(52) CPC 특허분류 G01N 33/6893 ( ) C12Q 2600/156 ( ) G01N 2333/47 ( ) G01N 2800/2878 ( ) (72) 발명자 정기화 서울특별시성북구길음로 13 길 22, 702 동 1

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1 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) (45) 공고일자 2018년04월17일 (11) 등록번호 (24) 등록일자 2018년04월11일 (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) C12Q 1/68 ( ) C07K 14/47 ( ) G01N 33/68 ( ) (52) CPC 특허분류 C12Q 1/6883 ( ) C07K 14/47 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일자 2016 년 10 월 31 일 심사청구일자 (56) 선행기술조사문헌 2016 년 10 월 31 일 NKHRO, 'Study on the genomic causes of Charcot-Marie-Tooth peropheral neuropathy by whole exome sequencing', 박사학위논문, 공주대학교 (2014) (73) 특허권자 사회복지법인삼성생명공익재단 서울특별시용산구이태원로 55 길 48 ( 한남동 ) 공주대학교산학협력단 충청남도공주시공주대학로 56 ( 신관동 ) (72) 발명자 최병옥 서울특별시강남구선릉로 120, 10 동 1005 호 ( 대치동, 개포우성아파트 ) 홍영빈 서울특별시송파구새말로 62, 877 호 ( 문정동 ) ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 ( 뒷면에계속 ) 리앤목특허법인전체청구항수 : 총 17 항심사관 : 김승범 (54) 발명의명칭샤르코 - 마리 - 투스병제 1 형의원인유전자로서 PMP22 및이를이용한상기질병의진단방법 (57) 요약 PMP22 단백질변이체또는 PMP22 유전자변이체, 이들을특이적으로검출할수있는제제를포함하는샤르코 - 마리 - 투스병제 1 형을진단하기위한조성물또는키트, 및이를이용한상기질병의진단방법을제공한다. 상기변이체를이용한진단은유전성이강하면서도단일유전자결함에의해발병하는샤르코 - 마리 - 투스병에대하여유전자검사를통한정확한조기진단을가능하게하며, 그에따라최근개발되고있는치료방법을조기에적용하여치료효과를극대화할수있다. 대표도 - 도 1-1 -

2 (52) CPC 특허분류 G01N 33/6893 ( ) C12Q 2600/156 ( ) G01N 2333/47 ( ) G01N 2800/2878 ( ) (72) 발명자 정기화 서울특별시성북구길음로 13 길 22, 702 동 1704 호 ( 길음동, 길음 7 구역두산위브아파트 ) 남다은 충청북도청주시상당구호미로 317, 305 동 801 호 ( 용담동, 가좌마을부영그린타운 1 차 ) (56) 선행기술조사문헌 MOLECULES ND CELLS ( ) 39(5): 김성희, "PMP22 점돌연변이를가진 Dejerine-Sottas 증후군환자들의임상다양성과조직병리변화 ", 석사학위논문, 이화여자대학교 (2013) PLOS GENETICS ( ) 12(2):e Reference SNP (refsnp) Cluster Report: rs ( )* SN NEURO (2012) 4(5):art:e00101 THE MERICN JOURNL OF HUMN GENETICS (1999) 64: BRIN (1997) 120:47-63 * 는심사관에의하여인용된문헌 이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 부처명 연구관리전문기관 연구사업명 연구과제명 기여율 5/10 HI14C3484 보건복지부 연구중심병원사업 한국보건산업진흥원 중개연구를통한줄기세포의신경재생치료법개발 주관기관 삼성서울병원 연구기간 ~ 이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 부처명 연구관리전문기관 연구사업명 연구과제명 기여율 3/10 HI15C1560 보건복지부 한국보건산업진흥원 포스트게놈다부처유전체사업 선천성말초신경병의유전체 - 임상연계아시아협력연구 주관기관 삼성서울병원 연구기간 ~ 이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 부처명 연구관리전문기관 연구사업명 연구과제명 기여율 2/10 HI12C0135 보건복지부 한국보건산업진흥원 질환극복기술개발사업 신경계희귀질환환자중심형통합관리시스템구축 주관기관 공주대학교 연구기간 ~ 공지예외적용 : 있음 - 2 -

3 명세서청구범위청구항 1 삭제청구항 2 삭제청구항 3 삭제청구항 4 서열번호 1의아미노산서열에서 82번위치의류신 (L) 이프롤린 (P) 으로치환된아미노산서열로이루어진단백질, 또는서열번호 2의뉴클레오티드서열에서 245번위치의티민 (T) 이시토신 (C) 으로치환된뉴클레오티드서열로이루어진폴리뉴클레오티드를특이적으로검출할수있는제제를포함하는, 샤르코-마리-투스병제1형 (Charcot-Marie-Tooth disease type 1: CMT1) 의발병여부또는그발병의위험을진단하기위한조성물. 청구항 5 청구항 4에있어서, 상기단백질을특이적으로검출할수있는제제는 L82P 변이부위를특이적으로검출할수있는제제인것인조성물. 청구항 6 청구항 4에있어서, 상기단백질을특이적으로검출할수있는제제는항체인것인조성물. 청구항 7 청구항 4에있어서, 상기폴리뉴클레오티드를특이적으로검출할수있는제제는 245T>C 변이부위를특이적으로검출할수있는제제인것인조성물. 청구항 8 청구항 4에있어서, 상기폴리뉴클레오티드를특이적으로검출할수있는제제는프라이머, 프로브또는안티센스핵산인것인조성물. 청구항 9 청구항 8에있어서, 상기안티센스핵산은상기폴리뉴클레오티드또는그의단편, 또는이들에상보적인것인조성물. 청구항 10 청구항 9에있어서, 상기단편은 10개이상의뉴클레오티드를갖는것인조성물. 청구항 11 청구항 4 내지 10 중어느한항의조성물을포함하는 CMT1의발병여부또는그발병의위험을진단하기위한키트

4 청구항 12 청구항 11에있어서, 상기키트는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이칩키트또는단백질칩키트인것인키트. 청구항 13 CMT1을진단하거나발병위험도를예측하기위한정보를제공하기위하여, 개체로부터분리된생물학적시료에서, 서열번호 1의아미노산서열에서 82번위치의류신 (L) 이프롤린 (P) 으로치환된아미노산서열로이루어진단백질, 또는서열번호 2의뉴클레오티드서열에서 245번위치의티민 (T) 이시토신 (C) 으로치환된뉴클레오티드서열로이루어진폴리뉴클레오티드를검출하는방법. 청구항 14 청구항 13에있어서, 상기단백질을특이적으로검출할수있는제제를사용하여검출하는것인방법. 청구항 15 청구항 14에있어서, 상기단백질을특이적으로검출할수있는제제는 L82P 변이부위를특이적으로검출할수있는제제인것인방법. 청구항 16 청구항 14에있어서, 상기단백질을특이적으로검출할수있는제제는항체인것인방법. 청구항 17 청구항 13에있어서, 상기단백질을검출하는분석법은웨스턴블랏팅, ELIS, 방사선면역분석법, 방사선면역확산법, 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역확산법, 로케트면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전분석, 보체고정분석, FCS 또는단백질칩인것인방법. 청구항 18 청구항 13에있어서, 상기폴리뉴클레오티드의 245T>C 변이부위를특이적으로검출할수있는제제를사용하여검출하는것인방법. 청구항 19 청구항 18에있어서, 상기폴리뉴클레오티드의 245T>C 변이부위를특이적으로검출할수있는제제는프라이머, 프로브또는안티센스핵산인것인방법. 청구항 20 청구항 13에있어서, 상기폴리뉴클레오티드를검출하는분석법은역전사중합효소반응, 경쟁적역전사중합효소반응, 실시간역전사중합효소반응, RNase 보호분석법 (RP), 노던블랏팅또는 DN 칩인것인방법. 발명의설명 [0001] 기술분야 PMP22 단백질변이체또는 PMP22 유전자변이체, 이들을특이적으로검출할수있는제제를포함하는샤르코 - 마 리 - 투스병제 1 형을진단하기위한조성물또는키트, 및이를이용한상기질병의진단방법에관한것이다. [0002] 배경기술샤르코-마리-투스병 (Charcot-Marie-Tooth disease: CMT) 또는유전운동감각신경병 (hereditary motor and sensory neuropathy) 은유전적및임상적으로이질적인말초신경시스템의장애로서, 감각기능의손실을동반한원위성근육약화등의증상을나타낸다 (Harding et al., Brain 103: (1980)). CMT는가장보편적 - 4 -

5 인종류의유전말초신경병증이다. 이는 80개이상의원인유전자와관련이있다. 조직병리학적및전기생리학적결과에따르면, CMT는 (1) 38 m/s 이하의정중운동신경전도속도를나타내는탈수초성 CMT1; (2) 38 m/s 이상의정중운동신경전도속도를나타내는축삭형 CMT2; 및 (3) 25 내지 45 m/s 사이의정중운동신경전도속도를나타내고, 축삭및 / 또는탈수초성특징을보이는신경병리를나타내는중간형 IntCMT로분류할수있다. [0003] [0004] [0005] 상기 CMT의발생빈도는 2500 명당한명으로유전되는희귀질환가운데높은빈도를보인다. CMT 환자들은발과손의근육들이점점위축되어힘이약해지며, 발모양과손모양이변형되거나안면마비및청력장애등이발생한다. 발병은주로 10 세전후에일어나나드물게는 30 대이후에도일어난다. 환자들의증상은유전자돌연변이의종류에따라거의정상에가까운가벼운상태에서부터아주심하여보행에도움이필요하거나또는휠체어에의존해야하는정도까지다양하다. CMT 치료를위한약물들가운데프로게스테론수용체의길항제인오나프리스톤 (onapristone) 을투여한형질전환마우스에서 PMP22 mrn의과발현을감소시키고부작용이없이유전운동감각신경병의표현형을호전시킨보고가있었고, 말초신경에서수초형성에필수적인물질인아스코르빈산 (ascorbic acid) 은 CMT1 형질전환마우스에서수초재형성및유전운동감각신경병의표현형을개선하였고, 뉴트로핀-3(neurotrophin-3; NT-3) 은 CMT1 환자군에서수초화된신경섬유를증가시켜감각증상개선효과를나타냈다고보고되었다. 따라서, CMT의정확한유전적진단에따라발병의억제및유전적원인에적합한맞춤치료가가능하게되었으나, 아직까지효율적인유전성신경질환의진단방법개발은미흡한실정이다. 유전적으로매우이질적인특성을가진운동감각신경병의맞춤치료를위하여먼저정확한유전적진단법의확립이요구되고있다. 이에본발명자들은 CMT1의발병원인을규명하고자예의연구노력한결과, 기존에보고되지않은신규한돌연변이유전자를규명하였으며, 상기돌연변이유전자가 CMT1의진단에유용하게이용될수있음을확인함으로써본발명을완성하였다. 선행기술문헌 [0006] 비특허문헌 ( 비특허문헌 0001) Harding et al., Brain 103: (1980) 발명의내용 [0007] [0008] [0009] [0010] 해결하려는과제일양상은서열번호 1의아미노산서열에서 82번위치의류신 (L) 이프롤린 (P) 으로치환된아미노산서열로이루어진 PMP22 (peripheral myelin protein 22) 단백질변이체또는이를코딩하는폴리뉴클레오티드를제공한다. 다른양상은서열번호 1의아미노산서열에서 82번위치의류신 (L) 이프롤린 (P) 으로치환된아미노산서열로이루어진단백질, 또는서열번호 2의뉴클레오티드서열에서 245번위치의티민 (T) 이시토신 (C) 으로치환된뉴클레오티드서열로이루어진폴리뉴클레오티드를특이적으로검출할수있는제제를포함하는, 샤르코-마리-투스병제1형 (CMT1) 의발병여부또는그발병의위험을진단하기위한조성물을제공한다. 다른양상은상기조성물을포함하는 CMT1의발병여부또는그발병의위험을진단하기위한키트를제공한다. 다른양상은 CMT1을진단하거나발병위험도를예측하기위한정보를제공하기위하여, 개체로부터분리된생물학적시료에서, 서열번호 1의아미노산서열에서 82번위치의류신 (L) 이프롤린 (P) 으로치환된아미노산서열로이루어진단백질, 또는서열번호 2의뉴클레오티드서열에서 245번위치의티민 (T) 이시토신 (C) 으로치환된뉴클레오티드서열로이루어진폴리뉴클레오티드를검출하는방법을제공한다. [0011] [0012] 과제의해결수단일양상은서열번호 1의아미노산서열에서 82번위치의류신 (L) 이프롤린 (P) 으로치환된아미노산서열로이루어진 PMP22 (peripheral myelin protein 22) 단백질변이체또는이를코딩하는폴리뉴클레오티드를제공한다. 상기 PMP22 단백질변이체는분리된 PMP22 단백질변이체일수있다

6 [0013] [0014] [0015] [0016] [0017] [0018] [0019] [0020] [0021] [0022] [0023] [0024] [0025] [0026] [0027] [0028] 상기 PMP22 단백질변이체를코딩하는폴리뉴클레오티드는서열번호 2의뉴클레오티드서열에서 245번위치의티민 (T) 이시토신 (C) 으로치환된뉴클레오티드서열로이루어진폴리뉴클레오티드일수있다. 따라서, 상기 PMP22 단백질변이체는서열번호 2의뉴클레오티드서열에서 245번위치의티민 (T) 이시토신 (C) 으로치환된뉴클레오티드서열로이루어진폴리뉴클레오티드에의해코딩되어서열번호 1의아미노산서열에서 82번위치의류신 (L) 이프롤린 (P) 으로치환된아미노산서열로이루어진 PMP22 단백질변이체일수있다. 상기서열번호 2의뉴클레오티드서열에서 245번위치의티민 (T) 이시토신 (C) 으로치환된뉴클레오티드서열로이루어진폴리뉴클레오티드는 PMP22 유전자변이체일수있다. PMP22 (peripheral myelin protein 22) 유전자는말초신경계에서수초 (myelin) 의주요구성요소를암호화하는유전자로서, NCBI ccession number NM_ 로등록된유전자일수있고, 예를들어서열번호 2로표시되는뉴클레오티드서열로이루어진유전자일수있다. PMP22 단백질은상기 PMP22 유전자에의해코딩되는단백질로서, 서열번호 1로표시되는아미노산서열로이루어진단백질일수있다. 용어, "PMP22 단백질변이체 " 란서열번호 1로표시되는 PMP22 단백질의아미노산서열일부에변이가일어난것을의미한다. 구체적으로, 서열번호 2의뉴클레오티드서열에서 245번위치의티민 (T) 이시토신 (C) 으로치환된 PMP22 유전자변이체에의해코딩되는단백질일수있고, 보다구체적으로, 서열번호 1로표시되는아미노산서열에서 82번위치인류신 (L) 이프롤린 (P) 으로치환 (p.leu82pro 또는 p.l82p) 된 PMP22 단백질변이체일수있다. 용어, "PMP22 유전자변이체 " 란서열번호 2로표시되는 PMP22 유전자의뉴클레오티드서열일부에변이가일어난것을의미한다. 구체적으로, 서열번호 2의뉴클레오티드서열에서 245번위치의티민 (T) 이시토신 (C) 으로치환 (c.245t>c) 된 PMP22 유전자변이체일수있다. 상기서열번호 2의뉴클레오티드서열에서 245번위치인티민 (T) 은척추동물사이에서종간보존이매우잘되어있는서열위치일수있다. 상기 PMP22 유전자변이체는 PMP22 유전자의점돌연변이 (point mutation), 구체적으로미스센스돌연변이 (missense mutation) 에의해생성된것일수있다. 상기 PMP22 유전자변이체는드노보 (de novo) 돌연변이에의해생성된것일수있다. 용어, " 드노보돌연변이 " 란부모로부터물려받지않고새롭게발생된돌연변이를의미한다. 따라서, 상기 PMP22 유전자변이체는부모로부터물려받은것이아니라샤르코-마리-투스병제1형환자에게서새롭게발생된돌연변이에의해생성된것일수있다. 상기서열번호 1의아미노산서열에서 82번위치의류신 (L) 이프롤린 (P) 으로치환된아미노산서열로이루어진 PMP22 단백질변이체, 또는서열번호 2의뉴클레오티드서열에서 245번위치의티민 (T) 이시토신 (C) 으로치환된뉴클레오티드서열로이루어진 PMP22 유전자변이체는샤르코-마리-투스병제1형의진단마커일수있다. 따라서, 상기 PMP22 단백질변이체의 L82P 변이부위또는상기 PMP22 유전자변이체의 245T>C 변이부위는샤르코-마리-투스병제1형의진단을위한돌연변이마커일수있다. 샤르코-마리-투스병 (Charcot-Marie-Tooth disease: CMT) 은손과발의말초신경발달에관여하는유전자의돌연변이로인해발생하는유전성질병으로서, 발병유형에따라신경수초이상과관련이있는제1형, 축삭돌기이상과관련이있는제2형, 그리고제1형과제2형이복합적으로나타나는제3형과제4형, X 염색체와관련된 X형으로분류될수있다. 샤르코-마리-투스병제1형 (Charcot-Marie-Tooth disease type 1: CMT1) 은상염색체우성질병이며, 수초의손상으로신경전도속도가감소된탈수초성신경병증 (demyelinating neuropathy) 이다. CMT1은유전자변이등이보고된순서에따라 1, 1B, 1C 등차례로명명되었다. 구체적으로, 상기 PMP22 단백질변이체또는 PMP22 유전자변이체는 CMT1E의진단마커일수있다. 용어, " 진단 " 은병리상태의존재또는특징을확인하는것을의미한다. 따라서, 상기 "CMT1의진단 " 이란 CMT1 의발병여부또는발병가능성을확인하거나발병의위험을예측하는것을의미할수있다. 용어, " 진단마커 (diagnosis marker)" 는상기 CMT1의발병여부또는발병가능성을진단할수있는물질을의미할수있다. 유의성있는진단마커의선택과적용은진단결과의신뢰도를결정할수있다. 유의성있는진단마커란진단 - 6 -

7 하여얻은결과가정확하여타당도 (validity) 가높고, 반복측정시에도일관된결과를나타내도록신뢰도 (reliability) 가높은마커를의미할수있다. 상기진단마커로서서열번호 1의아미노산서열에서 82번위치의류신 (L) 이프롤린 (P) 으로치환된아미노산서열로이루어진 PMP22 단백질변이체, 또는서열번호 2의뉴클레오티드서열에서 245번위치의티민 (T) 이시토신 (C) 으로치환된뉴클레오티드서열로이루어진 PMP22 유전자변이체는 CMT1 환자에서만검출이되고, 정상인대조군에서는검출될확률이거의없는신뢰도가높은마커이다. 따라서상기변이체의존재여부를검출하여얻은결과를토대로진단된결과는타당하게신뢰할수있다. [0029] [0030] [0031] [0032] [0033] [0034] [0035] [0036] [0037] [0038] [0039] [0040] 다른양상은서열번호 1의아미노산서열에서 82번위치의류신 (L) 이프롤린 (P) 으로치환된아미노산서열로이루어진단백질, 또는서열번호 2의뉴클레오티드서열에서 245번위치의티민 (T) 이시토신 (C) 으로치환된뉴클레오티드서열로이루어진폴리뉴클레오티드를특이적으로검출할수있는제제를포함하는, CMT1의발병여부또는그발병의위험을진단하기위한조성물을제공한다. 구체적으로, 상기 CMT1은 CMT1E일수있다. 용어, " 단백질을특이적으로검출할수있는제제 " 란개체의시료내에서상기단백질을특이적으로확인하거나검출하기위하여사용될수있는물질을의미한다. 상기단백질을특이적으로검출할수있는제제는 L82P 변이부위를특이적으로검출할수있는제제일수있다. 용어, " 단백질의 L82P 변이부위를특이적으로검출할수있는제제 " 란개체의시료내에서상기단백질의 L82P 변이부위를특이적으로확인하거나검출하기위하여사용될수있는물질을의미한다. 상기단백질을특이적으로검출할수있는제제는 PMP22 단백질변이체, 예를들어 PMP22 변이체의 L82P 변이부위를타겟 (target) 으로하는특정화합물또는합성물질일수있고, 보다구체적으로 PMP22 단백질변이체에특이적인항체일수있고, 보다더구체적으로서열번호 1의단백질의 82번위치인류신 (L) 이프롤린 (P) 으로치환된 PMP22 단백질변이체에특이적인항체일수있으나, 그종류가반드시이에제한되는것은아니다. 용어, " 항체 " 란당해분야에서공지된용어로서항원성부위에대해서지시되는특이적인단백질분자를의미한다. 상기 PMP22 단백질변이체에특이적인항체는, PMP22 단백질변이체를코딩하는유전자를통상적인방법에따라발현벡터에클로닝 (cloning) 하여상기유전자에의해코딩되는 PMP22 단백질변이체를얻고, 얻어진 PMP22 단백질변이체로부터통상적인방법에의해제조될수있다. 여기에는상기 PMP22 단백질변이체에서만들어질수있는부분펩티드도포함될수있고, 부분펩티드로는, 최소한 7개아미노산, 바람직하게는 9개아미노산, 더욱바람직하게는 12개이상의아미노산을포함할수있다. 상기항체의형태는특별히제한되지않으며다클론항체, 단클론항체또는항원결합성을갖는것이면그것의일부도항체에포함되고모든면역글로불린항체가포함될수있다. 나아가, 항체에는인간화항체등의특수항체도포함될수있다. 다중클론항체는상기한 PMP22 단백질변이체항원을동물에주사하고동물로부터채혈하여항체를포함하는혈청을수득하는당해분야에널리공지된방법에의해생산할수있다. 이러한다중클론항체는염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소개등의임의의동물종숙주로부터제조가능하다. 단일클론항체는당해분야에널리공지된하이브리도마방법 (hybridoma method)(kohler 및 Milstein, European Jounral of Immunology 6: , 1976), 또는파지항체라이브러리 (Clackson et al, Nature 352: , 1991; Marks et al, J Mol Biol 222(58): 1-597, 1991) 기술을이용하여제조될수있다. 상기방법으로제조된항체는겔전기영동, 투석, 염침전, 이온교환크로마토그래피, 친화성크로마토그래피등의방법을이용하여분리, 정제할수있다. 상기 PMP22 단백질변이체를검출할수있는항체는 2개의전체길이의경쇄 (light chain) 및 2개의전체길이의중쇄 (heavy chain) 을가지는완전한형태뿐만아니라항체분자의기능적인단편을포함할수있다. 항체분자의기능적인단편이란적어도항원결합기능을보유하고있는단편을뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이있다. 용어, " 폴리뉴클레오티드를특이적으로검출할수있는제제 " 란개체의시료내에서상기폴리뉴클레오티드를특이적으로확인하거나검출하기위하여사용될수있는물질을의미한다. 상기폴리뉴클레오티드를특이적으로검출할수있는제제는 245T>C 변이부위를특이적으로검출할수있는제제일수있다

8 [0041] [0042] [0043] [0044] [0045] [0046] [0047] [0048] [0049] [0050] [0051] [0052] 용어, " 폴리뉴클레오티드의 245T>C 변이부위를특이적으로검출할수있는제제 " 란개체의시료내에서상기폴리뉴클레오티드의 245T>C 변이부위를특이적으로확인하거나검출하기위하여사용될수있는물질을의미한다. 상기폴리뉴클레오티드를특이적으로검출할수있는제제는 PMP22 유전자변이체에특이적으로결합하는물질일수있고, 구체적으로 PMP22 유전자변이체의 245T>C 변이부위에특이적으로결합하는물질일수있고, 보다구체적으로 PMP22 유전자변이체의 245T>C 변이부위에특이적으로결합하는프라이머, 프로브또는안티센스핵산일수있으나, 그종류가반드시이에제한되는것은아니다. 상기프라이머, 프로브또는안티센스핵산은서열번호 2의뉴클레오티드서열의 245번위치인티민 (T) 이시토신 (C) 으로치환된뉴클레오티드서열로이루어진폴리뉴클레오티드에특이적으로결합하고다른핵산물질의염기서열에는특이적결합을하지않는것일수있다. 상기프라이머, 프로브또는안티센스핵산은통상의기술자가 PMP22 유전자변이체의뉴클레오티드서열을바탕으로디자인할수있다. 용어, " 프라이머 " 란짧은자유 3말단수산화기 (free 3' hydroxyl group) 를가지는핵산서열로상보적인템플레이트 (template) 와염기쌍 (base pair) 을형성할수있고템플레이트가닥복사를위한시작지점으로기능을하는 7개내지 50개의핵산서열을의미한다. 프라이머는보통합성하지만자연적으로생성된핵산에서이용할수도있다. 프라이머의서열은반드시주형의서열과정확히같을필요는없으며, 충분히상보적이어서주형과혼성화될수있으면된다. 프라이머는적절한완충용액및온도에서중합반응 ( 즉, DN 폴리머레이즈 (polymerase) 또는역전사효소 (reverse transcriptase) 을위한시약및상이한 4가지뉴클레오사이드 3인산 (nucleoside triphosphate) 의존재하에서 DN 합성을개시할수있다. PCR 조건, 센스및안티센스프라이머의길이는당업계에공지된것을기초로변형할수있다. 따라서, PMP22 유전자변이체의뉴클레오티드서열부위의센스 (sense) 및안티센스 (antisense) 프라이머를이용하여 PCR 증폭을실시하여 CMT1을진단할수있다. 용어, " 프로브 " 란 mrn와특이적결합을이룰수있는짧게는수염기내지길게는수백염기에해당하는 RN 또는 DN 등의핵산단편을의미하며라벨링 (labeling) 되어있어서특정 mrn의존재유무를확인할수있다. 프로브는올리고뉴클레오티드 (oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DN(single stranded DN) 프로브, 이중쇄 DN(double stranded DN) 프로브, RN 프로브등의형태로제작될수있다. 적당한프로브의선택및혼성화조건은당업계에공지된것을기초로변형할수있다. 따라서, PMP22 유전자변이체의뉴클레오티드서열에상보적인프로브를이용하여혼성화를실시하여, 혼성화여부를통해 CMT1을진단할수있다. 상기프라이머또는프로브는포스포르아미다이트 (phospharamidite) 고체지지체방법, 또는기타널리공지된방법을사용하여화학적으로합성할수있다. 이러한핵산서열은기본성질을변화시키지않는추가의특징을혼입할수있다. 혼입할수있는추가의특징의예로메틸화, 캡화, 하나이상의핵산을동족체로의치환및핵산간의변형등이있으나, 이에제한하지않는다. 용어, " 안티센스핵산 " 은타겟으로하는 PMP22 유전자변이체에대한상보적인서열을가지고있어 PMP22 유전자변이체와이합체를형성할수있는핵산기반의분자를의미하며, PMP22 유전자변이체를검출하는데사용될수있다. 상기안티센스핵산은상기폴리뉴클레오티드또는그의단편, 또는이들에상보적인것일수있다. 상기단편은 5개이상, 구체적으로 10개이상, 보다구체적으로 10개내지 1000개, 보다더구체적으로 10개내지 500개, 보다더구체적으로 15개내지 500개, 보다더구체적으로 15개내지 300개, 보다더구체적으로 15개내지 200 개, 보다더구체적으로 15개내지 150개의뉴클레오티드를갖는것일수있으나, 검출특이성을증가시키기위하여적절한길이를선택할수있다. 다른양상은상기조성물을포함하는 CMT1의발병여부또는그발병의위험을진단하기위한키트를제공한다. 상기키트는검사대상에게서서열번호 1의아미노산서열에서 82번위치의류신 (L) 이프롤린 (P) 으로치환된아미노산서열로이루어진단백질, 또는서열번호 2의뉴클레오티드서열에서 245번위치의티민 (T) 이시토신 (C) 으로치환된뉴클레오티드서열로이루어진폴리뉴클레오티드를특이적으로검출함으로써 CMT1의발병여부또는그발병의위험을진단할수있다. 구체적으로, 상기키트는검사대상에게서서열번호 1의아미노산서열에서 82번위치의류신 (L) 이프롤린 (P) 으로치환된아미노산서열로이루어진단백질의 L82P 변이부위, 또는서열번호 2의뉴클레오티드서열에서

9 번위치의티민 (T) 이시토신 (C) 으로치환된뉴클레오티드서열로이루어진폴리뉴클레오티드의 245T>C 변이부 위를특이적으로검출함으로써 CMT1 의발병여부또는그발병의위험을진단할수있다. [0053] [0054] [0055] [0056] [0057] [0058] [0059] [0060] [0061] 상기키트에는서열번호 1의아미노산서열에서 82번위치의류신 (L) 이프롤린 (P) 으로치환된아미노산서열로이루어진단백질을특이적으로인지하는항체, 또는서열번호 2의뉴클레오티드서열에서 245번위치의티민 (T) 이시토신 (C) 으로치환된뉴클레오티드서열로이루어진폴리뉴클레오티드를특이적으로검출할수있는프라이머, 프로브또는안티센스핵산이포함될수있고, 이에추가로분석에적합한 1종이상의다른구성성분조성물, 용액또는장치가포함될수있다. 구체적으로, 키트는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이칩키트또는단백질칩키트일수있다. 상기 RT-PCR 키트는서열번호 2의뉴클레오티드서열에서 245번위치의티민 (T) 이시토신 (C) 으로치환된뉴클레오티드서열로이루어진폴리뉴클레오티드의 245T>C 변이부위를특이적으로검출하기위하여 RT-PCR을수행하는데요구되는필수요소를포함할수있다. RT-PCR 키트는서열번호 2의뉴클레오티드서열에서 245번위치의티민 (T) 이시토신 (C) 으로치환된뉴클레오티드서열로이루어진폴리뉴클레오티드의 245T>C 변이부위에특이적인각각의프라이머쌍외에도테스트튜브또는다른적절한컨테이너, 반응완충액, 데옥시뉴클레오티드 (dntps), Taq-중합효소및역전사효소와같은효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물 (DEPC-water), 멸균수등을포함할수있다. 상기마이크로어레이칩은 DN 또는 RN 폴리뉴클레오티드프로브를포함하는것일수있다. 상기마이크로어레이는서열번호 2의뉴클레오티드서열에서 245번위치의티민 (T) 이시토신 (C) 으로치환된뉴클레오티드서열로이루어진폴리뉴클레오티드의 245T>C 변이부위에특이적인프로브를포함하는것을제외하고는통상적인마이크로어레이의구성을포함할수있다. 상기마이크로어레이는서열번호 2의뉴클레오티드서열에서 245번위치의티민 (T) 이시토신 (C) 으로치환된뉴클레오티드서열로이루어진폴리뉴클레오티드의 245T>C 변이부위의존재여부를검출하여 CMT1의발병가능성을진단하는데유용한정보를제공할수있다. 서열번호 2의뉴클레오티드서열에서 245번위치의티민 (T) 이시토신 (C) 으로치환된뉴클레오티드서열로이루어진폴리뉴클레오티드의 245T>C 변이부위에대한프로브를기판상에고정화하여마이크로어레이를제조하는방법은당해분야에잘알려져있다. 예컨대, DN 마이크로어레이는, 이들로한정되는것은아니지만, 파이조일렉트릭 (piezoelectric) 방식을이용한마이크로피펫팅 (micropipetting) 또는핀 (pin) 형태의스폿터 (spotter) 를이용한방법에의해상기 245T>C 변이부위에대한프로브를기판상에고정화시킬수있다. 마이크로어레이의기판은아미노-실란 (amino-silane), 폴리-L-라이신 (poly-l-lysine) 및알데히드 (aldehyde) 로이루어진군에서선택되는활성기가코팅된것일수있으나, 이에제한되는것은아니다. 또한, 상기기판은슬라이드글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론막및니트로셀룰로스막 (nitrocellulose membrane) 으로이루어진군에서선택되는것일수있으나, 이에제한되는것은아니다. 또한, 마이크로어레이상에서의핵산의혼성화및혼성화결과의검출은당해분야에잘알려져있다. 상기검출은핵산시료를형광물질, 예를들면, Cy3 및 Cy5와같은물질을포함하는검출가능한신호를발생시킬수있는표지물질로표지한다음, 마이크로어레이상에혼성화하고상기표지물질로부터발생하는신호를검출함으로써혼성화결과를검출할수있다. 상기단백질칩키트는서열번호 1의아미노산서열에서 82번위치의류신 (L) 이프롤린 (P) 으로치환된아미노산서열로이루어진단백질의발현수준을측정할수있다. 단백질칩키트는항체의면역학적검출을위하여기재, 적당한완충용액, 발색효소또는형광물질로표지된 2차항체, 발색기질등을포함할수있다. 상기에서기재로는니트로셀룰로오스막, 폴리비닐수지로합성된 96-웰플레이트, 폴리스틸렌수지로합성된 96-웰플레이트, 유리로된슬라이드글라스등이이용될수있고, 발색효소로는퍼옥시다아제 (peroxidase), 알칼라인포스파타아제 (alkaline phosphatase) 등이사용될수있다. 또한, 형광물질로는 FITC, RITC 등이사용될수있고, 발색기질로는 BTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린 -6-설폰산)), OPD(o-페닐렌디아민 ), TMB( 테트라메틸벤지딘 ) 등이사용될수있다. 다른양상은 CMT1을진단하거나발병위험도를예측하기위한정보를제공하기위하여, 개체로부터분리된생물학적시료에서, 서열번호 1의아미노산서열에서 82번위치의류신 (L) 이프롤린 (P) 으로치환된아미노산서열로이루어진단백질, 또는서열번호 2의뉴클레오티드서열에서 245번위치의티민 (T) 이시토신 (C) 으로치환된뉴클레오티드서열로이루어진폴리뉴클레오티드를검출하는방법을제공한다. 용어, " 개체 " 는 CMT1의발병여부또는발병가능성을확인하거나발병위험도를예측하고자하는개체를의미 - 9 -

10 한다. 상기개체는척추동물일수있고, 구체적으로포유류, 양서류, 파충류, 조류등일수있고, 보다구체적 으로포유동물일수있으며, 예를들어인간 (Homo sapiens) 일수있다. [0062] [0063] [0064] [0065] [0066] [0067] [0068] [0069] [0070] 용어, " 생물학적시료 " 는개체로부터분리된조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액또는뇨와같은시료등을포함할수있으나, 이에제한되는것은아니다. 상기단백질은상기단백질을특이적으로검출할수있는제제를사용하여검출하는것일수있다. 구체적으로, 상기단백질을특이적으로검출할수있는제제는 L82P 변이부위를특이적으로검출할수있는제제인것일수있다. 상기단백질을특이적으로검출할수있는제제는항체일수있으나, 이에제한되지않는다. 상기단백질을검출하는분석법은웨스턴블랏팅 (Western blotting), 효소면역흡착법 (enzyme linked immunosorbent assay: ELIS), 방사선면역분석법 (radioimmunoassay: RI), 방사선면역확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 (rocket) 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전분석 (Immunoprecipitation ssay), 보체고정분석 (Complement Fixation ssay), 유세포분석 (Fluorescence ctivated Cell Sorter: FCS), 단백질칩등이있으나, 이에제한되는것은아니다. 상기폴리뉴클레오티드는상기폴리뉴클레오티드의 245T>C 변이부위를특이적으로검출할수있는제제를사용하여검출하는것일수있다. 상기폴리뉴클레오티드의 245T>C 변이부위를특이적으로검출할수있는제제는프라이머, 프로브또는안티센스핵산일수있으나, 이에제한되지않는다. 상기폴리뉴클레오티드를검출하는분석법은역전사중합효소반응 (RT-PCR), 경쟁적역전사중합효소반응 (Competitive RT-PCR), 실시간역전사중합효소반응 (Real-time RT-PCR), RNase 보호분석법 (RNase protection assay: RP), 노던블랏팅 (Northern blotting), DN 칩등이있으나, 이에제한되는것은아니다. 상기방법에서, 개체로부터분리한생물학적시료에서열번호 1의아미노산서열에서 82번위치의류신 (L) 이프롤린 (P) 으로치환된아미노산서열로이루어진단백질의 L82P 변이부위, 또는서열번호 2의뉴클레오티드서열에서 245번위치의티민 (T) 이시토신 (C) 으로치환된뉴클레오티드서열로이루어진폴리뉴클레오티드의 245T>C 변이부위가존재할경우, CMT1이발병되었거나또는발병위험이있는것으로진단할수있다. [0071] 발명의효과일양상에따른 PMP22 단백질변이체또는 PMP22 유전자변이체는샤르코-마리-투스병제1형을진단하기위한마커로서이용할수있다. 상기 PMP22 유전자변이체를이용한진단은유전성이강하면서도단일유전자결함에의해발병하는샤르코-마리-투스병에대하여유전자검사를통한정확한조기진단을가능하게하며, 그에따라최근개발되고있는치료방법을조기에적용하여치료효과를극대화할수있다. [0072] 도면의간단한설명도 1은 PMP22 유전자변이를갖는 CMT1 환자가포함되어있는두가족 (c.215c>t 변이를갖는 FC829 가족및 c.245t>c 변이를갖는 FC416 가족 ) 의가계도이다. PMP22 유전자변이부위의유전자형은각각의구성원의하단에나타내었다. 흰색도형은정상인, 검정색도형은 CMT1 환자를의미한다. 도 2는대조군 ( 정상인 ) 과 CMT1 환자에서두가지 PMP22 변이 (FC829 가족에서 c.215c>t 및 FC416 가족에서 c.245t>c) 위치를포함하는염기서열크로마토그램이다. 도 3은 CMT1 환자가가지는 PMP22 변이의위치 (p.ser72leu, p.leu82pro) 가종간에잘보존되는것을나타내는아미노산서열분석결과이다. 도 4는 p.ser72leu 돌연변이를갖는 FC829 환자가 7세일때촬영한 T1-강조 MRI 영상이다 : (a) 허벅지 (thigh) 근육의관상면영상 (Coronal images); (b) 종아리 (calf) 근육의관상면영상 ; (c) 중앙허벅지 (middle thigh) 의축상면영상 (xial images); 및 (d) 중앙종아리 (middle calf) 의축상면영상. 허벅지에서거의모든근육이정상이었다 (a, b). 그러나, 종아리에서는경미한근육위축이관찰되었다 (c, d). 도 5는신규한 p.leu82pro 돌연변이를갖는 FC416 환자의 T1-강조 MRI 영상이다 : (a) 하지근육의관상면영상 ; (b, f) 허벅지의상부의축상면영상 ; (c, g) 허벅지의하부의축상면영상 ; (d, h) 종아리근육의상부의축상

11 면영상 ; 및 (e, i) 종아리근육의하부의축상면영상. 22세에촬영한 MRI 영상은 a-e에나타내었으며, 24세에촬영한 MRI 영상은 f-i에나타내었다. 도 6은 FC416 환자의원위비복신경 (distal sural nerve) 의조직병리학적검사결과를나타낸도면이다 : (a) 400 배배율에서관찰한박막횡단절편 ; (b) 1000배배율에서관찰한박막횡단절편 ; (c) 3000배배율에서관찰한전자현미경결과 ; (d) 25,000배배율에서관찰한전자현미경결과 ; 및 (e) 유수섬유및무수섬유의분포를나타내는히스토그램. [0073] [0074] [0075] [0076] [0077] [0078] [0079] [0080] [0081] [0082] [0083] [0084] [0085] 발명을실시하기위한구체적인내용이하본발명을실시예를통하여보다상세하게설명한다. 그러나, 이들실시예는본발명을예시적으로설명하기위한것으로본발명의범위가이들실시예에한정되는것은아니다. 실시예1. CMT1의원인유전자의확인 1. 환자의선별 CMT1이발병된 2명의환자를포함하는한국인 2가족 (ID: FC416 및 FC829) 총 12명을선별하였다. 또한, 신경근장애에대한가족력이없는 500명의건강한한국인을대조군으로모집하였다. 2. 전체엑솜시퀀싱및 CMT1 원인유전자의동정 CMT1 환자에서 CMT1 원인유전자를확인하기위한실험을하였다. 구체적으로, 실시예 1의 1절에서선별된환자의전체혈액으로부터게놈 DN 정제키트 (Qiagen, Hilden, Germany) 를사용하여게놈 DN(genomic DN) 를추출하였다. 헥사플렉스미소부수체 (hexaplex microsatellite) PCR 및실시간 (real-time) PCR을이용하여모든가족샘플에대해 17p12(PMP22) 중복또는결실을확인하였다 (Nam et al., Mol. Cells. Doi: /molcells (2016)). 또한, 인간 SeqCap EZ 인간엑솜라이브러리 v3.0 (Roche/NimbleGen, Madison, WI, US) 및 HiSeq2500 게놈분석기 (Illumina, San Diego, C, US) 를이용하여 CMT1 발병된환자에대해전체엑솜시퀀싱 (whole exome sequencing: WES) 을수행하였다. 레퍼런스 (reference) 서열로서 UCSC 어셈블리 hg19를사용하였다. 그리고, 기능적으로중요한변이체즉, 미스센스, 넌센스, 엑손의삽입-결실및스플라이싱부위를 WES 데이터로부터선별하였다. dbsnp144( 게놈프로젝터데이터베이스 (1000G, 엑솜변이체서버 (ESP; 및 Exome ggregation Consortium(ExC, 에서미보고되거나드문변이체즉, 0.01 이하의소수대립유전자빈도를기준으로추가적으로선택하였다. CMT 및말초신경증관련유전자내의변이체를유전적원인의후보로서우선고려하였다. 또한, 유전체분석기 BI3130XL (Life Technologies, Foster City, C, US) 를사용하여생어 (Sanger) 시퀀싱하여후보변이체를확인하였다. 전체엑솜시퀀싱결과로부터 PMP22 내에서두개의이형접합돌연변이를서로다른 CMT1 환자가계에서발견하였다. 이돌연변이는 FC829 가계에서 p.ser72leu (c.215c>t) 돌연변이, 그리고 FC416 가계에서 p.leu82pro (c.245t>c) 돌연변이이다. FC416 가계에서발견된 p.leu82pro 돌연변이는 dbsnp144, 1000G, ESP 및 ExC와같은인간게놈변이체데이터베이스에서보고된바없는신규한돌연변이이다. 반면, p.ser72leu (rs ) 는탈수초성 CMT의근본원인으로서이전에보고된바있다. 도 1은 PMP22 유전자변이를갖는 CMT1 환자가포함되어있는두가족 (c.215c>t 변이를갖는 FC829 가족및 c.245t>c 변이를갖는 FC416 가족 ) 의가계도이다. 또한, 도 2는대조군 ( 정상인 ) 과 CMT1 환자에서두가지 PMP22 변이 (FC829 가족에서 c.215c>t 및 FC416 가족에서 c.245t>c) 위치를포함하는염기서열크로마토그램이다. 상기도 1 및도 2에나타낸바와같이, 이두돌연변이즉, c.215c>t 및 c.245t>c는 CMT를앓고있는환자에서만발견되었으며, CMT를앓고있지않은부모또는다른가족구성원에서는발견되지않았다. 따라서, 이두돌연변이가부모로부터물려받은것이아니라새롭게발생된돌연변이인드노보 (de novo) 돌연변이임을알수있었다. 또한, 이돌연변이들은 500명의건강한한국인대조군또는 302 WES 데이터에서는검출되지않았다. 3. 돌연변이부위에서 PMP22 단백질서열의보존분석인간 (Homo spiens), 쥐 (Mus musculus), 소 (Bos taurus), 늑대 (Canis lupus familiaris), 닭 (Gallus gallus) 및아프리카발톱개구리 (Xenopus laevis) 의 PMP22 단백질에서 p.ser72leu 및 p.leu82pro 돌연변이부위의아미

12 노산서열이보존되어있는지확인하기위한실험을하였다. [0086] [0087] [0088] [0089] [0090] 우선, 아미노산서열은 NCBI로부터얻었으며, 각서열의 ccession number는 NP_ (Homo spiens), NP_ (Mus musculus), NP_ (Bos taurus), XP_ (Canis lupus familiaris), NP_ (Gallus gallus) 및 NP_ (Xenopus laevis) 에해당하였다. 단백질서열의보존분석은 MEG6, version 6.0( 을사용하여수행하였다. 도 3은 CMT1 환자가가지는 PMP22 변이의위치 (p.ser72leu, p.leu82pro) 가종간에잘보존되는것을나타내는아미노산서열분석결과이다. 도 3에나타낸바와같이, p.ser72leu 및 p.leu82pro 돌연변이부위는포유동물부터양서류에이르는척추동물종사이에잘보존된제2 막관통 (second transmembrane: TM2) 도메인에위치하고있음을알수있었다. 4. 인실리코 (in silico) 분석및원인이되는돌연변이의결정인실리코 (in silico) 분석은 MUpro( 및 PolyPhen- 2( 로수행하였다. 표 1은 p.ser72leu 및 p.leu82pro 돌연변이가 CMT1 발병원인인지를확인하기위한, PolyPhen-2 및 Mupro 프로그램에의해시뮬레이션된인실리코 (in silico) 분석결과이다. 표 1에나타낸바와같이, p.ser72leu 및 p.leu82pro 돌연변이가 CMT 발병의원인이되는효과를가질것이라고예측할수있었다. [0091] 돌연변이프로그램 SIFT PP2 MUpro p.ser72leu 0.00 * * p.leu82pro 표 * * -1 * [0092] [0093] [0094] [0095] [0096] 실시예 2. CMT1 환자의임상징후및전기생리학적평가 1. CMT1 환자의임상징후의확인 CMT1 환자가가지는임상징후를확인하기위한실험을하였다. 구체적으로, 실시예 1의 1절에서선별된두 CMT1 환자에대해운동및감각장애, 심부반사 (deep tendon reflexes) 및근위축을확인하였다. 의학연구심의회 (medical research council: MRC) 의등급으로굴근 (flexo r) 과신근 (extensor) 의강도를수동으로측정하였다 (Paternostro-Sluga et al., J. Rehabil. Med. 40: , 2008). 지체장애는기능장애등급법 (functional disability scale: FDS) 및 CMT 신경병증점수 (CMT neuropathy score; CMTNS) 를사용하여평가하였다. 감각장애는통증, 온도, 진동및위치의수준및심각도의측면에서측정하였다. 표 2는 2명의 CMT 환자의임상적특징을비교하여나타낸것이다. 그결과, 두환자는분만기의문제또는신경근장애의가족력을가지지않았다. 두환자는지연된운동이정표 (motor milestone) 를가졌다. 24개월에는혼자서걷기가어려웠다. 아동기에, 평형이상 (dysequilibrium) 과함께보행의어려움이발달하였다. 근육약화및위축이다리의말단부분에서두드러졌다. 상지 (upper limbs) 에서말초적으로면적이작아지는것이두드러졌다. 사지의중심부분은상대적으로보존되었다. 지적능력은정상이었다. 인식할수있는신경확장은관찰되지않았다. 길이에의존적인감각손실은두환자에서공통적으로관찰되었다. 진동감각및위치감각은통각및온도감각보다더심각하게손실되었다. 병의초기단계에서무반사증 (areflexia) 이발견되었다. 그러나, 병적반사 (pathological reflexes) 는발견되지않았다. 기능장애는심각하였다. 두 CMT1 환자에서높은 FDS 및 CMTNS가발견되었다. 또한, 발기형및척추측만증이발견되었다. [0097] 환자 ID FC416( 여성 ) FC829( 여성 ) 아미노산변경 p.leu82pro p.ser72leu 검사연령 (years) 24 7 발병연령 (years) <1 <1 표

13 현재증상 보행장애 보행장애 발병시증상 발달지연 발달지연 사지근육약화 a 상지 (upper limb) 하지 (lower limb) 근육위축 b U<L U<L 감각손실 c P<V P<V 반사신경 이두박근 / 삼두박근 -/- -/- 무릎 / 발목 -/- -/- 발바닥반응 No No 요족 (Pes cavus) Yes Yes 운동실조 (taxia) Yes Yes 척추측만증 Yes Yes 청력손실 No No CMTNS d FDS e 3 3 근전도검사섬유성연축, 신경성 MUPs 섬유성연축, 신경성 MUPs + ++ [0098] [0099] [0100] [0101] [0102] [0103] [0104] [0105] [0106] [0107] a. 상지에서근육약화 : +, MRC 등급에서본질적인손의약화 (intrinsic hand weakness) 4/5; ++, 본질적인손의약화 <4/5; +++, 근위부약화및휠체어의존. 하지에서근육약화 : +, MRC 등급에서발목배굴곡 (ankle dorsiflexion) 4/5; ++, 발목배굴곡 <4/5; +++, 근위부약화및휠체어의존. b. U<L 하지근육우세위축. c. P, 통각 ; V, 진동감각. d. 샤르코-마리-투스신경병증점수. e. 기능장애등급법 (3, 보행이어려우나도움없이보행가능 ; 4, 지팡이를사용하여보행가능 ; 5, 목발을사용하여보행가능 ; 6, 사람의도움을받아보행가능 ; 7, 휠체어의존 ). MUPs, 운동단위활동전위 (motor unit action potential). 2. CMT1 환자의전기생리학적평가실시예 1의 1절에서선별된 CMT1 환자에대하여전기생리학적평가를하였다. 구체적으로, 신경전도검사 (nerve conduction studies: NCSs) 는표면전극으로수행하였다. 정중신경및척골신경의운동신경전도속도 (motor nerve conduction velocities: MNCVs) 는팔꿈치또는손목에서의자극에의해측정하면서, 단무지외전근 (abductor pollicis brevis) 및소지내전근 (adductor digiti quinti) 각각에대한복합근활동전위 (compound muscle action potentials: CMPs) 를기록하였다. 같은방법으로, 비골신경및경골신경의 MNCVs 및 CMPs를측정하였다. 감각신경전도속도 (sensory nerve conduction velocities: SNCVs) 및감각신경활동전위 (sensory nerve action potentials: SNPs) 는정중신경및척골신경으로부터손가락-손목부분에대해얻었다. 바늘근전도검사 (needle electromyography: EMG) 는양방향근위부및원위부하지근육에서수행하였다. 표 3은 CMT1 발병된두여성환자의전기생리학적평가결과를요약한것이다. 그결과, CMT1 발병된두여성환자의전기생리학적평가결과를표 2에요약하였다. 두환자모두정중, 척골, 비골또는경골신경에서 CMP 가유발되지않았다. FC416 환자에서는정중, 척골또는장딴지신경에서 SNP 전위가없었다. 그러나, FC829 환자에서는양방향정중및척골신경에서 SNP가감소하였다. 바늘근전도검사는만성신경병증과일치하는장기간의신경성패턴을보여주었다. 시각유발전위및뇌간청각유발전위는정상이었다

14 표 3 [0108] 환자 FC416 FC829 표준값 검사연령 (years) 24 7 방향 (side) 오른쪽 왼쪽 오른쪽 왼쪽 운동신경평가정중운동신경 TL (ms) CMP (mv) MNCV (m/s) 척골운동신경 TL (ms) CMP (mv) MNCV (m/s) 비골운동신경 TL (ms) CMP (mv) MNCV (m/s) 경골운동신경 TL (ms) CMP (mv) MNCV (m/s) 감각신경평가정중감각신경 SNP (μv) SNCV (m/s) 척골감각신경 SNP (μv) SNCV (m/s) 장딴지신경 SNP (μv) SNCV (m/s) <3.9 >6.0 >50.5 <3.0 >8.0 >51.1 <5.3 >1.6 >41.2 <5.4 >6.0 >41.1 >8.8 >39.3 >7.9 >37.5 >6.0 >32.1 [0109] [0110] [0111] [0112] [0113] [0114], 전위없음 (absent potentials); CMP, 근전위도 (compound muscle action potential); MNCV, 운동신경전도속도 ; SNP, 감각신경활동전위 ; 및 TL, 말단잠복기 (terminal latency). 실시예 3. CMT1 환자다리근육의지방대체 (fatty replacement) 의확인 CMT1 환자의근육이지방으로대체되는소견을확인하기위하여, CMT1 환자의허벅지 (thigh) 및종아리 (calf) 의자기공명영상 (magnetic resonance imaging: MRI) 촬영을수행하였다. 구체적으로, 위상-배열멀티-코일 (phase-array multi-coil) 이구비된 1.5-T 시스템 (Siemens Vision, Siemens, Germany) 을사용하여두명의발병된개인 (FC416 II-2 및 FC829 II-1) 의허벅지및종아리를 MRI 촬영하였다. 다리 MRI는축면 [ 시야 (field of view: FOV), cm; 단면두께, 10 mm; 단면간격, mm] 및관상면 [FOV, cm; 단면두께, 4-5 mm; 단면간격, mm] 에서수행하였다. T1-강조스핀-에코 (spin-echo: SE) (TR/TE /14-20, 512 매트릭스 ), T2-강조 SE (TR/TE /96-99, 512 매트릭스 ) 및지방-억제 (fat-suppressed) T2-강조 SE (TR/TE /85-99, 512 매트릭스 ) 의프로토콜을사용하였다. 도 4는 p.ser72leu 돌연변이를갖는 FC829 환자가 7세일때촬영한 T1-강조 MRI 영상이다 : (a) 허벅지 (thigh) 근육의관상면영상 (Coronal images); (b) 종아리 (calf) 근육의관상면영상 ; (c) 중앙허벅지 (middle thigh) 의축상면영상 (xial images); 및 (d) 중앙종아리 (middle calf) 의축상면영상. 허벅지에서거의모든근육이정상이었다 (a, b). 그러나, 종아리에서는경미한근육위축이관찰되었다 (c, d). 도 5는신규한 p.leu82pro 돌연변이를갖는 FC416 환자의 T1-강조 MRI 영상이다 : (a) 하지근육의관상면영상 ; (b, f) 허벅지의상부의축상면영상 ; (c, g) 허벅지의하부의축상면영상 ; (d, h) 종아리근육의상부의축상면영상 ; 및 (e, i) 종아리근육의하부의축상면영상. 22세에촬영한 MRI 영상은 a-e에나타내었으며, 24세에

15 촬영한 MRI 영상은 f-i 에나타내었다. [0115] [0116] [0117] [0118] [0119] [0120] [0121] [0122] [0123] 도 4 및도 5의결과를종합하면, 허벅지근육에비해아래다리근육에서현저한지방대체및위축을보임을 T1-강조다리 MRI 영상에서확인하였으며, 이는길이에의존적인신경병증의이론과일치하였다. FC829 환자는 7세에 MRI 촬영을하였으며, 이환자의허벅지근육의 MRI는거의정상이었다 ( 도 4a 및 c). 다만, 초강력성신호 (hyperintense signal) 의변화없이약간의근육위축을보임을아래다리 MRI 영상에서확인하였다 ( 도 4b 및 d). FC416 환자는 22세 ( 도 5a-c) 및 24세 ( 도 5f-i) 에 MRI 촬영을하였다. 후속 MRI 영상은 2년동안유의미한변화가없었음을보여준다. 이는임상적진행의속도가느리다는것을의미한다. 허벅지수준에서, 거의모든허벅지근육에서지방침윤은관찰되지않았다 ( 도 5b, c, f 및 g). 화살표로표시된바와같이, 장비골근 (peroneus longus) 및단비골근 (peroneus brevis) 이선택적으로연관되었음은주목할만하다. 그러나, 다른근육들은질병말기까지상대적으로남아있었다 ( 도 5d, e, h 및 i). 실시예 4. CMT1 환자의조직병리학적분석 CMT1 환자가가지는조직병리학적인증상을확인하기위하여, 23세 FC416 II-2 환자의원위비복신경 (distal sural nerve) 을대상으로생검 (biopsy) 을수행하였다. 구체적으로, 새로운시료를포르말린으로고정하고, 절개하고, 헤마톡실린및에오신 (hematoxylin and eosin: H-E), 메이슨트리크롬 (Masson's trichrome), 룩솔패스트블루 (Luxol fast blue) 및보디안 (Bodian) 으로염색하였다. 전자현미경관찰을위해, 시료를 ph 7.4에서 2.5 mm 카코딜염산 (cacodylate) 버퍼에용해된 2% 글루타르알데히드 (glutaraldehyde) 로고정하였고, 세미-씬 (semi-thin) 및울트라-씬 (ultra-thin) 연구를위해가공하였다. 톨루이딘블루로염색된세미-씬부분은광학현미경에서평가하였다. 울트라-씬샘플 (60-65 nm) 은초미세구조연구를위해우라닐아세테이트및시트르산납으로대비하였다 (H-7650, Hitachi, Japan). 신경다발들의영역및유수신경섬유 (myelinated fibers: MFs) 의밀도는컴퓨터-기반이미지분석기 (analysis, Soft imaging System, GmbH, Germany) 를사용하여비복신경의톨루이딘블루염색된세미-씬횡단면으로부터직접적으로측정하였다. FC416 환자는 5세일때이전병원에서첫번째비복신경생검을겪은바있다. 그당시결과에의하면, 양파구조 (onion bulb: OB) 형성및신경내막공간에서의뮤코이드 (mucoid) 물질의퇴적이확인되었다. 표 4는본실시예에따른두번째비복신경생검결과를요약한것이다. 도 6은 FC416 환자의원위비복신경 (distal sural nerve) 의조직병리학적검사결과를나타낸도면이다 : (a) 400배배율에서관찰한박막횡단절편 ; (b) 1000배배율에서관찰한박막횡단절편 ; (c) 3000배배율에서관찰한전자현미경결과 ; (d) 25,000배배율에서관찰한전자현미경결과 ; 및 (e) 유수섬유및무수섬유의분포를나타내는히스토그램. 도 6에나타낸바와같이, 두번째생검에서 ( 도 6a-d), 같은성별및연령군에서와비교하여 MFs의수및영역은각각 195/mm 2 ( 표준값의 1.9%) 및 0.2% ( 표준값의 0.8%) 로극적으로감소하였다. 평균수초두께는 0.2 μm 로감소하였다. 2 μm 이상의직경을갖는두꺼운수초는관찰되지않았다 ( 정상대조군에서 20%). 슈반세포 (Schwann cell) 박막층또는기초박막을포함하는 OBs 형성이빈번하게관찰되었다 (973/mm 2 ). 도 6e 의막대그 래프에서, 3 및 6 μm 이하의직경을갖는 MFs 는각각전체 MFs 의 28.6 및 100% 를의미한다. [0124] 환자 ID FC416 표준범위 생검연령 (years) 23 계수법 (EM) 30,000x, 13 필드 OB (/mm 2 ) 973 OB를동반한 MFs (/mm (20.0 %) ) (%) 778 (80.0 %) 탈수초성 / 좋지못한유수성 (/mm 2 ) (%) - 축삭돌기없음 (/mm 2 ) (%) 알려지지않은종류 (/mm 2 ) (%) 표 4 MFs (/mm 2 ) a ,

16 MFs 의크기 (μm) 범위 ( 평균 ) <3 μm (%) (3.6) <6 μm (%) MF% 영역 g-비율 범위 ( 평균 ) >0.7 (%) 수초두께 ( 평균 ) >2 μm (%) b OB 를동반한무수초성축삭돌기 (/mm 2 ) 지름 ( 평균 ) <3 μm (%) 추정탈수초성축삭돌기 (/mm 2 ) 직경 >1.7 μm (%) (0.9±0.03) (0.2) (2.6) (4.5) [0125] [0126] [0127] EM, 전자현미경 ; MF, 유수섬유 (myelinated fiber), OB, 양파구조 (onion bulb); g-ratio, 축삭돌기직경 / 전체섬유직경 a. 정상대조군 (/mm 2 ): 14,170 (2-5세, n=5), 10,530 (11-20세, n=5) b. 정상대조군 (%): 20.0 도면 도면 1 도면

17 도면 3 도면 4 도면

18 도면 6 서열목록 <110> Samsung Life Public Welfare Foundation KONGJU NTIONL UNIVERSITY INDUSTRY-UNIVERSITY COOPERTION FOUNDTION <120> PMP22 as a causative gene of Charcot-Marie-Tooth disease type 1 and method for diagnosing the disease using the same <130> PN115308KR <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 160 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Leu Leu Leu Leu Leu Ser Ile Ile Val Leu His Val la Val Leu

19 Val Leu Leu Phe Val Ser Thr Ile Val Ser Gln Trp Ile Val Gly sn Gly His la Thr sp Leu Trp Gln sn Cys Ser Thr Ser Ser Ser Gly sn Val His His Cys Phe Ser Ser Ser Pro sn Glu Trp Leu Gln Ser Val Gln la Thr Met Ile Leu Ser Ile Ile Phe Ser Ile Leu Ser Leu Phe Leu Phe Phe Cys Gln Leu Phe Thr Leu Thr Lys Gly Gly rg Phe Tyr Ile Thr Gly Ile Phe Gln Ile Leu la Gly Leu Cys Val Met Ser la la la Ile Tyr Thr Val rg His Pro Glu Trp His Leu sn Ser sp Tyr Ser Tyr Gly Phe la Tyr Ile Leu la Trp Val la Phe Pro Leu la Leu Leu Ser Gly Val Ile Tyr Val Ile Leu rg Lys rg Glu <210> 2 <211> 483 <212> DN <213> Homo sapiens <400> 2 atgctcctcc tgttgctgag tatcatcgtc ctccacgtcg cggtgctggt gctgctgttc 60 gtctccacga tcgtcagcca atggatcgtg ggcaatggac acgcaactga tctctggcag 120 aactgtagca cctcttcctc aggaaatgtc caccactgtt tctcatcatc accaaacgaa 180 tggctgcagt ctgtccaggc caccatgatc ctgtcgatca tcttcagcat tctgtctctg 240 ttcctgttct tctgccaact cttcaccctc accaaggggg gcaggtttta catcactgga 300 atcttccaaa ttcttgctgg tctgtgcgtg atgagtgctg cggccatcta cacggtgagg 360 cacccggagt ggcatctcaa ctcggattac tcctacggtt tcgcctacat cctggcctgg

20 gtggccttcc ccctggccct tctcagcggt gtcatctatg tgatcttgcg gaaacgcgaa 480 tga