밭에길이 20m, 넓이 7m 의비닐하우스를설치하여실험을실시하였다. 비닐하우스설치후양쪽이열린 멸균된 plastic tube (3 cm x 16.5 cm) 를 rack 에설치하고, 채로곱게거른후 80% 알코올을 spray하고약 30분동안공기건조하여무균상태가된멸균된흙을 tube에 11 cm 깊이로채웠다. 그후각각의미생물균주를처리한 2개의 seed를토 양위에파종한후 2 cm 두께로 vermiculite 를덮고충분한수분을뿌려주었다. 그 후평균온도 31~35, 습도 47~ 60% 로유지시킨비닐하우스내에서배양하였다. rack은 shoot 가나올때까지 3 mm 두께의플라스틱을덮어두었다. 파종약 6 주후 shoot 가나오기시작하였는데발아종자의생장촉진관련생 리학적특성을연구하기위해각군의 shoot의길이를측정하여그결과를표 3-7 에나타내었다. 표 3-7에나타난결과에서보여주는바와같이최초측정한 shoot 의길이는아직떡잎이너무어린관계로거의모든군에서약 2.1mm~2.3mm를나타 내어아직확연한성장차이를구분할수없었다. 따라서시간의경과에따라 3차년 도연구과제와연계하여계속추적하여각군의성장차이를규명하고자한다. 황칠나무의종자는매년 2월경에파종하여야만발아하는특성을가지고있어본연구팀 도 2007년 10월부터 tube assay 실험을위해황칠종자를냉습처리하면서연구를시작하였고, 그후 2008년 2월냉습처리된황칠종자를파종하였고그 6주후인 2008년 4월경종자가발 아하였고 shoot 가나오기시작하였다. 따라서이연구의실험결과는위에보고한 1차연 구결과외에차후 한 3 차년도연구과제인 황칠나무종자에토양미생물의접종법을이용 Field test 연구와연계하여발아한황칠종자의떡잎을 2008년봄까지비닐하우스 에서키운후 2008년 4월경노지로옮겨심어노지에서 1년키울예정이며그후 노지에서성장하는황칠나무의크기, 잎의수, 가지의직경, 뿌리의건조중량등을 본연구의잔여연구기간인 2009년 4월까지약 1년 2개월동안황칠나무의생장을지켜보면 서지속적으로결과데이터를기록, 발아종자의토양미생물과연계된생장촉진관련생 리학적특성연구의연구결과를도출할계획이다

320 표 3-7. 각군에대한 shoot 길이측정실험결과지 (Tube assay) Groups C C2 C4 Shoot의길이 2.2 mm 2.1 mm 2.2 mm 2.2 mm 2.1 mm 2.2 mm 2.2 mm 2.3 mm 2.2 mm 2.2 mm 2.2 mm 2.3 mm 2.2 mm 2.2 mm 2.2 mm 2.2 mm 2.3 mm 2.2 mm 2.3 mm 2.2 mm 2.2 mm 2.3 mm 2.2 mm 2.3 mm 2.2 mm 2.2 mm 2.2 mm 2.3 mm 2.2 mm 2.1 mm Groups C5 Shoot의길이 2.1 mm

321 2.2mm 2.2mm 2.1mm 2.2mm 2.2mm 2.1mm 2.2mm 2.2mm 2.1mm 2.2mm 2.1mm 2.3mm 2.2mm C6 C7 Groups 2.2 mm 2.3 mm 2.3 mm 2.3 mm 2.2 mm 2.3 mm 2.2 mm 2.3 mm 2.2 mm 2.3 mm 2.2 mm 2.2 mm 2.3 mm 2.2 mm 2.2 mm 2.2 mm Shoot의길이 2.1 mm C8 2.2mm 2.2mm 2.1mm 2.2mm

322 C9 C10 Groups C mm 2.3 mm 2.2 mm 2.1 mm 2.2 mm 2.1 mm 2.2 mm 2.2 mm 2.2 mm 2.2 mm 2.1 mm 2.2 mm 2.2 mm 2.1 mm 2.2 mm 2.2 mm 2.2 mm 2.1 mm 2.2 mm 2.1 mm 2.2 mm 2.2 mm 2.3 mm 2.2 mm 2.2 mm Shoot의길이 2.3 mm 2.2 mm 2.2 mm 2.1 mm 2.2 mm 2.1 mm 2.2 mm 2.1 mm

323 Cmix 2.2mm 2.2mm 2.2mm 2.3mm 2.2mm 2.1mm 2.2mm 2.2mm 2.3mm 2.2mm 2.3mm 2.2mm 라. 토양미생물을한균주씩또는 mixed culture하여 pot test (1) 실험재료및방법 ( 가) 황칠나무종자 황칠나무종자는 2007년 10월전라남도완도군보길면부황리야산및적자산에서 3kg을 채집하여냉장실에보관하였다가 2007년 12월부터 2008년 3월까지발아율을높이기위해냉 습처리하였다. 즉, 냉장실의온도를 4 로유지하면서습기를충분히머금은축축한모래 로황칠종자를덮어 3개월동안유지하였고 3 개월후이종자를발아실험에사용하였다. ( 나) 식물생장촉진토양미생물분리 본실험에서는황칠수액의분비량이가장많은것으로나타난 Site C ( 전라남도 완도군보길면민가자생황칠나무) 에서분리된 12개의토양미생물균주가황칠 나무의생장에어떠한영향을미치는가를조사하기위해실험을실시하였다. 먼저 Site C의황칠나무뿌리근처지표 cm의 Nonrhozospher soil (NRS), Rhizosphere soil (RS), Rhizoplane (RP) soil에서무균적으로 soil sampling 하고이 soil을채취용용기에담아운반한후 4 에보관하며실험재료로사용하였다. 분리 된토양미생물을각각 C2, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11 등으로명명한후

324 100ml의 NA배지에접종후 37 에서 24시간배양하고 Spectrophotometer 를이용하여균수 를계산한후이들균주를 15% glycerol 존재하에서 -80 에보관하면서실험에사 용하였다. ( 다) 사용배지 사용배지는 Bacillus, Paenibacillus, Pseudomonas 등의균주의특성에맞는배 지를선택사용하여균주의배양, 보관등에이용하였다. Bacillus를분리하기위한 기초배지로 Nutrient Agar(NA) 배지(BBL) 와 Nutrient Broth(NB) 배지(BBL) 를사 용하였고, 위상차현미경관찰, 아포와내독소단백질결정체분리, 생장곡선측정을 하기위하여 Glucose Yeast Salt(GYS) 배지(Nickerson et al., 1974) 를수정하여사 용하였다. 생화학적검사용배지로는 Cowan과 Steel 방법에명기된배지를사용하 였다. 분리균주를보관하기위해서는 Brain Heart Infusion(BHI) 배지(DIFCO) 를사 용하였으며, 사용한배지들은각실험방법에따라 121, 15lb에서 15분간가압습윤 멸균하고, 고온에영향을받는성분들은증류수에용해시켜여과지 (Whattman, 0.45 μm) 로여과하여사용하였다. C site 에서분리된각균주의번호및명칭 C2 : C4 : C5 : C6 : C7 : C8 : C9 : Bacillus cereus strain H1439 Bacillus cereus clone B305 Bacillus luciferensis Paenibacillus ginsengagri Paenibacillus ginsengagri Bacillus bataviensis Paenibacillus pabuli C10 : Paenibacillus agaridevorans C11 : Pseudomonas fluorescens strain 2P

325 ( 라) 실험군의분류 실험군은정상군( 황칠종자 + 배양액), 실험군(No. 1 : 황칠종자 + C2 균주배양액, No. 2 : 황칠종자 + C4 균주배양액, No. 3 : 황칠종자 + C5 균주배양액, No. 4 : 황칠종자 + C6 균주배양액, No. 5 : 황칠종자 + C7 균주배양액, No. 6 : 황칠종자 + C8 균주배양액, No. 7 : 황칠종자 + C9 균주배양액, No. 8 : 황칠종자 + C10 균주배양액, No. 9 : 황칠종자 + C11 균주배양액, No. 10 : 황칠종자 + C2, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11 mixture 균주배양액) 으로분류하여 2007년 10월부터 2008년 2월까지정상적인발아를위해 적절한수분과온도가공급된황칠종자에각군의미생물균주배양액을분주한후 Pot test 를통하여수액채취량이많은황칠나무의뿌리토양에서서식하는미생물 우점종이황칠나무의종자발아에미치는영향을측정하였다. ( 마) Pot test 채로곱게거른후 80% 알코올을 spray하고약 30분동안공기건조하여무균상 태가된멸균된흙 250 g을멸균된식물생장용 pot에담은후물 100 ml를분주한 다. 균이배양되지않은일반세균배양액이처리된정상군 seed 5개를 pot에심고 대조군으로하였으며, C2, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11 각각의균주배양액및 C2 - C11 균주배양액 mixture 를처리한 seed를각각준비된실험용 pot에 5개씩심고 2-3 cm 두께로 vermiculite 를덮고충분한수분을뿌려주었다. 그후평균온도 31-35, 습도 47-60% 로유지시킨비닐하우스내에서배양하였다. 각각의종자발아용 pot은 shoot 가나올때까지 3 mm 두께의플라스틱을덮어두었다. 파종약 6 주 후발아율을조사하였는바, 정상군 2개의 pot ( 각 pot 당 5 개의종자파종), No. 1 - No. 10까지의각각의실험군역시 2개의 pot 에 ( 각 pot 당 5 개의종자파종) 실 험을실시하여각군당총 10개의종자를 pot 에파종한후그결과를측정하였다. ( 바) 발아종자의생장촉진관련생리학적특성연구 정상군 2개의 pot (10 개의종자파종), No. 1 - No. 10까지의각각의실험군역 시 2개의 pot에 pot test 를실시하여 ( 각각의실험군역시 10 개의종자파종) 정상 군및실험군황칠종자의발아율을측정한후발아된 plant는가장긴잎의끝에해 당하는 shoot 길이를측정하였다. 그후황칠떡잎이발아한실험군의떡잎은 3차년도 연구와연계하여노지의토양에이식하여노지에서성장하는황칠나무의크기, 잎의수,

326 가지의직경, 뿌리의건조중량등을측정하여수액채취량이많은황칠나무의뿌리 토양에서서식하는미생물이발아한황칠종자의생장촉진및생리적특성에미치는 영향을장기적으로조사할예정이다. 이는황칠나무의생장및수액분비촉진관련 생리적특성과황칠나무의뿌리토양에서분리한미생물과의역학관계를규명하는데 중요한 data 를제공할것으로사료된다. (2) 실험결과및고찰 ( 가) 황칠종자의 Pot test에의한발아율측정결과 2008년 2월완도군보길면의해안가남사면에위치한밭에길이 20m, 넓이 7m 의비닐하우스를설치하여 pot test 실험을실시하였다. 비닐하우스설치후비닐하 우스내부의흙을평탄하게하는평탄작업을실시하고실험을수행하였다. 실험에 이용된모든흙은채로걸러고운흙만을모아실험에사용하였으며이흙은 80% 알코올 spray하여무균처리한후건조하여 pot test 실험에사용하였다( 그림 3-18~ 27)

327 그림 Pot test 실험을실시하기위해남사면밭에설치한비닐하우스전 경 ( 전라남도완도군보길면에위치)

328 그림 Pot test 실험전비닐하우스안의토양을고르게정리하는평탄작 업을하는모습

329 그림 Pot test 경. 실험을위해토양이평탄하게정리된비닐하우스내의전

330 그림 Pot test 발아실험을위해 2007년 12월부터 2008년 2월까지냉습처 리된황칠나무종자

331 그림 Pot test 발아실험을위해채로흙을곱게거른모습 : 이흙을 80% 알코올로 spray 하여무균처리한후공기건조하여실험에사용하였 다

332 그림 Pot test 실험을위해종자발아용 pot에무균처리된토양을고르게 채워넣은모습

333 그림 종자발아용 pot에무균처리된토양을고르게채워넣은후각각의 균주를처리한황칠나무종자를파종한모습

334 그림 종자발아용 pot에무균처리한토양을고르게채워넣은후각각의 균주를처리한황칠나무종자를파종하고그상단에버미큘라이트 를처리한모습

335 그림 비닐하우스내에동물로부터 pot test 실험모델을보호할보호망을 설치한모습 ( 수직그림)

336 그림 비닐하우스내에동물로부터 pot test 실험모델을보호할보호망을 설치한모습 ( 수평그림)

337 실험군은정상군 ( 황칠종자 + 배양액) 과실험군(No. 1 : 황칠종자 + C2 균주배양액, No. 2 : 황칠종자 + C4 균주배양액, No. 3 : 황칠종자 + C5 균주배양액, No. 4 : 황칠종자 + C6 균주배양액, No. 5 : 황칠종자 + C7 균주배양액, No. 6 : 황칠종자 + C8 균주배양액, No. 7 : 황칠종자 + C9 균주배양액, No. 8 : 황칠종자 + C10 균주배양액, No. 9 : 황칠종 자 + C11 균주배양액, No. 10 : 황칠종자 + C2, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11 mixture 균주배양액) 으로분류하였고, 각각의실험군의 pot test 실험을위하여 2008 년 2월전라남도완도군보길도의해안가남향에있는밭에길이 20m, 넓이 7m의 비닐하우스를설치하여실험을실시하였다. 즉, 채로곱게거른후 80% 알코올을 spray하고약 30분동안공기건조하여무 균상태가된멸균된흙 250 g을멸균된식물생장용 pot에담은후물 100 ml를분 주하였다. 균이배양되지않은일반세균배양액이처리된정상군 seed 5개를 pot에 심고대조군으로하였으며, C2, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11 각각의균주배양 액및 C2 - C11 균주배양액 mixture 를처리한 seed를각각준비된실험용 pot에 5개 씩심고 2-3 cm 두께로 vermiculite 를덮고충분한수분을뿌려주었다. 그후평 균온도 31-35, 습도 47-60% 로유지시킨비닐하우스내에서약 60일간배양하였다. 각각의종자발아용 pot은 shoot 가나올때까지 3 mm 두께의플라스틱을덮어두 었으며파종약 6 주후발아율을조사하였고그결과를표 3-8 에나타내었다. 황칠종자는파종후약 6주후에발아하였는데대조군인 C group 은 70% 평균발아율을 보인반면, Bacillus cereus strain H1439균주를처리한 C2군및 Bacillus cereus clone B305균주를처리한 C4 군은각각 90% 의발아율을보여대조군에비해높은 발아율을나타내었다. 또한 Paenibacillus ginsengagri균주를처리한 C6군은 80% 의 발아율을보여대조군에비해높은발아율을보였고마찬가지로 Paenibacillus ginsengagri균주를처리한 C7 군및 C2 - C11 균주를 mixture한군역시 80% 의 발아율을보여대조군에비해높은발아율을나타내었다. 한편 Bacillus luciferensis 균주를처리한 C5 군, Bacillus bataviensis균주를처리한 C8 군, Paenibacillus pabuli 균주를처리한 C9 군, Paenibacillus agaridevorans균주를처리한 C10군및 Pseudomonas fluorescens strain 2P24 균주를처리한 C11군은각각 70%, 70%, 70%, 70%, 70% 의발아율을나타내대조군과뚜렷한차이를나타내지않았다. 즉 황칠수액의분비량이가장많은것으로나타난 Site C ( 전라남도완도군보길면민 가자생황칠나무) 에서분리된 9개의미생물균주중 Paenibacillus ginsengagri균

338 주, Paenibacillus ginsengagri균주, Bacillus cereus strain H1439 균주및 Bacillus cereus clone B305 균주와 C2 - C11 균주를 mixture한군이대조군에비해황칠의 종자발아를촉진시키는것으로결과가나타났다. 따라서 pot test 의전체적인결과 는 tube assay 연구결과와비슷한양상을보여주었고이는 1 차년도연구, 2차년도 의 다. tube assay, pot test 연구에서일관성있는연구결과를나타낸것으로사료된 표 3-8. Pot test 발아율실험결과지 Groups 종자 No. 발아유( ) 무( ) C C2 C4 Ca Cb Cc Cd Ce Cf Cg Ch Ci Cj C2a C2b C2c C2d C2e C2f C2g C2h C2i C2j C4a C4b C4c C4d

339 C4e C4f C4g C4h C4i C4j Groups 종자 No. 발아유( ) 무( ) C5 C6 C7 C5a C5b C5c C5d C5e C5f C5g C5h C5i C5j C6a C6b C6c C6d C6e C6f C6g C6h C6i C6j C7a C7b C7c C7d C7e C7f C7g C7h

340 C7i C7j Groups 종자 No. 발아유( ) 무( ) C8 C9 C10 C8a C8b C8c C8d C8e C8f C8g C8h C8i C8j C9a C9b C9c C9d C9e C9f C9g C9h C9i C9j C10a C10b C10c C10d C10e C10f C10g C10h C10i C10j Groups 종자 No. 발아유( ) 무( )

341 C11 Cmix C11a C11b C11c C11d C11e C11f C11g C11h C11i C11j Cmixa Cmixb Cmixc Cmixd Cmixe Cmixf Cmixg Cmixh Cmixi Cmixj ( 나) 발아종자의생장촉진관련생리학적특성연구 Pot에황칠종자파종약 6 주후 shoot 가나오기시작하였는데각군의 shoot 의길이를측정하여그결과를표 3-9 에나타내었다. 표 3-9에나타난결과에서보 여주는바와같이 pot test의 shoot 길이측정연구결과역시 tube assay의연구결 과와마찬가지로최초측정한 shoot의길이는아직떡잎이어린관계로거의모든 군에서약 2.1mm~2.3 mm를나타내어아직성장차이를확연히구분할수없었다. 따라서 2차년도 tube assay 연구와마찬가지로이연구의실험결과는위에보고한 1차연구결과외에차후 3 차년도연구과제인 황칠나무종자에토양미생물의접종법을 이용한 Field test 연구와연계하여발아한황칠종자의떡잎을 2008년봄까지비닐하 우스에서키운후 2008년 4월경노지로옮겨심어노지에서 1년키울예정이며그 후노지에서성장하는황칠나무의크기, 잎의수, 가지의직경, 뿌리의건조중량등

342 을본연구의잔여연구기간인 2009년 4월까지약 1년 2개월동안황칠나무의생장을지켜 보면서지속적으로결과데이터를기록하여발아종자의토양미생물과연계된생장촉진 관련생리학적특성연구의연구결과를도출할계획이다. 표 3-9. 각군에대한 shoot 길이측정실험결과지 (Pot test) Groups C C2 C4 Shoot의길이 2.1 mm 2.1 mm 2.2 mm 2.2 mm 2.3 mm 2.2 mm 2.2 mm 2.3 mm 2.2 mm 2.1 mm 2.2 mm 2.1 mm 2.2 mm 2.2 mm 2.2 mm 2.3 mm 2.3 mm 2.2 mm 2.3 mm 2.2 mm 2.2 mm 2.2 mm 2.2 mm 2.3 mm 2.3 mm 2.3 mm 2.2 mm

343 2.3 mm 2.2 mm 2.1 mm Groups C8 C9 C10 Shoot의길이 2.2 mm 2.2 mm 2.2 mm 2.1 mm 2.1 mm 2.2 mm 2.2 mm 2.3 mm 2.2 mm 2.1 mm 2.2 mm 2.2 mm 2.2 mm 2.2 mm 2.2 mm 2.1 mm 2.3 mm 2.2 mm 2.3 mm 2.2 mm 2.2 mm 2.1 mm 2.3 mm 2.1 mm 2.2 mm 2.2 mm 2.2 mm 2.2 mm 2.2 mm 2.1 mm

344 Groups C11 Cmix Shoot의길이 2.2 mm 2.2 mm 2.3 mm 2.2 mm 2.1 mm 2.2 mm 2.1 mm 2.2 mm 2.3 mm 2.2 mm 2.2 mm 2.2 mm 2.2 mm 2.2 mm 2.3 mm 2.2 mm 2.3 mm 2.2 mm 2.3 mm 2.3 mm Groups C5 C6 Shoot의길이 2.1 mm 2.1 mm 2.2 mm 2.2 mm 2.2 mm 2.1 mm 2.2 mm 2.2 mm 2.2 mm 2.2 mm 2.1 mm 2.3 mm

345 C7 2.2mm 2.2mm 2.3mm 2.2mm 2.3mm 2.2mm 2.3mm 2.1mm 2.1mm 2.3mm 2.2mm 2.3mm 2.2mm 2.2mm 2.3mm 2.3mm 2.2mm 2.1mm

346 3. 3 차년도연구결과보고서 가. 연구개발목표 3 차 연도 황칠나무에토양미생물의접종법을이용한 Field test와식물생장및수액분비관련토양미생물개발및유용유전자탐색 나. 연구개발수행내용 - 황칠나무의생장촉진능력이뛰어난균주선발 - Field soil 일정량에일정균주를한균주씩또는 mixed culture하여 seed treatment - Inoculation 등의방법으로 plant number, plant height, head number, yield 등측정비교 - Internte search를통하여 datd base 이용 - 식물생장촉진활성관련유전자자료를참고하여 Gene cloning, PCR 방법이용유용유전자탐색 다. 황칠나무종자에토양미생물의접종법을이용한 Field test : 황칠종자의토양미생물의접종법을이용한 Field test ( 생장특성 : 나무잎의 수, 나무의크기, Root weight 증가측정) (1) 실험재료및방법 ( 가) 황칠나무종자 에서 황칠나무종자는 1차년도인 2006년 10월전라남도완도군보길면부황리야산및적자산 3kg 을채집하여냉장실에보관하면서실험에사용하였다. ( 나) 미생물의배양 1차년도연구중황칠수액의분비량이가장많은것으로나타난 Site C( 전라남도 완도군보길면민가자생황칠나무) 에서분리된 9개의토양미생물균주를동정한

347 후이토양미생물을배양하여각각 C2, C11 등으로명명한후 100ml의 NA배 지에접종후 37 에서 24시간배양하고 Spectrophotometer 를이용하여균수를계산한후실 험에사용하였고분리된각균주의번호및명칭은아래와같다. C site 에서분리된각균주의번호및명칭 C2 : Bacillus cereus strain H1439 C4 : Bacillus cereus clone B305 C5 : Bacillus luciferensis C6 : Paenibacillus ginsengagri C7 : Paenibacillus ginsengagri C8 : Bacillus bataviensis C9 : Paenibacillus pabuli C10 : Paenibacillus agaridevorans C11 : Pseudomonas fluorescens strain 2P24 ( 다) 실험군의분류 실험군은 1. 정상군(C : 황칠종자 bedding), 2. 실험군 Ⅰ(C2 : 황칠종자 bedding + C2, C4 : 황칠종자 bedding + C4, C5 : 황칠종자 bedding + C5, C6 : 황칠종자 bedding + C6, C7 : 황칠종자 bedding + C7, C8 : 황칠종자 bedding + C8, C9 : 황칠종자 bedding + C9, C10 : 황칠종자 bedding + C10, C11 : 황칠종자 bedding + C11, Cmix : 황칠종자 bedding + C2 - C11 mixture ) 로분류하여 1 차년도에실험을실시하였다. 즉, 분리미생물을토양에처치후 황칠종자를파종하여이의발아율및생장정도 가 ) 를측정하는연구가 1 차년에기수행되었다. ( 나무잎의수, 나무의크기, Root weight 증 ( 라) 황칠종자의토양미생물의접종법을이용한 Field test : 1차년도에황칠종자의발아율및생장정도측정연구에쓰인장소는전라남도

348 완도군보길면의비닐하우스내였으며( 그림 3-28) 시기는 2007년 2월이었고실험 환경의평균온도는 31, 습도는 47% 로유지시켰다. 각군에사용된토지의면적은가로 20cm, 세로 20cm 였고 ( 이를각각 C, C2, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, Cmix site 로명 명), 파종전토양을다진후( 그림 3-29) 2007년 2 월파종을실시하였다( 그림 3-30). 파 종실시전상기실험군의분류에서설명한바와같이가로 20cm, 세로 20cm 인각각의 site 에 각각의균주를 10-1 으로희석하여 100ml 씩을고르게첨가하였고그후가로 20cm, 세로 20cm 인각각의 site 에각 site 당 100 개의황칠종자를흩어뿌리기로파종하고윗흙을덮어주 었다( 그림 3-31). 황칠종자파종후약 40일후인 2007년 4월각군당 100개의파종종자 의발아율을측정하여황칠종자발아에미치는미생물의영향을조사하였다. 발아율측정후 2007년 8월발아한황칠종자를무작위로각군당 20 그루를선발하여나뭇잎의수, 나무의 크기( 수고), 뿌리의중량등을측정하여황칠나무의뿌리토양에서분리한미생물이황 칠나무의생장에미치는영향을조사하여이미이상의결과를 1차년도연구결과로 써보고하였다. 그후남은떡잎들은 2008년봄까지비닐하우스에서키운후 2008년 4월경 field ( 노지) 로옮겨심어노지에서 1 년키운후, 2009년 3월 field에서성장중인황 칠나무의크기, 나무잎의수, 뿌리의건조중량등을측정하여 1차년도에 Site C ( 전 라남도완도군보길면민가자생황칠나무, 황칠수액이가장많은나무) 에서분리 된 9개의토양미생물균주가 field에서성장중인황칠나무의생장에어떠한영향 을미치는가를조사하여 을이용한 3차년도연구과제인황칠나무종자에토양미생물의접종법 Field test 에관한연구결과를도출하였다. ( 마) 통계처리 모든실험결과측정치는일변수분석법을사용하여통계처리하였으며 Student's T-test를이용하여 p<0.05 수준에서각실험군간의유의성을검증하였 다. 모든자료는 mean±standard deviation 으로나타내었다

349 그림 실험을실시한비닐하우스외부전경

350 그림 파종전토양을다져놓은모습

351 그림 정상군및실험군 Ⅰ, 실험군 Ⅱ, 실험군 Ⅲ에황칠종자를파종한모습

352 그림 정상군및실험군. Ⅰ, 실험군 Ⅱ, 실험군 Ⅲ에황칠종자파종후윗흙 을덮은모습

353 (2) 실험결과및고찰 ( 가) 황칠종자의토양미생물의접종법을이용한 Field test ( 생장특성 : 나무잎의 수, 나무의크기, Root weight 증가측정) 1 차년도연구과제인 황칠나무에접종한토양미생물의종자발아율, 생장속도증 가, root dry weight 증가 연구가끝난후남은떡잎들은 2008년봄까지비닐하우 스에서키운후 2008년 4월경 field ( 노지) 로옮겨심어노지에서 1 년키운후, 2009년 3월 field 에서성장중인황칠나무의크기, 나무잎의수, 뿌리의건조중량등 을측정하였다. 황칠종자의발아실험에쓰인장소는전라남도완도군보길면의비닐하우스내 였으며실험환경의평균온도는 31, 습도는 47% 로유지시켰다. 각군에사용된토지 의면적은가로 20cm, 세로 20cm 였고실험군은 1. 정상군(C : 황칠종자 bedding), 2. 실험군 Ⅰ(C2 : 황칠종자 bedding + C2, C4 : 황칠종자 bedding + C4, C5 : 황칠종자 bedding + C5, C6 : 황칠종자 bedding + C6, C7 : 황칠종자 bedding + C7, C8 : 황칠종자 bedding + C8, C9 : 황칠종자 bedding + C9, C10 : 황칠종자 bedding + C10, C11 : 황칠종자 bedding + C11, Cmix : 황칠종자 bedding + C2 - C11 mixture ) 으로분류하였다. 전라남도완도군보길면의비닐하우스내의 20cm 세로 20cm 크기인각각의 site 에 서발아한황칠떡잎은 2008년 4월경상기비닐하우스를벗겨내어 field ( 노지) 환경을 조성한후노지에서 1 년키웠고, 그후 2009년 3월 field에서성장중인황칠나무중 각군당 20그루를무작위로선발하여이들 20 개체각각에대한나무의크기, 나 무잎의수, 뿌리의건조중량등을측정하였고그결과를표 3-10 에나타내었다. 표 3-10 을살펴보면나무크기의평균치는정상군인 C의 5.98 cm ± 0.23에비해 C6군과 Cmix 군이각각 6.88 cm ± 0.18, 6.48 cm ± 0.36로정상대조군에비해유의적인증가를 나타내었으며이외의나머지군들에서는유의적인증가치가나타나지않았다. 또한 표 3-10 에나타난황칠나무의나무크기 ( 수고) 는 2007년 4월황칠종자가발아한후 4개월지난 2007년 8 월측정한떡잎의나무크기 ( 수고) 에비해전혀어린나무가성 장하지않았는데이러한현상은비닐하우스에서발아, 성장한식물이노지의바람 과추운기후에적응하며견디는과정에서성장이더디일어나는것으로생각되며

354 아마 2009 년봄이후에는활발한성장이일어날것으로사료된다. 또한측정된황 칠떡잎의나뭇잎수는정상군에서 4.2 개 ± 0.24 나타내었는데실험군에서는정상군 과비교하여유의적인증가를나타낸군이전혀없었다. 특이한사항은황칠떡잎의 나뭇잎수는 2007년 4월황칠종자가발아한후 4개월지난 2007년 8월측정한떡잎 의나뭇잎수와거의차이가없었으며오히려 C2 군은나뭇잎의수가줄어든것으 로나타났는데이러한결과가나온이유는비닐하우스에서자라던황칠나무가노지 환경에노출되면서바람의영향등으로나뭇잎이떨어진것으로사료되며아직 2007년 8 월측정당시의어린잎숫자가그대로유지되고있는것으로생각된다. 황 칠뿌리는모든군에서 2007년 8 월측정당시보다굵고건강해진모습을나타냈다. 정상군인 C의 3. 42g ± 0.23을나타내었고 C7군이 3.98g ± 0.30, Cmix군이 3.88g ± 0.33 의평균중량을나타내정상군에비해유의성있는증가를나타내었으며그외 의군에서는유의적인중량증가를나타낸군이없었다. 이결과를종합해보면황칠 어린나무의크기에서는 C6군인 Paenibacillus ginsengagri균주와 Cmix 군이, 황칠뿌리 의중량측정에서는 C7군인 Paenibacillus ginsengagri균주와 Cmix군이정상군에 비해유의적인성장증가세를나타낸것으로연구결과가나왔다. 이러한연구결과는 1 차년도, 2차년도와유사한실험결과를나타내었는데 1차년도 에실시한황칠나무에접종한토양미생물의종자발아율실험결과에서도 Bacillus cereus strain H1439 균주, Paenibacillus agaridevorans균주, Paenibacillus ginsengagri균주및 C2 - C11 균주를 mixture한군이대조군에비해황칠의종자 발아를촉진시키는것으로결과가나타났고, 2차년도에실시한 Tube assay 및 Pot test 연구에서는 C6, C7인 Paenibacillus ginsengagri균주, Paenibacillus ginsengagri균주, Bacillus cereus strain H1439 균주와 C2 - C11 균주를 mixture 한군이대조군에비해황칠의종자발아를촉진시키는것으로결과가나타나 1차년 도, 2차년도및 3차년도실험에서공통적으로 C6, C7인 Paenibacillus ginsengagri 균주, Paenibacillus ginsengagri균주및 C2 - C11 균주를 mixture한 Cmix군이대 조군에비해비닐하우스환경에서든 field ( 노지) 환경에서든상관없이황칠의성장 을촉진하는것으로연구결과가나타난바, 차후이들균주에대한생리적특성연 구가뒤따라야할것으로사료된다

355 표 정상군및실험군 Ⅰ의성장측정실험결과 : 무작위로추출한발아개 체의성장률측정 Site NO 나무의크기( 수고) 평균치 나무잎의수평균치 뿌리의중량평균치 C 5.98 cm ± 개 ± g ± 0.23 C cm ± 개 ± g ± 0.11 C cm ± 개 ± g ± 0.18 C cm ± 개 ± g ± 0.14 * C cm ± 개 ± g ± 0.43 C cm ± 개 ± g ± 0.30 * C cm ± 개 ± g ± 0.09 C cm ± 개 ± g ± 0.28 C cm ± 개 ± g ± 0.23 C cm ± 개 ± g ± 0.29 Cmix 6.48 cm ± 개 ± g ± 0.33 * 1) Each value represents the mean±s.d. of 10 rats. n = 20 * Significant differences as compared with control : p<0.05. 라. 황칠생장및수액분비관련토양미생물개발및유용유전자탐색 (1) 실험방법및고찰 ( 가) 토양미생물의분리

356 1차년도에 C site로부터 12 종의토양미생물을분리하였다. 이들토양미생물의분 리는 D. W. 희석법을사용하였는데, 각군에서채취한토양 5g 을멸균된 3차증류 수 50ml 에넣어 1차희석후 10-1 부터 10-6 까지멸균된 3 차증류수로희석하였다. 그후각희석시킨토양을 NA 배지(Difco Inc, U. S. A) 에 100ul smear하여 37 와 28 incubator 에서 24~ 48 시간배양하였다. 배양후생성된 Colony 의외부형태적특성으로 분류하여각각다른균이라생각되는것을따로멸균된니들로채취하여 LB 배지 (Bacto Inc, U. S. A) 로옮겨배양하였다. 배양된균을다시 NA 배지 (Difco Inc, U. S. A) 에 Stricking 하여하나의균종인지확인후균의동정에들어갔다. ( 나) 토양미생물의동정 일반적인미생물동정은크게두가지방법으로이루어진다. 그중하나는세균의외부적인 형태나염색의특징또는포자형성이나운동성, 화학적물질에대한반응등을보는생화학적 동정법을통한동정이고다른방법은대상균주에서 DNA 를추출하여염기서열확인을통한 균동정법이다. 본실험자의경우 1차년도에 DNA 염기서열조사를통한균동정을우선실 시하였다. 균에서 DNA 를추출하기위하여 DNA Extraction Kit(G-spin Genomic DNA Extraction Kit, intron Inc, U. S. A) 를사용하였고추출한 DNA는 PCR의주형 DNA 로사용되었다. 동정에사용된 DNA는 16S ribosomal DNA 를채택하였다. 16S ribosomal DNA 는거의대부분의균이공통된 primer 부착염기서열을가지고있어이곳에 primer를부착하여 DNA를증폭시킨후증폭된 DNA의염기서열을분석하여각각 의균주의종을동정할수있다. 따라서 PCR을통하여 16S ribosomal DNA 단편을증폭시켜염기서열을분석 하였고, PCR의주형 DNA로는각각의균주에서추출한 DNA를사용하였고 Primer 는 16S ribosomal DNA primer(forward primer : AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG, reverse primer : GGT TAC CTT GTT ACG ACT T) 를사용하였다. 그리고 PCR 은 30cycle 을진행하였고 Tm값은 52 로설정하였다. ( 다) 사용배지및시약 여 1차년도에분리된 Bacillus, Paenibacillus, Pseudomonas속균주의생장을위하 Luria-Bertani(LB; Difco Inc, U. S. A) 를사용하였고, Ralstonia속균주의생장

357 을위해서는 Nutrient Broth(NB; Difco Inc, U. S. A) 를사용하였다. 균주의보존은균배양액을 15% glycerol (Shinyo, Japan) 이되도록조성하여 -70 Deep Freezer(Ilshinlab Inc., Korea) 에보관하고사용하였다. Genomic DNA 의추출및정제를위해 Puregene TM DNA Isolation kit (Gentra Inc., U. S. A) Seakem LE agarose (Bioproduct Inc., U. S. A) 을구입하여사용하였고, Sigma Inc.(U. S. A) 의 Et-Br(ethidium bromide), EDTA, lysozyme, isopropanol를사용하 였다. 전지영동의확인을위한분자마커로 Super coil DNA marker (Promega Inc., U. S. A) 와 1 kb ladder marker (Elpisbiotech Inc., Korea) 를사용하였다. ( 라) Genomic DNA 분리 1차년도에분리된 C site 12종분리균주의 genomic DNA는 Puregene TM DNA Isolation kit 을사용하여분리하였다. 균주를 LB, Nutrient broth에접종하여밤샘 배양한후 E-tube에 1.5ml 넣고 13,000rpm, 1분간원심분리한뒤상등액을버리고 침강된균체를회수하였다. 침강된균체에 lysozyme(20mg/ml, Sigma Inc., U. S. A) 이첨가된 cell suspension solution 300μl를넣고재현탁한후 37 에서 2시간 동안반응시켜세포벽을약화시켰다. 반응이끝난균액을원심침강후상등액을버 려 speroplast 를회수하였으며, 여기에 cell lysis solution 300 μl(1μl RNase A, 4mg/ml) 를첨가하고피펫을이용하여천천히 inverting 하여용균액을준비하였다. Protein precipitation solution 100μl를넣고 20초간강하게섞어서 30분간얼음에 정치한후 4, 12,000rpm에서 5분간원심분리하여단백질을침전시키고상층액을 회수하였다. 400μl의 isopropanol을넣고조심스럽게 inverting하여 DNA의응축을 확인한후, 실온에서 12,000rpm, 5분간원심분리하여 DNA를침전시키고상층액을 제거하고 500μl의 70% Et-OH를사용하여 DNA washing하고다시원심분리하여 에탄올을제거하였다. DNA침전물을 37 에서충분히건조시킨후멸균된 3차증 류수 100μl에녹여전기영동하여확인한후 -20 에보관하였다. ( 마) Primer Preparation ipdc 유전자는 Azospirillum brasilense의유전자중옥신분비를촉진하는 Indole-3-Pyruvate Decarboxylase를코딩하고있는유전자이며 P450-Ⅱ 유전자는 Gibberella fujikuroi 의지베렐린생합성유전자의일부분으로알려져있어식물의

358 생장을촉진하고식물수액의분비를자극하는토양미생물의유전자로알려져있다. 따라서본 3차년연구에서는 ipdc 유전자와 p450-Ⅱ 유전자를타겟으로하여 1차년 도에분리된 C site 12종토양미생물의제놈에 ipdc 유전자와 p450-Ⅱ 유전자가존 재하는지여부를알아보기위해연구를실시하였다. 기분리된 ipdc 유전자와 p450-Ⅱ 유전자의존재여부를확인하기위하여사용한 primer는 Bioneer(Seoul, Korea) 홈페이지의생물정보학도구를이용하여 design하 였고 Macrogen Co. Ltd (Korea) 에서주문제작하여의뢰하였다. ipdc 유전자를얻 기위해 Azospirillum brasilense ipdc(ann V. B, 1999) 의염기서열을근거로 ipdc-f primer와 ipdc-r primer 를제작하였다. Gibberella fujikuroi(bettina T, 2002) 에서 p450-Ⅱ 유전자를얻기위해 p450- Ⅱ_F primer와 p450- Ⅱ_R primer를 실험에사용하였다. 실험에사용한 primer의 nucleotide sequence는표 3-11 과같다. 표 Primers used for PCR Primers Nucleotide sequences(5' 3') Product Size ipdc_f ipdc_r GAAAGACGCCCATCAGGC ACCATCTGCACCGGCGAC 996bp P450-Ⅱ_F P450-Ⅱ_R ACCAAGGGGTCAAAGAGTCG GACTTTAGGGGAAAGGTTATAGAG C 2753bp ( 바) Polymerase chain reaction (PCR) ipdc-f primer와 ipdc-r primer, P450- Ⅱ_F primer와 P450- Ⅱ_R primer를사 용하여 PCR 을수행하였다. 사용한 PCR반응용액은 1μl주형 DNA 50ng, 1μl dntps (2.5 mm each), 2μl 의 10X reaction buffer (with MgCl ₂), 1 U HF DNA polymerase 을기본으로구성하여사용하여결과를얻었고, 각각의 PCR 반응조건 은 ipdc 유전자는 94 5 분간변성후, 94 1분 denaturation, 초 annealing, 72 1분 elongation 하고 30 cycle 수행후 72 5분간최종 elongation

359 을수행하였고, p450-Ⅱ 유전자는 94 5 분간변성후, 94 1분 denaturation, 57 30초 annealing, 72 2분 elongation 하고 30 cycle 수행후 72 5분간최종 elongation 을수행하였다. p450-Ⅱ의 PCR 크기가 2.8 kb 정도되기때문에 PCR 오 류가적은 AccuPower HF PCR, premix 96 tube, 0.2ml 8-strip, 20μl reaction (HF DNA polymerase, Each:dNTP, 10 reaction buffer, stabilizer and tracking dye) 을이용하여오류가적은 PCR 제품을이용하여유전자를증폭하였다. 증폭된산물 의확인은 0.8% agarose gel (Seakem LE., Bioproducts Inc., U. S. A) 상에서확인 하였고. -20 냉동고에보관하여사용하였다. (2) 실험결과및고찰 ( 가) 토양미생물의분리의분리및동정 및 1차년도에 C site로부터분리된균주는총 12균주이며그동정결과는그림 와같다. 표 Identification of isolated strains from site C of a wild Dendropanax morbifera community by 16S rrna sequence analysis Strain No. C2 Homologous microorgarnism Bacillus cereus strain H1439 C4 Bacillus cereus clone B305 C5 Bacillus luciferensis C6 Paenibacillus pabuli C7 Pseudomonas fluorescens strain 2P24 C8 Paenibacillus ginsengagri C9 Bacillus niacini

360 C10 Paenibacillus ginsengagri C11 Bacillus bataviensis C13 Paenibacillus agaridevorans C15 Ralstonia sp. c308 C16 Pseudomonas putida strain PC16 C2~C16 : 분리균주의분류번호 16S rrna % identityª : indicates percent of homology between 16S rdna sequences of each strain to that of close relatives 표 S rrna sequencrs of isolated strains from site C of a wild Dendropanax morbifera community Strain No. 16S rrna Sequence C2 TGTTCTTGTCGGCGGCTGGCTCCATAAAGGTTACCCCACCGACTT CGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGG CCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGC GATTCCAGCTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTG AGAACGGTTTTATGAGATTAGCTCCACCTCGCGGTCTTGCAGCTC TTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGG GCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACC GGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTTAATGATGGCAACTAAGATC AAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACAC GAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCTCCCGAAGG AGAAGCCCTATCTCTAGGGTTTTCAGAGGATGTCAAGACcTGgTA AGGtTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTG TGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGtTTCAGCCTTGCGGCCGTAC TCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAACTTCAGCACTAAAGGGC GGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTA CCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGT GTCAGTTACAGACCAGAAAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCC ATATCTCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAATTCCACTTTCCT CTTCTGCACTCAAGTCTCCCAGTTTCCAATGACCCTCCACGGTTG

361 AGCCGTGGgCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCACCTGCGCGCGC TTTACGCCCAATAATTCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTAC CGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGgCTTTCTGGTTAGGTAC CGTCAAGGTGCCAGCTTATTCAACTAGCACTTGTTCTTCCCTAAC AACAGAGTTTTACGACCCGAAAGCCTTCATCACTCACGCGGCGTT GCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGC CTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATC ACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACC TCACCAACTAGCTAATGCGACGCGGGTCCATCCATAAGTGACAGC CGAAGCCGCCTTTCAATTTCGAACCATGCAGTTCAAAATGTTATC CGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTATGGGCA GGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACTTCATAAGA GCAAGCTCTTAATCCATTCGCTCGACTTGCATGTATACCAAAAGT GTG 16S rrna % identity Bacillus cereus strain H1439 균의 16S ribosomal RNA gene과 98% 부분에서 99% 동일함을보임 Strain No. 16S rrna Sequence C4 AACAGTAACGGCACTCTATGTGTGTCGGCGGCTGGCTCCATAAAG GTTACCCCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACG GGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTG ATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCATGTAGGCGAGTTGCAG CCTACAATCCGAACTGAGAACGGTTTTATGAGATTAGCTCCACCT CGCGGTCTTGCAGCTCTTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTA GCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTT CCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTTAAT GATGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACC CAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTC ACTCTGCTCCCGAAGGAGAAGCCcTATCTCTAGAGTTTtCAGAgGA TGTCAAGACCTGGTAAGGTtCTtCGCGTTGCTTCGAaTTAAACCAC ATGcTCCACCGCTtGTgGCGGGCCCCCGTCAATtcCTTTGAGTTTCA GCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAACT TCAGCACTAAAGGGCGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATCGT TtACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACG CTTTCGCGCCTCAGTGTCAGTTACAGACCAGAAAGTCGCCTTCGC CACTGGTGTTCCTCCATATCTCTACGCATTTCACCGgCTACACAT GGAATTCCACTTTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCCAGTTTCCAA TGACCCTCCACGGTTGAACCGTGGGgCTTTYACATCAGACTTAAR

362 AAACCACCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAaTTCCGGATaACGCTT GCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGgCACGTAGcTTAGCCGTGg CTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCCAGCTTATTCAACTAGCA CTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGTTTTACGACCCGAAAGCCTTCA TCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAA GATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAG TCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGC CTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGACGCGGGTC CATCCATAAGTGACAGCCGAAGCCGCCTTTCAATTTCGAACCATG CAGTTCAAAATATTATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTA TCCCAGTCTTATGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGC CGCTAACTTCTTGAGAGCAAGCTCTCAATCCATTCGCTCGACTGC ATGATCAAAAACTAGGTACCTGAGCATGCGAVTAGCTCTTAATC CATTCGCTCGACTTGCATGTATACCAAAAGTGTG 16S rrna % identity Bacillus cereus clone B305 균의 16S ribosomal RNA gene과 96% 부분에서 99% 동일함을보임 (Continue)

363 Strain No. 16S rrna Sequence 16S rrna % identity C5 AACCGTTACTGTCACTCTATGCGCGTCGACGGCTGGCCTCCTAAA AGGTTACCCCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGA CGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGC TGATCCGCGATTACTAGTGATTCCGGCTTCATGTAGGCGAGTTGC AGCCTACAATCCGAACTGAGAATAGTTTTATGGGATTAGCTCCAC CTCGCGGTCTTGCAACCCTTTGTACTATCCATTGTAGCACGTGTG TAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACC TTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTAA ATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAA CCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTG TCACTCTGTCCCCGAAGGGAACGCCCTATCTCTAGGGTTGTCAGA GGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAA CCACATGCTCCACCACTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGT TTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTT AACTTCAGCACTAAAAGGGCGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTC ATCGTTTACAGCGTGGAcTACCcAGGGTATMTAAaTCCTGTTTRC TcCCCCACGCTTTCGCGCCTCAgCGTCAGTTACAGACCAgAAAGTC GCCTTCGCCaCTGGTGTTCCTCCAAaTCTYtTACGCATTTCACCGCT ACWCTTGgAATTCCWCTTTCCTCTTCTGCACTCAARTTTCCCAgT TTYCAaTGACtCCTCCCCGGTtGAGCCGGGGgCTTTCACATCAgACT TAaGAAACCGCCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAAC GCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCC GTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCCAGCTTATTTAACT AGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGACCCGAAGGCC TTCATCGCTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCG GAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCT CAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGT CGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGG CCCATCTGTAAGTGATAGCCGAGGCCATCTTTCAACTAAGGAACA GGAGTTCCTCAGTGTCATCCGGTATTAGCTCCGGTTTCCCGAAGT TATCCCAGTCTTACAGGTAGGTTGCCCACGTGTTACTCTCCCGTC CGCCGCTAACTAACGGGAGCAAGCTCCCATTAGTCCGCTCGACTT GCAGTATAAAAACGGGGTACCTGTCCACCGATVT Bacillus luciferensis 균의 16S rrna gene과 95% 부분에서 97% 동일함 을보임 (Continue)

364 Strain No. 16S rrna Sequence 16S rrna % identity C6 ATGTCTGGTCGGCGGCTGGCTCCTTGCGGTTACCCCACCGACTTCG GGTGTTATAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGACC CGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCAA TTCCGACTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAG ACCGGCTTTGTTGGGATTGGCTCCATCTCGCGATTTCGCAGCCCG TTGTACCGGCCATTGTAGTACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGG CATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCG GCAGTCTATCTAGAGTGCCCACCCGAAGTGCTGGCAACTAAATAT AAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACAC GAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCTCCTCTGTCCCGAAGGa AAAGATACATCTCTGTACCGATCAGAGGGATGTCAAGACCTGGT AAGGTTcTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATACTcCACTGCT TGTGCGGGTCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCG TACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGTGTTAACTTCGGCACCAAGG GTATCGAAACCCCTAACACCTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGA CTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTC AGCGTCAGTTACAGCCCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCC TCCACATATCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCT CCTCTTCTGCACTCAAGTCACCCAGTTTCCAGTGCGATCCGGGGT TGAGCCCCGGGAaTTAAACACCAGACTTAAATTACCGCCTGCGCGC GCTTTACGCCCAATAATTCCGGACaACGCTTGCCCCCTACGTATTA CCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCcGGGGCTTTCTTCTCAGGTAC CGTCACCTTGAGAGCAGTTACTCTCCCAAGCGTTCTTCCCTGGCA ACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCATTG CTCCGTCAGGCTTTCGCCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCT CCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCAC CCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTC ACCAACTAGCTAATGCGCCGCAGGCCCATCCCCAAGTGACAGATT GCTCCGTCTTTCCAGTTTCCTTCAGGCGAAGAAAACAATTATTCG GTATTAGCTACCGTTTCCGGTAGTTGTCCCAAACTTGAGGGCAGG TTGCCTACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACGTATCAGAGAA GCAAGCTTCTCATCAAGTCCGCTCGACTGCAGTATACACACGCGA GCCAVT Paenibacillus pabuli 균의 16S rrna gene과 97% 부분에서 99% 동일함 을보임

365 (Continue) Strain No. 16S rrna Sequence 16S rrna % identity C7 CGTCTTGTCGGTACCGTCCCCCCGAAGGTTAGACTAGCTACTTCT GGTGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCC CGGGAACGTATTCACCGCGACATTCTGATTCGCGATTACTAGCGA TTCCGACTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGGACTACG ATCGGTTTTGTGGGATTAGCTCCACCTCGCGGCTTGGCAACCCTC TGTACCGACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGCCGTAAGGGCC ATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGG CAGTCTCCTTAGAGTGCCCACCATAACGTGCTGGTAACTAAGGAC AAGGGTTGCGCTCGTTACGGGACTTAACCCAACATCTCACGACAC GAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCAATGTTCCCGAAGG CACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCATTGGATGTCAAGGCCTGGTA AGGTTCTYCGCGTTGCTtCGAAWTAAACCACATGCTcCACCGCTTG TGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTA CTCCCCAGGCGGTCAACTTAATGCGTTAGCTGCGCCACTAAGAGC TCAAGGCTCCCAACGGCTAGTTGACATCGTTTACGGCGTGGACTA CCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTCAG TGTCAGTATCAGTCCAGGTGGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTT CCTATATCTACGCATTTCACCGCTACACAGGAAATTCCACCACCC TCTACCATACTCTAGCTCGACAGTTTTGAATGCAGTTCCCAGGTT GAGCCCGGGGCTTTCACATCCAACTTAACGAACCACCTACGCGCGC TTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCTGTATTAC CGCGGCTGCTGGCACAGAGTTAGCCGGTGCTTATTCTGTCGGTAA CGTCAAAACACTAACGTATTAGGTTAATGCCCTTCCTCCCAACTT AAAGTGCTTTACAATCCGAAGACCTTCTTCACACACGCGGCATGG CTGGATCAGGCTTTCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCC TCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGACTGATC ATCCTCTCAGACCAGTTACGGATCGTCGCCTTGGTGAGCCATTAC CTCACCAACTAGCTAATCCGACCTAGGCTCATCTGATAGCGCAAG GCCCGAAGGTCCCCTGCTTTCTCCCGTAGGACGTATGCGGTATTA GCGTCCGTTTCCGAGCGTTATCCCCCACTACCAGGCAGATTCCTA GGCATTACTCACCCGTCCGCCGCTCTCAAGAGGTGCAAGCACCTCT CTACCGCTCGACTGCATGGTATGCATACTAG Pseudomonas fluorescens strain 2P24 균의 16S ribosomal RNA gene과 97% 부분에서 99% 동일함을보임

366 (Continue) Strain No. 16S rrna Sequence C8 TTGACTTACAGTACCCTGTTTTTGATACTGCAAGTCGAGCGGACT TGATGGAGTGCTTGCACTCCTGATGGTTAGCGGCGGACGGGTGAG TAACACGTAGGCAACCTGCCCTCAAGACTGGGATAACTACCGGAA ACGGTAGCTAATACCGGATAATTTATTTTGCAGCATTGTGAAAT AATGAAAGGCGGAGCAATCTGTCACTTGAGGATGGGCCTGCGGCG CATTAGCTAGTTGGTGGGGTAACGGCCCACCAAGGCGACGATGCG TAGCCGACCTGAGAGGGTGAACGGCCACACTGGGACTGAGACACG GCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATG GGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTT CGGATCGTAAAGCTCTGTTGCCAAGGAAGAACGTCTTCTAGAGTA ACTGCTAGGAGAGTGACCGTACTTGAGAAGAAAGCCCCGGCTAAC TACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGGGCAAGCGTTGTCC GGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTCTTTAAGTCTG GTGTTTAAACCCGGAGGCTCAACTTCGGGTCGCATTGGAAACTGG GGAACTTGAGTGCAAAAGAGGAGAGTTGGAATTCCACCTGTACT GGGA CCCAAAAGGTACTCTATGCCCGCGGCGGCTGGCTCCCTTGCGGGTT ACCCCACCGACTTCGGGTGTTGTAAACTCTCGTGGTGTGACGGGC GGTGTGTACAAGACCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATC CGCGATTACTAGCAATTCCGACTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCT GCAATCCGAACTGAGACTGGCTTTTATAGGATTGGCTCCACCTCG CGGCTTCGCTTCCCGTTGTACCAGCCATTGTAGTACGTGTGTAGC CCAAGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCGCCTTCC TCCGGTTTGTCACCGGCAGTCATTCTAGAGTGCCCACCCAAAGTG CTGGCAACTAAAATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCC AACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCA CCTCTGTCCCGAAGGCCGCCTCTATCTCTAGAGGATTCAGAGGGA TGTCAAGACTTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCAATTAAACCAC ATACTCCACTGCTTGTGCGGGTCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTC AGTCTTGCAACCGTACTCCCCAGGCGGAATGATTAAGGGTAACTT 16S rrna % identity Paenibacillus ginsengagri 균의 16S rrna gene과 95% 부분에서 99% 동일함을보임

367 (Continue) Strain No. C9 AAGGATTGGACAGGGTATTTTTTTTTTAGTACTGCAAGTCGAGC GAATCATATGAGGAGGCTTGCTCCTGTTATGATTAGCGGCGGATG GAGCGGGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACA TCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAATCCTTTTCCACACATGT GGGAAAGCTGAAAGACGGTTTCGGCCCTTCACTTACAGATGGGCC CGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGA CGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTG AGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTT CGCTATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACTCCGCGTGAGCGATGT 16S rrna Sequence AATCGTACGTGTCACTCTAGGTCCGCGGCAGCTGGCTCCTTACGG TTACCCCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGAGAGACAG GCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGTGCATGCTG ATCCGCGATTACTAGCGATTCCGGCTTCATGTAGGCGAGTTGCAG CCTACAATCCGAACTGAGAATGGTTTTATGGGATTGGCTAAACCT CGCGGTTTCGCAGCCCTTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTA GCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTT CCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAAT GCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACC CAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTC ACTCTGTCCCCCGAAGGGGAAAGTCCTATCTCTAGGAGTGTCAAA GGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAA CCACATGCTCCACCGCTT 16S rrna % identity Bacillus niacini 균의 16S ribosomal RNA gene과 89% 부분에서 98% 동 일함을보임

368 (Continue) Strain No. 16S rrna Sequence 16S rrna % identity C10 AGCTTCTTGTCGGCGGCTGGCTCCCTTGCGGGTTACCCCACCGACT TCGGGTGTTGTAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAG ACCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAG CAATTCCGACTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACT GAGACTGGCTTTTATAGGATTGGCTCCACCTCGCGGCTTCGCTTC CCGTTGTACCAGCCATTGTAGTACGTGTGTAGCCCAAGTCATAAG GGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCGCCTTCCTCCGGTTTGTCA CCGGCAGTCATTCTAGAGTGCCCACCCAAAGTGCTGGCAACTAAA ATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGA CACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACCTCTGTCCCGAA GGCCGCCTCTATCTCTAGAGGATTCAGAGGGATGTcCAAGACTTG GTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCcACATACTCCACT GCtTGTGCGGGTCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGAC CGTACTCCCCAGGCGGAATGCTTAATGTGTTAACTTCGGCACCAA GGGTATCGAAACCCCTAACACCTAGCATTCATCGTTTACGGCGTG GACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGC CTCAGCGTCAGTTACAGCCCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGT TCCTCCACATATCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCAC TCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAGTGCGACCCGA AGTTGAGCCTCGGGgTTTAAACACCAGACTTaAAGAACCGCCTGC GCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCCCCTACGT ATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGGGCTTTCTTCTCA AGTACCGTCACTCTCCTAGCAGTTACTCTAGAAGACGTTCTTCCT TGGCAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGG CGTTGCTCCGTCAGGCTTTCGCCCATTGCGGAAGATTCCCTACTG CTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCC GTTCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGGGCCGT TACCCCACCAACTAGCTAATGCGCCGCAGGCCCATCCTCAAGTGAC AGATTGCTCCGCCTTTCATTATTTCACAATGCTGCAAAATAAAT TATCCGGTATTAGCTACCGTTTCCGGTAGTTATCCCAGTCTTGAG GGCAGGTTGCCTACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACCATCAG GAGTGCAAGCACTCCATCAAGTCCGCTCGACTTGCAGTATACCAA ACGGAG Paenibacillus ginsengagri 균의 16S rrna gene과 98% 부분에서 99% 동일함을보임

369 (Continue) Strain No. 16S rrna Sequence 16S rrna % identity C11 ATGTTGTTGTCGGCGGCTGGCTCCTTACGGTTACCCCACCGACTT CGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGG CCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGC GATTCCGGCTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTG AGAATGGTTTTATGGGATTGGCTAAACCTCGCGGTCTTGCAGCCC TTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGG GCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACC GGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATC AAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACAC GAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGTCCCCCGAAGG GGAACGTCCTATCTCTAGGAGTGTCAGgAGGATGTCAAGACCTGG TAAGGTTtCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGC TTGTGCGGGCCCCCGTCAAaTTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCC GTACTCCCCAGGCGGaAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAA GGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGtTTACGGCGTGG ACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCC TCAGCGTCAGTTACAGACCAGAAAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTT CCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCGCT TTCCTCTTCTGCACTCAAGTCCCCCAGTTTCcAATGACCCTCCACG GgTTGAGCCGTgGGCTTTCACATCAGACTTAAAGGACCGCCTGCGC GCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAaCGCTTGCCACCTACGTAT TACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTtGGCTTTCTGGTTAGG TACCGTCAAGGTACCGGCAGTTACTCCGATACTTGTTCTTCCCTA ACAACAGAGCTTTACGACCCGAAGGCCTTCATCGCTCACGCGGCG TTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCT GCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGA TCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTA CCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGCCCATCTGTAAGTGACA GCCGAAACCGTCTTTCAGTTTTTCCTCATGAGAGGAAAAAGATT ATCCGGTATTAGCTCCGGTTTCCCGAAGTTATCCCAGTCTTACAG GCAGGTTGCCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACCAATGGG AGCAAGCTCCCAAAGATTCGCTCGACTTGCATGTATCCAAAACTA AT Bacillus bataviensis 균의 16S rrna gene과 98% 부분에서 99% 동일함 을보임

370 (Continue) Strain No. C13 16S rrna Sequence AATCAATGCTCACGTGTCCCGTCGTTGTCTGCAGTCGAGCGGATC TTGTCCTTCGGGACAAGGTTAGCGGCGGACGGGTGAGAAAAACGT GGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACATTCGGAAACGAATGC TAATACCGGATACGCGAATTGGTCGCATGGCCGAATCGGGAAAGG CGGAGCAATCTGCCACTTATGGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTA GTTGGTGGGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACC TGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACT CCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGT CTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTA AAGCTCTGTTGCCAGGGAAAAACGCTTGCGAGAGTAACTGCTCGC AAGGTGACGGTACCTGAGAAGAAAGCCCCGGCTAACTACGTGCCA GCAGCCGCGGTAATA AATACGGTAAGTCACTCTATTCGGCGCAGCTGGCTCCTTGCGGTT ACCCCACCGGCTTCGGGTGTTGTAAACTCTCGTGGAGAAGAAGGG CGGTGTGTACAAGACCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGAT CCGCGATTACTAGCAATTCCGACTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCC TGCAATCCGAACTGAGACCGACTTTGATAGGATTGGCTCCACCTC GCGGTTTCGCTTCCCGTTGTATCGGCCATTGTAGTACGTGTGTAG CCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTC CTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCATCCTAAAGTGCCCACCCAAAGT GCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGC 16S rrna % identity Paenibacillus agaridevorans 균의 16S rrna gene과 88% 부분에서 95% 동일함을보임

371 (Continue) Strain No. 16S rrna Sequence 16S rrna % identity C15 CGTCCTCTCTTGGTATCGCCCTCCTTGCGGTTAGGCTAACTACTT CTGGCAAAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGA CCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGC GATTCCAGCTTCACGTAGTCGAGTTGCAGACTACGATCCGGACTA CGATGCGTTTTCTGGGATTGGCTCCCCCTCGCGGGTTGGCAACCCT CTGTACGCACCATTGTATGACGTGTGAAGCCCTACCCATAAGGGC CATGAGGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGG CAGTCTCTCTAGAGTGCCCTTTCGTAGCAACTAGAGACAAGGGTT GCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGA CGACAGCCATGCAGCACCTGTGTCCACTTTCCCTTTCGGGCAcCTA ATGCATCTCTGCTTCGTTAGTGGCATGTCAAaGRGTAGGTAAGGt TTTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCACATCATCCACCGCTTGTGC GGGTCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAATCTTGCGACCGTACTC CCCAGGCGGTCAACTTCACGCGtTAGCTACGTTACTGAAGAAATG AATCCCCAACAACTAGTTGACATCGTTTAGGGCGTGGACTACCAG GGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGTGCATGAGCGTC AGTAACGTCCCAGGGGGCTGCCTTCGCCATCGGTATTCCTCCACA TCTCTACGCATTTCACTGCTACACGTGGAATTCTACCCCCCTCTG ACATACTCTAGCCTGACAGTCACAAGCGCCATTCCCAAGTTAAGC TCGGGGATTTCACGCCTGTCTTATCAAaCCGCCYGCGCACGCTTTA CGCCCAGTAATTCCGAtTAACGCTCGCACCCTACGTATTACCGCGG CTGCTGGCACGTAGTtAGCCgGTGCTTATTCTTCCGGTACCGTCAT CCCCCCACCGTATTAGGGCGAAGGTTTTCTTTCCGGACAAAAGTG CTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCACACACGCGGCATTGCTGGAT CAGGGTTGCCCCCATTGTCCAAAATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTA GGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCTGATCGTCCTCT CAGACCAGCTACTGATCGTCGCCTTGGTAGGCTTTTACCCCACCA ACTAGCTAATCAGACATCGGCCGCTCCTGTCGCGCGAGGCCTTAC GGTCCCCCGCTTTCACCCTCAGGTCGTATGCGGTATTAGCTAATC TTTCGACTAGTTATCCCCCACGACAGGGCACGTTCCGATGTATTA CTCACCCGTTCGCCACTCGCCACCAGGCCGAAGCCCGTGCTGCCGT TCGACTGCATGTTAAGACGAAGCTAAGAATVT Ralstonia sp. c308 균의 16S rrna gene과 97% 부분에서 99% 동일함을 보임

372 (Continue) Strain No. 16S rrna Sequence 16S rrna % identity C16 CGTACTGTGCTAGTACCGTCCCCACCGCAAAGATTAGACTACGTC TACTTCTGGTGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTA CAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGACATTCTGATTCGCGATTA CTAGCGATTCCGACTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCG GACTACGATCGGTTTTATGGGATTAGCTCCACCTCGCGGCTTGGC AACCCTCTGTACCGACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGCCGT AAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTG TCACCGGCAGTCTCCTTAGAGTGCCCACCATAACGTGCTGGTAAC TAAGGACAAGGGTTGCGCTCGTTACGGGACTTAACCCAACATCTC ACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCAAtGCTCC CGAAGGCACCAaTCCATCTCTGGAAAGtTCATTGGATGTCARGSCC TgGGTAAGGTTCTTCGCGTYGCTtCRAATTAAACCACATGCTCcAC cgsttgtgcgggcccccgtyaattcatttgagtttwaaccttgcgg CCGTACTCCCCAGGCGGTCAACTTAaTGcGTTAGCTGCGcCCACTA AGAGCTCAAGGCTCCCAAMGGSTAGTTGACATCGTTtASGGCGTG GACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTtCGCAC CTCAGTGTCAGTATCAGTcCCAGGTGGTCGCCTTCGCCACTGGTGT TCCTTcCCTATATCTACGCATTTCACCGCTACACAGGAAATTCCA CCACCCTCTACCATACTCTAGCTTGTCAGTTTTGAATGCAGTTCC CAGgTTGAGCCCGGGGCTTTCACATCCAACTTAACAAACCACCTA CGCGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCtTGCACCCTCTG TATTACCGCGGCTGCTGGCACAGAGTTAGCCGGTGCTTATTCTGT CGGTAACGTCAAAATTGCAGAGTATTAATCTACAACCCTTCCTCC CAACTTAAAGTGCTTTACAATCCGAAGACCTTCTTCACACACGCG GCATGGCTGGATCAGGCTTTCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACT GCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGA CTGATCATCCTCTCAGACCAGTTACGGATCGTCGCCTTGGTGAGC CATTACCTCACCAACTAGCTAATCCGACCTAGGCTCATCTGATAG CGCAAGGCCCGAAGGTCCCCTGCTTTCTCCCGTAGGACGTTGCGGT ATTAGCGTTCCTTTCGAAACGTTGTCCCCCACTACCAGGCAGATT CCTAGGCATTACTCACCCGTCCGCCGCTGAATCAGAGAGCAAGCT GCGTCTCCATCGCGACTCGACTAGCATGAGTACTGCCTAGCGCCCC CCCG Pseudomonas putida strain PC16 균의 16S ribosomal RNA gene과 93% 부분에서 98% 동일함을보임

( 나) Genomic DNA 분리결과 황칠수액의분비가가장활발한 Site C에서 1차년도에분리된균주들의 Genomic DNA 를분리하였다. C site 12종분리균주의 genomic DNA는 PuregeneTM DNA Isolation kit 을사용하여분리하였다.

373 ( 나) Genomic DNA 분리결과 황칠수액의분비가가장활발한 Site C에서 1차년도에분리된균주들의 Genomic DNA 를분리하였다. C site 12종분리균주의 genomic DNA는 PuregeneTM DNA Isolation kit 을사용하여분리하였다. 분리된 DNA는 37 에서 충분히건조시킨후멸균된 3차증류수 100μl에녹여전기영동하여 DNA를확인 하였고 -20 에보관하면서사용하였다. 시간대별로균주를키워 genomic DNA를분리한후그결과를확인해본결과 전체적으로 10kb 이상의밴드패턴을보였다. 24시간이후에서는균주들이사멸기 에접어들어서분리된균주에서 genomic DNA 를분리하기가어려웠다( 그림 3-32). 그림 Pattern of genomic DNA of isolated strain from a wild Dendropanax morbifera community(site C); Lane M, 1 kb ladder marker; Lane 1, C-1; Lane 2, C-2; Lane 3, C-3; Lane 4, C-4; Lane 5, C-5; Lane 6 C-6; Lane 7, C-8; Lane 8, C-9; Lane 9, C-10; Lane 10, C-11; Lane 11, C-12; Lane 12, C - 13; Lane 13, C-18; Lane 14, C

374 ( 다) ipdc 및 P450-Ⅱ 유전자의 PCR 결과황칠나무의수액은외상에의하여자극을받으면분비되는항균성물질인것으 로보고되었다(Choi, 2003). 황칠수액의장점등은오래전부터효능이입증되었으 며대량화재배를위한여러가지연구도이미수행되고있다. 본연구에서는이미 알려진황칠나무의재배조건외에황칠의생장및수액생산을향상시키는근권미 생물과의협력관계를규명하여황칠나무의성장및수액분비증가에도움이되는 요소를규명하고자이미 1차년에분리된 C site의토양미생물 12종의유전자로부터 옥신또는지베렐린의생산에영향을미치는유전자탐색실험을실시하였다. 우선 1차년도연구에서황칠나무가자생하고있는군락중황칠수액의분비가 가장많은 site C 의토양에서분리된토양미생물 12종은 16S rrna 분석을통한 동정결과 Bacillus 속 5 종, Paenibacillus속 4 종, Pseudomonas속 2 종, Ralstonia속 1 종으로확인되었다. 따라서금번 3차년에는이들균주에서식물성장호르몬과 연관된유전자의존재유무를확인하기위하여분리균주의 Genomic DNA를분리 하고옥신연관유전자인 ipdc 유전자와지베렐린연관유전자인 P450-Ⅱ 유전자 의염기서열을근거로특이적 primer를합성하고 PCR 을수행하였다. ipdc 유전자는 Azospirillum brasilense의유전자중옥신분비를촉진하는 Indole-3-Pyruvate Decarboxylase를코딩하고있는유전자이며 P450-Ⅱ 유전자는 Gibberella fujikuroi의지베렐린생합성유전자의일부분으로알려져있다. Azospirillum spp에의해분비된옥신은작물뿌리를자극하여작물생장을향상시 키는것으로알려지고있다. 또한옥신은작물의생장뿐만아니라식물체내에옥 신의증가는 Ca+의축적을유발하고뿌리에서는이를감지하고물과양분을지상부 로올려보내수액의생산에영향을주는것으로추측되고있다(Zimmer, 1998). 지 베렐린(gibberellin) 은개화촉진작용, 착과( 着果 ) 의증가작용, 열매의생장촉진작용, 종자발아촉진과신장촉진작용등이있는데이것은식물의초기생장을촉진시키지만 계속해서지베렐린이존재하면나무의수세가급격히저하되고양분의불균형상태 가생겨서나무가쉽게노화되어병해충에대한저항력도떨어진다. 따라서지베렐 린분비를촉진시키는균류를파악하여제거함으로써식물체가웃자라는것을미 연에방지할수있다. 따라서 3차년도본연구에서는이미연구가진행된상기 ipdc 유전자와 P450-Ⅱ 유전자의염기서열을근거로한 Primer를제작하여 1차년에분리한 C site 12종토

375 양미생물의 Genomic DNA를주형으로 PCR을실시하여황칠수액의분비가많은 황칠나무의뿌리에서채취된토양미생물이황칠나무의성장과황칠수액분비를촉 진하는유전자를함유하고있는지여부를실험하였다. 그결과분리균주 C-8과 C-10 에서 Azospirillum brasilense의유전자중옥신 분비를촉진하는 Indole-3-Pyruvate Decarboxylase를코딩하고있는유전자 ipdc 유전자인 1Kb 크기의 PCR Product를확인하였으나 Gibberella fujikuroi의지베렐 린생합성유전자인 P450- Ⅱ 유전자는확인할수가없었다( 그림 3-33). 따라서차후분리균주 C-8과 C-10에대한보다심도있는연구가진행된다면이 들균주를이용하여황칠나무의생장과수액분비증가에도움이되는연구결과가 도출될것으로기대된다. 그림 The PCR products of ipdc gene from genomic DNA of isolated strain. PCR performed to 3 steps(94 5min 1cycle, 94 30sec, sec, 72 1min 30cycles, 72 5min 1cycle, 4 fixed) Lane M, 1 kb ladder marker; Lane 7, PCR Product of ipdc gene, C-8; Lane 9, PCR Product of ipdc gene, C

376 본연구는황칠나무의황칠생산량을파악하고황칠나무의뿌리에존재하는토 양미생물과의상호관계를규명하기위해이미연구가되어진 Azospirillum brasilense 의유전자중옥신분비를촉진하는 Indole-3-Pyruvate Decarboxylase를 코딩하고있는 ipdc 유전자와 Gibberella fujikuroi 의지베렐린생합성유전자의일 부분인 P450-Ⅱ 유전자을근거로하여 Primer를제작하였고황칠나무의토양에 존재하는근권미생물의 Genomic DNA를주형으로 PCR 을실시하였다. 식물체에 기여하는세균인 PGPB(Plant growth promoting bacteria) 를구분하고그유전자를 활용하여친환경적으로식물체를조절하여그부산물을산업적으로활용하는것을 목표로하였다. 분리된균은각각 NB 와 LB 액체배지및고체배지를이용하여 18-20시간배양 하고 genomic DNA 를분리하였다. Genomic DNA상에목표로하는유전자의존재 유무를확인하기위해이미연구되어진식물호르몬생산과연관이있는유전자를 근거로하여 primer를제작하고 PCR 을수행하였다. 분리된균주중 C-8과 C-10에 서옥신의생산과관련된 ipdc 유전자의 PCR 산물이나왔지만지베렐린과연관된 p450-Ⅱ 유전자의 PCR 산물은발견할수없었다. 분리균주들은일반적으로실험실에서사용되는 LB 배지나 NB 배지에서배양되 긴하지만일정시간(24 시간이상) 이지나게되면더이상성장하지않거나오히려 그수가줄어드는현상을보였다. 따라서실험실에서대량배양을하기위해서는 분리균주에대한배양배지및조건들의개선이필요하다고생각한다. 황칠수액생산증가에미치는영향을확인하기위해서분리균주 C-8과 C-10의 토양에서의적절한생장조건을찾아야할것이고, C-8과 C-10을직접토양에접종 하고수액을채취를통한황칠나무에미치는효과의확인이필요하다. 또한 cloning 과형질전환(transformation) 을통한 ipdc 유전자를제거한재조합분리균주 C-8과 C-10 의토양접종에따른황칠나무에미치는효과의확인도차후진행되 어야할것으로사료된다

377 제 5 절인체를대상으로한황칠수액의피부미백효과및 항노화효과에대한연구( 제 4 세부연구과제) 1. 1 차년도연구결과보고서 가. 연구개발목표 1 차 연도 황칠수액피부미백효과에대한연구 나. 연구개발수행내용 - human volunteer 를대상으로황칠수액도포후피부탄력성의개선정도를 reviscometer 를이용피부점성탄력도를측정하여판정 - human volunteer를대상으로황칠수액도포후 corenroemter와 tewameter를 이용하여피부장벽기능의개선정도를도포전과비교하여판정 * 피부각질층수분보유도측정 * TEWL( 경표피수분증발량) 측정 다. 황칠수액피부미백효과에대한연구 - 피부는표피와진피층으로구분되어있으며피부색의밝고어두움은주로표피 층과상부진피의변화에기인한다. 표피층을구성하고있는세포는각질형성세 포와멜라닌형성세포가주를이루고있는데그중멜라닌형성세포에서만드 는멜라닌이란색소가사람의피부색을결정하며기미나주근깨같은색소성질 환의원인이된다. 멜라닌은멜라닌형성세포에서만들어져서각질형성세포에전 달되어멜라닌소체의형태로존재한다. 인종에따른피부색의차이는멜라닌세 포의많고적음이아니라멜라닌소체의크기와수에따라결정된다. - 멜라닌외에피부의밝고어두움을결정하는중요한요소로각질층을들수가

378 있는데각질층은각질형성세포의마지막분화단계로서피부의수분증발을막 고외부물질의침투를막는방어막역할을하게된다. 이각질층이외부환경과 접하면서주위의분진이나피부에서분비되는피지와반응하여착색이되면서 피부가어둡거나건강하지못하게보이는원인이될수있다. 또한병적인조건 즉기미나주근깨같은색소성질환에서는표피혹은진피내에멜라닌이과다 생성되어피부색을검게만든다. - 따라서기능성미백소재의개발은주로멜라닌생성의억제, 각질층용해에맞 추어져발전해왔다. 그중멜라닌생성의마지막단계에효소로작용하는타이로 시나제를억제하는 arbutin이나 kojic acid등이대표적이며 α-hydroxi acid(aha) 계열에속하는여러각질용해제가미백치료에이용되고있다. 그외멜라닌색 소에작용하는 IPL(Intensive Pulsed Light), Q-switched Nd-YAG laser 같은 장비들을이용하여색소성병변의치료에이용하고있다. 연구자는황칠수액의멜라닌생성억제작용에주목하여사람의피부에서미백 작용의효과를평가하고자실험을수행하였다. (1) 각대상자에서의최소홍반량(MED: minimal eythema dose) 측정 - 태양광선과유사한파장을방출하는 Solar simulator(oriel Co, Stratford, USA) 를 이용하여자원자의배부에태양광유사광선을조사하여 24시간후대상자의최 소홍반량(Minimal erythema dose) 을결정한다( 그림 4-1). - 최소홍반량은개인의자외선에대한과민반응을예측하는수치로최소홍반량이 낮을수록일광화상을쉽게입고피부가하얀경향을띠며최소홍반량이높으면 일반적으로일광화상을잘입지않으며피부가검은경향을띤다고한다. 또한 최소홍반량이높은사람들은자외선에의한피부암발생율이적고최소홍반량 이낮은사람들은쉽게일광화상을입으며악성흑색종같은피부암발생율이높 은특성이있다. - 본실험에서개인의최소홍반량을측정하는이유는일반적으로최소홍반량의 2-3 배정도의광량이색소침착을유발하기에가장적당하기때문이다

379 그림 4-1. Determination of Minimal Erythema Dose(MED) on back. (2) 색소침착유발 - 자외선에의한색소침착반응은주로 UVA(ultraviolet A) 와 UVB(ultraviolet B) 에의해일어나며일주일에극대화되어서개인차에따라수개월이지나야정상으로돌아오는것으로알려져있다. - 미백제품을인체에적용할경우색소침착이심하지않은정상피부의경우그차 이를감별해내기가힘들며색소성질환이있는환자를대상으로할경우에도색 소침착이평균적으로고르게분포되어있고대칭이되는병변을발견해내기가 힘들기때문에인위적으로색소침착을유발한후효과를판정하는방식이가장 타당하다고할수있다. - 각대상자의상완안쪽에전날측정한 MED( 최소홍반량) 의 2.5배의광량을조사 하여인위적색소침착을유발한다. 고르게색소침착이일어난부위를반으로나 누어활성물질과대조군을나누어도포한후평가한다( 그림 4-2)

그림 4-2. Pigment induction after 7 days of irradiation. (3) 황칠수액의미백효과판정 각대상자의상완에유발된인위적색소침착부위에각각황칠수액과대조군이 되는 vehicle을도포하고 1 일, 1 주, 3 주, 8주에미백개선효과를 colorimeter와 spectrophotometer 를이용하여피부색을측정하여비교한다.

380 그림 4-2. Pigment induction after 7 days of irradiation. (3) 황칠수액의미백효과판정 각대상자의상완에유발된인위적색소침착부위에각각황칠수액과대조군이 되는 vehicle을도포하고 1 일, 1 주, 3 주, 8주에미백개선효과를 colorimeter와 spectrophotometer 를이용하여피부색을측정하여비교한다. ( 가) Colorimeter 측정 - 피부에서반사된가시광선영역( nm) 의빛을감지기를통해측정하여물 리적수치로환산하는기능을가지는 Colorimeter CM-2600d(Minolta Co, Osaka, Japan) 를이용하여 L*, a*, b* 값을측정한다. 측정된수치는 L*, a*, b* 값 으로표시하는데, L* 값은흰색을 100, 검은색을 0으로기준하여피부의명암의 정도를상대적으로나타낸수치이다. a* 값은빨강색은양의값, 녹색은음의값 을띠게되고 b* 값의경우노랑색은양의값, 파랑색은음의값을나타내게되며 각각의정도를수치로표시한것이다. - 피부의밝고어두움을표시하는 L* 값과노란색의정도를나타내는 b* 값을이용 하여이차원평면에도시하여각대상인에서 ITA (Individual Typology Angle) 를다음의공식을이용하여구한다. ITA = [arc tangent (L-50)/b] x 180/π

381 ITA는 L* 값을세로축, b* 값을가로축으로한 2차원적인평면에측정한수치를 점으로찍었을때그점이가로축과이루는각이다. 따라서피부가검을수록그각 은작아지고하얄수록각은커진다. 또한 ITA를이용해피부색에따라피부형을구 분할수있는데 Chardon 등이분류한기준에따르면다음과같다( 그림 4-3). very light > 55 > light > 41 > intermediate > 28 > tan > 10 > brown - ITA 를이용하여측정한피부색은단순한피부의밝고어두움을측정하는것이 아니라갈색의정도와피부의명암을이차원적으로종합적으로고려한수치로서 보다육안에가깝게피부색을평가할수있다는장점이있다. 그림 4-3. Determination of Individual Typology Angle(ITA) using L* and b* value. - 광조사를한부위는색소침착이증가하여색소침착이최대가되는광조사 7일 후 ITA 값이최저를보였으며이후시간이지남에따라색소침착이호전되어 ITA 값도증가하는양상을나타내었고측정 8주차까지정상으로회복되지는

382 않았다. 또한피부형은초기에 intermediate type에서광조사결과 tan type으로 검어졌다회복되는양상을보였다. - 황칠수액을도포한부위는 ITA값이 vehicle을도포한부위보다모든측정일에서 높은수치를나타내었으며그중측정 ( 표 4-1, 그림 4-3). 1, 7, 21일값은통계적유의성이있었다 - 이는황칠수액을도포한쪽의피부색이 vehicle을도포한쪽보다더밝음을의미 한다. 특히광조사 1일후부터색소침착의정도가황칠수액을도포한부위에서 대조군보다덜하였으며이는황칠수액이자외선에의한색소침착을초기단계부 터예방하는효과가있음을알수있다. 자외선조사초기에색소침착을억제하 는황칠수액의성질을응용하면현재널리사용되고있는기능성화장품인자외선차단제에포함시킬경우자외선차단지수를높여줄가능성을보여준다. (** P<0 01, Paired T test). - 색소침착이없는정상피부에서는황칠수액을도포한쪽과 vehicle을도포한부위 의차이를발견할수는없었다. 이는어느정도예상된결과로서색소침착이없 는정상피부의미백효과는그차이가너무작아서측정기기의오차범위내에포함될수있으며또한주변환경에의한요인에너무영향을많이받고또장기간의도포가필요한경우도있기때문에본실험에서는이를극복하고자인위적인색소침착을유도하여그효과를판정하였다. 표 4-1. The change of ITA measured on UV induced pigmentation Site 1 ( 광조사+vehicle 도포) Site 2 ( 광조사+ 황칠추출액도포) Site 3 (vehicle 도포) Site 4 ( 황칠추출액도포) Site 5 (Control) ITA (Mean±SD) Day 0 Day 1 Day 7 Day 21 Day ± ± ± ± ± ± ±7.76** 20.40±9.61 ** 24.18±4.27 ** 36.11± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±13.02 * P<0.05 was considered statistically significant ** P<0.01 was considered statistically significant

383 Site 1 : 광조사 + vehicle 도포 Site 2 : 광조사 + 황칠나 무수액도포 Site 3 : vehicle 도포 Site 4 : 황칠나무수액 Site 5 : Control 그림 4-4. The change of ITA measured on UV induced pigmentation. ( 나) Spectrophotometer에의한홍반지수와색소지수측정 - narrow-band spectrophotometer의일종인 mexameter를이용하여피부에서반사 되는 568nm, 660nm, 880nm 빛의강도를계산하여색소지수(melanin index) 와 홍반지수(erythema index) 를산출하였다. melanin index는피부가갈색을띄면 띌수록수치가증가하며 erythema index는피부가붉어지면붉어질수록수치가 증가하는특성을보인다. - 색소지수(Melanin index) 는색소침착이최대가되는광조사 7일째에최저값을 나타내었으며이후점차회복되는양상을나타내었으나측정 으로회복되지는않았다. 8주차까지정상값 - 색소침착유도후황칠수액을도포한쪽과 vehicle을도포한부위의색소지수의 변화는측정 7일차부터통계적유의성을나타내었으며 8주차까지황칠수액을 도포한쪽의색소지수측정치가낮았다( 표 4-2. 그림 4-5).. - 홍반지수(Erythema index) 는홍반이최대가되는광조사 24시간째최대값을보

384 였으며이후점차회복되는양상을나타내었으나측정 8주차까지정상값으로 회복되지는않았다. - 황칠수액을도포한쪽과 vehicle을도포한부위의홍반지수의변화는측정 7일 에만통계적유의성을나타내었으며그외의측정치는유의성이없었다표 4-3, 그림 4-6). - 결론적으로자외선조사이후황칠추출액도포부위에서대조군인 vehicle을도포 한쪽보다색소지수와홍반지수의유의한감소를보였다 ( 표 4-2, 3, 그림 4-5, 6) (** P<0 01, Paired T test). 색소지수는광조사 1주일뒤부터 8주까지황칠 추출액도포부위에서통계적으로유의한감소를보였으며홍반지수는측정일주 일째에서만통계적유의성을보였다. - 결론적으로색소지수는 colorimeter로측정한결과와유사성을보였으나홍반지수 의경우는일주일째에서만효과가있었다. 따라서황칠추출액은자외선에의한 피부염증반응으로인한색소침착및홍반반응에있어서홍반의감소보다는 색소침착을예방하는데더효과가있음을의미한다할수있다. 특이한사실은 측정 1주차에홍반반응의유의한감소를가져왔으나좀더대규모의대상자를 이용한검증이필요하며이런결과들이사실이라면자외선에의한미백효과뿐 만아니라급성일광화상반응의완화에도이용할수있을것이다. 표 4-2. The change of Melanin index on UV-induced pigmentation Site 1 ( 광조사+vehicle 도포) Site 2 ( 광조사+ 황칠추출액도포) Site 3 (vehicle 도포) Site 4 ( 황칠추출액도포) Site 5 (Control) Melanin Index (Mean±SD) Day 0 Day 1 Day 7 Day 21 Day ± ± ± ± ± ± ± ±59.27 ** ±84.56 ** ±85.33 ** ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±93.67 * P<0.05 was considered statistically significant ** P<0.01 was considered statistically significant

385 그림 4-5. The change of melanin index measured on UV induced pigmentation. 표 4-3. The change of Erythema index measured on UV-induced pigmentation Site 1 ( 광조사+vehicle 도포) Site 2 ( 광조사+ 황칠추출액도포) Site 3 (vehicle 도포) Site 4 ( 황칠추출액도포) Site 5 (Control) Erythema Index (Mean±SD) Day 0 Day 1 Day 7 Day 21 Day ± ± ± ± ± ± ± ± * ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±34.88 * P<0.05 was considered statistically significant ** P<0.01 was considered statistically significant

386 그림 4-6. The change of Erythema index measured on UV induced pigmentation

387 2. 2 차년도연구결과보고서 가. 연구개발목표 2 차 연도 human volunteer 를대상으로황칠수액의항노화효과판정 나. 연구개발수행내용 - Human volunteer를대상으로황칠수액도포후 reviscometer로 피부점성탄력도를측정하여피부탄력성개선정도판정 - human volunteer를대상으로황칠수액도포후 corneomter와 tewameter 를이용, 피부장벽기능개선정도판정 * 피부각질층수분함량, TEWL( 경표피수분증발량) 측정 - human volunteer 를대상으로황칠수액의첩포검사를시행최소자극농도및 접촉감작성에대한안전성확보 다. 황칠수액의항노화효과에대한연구 - 황칠수액의피부항노화효과에관한연구를위하여황칠수액도포시피부탄력 성과피부장벽기능의개선여부를판정하였다. 피부노화의증상은일반적으로 피부탄력성이떨어지면서주름이만들어지고피부내의수분함량이줄어들며 더불어피부를통한경피수분손실량이증가하는특징이있다. 노인의피부를 보면주름살과같이피부의수분함량이줄면서건조해보이며경피수분손실 량증가로인해가려움증과함께각질이일어나는건성습진이잘발생하는특징 이있다. - 피부의노화현상은크게내인성노화와외인성노화로나눌수있다. 내인성노 화는다른말로생리적노화현상이라고도부르며우리몸은유전자에의해일 정한수이상의세포분열을하면더이상세포가증식하지못하고세포고사에 빠지게되는데이를내인성노화라한다. 외인성노화는자연법칙에의해정해져

388 있는노화현상외에주변환경물질들에의해서노화가촉진되는현상을말하는 데피부에서는자외선에의해노화현상이촉진되는광노화현상을들수있겠다. 비근한예로일생동안야외에서일한 60대농부의얼굴과실내에서근무하는 60 대사무직직원의얼굴차이를보면광노화현상을미루어짐작할수있다. 자연 성노화와광노화의외견상의차이는자연성노화의경우미세한잔주름이생기 는반면광노화는굵고거친주름을만드는특징이있다. 피부의노화현상은나 이가들어가면서자연적으로피하조직을구성하는콜라겐, 엘라스틴같은피부 탄력물질의양이줄어들면서피부의탄력성이떨어지고주름이생기게되는현 상을말하는데여기에자외선에의한광노화현상이겹치게되면노화의정도는 더욱심해지게된다. - 피부탄력성의저하는노화로인하여피부의탄력성분을구성하는콜라겐이나엘 라스틴같은피부탄력물질의양이줄어드는내인성노화와더불어자외선같은 외부인자로인하여콜라겐이나엘라스틴의분해가촉진되게되는광노화같은 외인성노화가복합적으로작용하여일어난다. 또한피부의피지분비가줄며각 질층의세포증식능력도떨어지게되어피부장벽기능의저하도초래되게된다. 따 라서피부노화방지기능성물질은줄어드는표피나진피조직의분화재생을 촉진하거나, 콜라겐이나엘라스틴같은피부탄력물질의양을조절하거나활성 산소를제거하는기전을가지는물질을개발하는쪽으로진행되어왔으며최근 에는피부의수분함량을증가시키기위한피부노화방지에유의한것으로알 려져있다. - 그외피부의노화현상에영향을주는인자로서피부장벽기능을들수있다. 우 리피부는수분함량이높을수록탄력성이높아지게되는데나이가들어갈수록 피부수순함량이줄어들면서건조해지고거칠어지는현상이발생한다. 우리피 부의수분증발을막고또한외부물질의피부침투를막는기능을피부장벽기능 이라고부르는데이는피부각질층과피부에서분비되는지질막이자연스럽게 어울러져형성하는기능이다. 피부가노화가될수록피부장벽기능이떨어지게되 고이에따라피부수분량이감소하면서피부탄력성이더떨어지게되는것이다. 피부장벽기능을가장잘측정할수있는방법은표피수분량과경표피수분손실량을측정하는것이다. - 본연구에서는황칠수액도포후피부의주름형성과유의하게관련있는피부탄

389 력도와경피수분함유량, 경표피수분손실량의변화를관찰하였다. (1) 황칠수액의피부탄력성개선에관한연구 - 자원자를대상으로황칠수액도포전, 1 일후, 1 주, 3 주, 8주에피부탄력성의변화 정도를 reviscometry 기법을이용하여측정하였다. reviscometry 기법은 reviscometer를이용하여피부에 acoustic wave를발사하여일정 sensor에도달 하는시간을측정한후그시간차이를이용하여 acoustic wave가지나가는매 질의탄성정도를측정하는방법이다. reviscometry는그수치가클수록탄력성이저하되었다는것을의미하며피부노화의가장큰증상의하나인탄력성의변화를측정하는데가장유용한방법이다. - 본실험에서광조사후초기에피부의탄력성이떨어졌다다시원상으로회복 되는경향을보여주었는데이는자외선에의한광노화현상이나자외선에의한염증반응에의한피부부종으로탄력성이떨어진것으로해석할수있겠다. - 광조사후피부탄력성의변화는측정 1일차에탄력성이최대로저하되었는데이 는자외선에의한염증반응이광조사 24시간째에최대로됨을의미하며저하된 피부의탄력도는측정 2 달째까지정상으로회복되지는않았다. - 황칠나무추출액은정상적인피부에도포했을시에는 vehicle과비교하여피부 탄력성에는통계적으로유의한개선효과를나타내지는않았다. 이런결과는 8주 간의도포기간이통계적인차이를발생시키기엔충분하지않았을가능성이있고 정상인의피부에도포했을시에는개선효과가미미하여그차이를감지하기가 어려웠을수있다. 하지만자외선조사로피부탄력성을크게저하시킨후도포 했을시에는자외선에의한피부탄력성의저하를개선시키는효과가있었으며 이는측정 1, 7, 21 일째까지통계적유의성을보였다( 표 4-4, 그림 4-7)(* P<0 05; ** P<0 01, Paired T test)

390 표 4-4. The change of skin elasticity measured by reviscometer Reviscometer (Mean±SD) Day 0 Day 1 Day 7 Day 21 Day 56 Site 1 ( 광조사+vehicle 도포) ± ± ± ± ±66.45 Site 2 ( 광조사+ 황칠추출액도포 ) ± ±85.49* ±91.76 ** ± ** ±87.37 Site 3 (vehicle 도포) ± ± ± ± ±90.22 Site 4 ( 황칠나무추출액도포) ± ± ± ± ±69.33 Site 5 (Control) ± ± ± ± ±78.99 * P<0.05 was considered statistically significant ** P<0.01 was considered statistically significant Site 1 : 광조사 + vehicle 도포 Site 2 : 광조사 + 황칠나무수액도포 Site 3 : vehicle 도포 Site 4 : 황칠나무수액도포 Site 5 : Control 그림 4-7. The change of skin elasticity measured by reviscometer

391 (2) 황칠수액의피부장벽기능개선에관한연구 피부는각질층에수분을함유하고있으며피부내의수분이외부로증발하지않 도록방어하는기능을가지고있다. 이렇게인체내의수분증발을막고피부각질 층이수분을함유하도록하는기능을우리는피부장벽기능이라고한다. 피부장벽 기능은피부탄력성을유지하는데매우중요한요소인피부의수분함량을증가시 키며피부장벽기능이파괴되었을경우엔피부건조현상으로인하여아토피성피 부염, 건선, 피부건조증의유발및악화요인이되고또한외부물질이피부로쉽게 침투하여피부감염이나접촉피부염이발생하기도한다. 뿐만아니라피부장벽기 능이파괴되어피부의수분함량이떨어지면피부의탄력성이떨어지고잔주름이 증가하여피부노화의주요원인으로작용하기도한다. 자원자를대상으로황칠수액도포전, 1 일후, 1 주, 3 주, 8주에피부장벽기능의 개선정도를피부각질층의수분함량을나타내는 Corneometer와경표피수분증발량 (transepidermal water loss, TEWL) 을측정할수있는 TEWA meter를이용하여 계측하였다. ( 가) Corneometer - Corneometer 는접촉부위의절연계수변화에영향을받는장치로서피부에서가 장높은절연계수를갖는수분함량에따른정전용량을측정함으로써수분함량 의상대적크기를나타내는장치이다. 이를이용하여주로피부의수분함유량을 측정하게되는데주로각질층의수분함량을반영한다고할수있다. - 피부의수분보유도는보통피부표면에접촉하는 probe를통해전달되는미미한 전류의정전부하용량계측을통해이루어진다. 수분의함량과정전부하용량은서 로비례하는경향이있어피부의보습도가높을수록측정되는수치가높아진다. - Corneometer 를이용하여각질층내수분함유량의변화를측정한다 ( 나) TEWAmeter - evaprimeter 라고도하며피부표면과주변공기사이의수분증기경사도를감지 하여표피에서의수분증발을측정하는기구이다. - 피부장벽이손상되면피부의각질층이수분을간직하지못하므로각질층수분이 증발하게된다. 이증발량을측정하는경표피수분증발량(transepidermal water

392 loss, TEWL) 은피부장벽기능의손상정도를평가하는중요한생리학적지표가된 다. - TEWAmeter를이용하여 TEWL 을측정한다. - corneometer로측정한피부수분함유량의변화는광조사 24시간후최저치가되 었으며그이후점차회복되어측정 8 주차에는거의정상으로회복되었다. - 황칠수액을도포한쪽과 vehicle을도포한부위의각질층수분함유량의변화는 광조사후 1일차부터통계적유의성을나타내어 3주차까지황칠수액을도포한 쪽의각질층수분함유량이높았다.( 표 4-5, 그림 4-8). - 광조사를하지않은정상피부의경우황칠나무추출액과 vehicle 사이에피부수 분함유량변화에있어서통계적유의성은관찰되지않았다. 이는황칠나무수액 이정상인피부보다는여러가지염증반응이나외부적인자로인하여피부장벽기 능이손상될경우피부수분함유량을증가시키는효과가대조군으로도포한기 제보다우월함을의미한다. - 피부장벽기능의손상정도를반영하는경표피수분손실량(TEWL) 은 corneometer의결과와마찬가지로광조사후 1일째에최대의수분손실량을나타 내었으며그이후점차회복되어측정 3 주차에는정상으로회복되었다. 이는자외 선으로인한피부장벽기능의손상이광조사후 1일차에최대가되며이때수분 손실량이최대가됨을의미한다. - 황칠수액을도포한쪽과 vehicle을도포한부위의경표피수분손실량의차이는 광조사후 1일차부터통계적유의성을나타내어 1주차까지황칠수액을도포한 쪽의경표피수분손실량이적었다.( 표 4-6, 그림 4-9). 하지만광조사를하지않 은정상피부의경우황칠나무추출액과 vehicle 사이에경표피수분손실량의차 이에있어서통계적유의성은관찰되지않았다. 이는황칠나무수액이정상인피 부보다는여러가지염증반응이나외부적인자로인하여피부장벽기능이손상될 경우피부수분증발을방지함으로써피부장벽기능을회복시키는효과가있음을 의미한다. - 종합적으로이런결과는 인위적으로피부장벽기능이파괴된경우즉일광화상 이나아토피, 건성습진같은병적인이상을가진피부에황칠추출액을도포함으로 써피부의충분한보습효과를줄수있으며더이상의피부수분손실을막을수 있다는것을의미한다

393 - 결론적으로황칠수액은대조군에비하여자외선으로인해장벽기능이손상된피 부에수분함량을증가시키고경표피수분손실량을감소시킴으로써피부장벽기 능의개선효과를나타내었다. 이런결과는아토피피부염이나건선, 피부건조증 같이병적으로피부장벽기능이저하된상황에서도개선효과를가져올수있다 는것을의미하며정상인피부에서도표피내수분함양저하로인한잔주름의개 선에효과가있음을의미한다고하겠다. 표 4-5. The change of water content of skin measured by corneometer Site 1 ( 광조사+vehicle 도포) Site 2 ( 광조사+ 황칠추출액도포) Site 3 (vehicle 도포) Site 4 ( 황칠추출액도포) Site 5 (Control) Corneometer (Mean±SD) Day 0 Day 1 Day 7 Day 21 Day ± ± ± ± ± ± ±17.38 ** 41.19±23.56 * 44.37±28.87 * 47.59± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±23.89 * P<0.05 was considered statistically significant ** P<0.01 was considered statistically significant 그림 4-8. The change of water content of skin measured by corneometer

394 표 4-6. The change of trans epidermal water loss measured by TEWA meter Site 1 ( 광조사+vehicle 도포) Site 2 ( 광조사+ 황칠추출액도포) Site 3 (vehicle 도포) Site 4 ( 황칠추출액도포) Site 5 (Control) TEWL (Mean±SD) Day 0 Day 1 Day 7 Day 21 Day ± ± ± ± ± ± ±12.65 ** 14.92±8.59 * 10.86± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±5.23 * P<0.05 was considered statistically significant ** P<0.01 was considered statistically significant 그림 4-9. The change of transepidermal water loss of skin measured by TEWA meter

395 3. 3 차년도연구결과보고서 가. 연구개발목표 3 차 황칠수액의피부항노화효과에대한연구 연도 황칠수액의피부자극성에대한안전성확보 나. 연구개발수행내용 - human volunteer 를대상으로황칠수액도포후피부탄력성의개선정도를 reviscometer 를이용피부점성탄력도를측정하여판정 - human volunteer를대상으로황칠수액도포후 corneomter와 tewameter를 이용하여피부장벽기능의개선정도를판정 * 피부각질층수분함유량측정 * TEWL( 경표피수분증발량) 측정 - human volunteer 를대상으로황칠수액의첩포검사를시행최소자극농도및 접촉감작성에대한안전성확보 다. 황칠수액의피부자극시험 (1) 개요 - 일반적으로피부에대한독성학적연구혹은안전성검사기법으로서자극반응의 판정기준은대부분국제접촉피부염학회 (ICDRG; International Contact Dermatitis Research Group) 이제시한주관적평점지표를원용하여사용하고있 다. - 화장품을사용하게되면흔한부작용중의하나가피부의자극반응과접촉피부염 의발생이다. 첩포검사는이의진단을위하여시행되기도하지만새로이생산되는 여러물질들의피부자극능력을검사하여자극능력이높은물질을제거하고자 극능력이낮은물질을생산하려는데목적이있다

396 - 첩포검사는피부에검사하고자하는물질을 48시간동안접촉시킨뒤피부의반 응을보는검사로가장널리쓰이는피부자극및알레르기판별검사법이다. 일 반적으로 1-5% 의농도에서검사를실시하며첩포제거후 48시간까지이상반 응을나타내지않으면음성으로판정할수있다. - 황칠수액의피부자극유발에대한안전성확보를위해유효농도의황칠수액을 사용하여첩포검사를실시하고, 식품의약품안전청 기능성화장품의유효성평가를 위한가이드라인 을참고하여평가하였다. (2) 첩포검사방법 황칠나무원액을바세린으로희석하여각각 1%, 2%, 5% 함량으로만들고, 피험 자의등부위에첩포를부착하여 48시간후제거하고제거당일과제거후 48시간에 피부과전문의가 International Contact Dermatitis Research Group(ICDRG) 가정한 기준에따라자극성유무를판정하였다( 표 4-7). 표 4-7. 첩포검사에대한 ICDRG 판정기준 - 음성 ± 미약한홍반성반 + 홍반성구진 ++ 홍반성구진및소수포 +++ 대수포 IR 자극반응 첩포는피검자의등부위에서 3 cm이상의거리를두고부착하였으며, 1%, 2%, 5% 함량으로직경 8mm의 Finn Chamber 와 Scanpore tape 를이용하여 48시간동안첩 포시험하였다

<1. control( 바세린), 2. 1% 희석, 2. 2% 희석, 3. 5% 희석> 그림 4-10. Patch test for excluding irritation reaction of the extracts of Dendrofanax morbifera.

397 <1. control( 바세린), 2. 1% 희석, 2. 2% 희석, 3. 5% 희석> 그림 Patch test for excluding irritation reaction of the extracts of Dendrofanax morbifera. (3) 첩포검사결과 첩포검사를시행하여 48 시간, 96시간후관찰한결과 International Contact Dermatitis Research Group(ICDRG) 가정한기준상자극성을보인경우나알레르기 성접촉피부염또는자극성접촉피부염이발생한사례도없었다. 또한환자가주 관적인소양증이나자극증상을호소한경우도없었으며세균감염의증상도관찰할 수없었다( 그림 4-11)

398 < 첩포후 48 시간경과> < 첩포후 96 시간경과> 그림 The results of patch test

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농림축산식품부장관귀하 본보고서를 미생물을활용한친환경작물보호제및비료의제형화와현장적용매뉴 얼개발 ( 개발기간 : ~ ) 과제의최종보고서로제출합니다 주관연구기관명 : 고려바이오주식회사 ( 대표자 ) 김영권 (

농림축산식품부장관귀하 본보고서를 미생물을활용한친환경작물보호제및비료의제형화와현장적용매뉴 얼개발 ( 개발기간 :2014. 7. 29 ~ 2016. 7. 28.) 과제의최종보고서로제출합니다. 2016. 7. 28. 주관연구기관명 : 고려바이오주식회사 ( 대표자 ) 김영권 ( 인 ) 협동연구기관명 : 목원대학교산학협력단 ( 대표자 ) 고대식 ( 인 ) 협동연구기관명