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1 발간등록번호

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3 보고서요약서 과제고유번호 해당단계 연구기간 ~ 단계구분 24 개월 / 24 개월 단위사업 농식품기술개발사업 연구사업명 사업명 기술사업화지원사업 대과제명 ( 해당없음 ) 연구과제명 세부과제명 구제역아데노바이러스와인터페론의공동접종을통한백신접종 초기돼지구제역예방연구 해당단계 참여 연구원수 총 : 37 명 내부 : 14 명 외부 : 23 명 해당단계 연구개발비 정부 :200,000 천원 민간 :68,000 천원 계 :268,000 천원 연구책임자 이중복 총연구기간 총 : 37 명 정부 :200,000 천원 참여 내부 : 14 명 총연구개발비 민간 :68,000 천원 연구원수 외부 : 23 명 계 :268,000 천원 연구기관명및 소속부서명 건국대학교산학렵력단, 농림축산검역본부 참여기업명 대성미생물연구소 요약 위탁연구 연구기관명 : 연구책임자 : 보고서면수 본연구에서는 1) 번째로는인터페론을생성하는나노젤을제작하 75 였고 2) 번째로는대장균에서인터페론을생산하는시스템을구축하였으며, 3) 번째로는 IL2 유전자가탑재된아데노바이러스를제작하였다. 4) 번째로는면역및진단항원을구제역아데노바이러스가감염된세포로부터생산하고정제하는기술을습득하였다. 따라서 1) Nanogel 담체기술특허 1건, 2) 대장균인터페론생산기술특허 1건및 3) 논문게재 4) 구제역진단항원생산기술에대한및기술이전 1건, 5) 학술발표 4건, 6) 정책활용 1 건, 7) 인력개발 3건의성과를거두었다.

4 코드번호 D-01 나노기술을이용한돼지인터페론의방출지연기술개발과면역력분석및실효성분석 - 세포에독성이없고면역증진효과가있는 Nanogel 탐색및제작 - RD-NG의합성및마우스모델시험 - RD-NG에반응성이있는돼지연구모델탐색 돼지인터페론의공동접종에의한돼지구제역아데노바이러스백신의방어력및면역력증진 - 돼지인터페론알파8 유전자의클로닝 연구의 목적및내용 - 재조합돼지인터페론알파 8 의발현및정제 - 재조합돼지인터페혼알파 8 의항바이러스효과검증 돼지구제역아데노바이러스의공장스케일대량생산기술확립 - 바이오리엑터를이용한구제역아데노바이러스의공장스케일생산기술확립 - 습득한기술을이용하여구제역아데노바이러스를대량생산하고면역원성시험 돼지인터페론유전자가삽입된아데노바이러스의공장스케일대량생산기술확보및기술전수 - 돼지인터페론, IL2, CD40L 등의유전자클로닝및아데노바이러스에삽입 - 상기의아데노바이러스의공장스케일대량생산기술확보및전수 - 구제역아데노바이러스와공동접종효과확인 돼지인터페론알파 8 연구결과논문개재 (Immune Network, 2017) 돼지인터페론알파 8 특허출원및기술이전 ( 출원번호 : ) 연구개발성과 poly IC 담지 Nanogel 담체특허출원 ( 출원번호 : ) 학술발표 4 건, 정책활용 1 건, 인력개발 3 건 구제역아데노바이러스를이용한구제역항원생산기술에대한기술이전및산 업화진행중 ( 메디안디노스틱 ) 연구개발성과의활용계획 ( 기대효과 ) 돼지구제역아데노바이러스대량생산기법에대한기술이전및산업화 돼지인터페론알파8의약리학적특성연구및제품화 Nanogel 담체를이용한구제역백신개발및산업화 구제역항원을이용한구제역항체진단기법개발및제품화 중심어 (5 개이내 ) 구제역아데노바이러스대량생산인터페론 나노겔 (Nanogel)

5 Purpose& Contents Results Expected Contribution 코드번호 D-02 Development of swine interferon release delay technology using nanotechnology and analysis of immunity and effectiveness - Production and efficacy evaluation of Nanogel carrying poly IC Establishment and technology transfer of industrial scale mass production technology of adenovirus with insertion of swine interferon gene - Gene cloning and adenovirus insertion of swine interferon, IL2 and CD40L - Establishment and technology transfer of industrial scale mass production technology of adenovirus with insertion of swine interferon, IL2 and CD40L - Validation of effects of simultaneous inoculation with FMD adenovirus Establishment of industrial scale mass production technology of swine FMD adenovirus - Establishment of industrial scale production technology of FMD adenovirus using bioreactor - Mass production of FMD adenovirus through the acquired technology and performance of immunogenicity experiment Enhancement of protectivity and immunity of swine FMD adenovirus vaccine by simultaneous inoculation with swine interferon - Cloning of swine interferon alpha8 gene - Expression and purification of recombinant swine interferon alpha8 - Validation of antiviral effect of recombinant swine interferon alpha8 Publication of research paper on swine interferon alpha8 (Immune Network, 2017) Patent application and technology transfer of swine interferon alpha8 (Application number : ) Patent application of Nanogel carrying poly IC (Application number : ) 4 academic publications, 1 policy application, 3 human resources development results On the progress of technology transfer and industrialization of FMD antigen production technology using FMD adenovirus (Mediandiagnostics) Technology transfer and industrialization of mass production technology of swine FMD adenovirus Pharmacological characteristics analysis and commercialization of swine interferon alpha8 Development and industrialization of FMD vaccine using Nanogel carrier Development and commercialization of FMD antibody diagnosis technique using FMD antigen Keywords FMD Adenovirus Mass production Interferon Nanogel

6 1. Introduction 1 2. Status of domestic and foreign technology development 2 3. Contents and results of research Research aim achievement level and contribution Application plan Foreign science technology information collected during research Security level of research results Research facilities and equipments registered at National Science and Technology Information System Safety measures implementation results Representative research results Supplemental information Reference 72 <Annex> Self-evaluation report

7 1. 연구개발과제의개요 1 2. 국내외기술개발현황 2 3. 연구수행내용및결과 목표달성도및관련분야에의기여도 연구결과의활용계획등 연구과정에서수집한해외과학기술정보 연구개발성과의보안등급 국가과학기술종합정보시스템에등록한연구시설 장비현황 연구개발과제수행에따른연구실등의안전조치이행실적 연구개발과제의대표적연구실적 기타사항 참고문헌 72 < 별첨 > 자체평가의견서

8 1 장. 연구개발과제의개요 1-1 절. 연구개발목적 코드번호 D-03 돼지구제역아데노바이러스의공장스케일대량생산기술확립 돼지인터페론의공동접종에의한돼지구제역아데노바이러스백신의방어력및면역력증진 돼지인터페론유전자가삽입된아데노바이러스의공장스케일대량생산기술확보및기술전수 나노기술을이용한돼지인터페론의방출지연기술개발과면역력분석및실효성분석 1-2 절. 연구개발의필요성 2010/2011년에는전국적으로구제역이발생하여약 3조원의경제적피해를입혔다. 2014/2015년에는전국적으로백신을접종하고있는상황에서도구제역이발생하여피해액이 600억원이나발생하였다. 2011년부터는축산차량에장착한 GPS와구제역백신에의해서피해가경감되었다. 구제역백신에의해서피해가경감되기는했으나이상육발생이라는또다른구제역백신의간접피해가발생하여양돈산업에 1년에 1천억원이상의피해를보게하는것으로보고되어있다. 구제역을종식시켜야하는것은현실인데백신을접종하니이상육의발생과백신비용이부담되는것도현실이다. 백신접종이정착단계에올랐지만이상육발생으로접종을기피하는분위기가형성되면서출하직전돼지에서구제역이발생하는현상이발생하게되었다. 이러한피해를막기위해서는이상육이생기지않고출하직전돼지한테접종했을때구제역이발생하지않아야한다. 본연구진은이러한현장애로를풀어주기위한바람직한백신을개발하고자하여서지난 3년동안연구를수행하였던바아데노바이러스를이용한벡터백신을개발하였다. 그러나이백신만으로는출하직전에구제역바이러스를신속하게막아주고방어면역력을출하때까지충분히유지하지못할것으로판단되었다. 이에기존백신대비다소미진한면역력을보충하고구제역이발생하고있는지역에서도구제역발생을막아줄수있는백신을개발하여차폐혹은현장에적용해보고자한다. 1-3 절. 연구개발범위 구제역아데노바이러스백신의대량생산기술을확립 아데노바이러스를이용한각종분자면역보조제생산및공동접종 돼지인터페론알파8의클로닝 재조합돼지인터페론알파8의발현및정제 재조합돼지인터페론알파8의항바이러스효과검증 poly IC 담지 Nanogel 담체제작 - 1 -

9 2 장. 국내외기술개발현황 2-1 절. 본연구관련국내외기술수준비교 코드번호 D-04 개발기술명 아데노바이러스벡터를이용한돼지구제역 O 형방어벡터백신개발 아데노바이러스의공장스케일대량생산기술확립 관련기술최고보유국 현재기술수준우리나라연구신청팀 기술개발목표수준 대한민국 30% 70% 100% 미국 30% 50% 90% 비고 돼지인터페론의면역력증진대한민국 / 미국 80% 80% 90% poly IC 및 Nanogel 프랑스 / 미국 30% 30% 70% 1) 개발기술명은본연구과제최종연구개발목표기술을의미 2) 현재기술수준은선진국 100% 대비우리나라및신청한연구팀의기술수준표시 3) 기술개발목표수준은당해과제완료후선진국 100% 대비목표수준제시 4) 부가설명이필요한경우비고란에작성 2-2 절. 특허분석 1. 특허분석범위 대상국가특허 DB 검색기간검색범위 국내, 국외특허정보원 ( 국제특허청 ( 미국특허청 ( 등최근 20년간 1. 구제역 (Foot and Mouth disease, FMD) 2. 소 (bovine), 돼지 (porcine), 인간 (human) 을포함한구제역 3. 소 (bovine), 돼지 (porcine), 인간 (human), 아데노바이러스 (Adenovirus) 를포함한구제역 - 2 -

10 2. 특허분석에따른본연구과제와의관련성 개발기술명 Adenovirus를이용한구제역백신의생산기술개발 Keyword Adenovirus, Porcine, Bovine, Human, Foot-and-Mouth disease, Vaccine 검색건수 432 유효특허건수 143 특허명 구제역에대한합성펩티드백신 (synthetic peptide vaccines for foot-and-mouth disease) 구제역 SAT 2형 VII 지역형의방어항원단백질을발현하는재조합바이러스 (Recombinant virus expressing preotective antigen protein of foot-and-mouth disease AST 2-VII topotype) 보유국미국대한민국 등록년도 관련성 ( %) 50% 50% 핵심특허 및관련성 유사점 본발명은구제역바이러스의 VP1 캡시드단백질유래의표적항원부위를포함하는면역원으로서의펩티드조성물의용도에관한. 본발명은구제역 SAT 2형 VII 지역형의방어항원단백질을코딩하는유전자가삽입된재조합플라스미드, 상기재조합플라스미드를이용하여제조한재조합구제역바이러스및상기재조합바이러스를유효성분으로 함유하는구제역예방용백신 조성물에관한것. 차이점 본연구에서는구제역바이러스의캡시드프로테인을목표로한재조합아데노바이러스를제작하는것을목표로하여특허기술과는최종산물에서차이있음 본연구에서는 chaperon 일부를조작한아데노바이러스를이용한구제역백신을만드는것을목표로하고있어, 상기특허기술과는벡터의조작방법및발명의최종산물부분에서차이있음 - 3 -

11 개발기술명 Keyword 돼지인터페론의면역력증진 FMDV vaccine, Adenovirus, interferon 검색건수 631 유효특허건수 15 특허명 돼지인터페론알파-돼지인터페론감마를동시발현하는재조합아데노바이러스 (Recombinant adenovirus simultaneously expressing porcine interferon alpha and porcine interferon gamma) 보유국 대한민국 등록년도 2013 관련성 (%) 60% 핵심특허 및관련성 유사점 본발명은돼지인터페론알파와인터페론감마를동시에발현시켜돼지인터페론알파와감마를한번에처리할수있게하여구제역바이러스에대한억제효과를증강시킬수있는재조합아데노바이러스에관한것. 차이점 본연구에서는 NF-beta, IL2, CD40L 를클로닝한아데노바이러스를 목표로하고있어, 상기특허기술과는아데노바이러스의조작방법및 발명의최종산물부분에서차이있음 - 4 -

12 개발기술명 공장스케일대량생산기술확립 poly IC 및 Nanogel Keyword Adenovirus, bioreactor interferon nanoparticle 검색건수 유효특허건수 31 7 항체의 FC 영역에특이적결합능을 가지는리포펩타이드및그를 아데노바이러스벡터의생산과 포함하는항원인지형지질 정제를위한신규한방법 나노입자 (Lipopeptides with 특허명 (Method for the production specific affinity to Fc region of and purification of adenoviral antibodies and vectors) antigen-recognizing lipid nanoparticles comprising the same) 핵심특허 및관련성 보유국미국대한민국 등록년도 관련성 (%) 70% 28% 유사점 차이점 바이오리엑터를이용한대량 배양과 TFF 를이용한농축방법 본연구에서는구제역을 클로닝한아데노바이러스를 목표로하고있어, 상기 특허기술과는클로닝된 아데노바이러스및발명의 최종산물부분에서차이있음 nanoparticle bound system 을 이용한투여 Lipopeptides 아닌나노젤을 이용하여인터페론알파방출을 조절함 1) 개발기술명은본연구과제최종연구개발목표기술을의미 2) keyword 는검색어를의미하며, 검색건수는 keyword 에의한총검색건수를, 유효특허건수는검색한특허중핵심 ( 세부 ) 개발기술과관련성이있는특허를의미 3) 핵심특허는개발기술과의관련성이높고인용도가높은특허를기준으로분석 2-3 절. 논문분석 1. 논문분석범위 대상국가논문 DB 검색기간검색범위 미국 PubMed 최근 20년간제목, 초록및키워드 - 5 -

13 2. 논문분석에따른본연구과제와의관련성 개발기술명 Keyword Adenoviral vectored FMDV FMDV, adenoviral vector immunoadjuvant가포함된 FMDV 백신 FMDV, adjuvamt, immunoadjuvant 검색건수 44 5 유효논문건수 37 2 논문명 학술지명 Adenovirus-vectored type Asia1 foot-and-mouth disease virus (FMDV) capsid proteins as a vehicle to display a conserved, neutralising epitope of type O FMDV Journal of virological methods Poly ICLC increases the potency of a replication-defective human adenovirus vectored foot-and-mouth disease vaccine virology 저자 Chai Z 등 Fayna Diaz-San segundo 등 게재년도 핵심논문 및관련성 관련성 (%) 70% 50% adenoviral vector를 유사점 기반으로하는 FMDV adenoviral vector를기반으로백신을사용하였으며여러하는 FMDV 백신을 Poly 혈청형을방어하기위해 ICLC로면역반응을증가시켜혈청형 2종 (Asia, O) 에이용하는백신개발대한유전자를이용한백신 개발 차이점 개발된백신은면역원성이효과적이지못한 subunit 백신인반면본연구에서는생독백신의장점인높은면역원성과사독백신의장점인안전성이확립된백신개발임 adenoviral vector를기반으로하는 FMDV 백신을기반으로하였으나본연구는 immunoadjuvant를 porcine interferon등을사용하여목적동물에서의면연원성을향상시킬백신개발임

14 개발기술명 FMDV 백신 poly IC 및 Nanogel Keyword FMDV, vaccine interferon nanoparticle 검색건수 ,100 유효논문건수 논문명 Development of Hyaluronic Acid Gold foot-and-mouth disease Nanoparticle/Interferon α virus (FMDV) serotype O Complex for Targeted virus-like-particles Treatment of Hepatitis C (VLPs) vaccine and Virus Infection evaluation of its potency 학술지명 Antiviral Research American Chemical Society 저 자 B. Mohana Subramanian 등 Min-Young Lee 핵심논문 게재년도 및관련성 관련성 (%) 70% 47% 유사점 차이점 FMDV serotype O의 VP1-2A-3C coding sequences 를 VLP 형태를이용하여 FMDV 백신개발생체전달시스템으로 VLP 기반구제역백신인반면본연구는아데노바이러스기반유전자전달백신개발임 nano particle을이용한 interferon의전달 virus infection의치료목적이아닌 vaccine과함께사용하여보다강력한면역력획득. 1) 개발기술명은본연구과제최종연구개발목표기술을의미 2) keyword 는검색어를의미하며, 검색건수는 keyword 에의한총검색건수를, 유효논문건수는검색한논문중핵심 ( 세부 ) 개발기술과관련성이있는논문을의미 3) 핵심논문은개발기술과의관련성이높고인용도가높은논문을기준으로분석 2-4 절. 제품및시장분석 1. 생산및시장현황 가. 국내관련 ( 유사 ) 제품의생산및시장현황 국내관련 ( 유사 ) 제품의생산 - 현지생산시설의부재로인하여국내에서는구제역백신을생산하지못한다

15 국내 국외 경쟁기업명 제품명 경쟁기업명 ( 국명 ) 제품명 - - 메리알 ( 프랑스, 영국 ) Aftopor 백신 - - 인터베트 ( 네덜란드 ) Decivac 백신 - - 아르헨티나 Aftogen 백신 - - 러시아 CNHKO 백신 시장현황 : 년국내동물의약품내수시장규모는 5,839억원이었으면, 그중양돈용동물용의약품시장규모가 2,347억원 (40%) 으로가장큰것으로나타났다. 한국동물약품협회에따르면, 국내동물용의약품내수시장은 2008년 (4,208억원 ) 부터 2012년 (5,837억원 ) 까지지속적으로상승하다가 2013년 5,469억원으로마이너스성장을기록했다. 하지만 2014년에는구제역발생등으로백신. 소독제판매량이증가하며 5,840억원으로다시성장세로돌아섬 ( 출처 :DailyVET: 2015년07월09일자 ) - 경쟁제조사별비중으로는국내외통틀어 10개업체가전체시장의 80% 이상을차지한형태임 ( 출처 : 이코노미스트 : 2010년 5월호 ) 년부터시행되는국내항생제금지에따라치료및예방제시장의급격한성장이예상된다. - 국내의한해구제역백신수요량은약 3천 500만 4천만두분 (1회접종량 ), 780,000병 /50두분정도로추정된다.( 한국동물약품협회, 구제역백신시장규모예측, 2011년 ). - 국내구제역시장규모는최소 350억원, 최대 600억원이이를전망이다.( 연합뉴스, 2011 년 7월 26일자 ). - 다국적기업인인터베트사와메리알사가국내백신수요량의 100% 공급하고있다. 구분 사육규모 ( 두 ) 접종 소요물량 (Dose) 비고 소 3,000,000 년2회 (2) 13,000,000 돼지 13,000,000 년1회 (2) 26,000,000 계 16,000,000-39,000,

16 수요처국명수요량 1) 관련제품 2) 농림부대한민국 39,000,000 Aftopor, Merial Decivac FMD DOE, Intervet/SPAH 팜스월드대한민국, 충남 540,000 Aftopor, Merial 대전충남양돈조합대한민국, 충남 65,000 Decivac FMD DOE, Intervet/SPAH 삼화육종대한민국, 충남 22,000 Aftopor, Merial 선진한마을대한민국 540,000 Aftopor, Merial 돈마루대한민국 43,000 Aftopor, Merial 태흥축산대한민국 108,000 Decivac FMD DOE, Intervet/SPAH Promeritage Vietnam 베트남 3) 58,000,000 Aftopor, Merial Transcend Phils. Inc. 필리핀 3) 28,000,000 Aftopor, Merial PVG Thailand 태국 3) 17,000,000 Aftopor, Merial * * * 1) 연간사용추정량 ( 돼지마리수 = 모돈두수 x 월간분만회수 x10 두자돈 x12 개월 ) 2) 국내긴급수입된 FMD 백신, 3) 출처 ; 국가통계포털 ( - 우리나라의한해구제역백신소요량은 3천500만 ~4천만두분으로, 구제역백신가격은바이러스타입이하나인경우 1달러, 3가지바이러스혼합형인경우 1.5달러에달해시장규모는최소 350억원, 최대 600억원시장에이름. - 구제역백신의경우전량수입에의존하고있어막대한외화손실이되고있으며, 또한항체생성률도낮은문제점이있어이를극복할수있는변역원성증강용분자어쥬번트의시장규모는점차확대될것으로예상되며, 이를통한백신의소요량감소로인한외화절감효과도있을것으로사료된다. - 면역관련치료제의국내시장규모는매년 13% 이상성장하고있으며 2010년에 1000억달러이상의시장규모가예상됨. 각종난치성질환의증가로면역증강제의수요증가가예상된다. - 국내의면역질환치료를위한연구개발수준과수행능력은최근크게향상되었으며, 산업체에서의백신의개발능력향상으로면역질환치료제시장규모가확대되고있다. 나. 국외관련 ( 유사 ) 제품의생산및시장현황 국외관련 ( 유사 ) 제품의생산 - 구제역사독백신은다국적기업인인터베트사와메리알사가주로제조판매하고있으며, 아르헨티나와러시아의경우는자체적으로구제역백신을제조판매한다

17 - 국외 FMD Vaccine의경우러시아의 agrovet사 10종, 브라질 Bayer Saude animal사 1 종, 아르헨티나 Biogenesis-bago S.A사 2종, 인도 Biovet private limited사 1종, 보츠와나 Bostswana Vaccine Institute사 1종, 인도 Brilliant Bio Pharma Ltd사 1종등많은백신이나와있음. 특히우리나라와근접한중국의경우 Tiankang Biopharmacuetical사 6종의백신이나와있으며, 우리나라는현재 merial사의백신을사용하고있음국외의모든제품은사독백신을생산하고있음. (The Center for Food Security&Public Health'-Vaccines:Foot and Mouth Disease, ot-and-mouth-disease&lang=en) 세계의구제역백신시장 ( 국가통계포털추정치, 2008 년 ) - 전세계동물백신시장은 2008년도현재약 40억달러이며연평균 5.9% 의성장세를지속하여오는 2013년에는이르면 50억달러대를기록할것으로예상된다.( 출처 : 약업닷컴 2008년 2월 19일자, ImmunoBiosciences, Inc). - 소사육두수 : 1,347,473,112두, 양돈사육두수 : 941,281,626두 ( 국가통계포털 2008년 ). - 총 2,288,754,738두 x 30%(back-yard제외 ) x 600원 / 두 / 비용 = 약 4,120억원 - 전세계중구제역호발지역은중국, 동남아시아, 인도, 남미및러시아등이있다.(OIE 보고서 ). - 남미의경우, 아르헨티나에 OIE reference lab. 이위치하고 Homologous serotype인 O-campos를사용 - 인도의경우, 다국적기업 ( 메리알, 인터벳 / 쉐링푸라우등 ) 제조시설이위치하고있어, 수출을통한접근이어려운상태이다 년중국시장에서의구제역백신시장은약 3억달러정도형성되었으며, 전세계적으로는이보다큰시장을형성한다. ( 출처 : Reuters; 2011년 1월 31일자 ). - 따라서수출목표시장을동남아시아 ( 베트남, 태국 ) 및러시아등으로예측되고있다. - 어쥬번트와면역관련치료제의전체시장규모는매년 13% 이상성장하고있으며 2010년에 1000억달러이상의시장규모가예상되고있다 ( 국가기술지도 2002). - 동물백신의사용량증가에따른어쥬번트의사용량도점차증가하고있는실정으로효과적인분자어쥬번트의시장도확대될전망이다. - 최근의시장보고에따르면전세계적인구제역백신시장의꾸준한성장이기대됨. Foot and Mouth Disease (FMD) Vaccines Market - Global Industry Analysis, Size, Share, Growth, Trends and Forecast, 에서는 2014년에서 2020년간의백신시장의연평균성장률이 8.8% 일것으로예측함. 2013년도의 FMD 백신시장은 5억 1천만 US달러에근접하였고이에따라 2020년도에는 9억 5천만달러에이를것으로예상이됨

18 <2011 년도의 FMD vaccine 의국제적수요산정 > 지역중국남미아시아중동유럽지역아프리카 투약량 / 년 16억 5억 2억 2천만 1천 5백만 1천 5백만 ( Albany, NY, April 24, 2015 (GLOBE NEWSWIRE) )/( 표-Institute for American Health)( -and-mouth-disease-vaccines-market-to-earn-highest-revenues-from-apac-to-hi t-us-0-95-billion-by-2020-transparency-market-research.html) 2. 개발기술의산업화방향및기대효과가. 산업화, 제품화계획 제품의특징 - 인터페론알파를아데노바이러스화및담체화를통하여백신접종후단기간 ( 최소 0-14일에서최대 4주 ) 의구제역차단에연이은면역증강을위한인터페론구제역백신을개발하고자함 - 이상육울발생시키지않는백신의개발로높은제품경쟁력을확보함 - 국내분리주를이용한맞춤형구제역백신의생산 - 국내분리주를이용한맞춤형백신으로해외수입백신을대체할수있음 개발제품의국내시장및해외시장산업화방안 - 국내분리주를이용한맞춤형돼지구제역백신의생산 - 해외수입돼지용구제역백신을대체하여연간 600억원의수입대체효과 - 매년구제역발생으로인한축산업의연간경제적손실액을최소화함 - 이상육발생이없는구제역백신의개발로이상육발생으로인한연간 1,324억원을경제적손실을막음 구제역백신의해외시장진출 - 구제역백신은국내분리주로생산되었으나, 대부분이중국분리주와유사성이있으므로, 중국시장및극동아시아지역을목표로우선적으로수출을진행함 - 제품화첫해인 3차년도에는세계전체구제역백신시장의 5%(280억원 ), 그다음해에는 10%(561억 ) 을수출함 - 최종적으로지속적인새로운구제역분리주에대한백신개발로세계구제역백신시장의

19 30%(1683 억원 ) 의점유율을달성 Ÿ Ÿ Ÿ Ÿ Ÿ Ÿ Ÿ Ÿ 2000년이전에는구제역의발생이없었고국가정책이빠른전파를차단하기위한살처분정책을고수하여, 농림축산검역본부해외전염병과를제외하고는연구활동이전무한상황이었다. 농림축산검역본부해외전염병과에서도국내구제역발병시예방을위한백신연구가한두건시도되었으나, 차폐시설 (BSL3 이상 ) 이없는관계로인해성공적인수행이없는상황이었다. 더하여국내구제역전문가들은백신연구에대해많은거부감이있어서국내백신업체및사설연구기관에서이에대한연구가활발하지않았던상황이었다. 1962년 Vallee 등이포름알데하이드로생바이러스를불활화하여백신을만드는연구를시작하였으며, Waldmann등은 (1937) 포름알데하이드로불활화하여알루미늄하이드록사이드겔과혼합한백신을사용한경험이있음. 1960년대초소초대신장세포 (Bovine primary kidney cell) 를이용하여구제역바이러스를대량으로배양할수있는백신생산라인이개발되었으며이백신은 1960년대유럽에서구제역청정화를이루는계기가되었음. 이후햄스터신장유래세포 (BHK-21) 와같은세포가개발되면서구제역바이러스가성공적으로대량배양이이루어지고포름알데하이드에서 BEI(binary ethylenimine) 에의한불활화체계로바뀌면서백신의안정성을확보할수있게되었다. 세계식량기구 (FAO) 및국제수역기구 (OIE) 등은구제역에대한심각성과통상관계정립을위해전세계중앙연구소및지역연구소를운영하고있으며몇몇나라들은별도의국가정책에따라 FMD바이러스에대한연구소를운영하고있음. 국내의경우, 현재 FMD 백신제조와는별도로농림축산검역본부에구제역진단과를신설하였고, FMD를전문적으로연구할수있는시설을보유하고있다. 메리알의 Aftopor 제품은 O1 type(manisa or Taiwan), A22(Iraq), Asia1 (Shamir) 의바이러스 strain 을사용하여불활화바이러스백신으로판매되고있음. 인터베트의 Decivac 제품은 Type O : O1-BFS, O1-Manisa, Type A : A10-Holl, A-Iran, A22-Iraq, A24-Cruzeiro, Type C : C1-Detm., C3, Type ASIA : ASIA1 의 strain을사용하여불활화바이러스백신으로판매되고있다. FMDV 국내야외분리주의유전자중면역원성이뛰어난유전자 (VP1, 3D) 를재조합단백질로발현하여효과적인백신개발이필요함. 구제역바이러스는지속적으로변이가진행됨으로써유전형과항원형이새로운 subtype이보고되고있는가운데, 야외질병원인체와백신항원이동질한유전자백신을개발가능한기술력을확보가필요하다. 본연구결과도출되는방어항원발현시스템은원인병원체가확인되면, 유전자의분석과합성에서백신의제작까지는 2개월정도소요됨. 이렇게신속하게백신을제작할있는플랫폼을구축하면국가재난형질병또는긴급을요하는신종바이러스성질병에효과적으로대처가가능하다. 본연구에서확립될벡터시스템은동물체내에서방어항원을발현시키기때문에체액성면역뿐만아니라세포성면역을증가시키기때문에방어능이우수하다. 이시스템은병원체유전자의일부만을이용하기때문에백신을안전하게생산할수있

20 을뿐만아니라, 백신주의병원성복귀나환경으로배출등이없는차세대백신플랫폼임. 따라서특수한차폐시설을요하는고위험성바이러스에대한백신을일반백신제조업체에서도안전하게생산할수차세대백신제작시스템으로그활용도의제한이없다. Ÿ 동물의약품및유전자백신의효용성을확인하고, 유전자백신의제제화연구를통하여산업화및제품화를용이하게한다. Ÿ 고위험성병원체를일반백신생산라인에서대량생산공정으로확립할수있고, 생산된백신제형이불활화과정을필요로하지않기때문에백신의원가경쟁력과안정화된제품을개발할수있어즉시산업화가용이하다. Ÿ 이백신제작플랫폼은특별한기술적인어려움이없이다양한병원체의방어항원을발현시킬수있기때문에, 다양한가축질병퇴치에사용할수있음. 이를통하여농가의소득증대및국가경제에이바지할수있다. Ÿ 계속적으로바이러스의변이가진행됨으로써유전형과항원형이새로운 subtype이보고되고있는가운데, 야외질병원인체와백신항원이동질한유전자백신을개발가능한기술력을확보한다. Ÿ 연구결과도출되는유전자백신의제작기간은 2개월정도밖에안되기때문에신종바이러스에대하여신속하게대처가가능하다. Ÿ 본유전자백신은동물체내에서항원발현면역반응을유발하는백신으로서, 세포성면역및체액성면역을증가시키고, 안정하며, 병원성복귀문제가없는제 3세대백신이다. Ÿ In vivo 상에서활성발현을극대화하기위해항원유전자전달체계최적화기술을개발한다. Ÿ 동물의약품및유전자백신의효용성을확인하고, 유전자백신의제제화연구를통하여산업화및제품화를용이하게한다. Ÿ 대량생산공정확립및안정화제형개발을통한원가경쟁력및안정화된제품을개발하여산업화가가능하다. Ÿ 가축질병퇴치를통하여농가의소득증대및국가경제에이바지할수있다. 나. 산업화를통한기대효과 Ÿ 본연구의최종결과는유전자재조합구제역백신을제작하는기법을확립하는것으로, 연구과제가종료되는 2015년에구제역백신의예방정책의변경여부에따라본기술의산업화여부가결정될것으로예상한다. 즉, 현재사용되고있는구제역사독백신에더하여유전자재조합구제역백신의사용을승인하면다음과같은경제적인효과를기대할수있을것이다

21 Ÿ ( 단위 : 원 ) 산업화기준항목 1년후 2년후 3년후 계 직접경제효과 60,000,000 60,000,000 60,000, ,000,000 경제적파급효과 4,132,400,000 4,132,400,000 4,132,400,000 12,397,200,00 0 부가가치창출액 28,000,000 56,100, ,300, ,450,000 합 계 4,220,400,000 4,248,500,000 4,360,700,000 1) 직접경제효과 : 본연구과제개발기술의산업화를통해기대되는제품의매출액추정치 2) 경제적파급효과 : 본연구과제개발기술의산업화를통한농가소득효과, 비용절감효과등추정치 3) 부가가치창출액 : 본연구과제개발기술의산업화를통해기대되는수출효과, 브랜드가치등추정치 (1) 시장잠재력 - 국내소요량 : 39,000,000두분 (1회접종분 ), 780,000병 /50두분 구분 사육규모 ( 두 ) 접종 소요물량 (Dose) 비고 소 3,000,000 년2회 (2) 13,000,000 돼지 13,000,000 년1회 (2) 26,000,000 계 16,000,000-39,000,000 - 생산금액은 : 230억원 / 년 (1회분 600원 ) (2) 경제적인효과 - 수입대체효과 : 국내 외경쟁업체현황에서언급되었듯이, 현재국내에서수입된구제역예방용백신은아래표와같이약 600억원정도임 ( 10년 10월 11년 3월, 사단법인한국동물약품협회자료 ). 본기술제품개발이성공적으로수행되어상품화시, 약 300억원의수입대체효과가있을것으로예측된다

22 년구제역발생시수입된구제역백신현황 ( 단위 : 백만원 ) 공급기업명매출 ( 국내점유율, %) 메리알코리아 17,011(58%) 인터베트 / 쉐링푸라우코리아 12,300(42%) 계 29,311(100%) (3) 수출증대효과 - 동남아시아지역의구제역상재국에공급되고있는다국적기업제품을대체할경우, 국내동물약품수출에크게기여할전망이다. - 축산규모가우리나라보다큰베트남 ( 총 3천만두 ), 태국 ( 약 2.5천만두 ) 및러시아 ( 약 2천만두 ) 등지에대한수출을목표로당사의해외수출파트너와연계한판촉으로개발종료 3년후에는최대약 $18,700,000 (75백만두x2회전x25% 점유율x$0.5/ 도즈 ) 이상의수출이증대될것으로예측된다. (4) 수입단가인하효과 - 구제역제품의국내생산으로인하여외국에서수입되는완제품도경쟁력을확보하기위 해서는현재의가격보다낮은단위가격으로시장에공급될것으로예상된다. 3. 제품화의특성 강점 (Strength) 약점 (Weakness) 기회요인 (Opportunities) 위협요인 (Threat) 구제역이발병하는지역에서분리한바이러스를이용하기때문에방어능이우수함 특허출원 사독백신과비교되는중화항체가수준 구제역연중발생가능성높음 구제역백신사용후발생율감소에따른백신접종인식높음 경쟁품거의없음 국내발생균주를이용한백신제조로항원상동성확보를통한시장접근성용이 유전자재조합구제역백신에대한인지도저하 (vs. Whole FMD virus백신 )

23 3 장. 연구수행내용및결과 3-1 절. poly IC 담지 Nanogel 담체제작 코드번호 D 이론적접근방법 가. 인터페론혹은인터페론유도체의지연방출담체개발 상기한바와같이구제역바이러스에저항하는인터페론을돼지에게주입하여구제역발생을막고구제역아데노바이러스의면역력을향상시키기위해서는인터페론이필수적이나인퍼페론은최대 5일의짧은시간동안만구제역에대한방어력이형성되고그이후는구제역에대한방어가어렵다. 인터페론을대량생산하는방법중의하나는 poly (I:C) 를구제역아데노바이러스백신과함께접종하여면역력을높이는방법이다. 본연구진에서돼지에게 Kg당 500μg의 poly (I:C) 를접종하여실험해본결과접종 6시간후부터 9 ng/100μl씩생성된후에 48시간이상지속되는것을확인할수있었다. 인터페론을직접이용한구제역백신의면역능을증강시킬수있다는연구결과가알려져있으므로본연구과제를수행하는과정에서용량과유효성을확인하는실험이동반되어야한다. 그러나실효성면에서산업화하는데에는어려움이따를것으로생각된다. 체내에서인터페론의지속시간을인위적으로증가시키는방법중의하나는 nanoparticle과같은담체를이용하는것이다. 본연구진은방출지연담체작제능력을보유하고있다. 2. 실험적접근방법 가. 인터페론혹은인터페론유도체를탑재하기위한담체개발 나노젤은분자량과고분자구조제어가가능한 Atom Transfer Radical Polymerization (ATRP) 를기반한 inverse miniemulsion 중합으로합성한다. 수용성의개시제와단량체및가교제를물상에녹인후, 계면활성제와유기용매를투입함으로써 inverse emulsion을형성하여중합을진행한다. 이때, emulsion이형성되기전에단량체수용액에혼합함으로써 Poly I:C가담지되어있는나노젤을합성할수있다

24 그림 1. Nanogel 합성개념도 나. 제작된담체와아데노구제역바이러스백신의돼지혼합접종실험 각그룹의돼지에인터페론알파아데노바이러스및인터페론알파담체와 1 x 10 9 PFU/ml 농도의구제역아데노바이러스백신을접종한후에혈중인터페론의량을측정한다. 인터펜론의지속적인방출을측정하기위해서백신에의한면역이형성되는시점인최소 2주에서 3-4주까지담체에담긴인터페론혹은그의유도체에의한인터페론의형성을핼액을통해서측정분석한다. 인터페론과동시에투여한아데노구제역백터백신에의한중화항체가를측정하기위해서검역원차폐연구실에혈액을송부하여중화항체가가 16배이상생성되었는지확인한다. 3. 연구결과 가. Nanogels 제작 그림 2. RITC-Dextran-Nanogel 합성개념도 Nanogel 종류로 Basic-Nanogel(B-NG), RITC-Dextran-Nanogel(RD-NG), Poly IC-Nanogel, Poly IC-RITC-Dextran-Nanogel 로제작하여이 Nanogel 들과세포와의독성

25 실험을하기위해 MTT 실험을진행하였다. Mouse Raw264.7 세포에 Nanogels을처리한결과 poly (I:C) 가합성된 poly IC-Nanogel 과 poly IC-RITC-Dextran-Nanogel은독성이나타나실험 24시간이내에사멸하였으며 basic-nanogel과 RITC-Dextran-Nanogel은 poly (I:C) 가합성된 Nanogel에비해독성이낮게나타났다 ( 그림 3). 그림 3. poly (I:C)-RITC-Dextran-Nanogel 의세포독성확인 농도에따른 nanogel의독성을확인하기위하여 Raw264.7 세포에 0ug에서 200ug까지 Basic-Nanogel, RITC-Dextran-Nanogel을처리하고 MTT한결과 200ug까지처리하여도 Raw264.7 세포에독성이없음을확인할수있었다. 또한 RITC-Dextran은형광물질이기때문에세포탐식및생체내 Nanogel의분포를관찰하기위해유리한점을가지고있다는것을확인할수있었다 ( 그림 4). 그림 4. Raw264.7 에 B-NG 와 RD-NG 와의독성검사 나. Mouse Raw RITC-Dextran-Nanogel in vitro (1) Mouse Raw264.7 에주입한 RD-NG 와의 uptake 이실험은 Mouse macropage 인 Raw264.7에 RITC-Dextran-Nanogel 을처리해줌으로써 Raw264.7이 RITC-Dextran-Nanogel을 uptake를하는지보기위한실험으로이때형광현미경을이용하는실험이므로 Nanogel에 TRITC-Dextran을합성하여제작된 Nanogel 을사용하였다. 먼저 60Φ dish에 cover glass를깔고 Raw cell을 2.5X10 5 로 seeding후

26 RITC-Dextran-Nanogel 200ug 더한후, 0hr, 24hr, 48hr, 72hr 으로 time dependent하게조건을두었다. Raw264.7이자라있는 cover glass를 24 well plate로옮겨 DPBS washing을해준후 Raw264.7을 cover glass 에고정시키기위해 acetone을이용하여 fix 를해준후 DAPI를염색하여 slide glass 에붙여주고형광현미경으로관찰하였다. 그림 5. Raw264.7 세포에의한 RD-NG 의 uptake 확인 그결과, ( 그림 5) control 0hr보다 24hr에서확연하게 Raw264.7이 RITC-Dextran-Nanogel을 uptake 하였음을 Red signal로확인할수있었으며, 점점시간이지나갈수록 Raw264.7이더많은 RITC-Dextran-Nanogel을 uptake한다는것을확인할수있었다. (2) Mouse Raw264.7 에주입한 RD-NG 와의 RIG-1, IFN-α 의증가 그림 6. RD-NG 의처리시간과농도에따른 RIG-1 에대한영향확인. 이실험은 Raw 264.7에 RITC-Dextran-Nanogel 을처리해줌으로써 Raw264.7이 RITC-Dextran-Nanogel을 uptake를하여 RIG-1이증가하는지확인하는실험으로 western blot을진행하였다. Raw264.7 에 RD-NG 200ug처리해주고 0, 2, 8, 24, 48, 72hr 시간별로확인한결과 0hr 보다 24hr 에서 RIG-1의증가를확인할수있었다 ( 그림 6)

27 그림 7. 각나노겔의농도에따른 Raw264.7 의반응 이는 Raw264.7 과 RD-NG가면역반응이일어나그중 RLR signal 에서도 RIG-1이증가됨을확인할수있었다. Raw264.7에 RD-NG 10, 50, 100, 200ug 농도별로처리하고 24hr 후 western blot 으로확인한결과 100ug, 200ug 에서 RIG-1이증가하였음을알수있었다. 더낮은농도의 Nanogel에서도 RITC-Dextran-Nanogel이 Basic-Nanogel 보다반응이좋았다 ( 그림 7). 위의결과와같이 B-NG 보다 RD-NG와 RIG-1이증가되었음을확인할수있었고또한 RITC-Dextran 보다 Nanogel에합성이된 RITC-Dectran-Nanogel 이더 Raw264.7과반응을보였다. 더나아가이과제의목적인돼지구제역을예방하는백신의제작을목표로최종적으로 Interferon-α의생성을확인하기위해 RLR(RIG-I-like receptor) signal에서 RIG-1을시작으로최종단계인 Interferon-α의생성을확인하기위해 Raw264.7에 RITC- Dextran-Nanogel을처리후 ELISA를하였다. 그림 8. INF-α ELISA 결과 RITC-Dextran-Nanogel 100ug 에서 IFN-α 의생성이증가하였으며오히려더많은양을 처리하였을경우에는 IFN-α 의양이줄어들었다 ( 그림 8). Raw264.7 은 RITC-Dextran-Nanogel 와반응하여 RIG-1 을활성화시키고 IFN-α 를분비한다

28 (3) Mouse Raw264.7 에주입한 RD-NG 과의직접적인결합증명. 그림 9. B-NG 와 RN-NG 의 Raw264.7 세포에대한결합확인 이실험은 Raw264.7에 RITC-Dextran-Nanogel처리해줌으로써 pattern recognition receptor 인 RIG-1이 RITC-Dextran-Nanogel의구조를인식하여직접적으로결합하였는지확인하는실험으로 Immunoprecipitation을진행하였다 ( 그림 9). Raw264.7에 RITC-Dextran-Nanogel 200ug 처리하고 24 hr 후하나는 washing을 trypsin 으로해주고하나는 PBS로해주어 RIG-1을찍은결과 PBS로 washing 해준 sample에서 RIG-1 band가나왔으며이는 RIG-1이 RITC-Dextran-Nanogel의패턴을인식하여 binding하였음을알수있다. 동일한방법으로 control과 Basic-Nanogel을포함하여진행한결과, RIG-1 이 Basic-Nanogel과도직접적인결합을한다는것을알수있다. B-NG보다는 RD-NG와 Raw264.7 과상호작용하였고 MTT assay에서도세포에독성이없었으며, uptake결과에서도시간이갈수록더많이 uptake하는것을확인하였다. 또한 RD-NG를처리함으로써 RIG-1이증가하면서 IFN- 도증가하였고이것은 IP 결과에서패턴인식수용체 RIG-1이 Nanogel 을인식하여결합하는것을알수있었다. 확인을위해 B-NG와 RD-NG, Dextran-Nanogel을가지고 IP반복실험중이며더나아가 RD-NG의농도를더높게제작하여적은양으로도 RIG-1과의상호작용을확인할것이다. 다. Mouse C57BL/6 + RITC-Dextran-Nanogel in vivo (1) 연구재료및방법 in vitro상에서 Mouse Raw264.7이 RIRC-Dextran-Nanogel에의해 RIG-1이증가되는현상을확인하였으므로 in vivo상으로확인하고자하였다. 동물은 Mouse C57BL/6 5주령 female 총23마리사용하였으면각 intravenus injection, intrapenitoneal injection 하였고 PBS, poly IC, RITC-Dextran, Basic-Nanogel, RITC-Dextran-Nanogel 를사용하였으며 injection하고 3day후에분석하였다

29 (2) 연구결과 ( 가 ) 1set Interferon-α을촉진하는 poly IC 보다 RITC-Dextran-Nanogel 100ug 에서 IFN-a 생성을확인하였으며이결과를바탕으로 Mouse in vivo 에접목시켜진행하였다. C57BL/6에 RITC-Dextran-Nanogel을 injection 하여주요장기 (Spleen, Liver, Lung, Thymus, Lymph node) 를가지고 Immunofluorescence를확인하였다. 그림 10. Lymph node 에서면역반응을일으키는 RD-NG 확인 위의 ( 그림 10) 에서보이듯이주요면역반응을일으키는장기인 Spleen, Thymus, Lymph node 중에서도 Lymph node 에서 RITC-Dextran-Nanogel의 signal을보였으면 22D1(SIGN-R1) 과도 merge가되는결과를확인할수있었다. 이는 RITC-Dextran-Nanogel을 injection 해주면 Lymph node에영향을미치며그로인해 SIGN-R1이분비되는것을알수있다. 또한주요장기에서 RIG-1의분비를확인하기위해 Western blot을하였다. 그림 11. RD-NG 에의한 RIG-1 유전자활성

30 Immunofluorescence결과와비슷하게 Lymph node 에서약하지만 RIG-1의증가를확인할수있었었다 ( 그림 11). 이결과들을토대로 porcine 구제역바이러스제거를위해 Interferon-α을생성할수있는 RITC-Dextran-Nanogel을이용하고자 porcine primary cell 에서도 macropage만 isolation하여 RITC-Dextran-Nanogel 과 uptake를확인하였다. ( 나 ) 2set 그림 12. Mouse lymph node 에서 RD-ND 의 uptake 확인. 확인을위해반복실험을하였다. 위의결과 ( 그림 12) 는 C57BL/6에 control, PBS (200ul/20g), poly IC (0.2mg/20g), RITC-Dextran (1ug/20g), Basic-Nanogel (200ug/20g), RITC-Dextran-Nanogel(200ug/20g) 으로 intravenus injection 하여 3day 분석한결과, 1set와는다르게림프절에서 RITC-Dextran-Nanogel (red signal) 이보이지않았고 control과비슷하게보여져분석이어려웠으며, 수차례 in vivo를반복하였지만같은결과를확인하지못하였다. A B C D

31 E F 그림 13. RD-NG 에대한 Lymph node 와 spleen 의 RIG-1 의반응. RIG-1을양적으로확인하기위해 western blot을진행하였다. 정확한분석을위해 1set에서반응을보였던 lymph node를부위를나누어분석하였다. 분석을 control (-, 2마리 ), PBS (PBS, 2마리 ), poly IC (PIC, 4마리 ), RITC-Dextran (RD, 4마리 ), Basic-Nanogel (B-NG, 4마리 ), RITC-Dextran-Nanogel (RDNG, 4마리 ) 를두그룹으로나누었고 ( 그림 34 A, B) 는 Lymph node 중에서도 Mesenteric부분만사용하였고 ( 그림 13 C, D) 는 popliteal lymph node, axillary lymph node등나머지부분의 Lymph node를사용하여분석하였으며 ( 그림 13 E, F) 은 spleen만을사용하였다. 그결과 control 그룹과비교하여 poly IC, RITC-Dextran, Basic-Nanogel과 RITC-Dextran-Nanogel 을처리한그룹과차이를보이지않았으며 1set와다른결과를보였다. 1set에서는 Mouse의 Lymph node와 RITC-Dextran-Nanogel과선천성면역시스템작동을확인하였지만 2set에서는확인하지못하였다. 그래서현재다른 injection 경로로확인하는중이며반복실험중이다. 1set에서는 intravenus injection (IV) 와 intrapenitoneal injection (IP) 경로로 injection 하여 intravenus injection (IV) 에서면역반응을보였고 2set에서 intravenus injection (IV) 로 injection 하여진행하였으나면역반응을확인하지못하였다. 이를보완하기위해다른 injection 경로로 footpad injection을진행중이며현재 Nanogel이오래되어구조가변하거나형광이약해질가능성이있으므로새로제작된 Nanogel을사용할것이다. 본연구진은상기의마우스모델으로이용한 in vitro 및 in vivo 실험내용을바탕으로특 허를출원하였으며발명의명칭은 RIG-1 유사수용체와결합하는덱스트란중합나노입 자 이며출원번호는 이다. 라. 돼지세포 + RD-NG in vitro 실험 Mouse in vitro, in vivo에서 RITC-Dextran-Nanogel 과선천면역시스템을확인하였으므로과제최종목표인돼지구제역을예방하는백신제작에맞추어돼지 cell line을이용하여실험을하였다. 돼지 cell line으로 PAM, PAM-CD163, IBRS2, BAL, splenocytes를이용하였고 primary cell로는 spleen, tonsil, blood PBMC를이용하였다. 그리고돼지 RIG-1을인식하는항체가없어주로 porcine IFN- ELISA로분석을하였다

32 (1) 돼지 cell line 을이용한실험결과 먼저돼지 PAM, PAM-CD163을시도하였지만현미경상 uptake을확인할수없었으며 ( 그림 14) Western blot을통해서 phospho-nf-kb, phospho-akt, phospho-erk 를찍은결과 control에비해 RITC-Dextran-Nanogel 500ug에서 phospho-nf-kb, phospho-erk가증가하는듯보였다. 그림 14. RD-NG 에대한돼지 PAM, PAM-CD163 세포의반응 그래서 IFN- ( 그림 15.)ELISA 결과에서는 PAM cell 에서 RITC-Dextran-Nanogel 500ug 에서 IFN- 가조금증가하였지만 PAM-CD163 은전혀반응을보이지않았다. 그림 15. RD-NG 처리후 IFN- ELISA 결과

33 그림 16. 돼지 IBRS 2 에서의 pifn- 의변화. 두번째로분석한세포는 IBRS 2 이며돼지 kidney 유례의 cell line 으로 RITC-Dextran-Nanogel 과반응을하지않았다 ( 그림 16). 세번째로분석한세포는 BAL cell 로돼지폐에서분리한세포로서무균적으로부검하여 얻은돼지의폐에 PBS 를넣고마사지해준후 PBS 를다시회수하여 BAL cell 만분리하였 다. 3-4 일계대후분석하였다. 그림 17. 돼지 BAL 에서의 pifn- 의변화. pifn- ELISA 결과에서는 RITC-Dextran-Nanogel 200ug 에서 pifn- 가증가하는결 과를확인할수있었으나 western blot 에서는확인할수없었다 ( 그림 17). (2) 돼지비장유래유사탐식세포를이용한실험결과 위의여러종류의 cell들로시도한결과긍정적인결과를얻지못하여돼지조직들로 primary culture를하였다. 첫번째로면역세포가많이존재하는비장과편도를이용하여시도하였다

34 그림 18. 돼지평도와비장의 primary culture 조직샘플을일반적인 Primary culture (Enzyme digestion) 하였을때편도의경우 Target ( 면역계통 ) 하고자하는세포를찾기가힘들다고판단이되었고비장의경우가능성이있음을확인하여비장을이용하여시도하였다 ( 그림 18). 다만이와같은방법의경우일정배양시간이지나면기질을이루고있던세포가우세하게배양됨을파악하였다. 그림 19. 돼지비장 primary culture 이후에가능성이높은조직으로비장을선정하고 Target하고자하는세포의수율을높이기위해방법을모색하였고비장조직을 Collagen gel에 Explant 하여배양을해본결과 ( 그림 19) 면역세포로여겨지는세포를확보할수있었다. 확인을위해해당세포를회수하여재배양시킨후 RITC-Dextran Nanogel을처리하여관찰하였다

35 그림 20. Porcine spleen primary cell 과 RD-NG 의 uptake 확인 돼지비장 explant derived cell 에 RITC-Dextran-Nanogel 을 100ug 을처리하고 48hr 후 현미경관찰결과 ( 그림 20) 면역세포처럼보이는세포에 red signal 을확인하였으며이결 과를통해 uptake 를확인할수있었다. 그림 21. Porcine spleen primary cell 과 RD-NG 의 uptake 확인

36 또한 DAPI 와 merge 한결과 ( 그림 21) 핵내부에서 red signal 을관찰할수있었다. 한편면 역세포의수율을높이기위해비장조직을 Collagen gel 에 Explant 하여배양하였지만여전 히세포의양이너무적어다른실험을진행하기에어려움이있었다. 그림 22. Nanogel 에의한세포독성 상기돼지비장의 primary culture를이용한실험에서 RT-PCR을진행한결과 ( 그림 22) control과비교하여 RIG-1, IFN- 와 MDA5, IRF3의증가는보이지않았다. 하지만 IL-1β 이 poly IC와 Nanogels에서증가한것을확인하였고, TNF- 가증가된다는것은 Nanogel 이세포에약간의독성으로판단될수있기때문에 IL-10과 IL-1β 을추가하여해석해본결과, 독성이있다는것을확인하였다. (3) 돼지 PBMC 유래유사탐식세포를이용한실험결과 primary culture 에서두번째로시도한돼지혈액에서 PBMC 분리하여진행하였다. EDTA 채혈한전혈을 PBS 와 1:1 희석하여준다. 그리고 15ml튜브에 3ml Ficoll을넣은후 1:1로희석한전혈을 9ml위에조심스럽게올려준다. 원심분리하여 Ficoll층위에걸려있는 PBMC 회수해준다. 이후 wash해주고 seeding한다. 2hr 후상등액은다른 dish로옮겨주고부착한세포들은 media change만해주는데 M1 Macropage만얻기위해 Porcine GM-CSF를 Growth media에넣어주어 change 해준다 ( 그림 23A). 12hr 후부착세포현미경결과이다 ( 그림 23B). A에서상등액을계대해준세포이며 12hr후현미경결과이다 ( 그림 23C). 이때는약간세포가죽은듯하게검은세포들이관찰되었으며이 ( 그림 23D) 는부착세포에 Porcine GM-CSF가함유되지않은 media를사용한결과로세포가죽은것같은검은부분들이보였다. 결론적으로우리가원하는유사탐식세포로 ( 그림 23B) 의세포를실험에이용하였다. 하지만이경우에서도 macropage와유사한세포의양이적어실험하는데어려움이있었다

37 그림 23. 돼지 PBMC 의분화과정. 그림 24. 돼지 PBMC 를이용한 RNA isolation. Macropage와가장유사한 ( 그림 23B) 세포분석을위해위의조건 ( 그림 24) 으로물질을처리하여 24hr후 RT-PCR을하였으나 sample을수득하기전떠있는세포들이많았으며 RNA isolation하여 nano drop을찍은결과농도가낮아더이상진행할수없었다. 이를보완하기위해다음시도에서는세포의양을더많게하여 seeding 하여 Western blot을하였다

38 그림 25. 돼지 PBMC 를이용한 Western blot. 상기의내용으로보완하여실험해보았지만세포의양이매우적었으며 phosph-nf-kb가 actin과비례하는양상으로나타났다 ( 그림 25). 지금까지결과로는부족한부분이많으며유사탐식세포를수율을높이는실험을진행하고있다. 돼지의여러가지 cell line과돼지에서다양한 1차배양세포들로시도하였고 RIG-1 선천성면역 system의확인을못하였다. 그원인으로는필요한유사탐식세포의수가부족하여분석하기어려웠으며상대적으로다른기질세포가많았기때문에 RIG-1선천성면역체계의활성이낮아결과를보기어려웠다. 그래서현재유사탐식세포를더늘릴수있는분화조건확립하기위해실험을진행중이다. 3-2 절. 돼지인터페론알파 8 의클로닝 1. 돼지말초혈액세포에서인터페론알파 8 (IFNα8) 의자발적발현 본연구진은한국돼지 (Sus scrofa domestica) 의신선한말초혈액세포로돼지 IFNα8 발현조절을분석하기위해서돼지의전체혈액세포에 LPS, Poly I:C, VSV 자극제를처리하였다. 흥미롭게도, 돼지 IFNα8의자발적인발현이자극받지않은대조군에서검출되었고, 면역자극제를처리한것에는 IFNα8 전사체의의미있는유도는없었다 ( 그림 26). β-actin은전사량의변화에기인한것이아니라는것을보여주기위해분석했다. 그림 26. 각종면역자극에대한인터페론알파 8 의발현

39 본연구진은면역자극제를처리하지않은대조군전사체의 RT-PCR 산물을사용하여 TA 클로닝을하였고, DNA 서열을검증했다 ( 그림 27). 돼지 IFN의오픈리딩프래임은 "Met" 잔기에대한개시코돈및종결코돈 "TGA" 를포함하는 570 염기쌍으로이루어졌다는것을알수있었다. 23개의소수성신호펩티드아미노산서열은녹색으로강조하여표시했다 ( 그림 27). 그림 27. 돼지인터페론알파 8 의유전자염기서열및아미노산서열 2. 국내돼지의 IFNα8 의아미노산서열규명 TA클로닝으로확보한 DNA 서열로부터분석된한국돼지 IFNα8의아미노산서열을공개된돼지 IFNα8 아미노산서열과비교하기위해서정렬한결과다음과같다 ( 그림 28). 한국돼지로부터얻은 IFNα8은공개되어있는 IFNα8 아미노산서열 (Accession No: ACV42397) 과 98.4 % 동일한것으로나타났다 ( 그림 28). 3개의아미노산잔기가공개된돼지 IFNα8과비교해서차이가났고상이한잔기는노란색으로강조하여표시했다. 이번연구로획득한한

40 국돼지 IFNα8은 GenBank에등록번호 KX275310로등록하였다. 시그널서열이없는성숙단백질영역 (Met/1-Gly/23) 을대장균에서발현을위해 pproex/hta 벡터에서브클로닝하였다. 한국돼지의성숙 IFNα8의 2 개의아미노산잔기는 GenBank에공개된 IFNα8의아미노산잔기와상이하다 ( 그림 28). 그림 28. GenBank 등재돼지인터페론알파 8 아미노산서열과비교. 3-3 절. 돼지인터페론알파 8 의발현및정제 1. 재조합한국돼지 IFNα8 발현 대장균에서재조합 IFNα8 단백질의발현효율을비교하기위하여, 발현벡터를대장균 BL-21 / Codon 및 Rosetta 균주로형질전환 (transformation) 시켰다. 재조합단백질의생성은 IPTG를첨가함으로써유도되었고, anti-6xhis-tag 항체를사용한 Western blot으로확인했다 ( 그림 20A). anti-6xhis-tag 항체는 IPTG로유도된 25 kda 밴드를인식한것을확인할수있다 ( 화살표 ). 단백질발현은 BL-21 / Codon plus 균주로진행하였고재조합돼지 IFNα8 단백질의생산은불용성분획에존재한다

41 2. 재조합한국돼지 IFNα8 정제 첫번째정제단계는 mini-talon affinity column을사용하여수행했고, 용출된분획을 coomassie blue염색으로분석하였다 ( 그림 29B). 한국돼지 IFNα8의분자량은대략 25 kda로나타났다 ( 그림 29B의화살표 ). 탈론친화성컬럼으로정제된재조합 IFNα8 단백질은 Tris-Hcl (20 mm, ph 9.0) 에투석후음이온교환크로마토그래피로 2차정제하였다. 재조합돼지 IFNα8 단백질의용출최대점은결합된분획에서관찰되었다 ( 그림 30A). 음이온교환크로마토그래피로분획된단백질은 Silver염색으로시각화하였고재조합돼지 IFNα8 단백질의순도를확인하였다 ( 그림 30B). 음이온교환크로마토그래피로정제된재조합돼지 IFNα 8 단백질은 Silver염색에서약 25 kda 및희미한 38 kda 밴드로나타났다. 본연구진은 Western blot으로 38 kda 밴드도돼지 IFNα8임을확인하였다. 정제된재조합돼지 IFNα8 단백질은소혈청알부민 (BSA) 과비교하여정량하였다 ( 그림 30C). 그림 29. Talon 컬럼을이용한재조합돼지인터페론알파 8 의발현및정제

42 그림 30. 양이온교환크로마토그래피를이용한돼지인터페론알파 8 의정제 3-4 절. 돼지인터페론알파 8 의항바이러스효과검증 1. VSV 에대한한국돼지 IFNα8 의항바이러스활성분석 항바이러스분석은한국돼지 IFNα8와대조군인사람 IFNα2를사용했고먼저사람 WISH 세포주에서수행했다. 사람 IFNα2는 VSV(Vesicular Stomatitis Virus) 감염으로부터세포를보호하는반면, 돼지 IFNα8은세포를보호하지못했다 ( 그림 31A). 다음으로소 MDBK 세포주에돼지 IFNα8와사람 IFNα2를처리한결과는모두항바이러스효과를나타냈고 ( 그림 31B) 개 MDCK 세포주에서는사람 IFNα2와돼지 IFNα8가 VSV 감염으로부터보호하지못했다 ( 그림 31C)

43 그림 31. VSV 억제효과를이용한돼지인터페론알파 8 의항바이러스효과확인 2. Mx-1 과 OAS-1 을통한한국돼지 IFNα8 의항바이러스활성분석 한국돼지 IFNα8의항바이러스기전을연구하기위해서 IFN 자극으로유도된유전자를 RT-PCR로분석하였다. 소 MDBK세포주에돼지 INFα8을처리하고 3, 6 시간후분석한결과에서 Mx-1과 2', 5'-OAS-1의발현이증가했고 ( 그림 32A), 사람 WISH 세포에서의항바이러스유전자의발현은사람 IFNα2 처리군에서만증가했다 ( 그림 32B). 흥미롭게도, 개 MCBK 세포에서 Mx-1과 2', 5'-OAS-1의발현이 IFN 자극없이관찰되었다 ( 그림 32C). β -actin의결과는 IFN 자극으로유도된유전자에서실험적오류가없다는것을나타내고있다

44 그림 32. 돼지인터페론알파 8 의항바이러스효과확인 3. 논문게재 본연구진은상기연구결과를정리하여 Immune Network 지에논문을게재하였다. Title. : Species Specific Antiviral Activity of Porcine Interferon-α8 (IFNα8) Authors : Eunhye Kim, Hyunjhung Jhun, Joohee Kim, Unjoo Park, Seunghyun Jo, Areum Kwak, Sinae Kim, Tam T. Nguyen, Yongsun Kang, Insoo Choi, Joongbok Lee, Heijun Kim, Younghyun Kim, Siyoung Lee, Soohyun Kim Journal. : Immune Network Volume : 17(6): Published online 2017 Dec

45 3-5 절. 구제역아데노바이러스백신의대량생산기술을확립 1. 구제역 O 형진천주의 P12A3C 유전자를이용한구제역아데노바이러스 (Ad.JC) 작제 가. 구제역진천주 P12A3C 의합성및아데노바이러스에삽입 본연구진은지난 3년간의연구결과및역학조사결과를고려했을때 2014년국내발생 O 형구제역바이러스인진천주를기준으로하여연구를진행하는것이옳다는판단을하였다. 이에따라구제역 O형진천주 (O/SKR/JC/2014, KX162590) 의구조단백질유전자인 P1과비구조단백질유전자인 2A와 3C를연결하는 3.417Kb의 nucleotide를디자인하고 adeno-vector에 ligation하여구제역아데노바이러스진천주 (Ad.JC) 를제작하였다. 나. 진천주구제역아데노바이러스의발현 구제역진천주의구조단백질유전자 (P12A3C) 를포함하는아데노바이러스 (Ad.JC) 의구제역구조단백질발현은 6 cell culture plate에각 well당 2x10 5 cell/ml의 Adeno-X 293 cell을 3ml을분주하여단층세포를충분히단층을형성할때까지 3일동안배양한후각 well(1.8x10 6 cells) 당구제역진천주의방어항원유전자가함유된아데노바이러스 0.001TCID 50 /cell을접종한후 24시간과 48시간 IFA를진행하였다. 1차항체로는 VP1에대하여특이한 IgG anti-vp1 antibody를사용했고 2차항체로는 anti-mouse IgG-FITC antibody를사용했다. 그결과 ( 그림 33) 접종 24시간, 28시간후에서형광신호를발견할수있었으며시간이지남에따라증가하는것을관찰할수있었다. 그러므로구제역진천아데노바이러스 (Ad.JC) 는진천주의구제역항원을발현하는것을확인할수있었다. A. B. C. 그림 33. 구제역진천아데노바이러스를접종한 Adeno-X 293 세포. (A=0 시간, B=24 시간, C=48 시간 ) 다. 구제역진천아데노바이러스 (Ad.JC) 의면역원성확인 구제역진천아데노바이러스를작제한후정치배양을통해생산한후 8 주령의돼지에 10 8 TCID 50 /ml 의농도로 1ml 씩접종하였다. 접종 3 주후채혈하여분리한혈청으로부터항 체형성유무를 SP ELISA(PrioCHECK FMDV Type O antibody ELISA) 와구제역 LPB

46 ELISA로검사한결과다음 ( 표 1) 과같다. 8번개체가 31.69, 7번돼지는 26.24의 PI 값을나타낸것으로보아낮은정도의면역반응이지만면역이형성되는것을알수있었다. 그러나 LPB ELISA를이용한결과는아래표와같이모두 4배이하를나타내었다. 본연구진은구제역진천아데노바이러스 (Ad.JC) 가면역원성은있으나충분한량을접종하지않았기때문에구제역감염을방어할수있는면역을확보지못했다고원인을분석하고바이오리엑터 (Bioreactor) 를이용하여대량생산후재접종하기로계획하였다. 개체번호 SP ELISA(PI) LPB-ELISA <1:4 <1:4 <1:4 <1:4 <1:4 <1:4 <1:4 <1:4 표 1. 구제역진천아데노바이러스 (Ad.JC) 의면역원성검사결과. 2. 구제역및인터페론아데노바이러스의대량생산기술개발 가. 구제역아데노바이러스을위한세포대량배양기술개발 정치배양 (stationary culture) 을통한바이러스배양에서증식된바이러스의역가는최대 10 8 TCID 50 /ml으로나타나고있다. 이경우유효백신접종농도인 TCID 50 /ml를달성하기위해서 100배농축이필요하다. 과도한농축을통한백신생산방법은대량생산단계에서백신의단가를높이는원인이될수있다. 그러므로부유배양 (suspension culture) 과같은방법을도입하여구제역아데노바이러스의역가를향상시킬필요가있다. 나. Bioreactor ( 부유배양세포배양기 ) 이용을위한세포준비 문헌에의하면아데노바이러스의접종을위한부유배양세포는 HEK293.2sus(ATCC) 를사용하고, 부유배양에사용된배지는 Hyclone SFM4HEK293 media(fbs free) 를사용하는것으로보고되고있다 (GE Healthcare, Sweden). 본연구진은무혈청배지에세포를적응시키기위해서 HEK293.2sus 세포의배양을 25T-Flask부터시작하여 75T-Flask, 175T-Flask 단계별로진행한후 250ml Shaking-Flask 단계까지적응시키는단계별훈련을진행하고마지막으로 Bioreactor에충진하고자하였다

47 그림 34. 가동중인바이오리엑터 (Bioreactor) 바이오리액터의배양조건은리액터제작사의매뉴얼과제작사기술진의조언을바탕으로 아래표 ( 표 2) 에서보는바와같이 8% 이산화탄소, 40% 산소, 52% 공기와분당 75 회회전 조건으로실험하였다. Component CO 2 O 2 Air N 2 rpm Concentrati on 8% 40% 52% 0% 75rpm 표 2. 바이오리엑터 (Bioreactor) 가동조건 다. 바이오리액터배양전단계세포배양 관계자의견수렴결과바이오리액터에서직접세포를배양하는프로토콜은적절하지않은것으로판단하여소형플라스크에서 HEK293.2sus 세포를적응시키고일정숫자의세포가되었을때바이오리액터로옮기는절차가필요했다. 따라서 25T(6ml의배양액을채움 ), 75T(15ml), 175T 30ml), 그리고 250 플라스크 (90ml) 에 10 6 /ml 세포를접종하고시간대별로세포를채취하여그숫자를측정하였다. 그결과 ( 그림 35) 세포접종후 48시간에서 72시간사이에서최대치를보이고있으며반복실험에의해서검증한바세포가안정적으로적응했다고볼수있다

48 그림 35. HEK293.2sus 세포의무혈청배지성장곡선. 처음접종한세포의양을 1로보았을때시간대별세포의증가량으로환산해본결과 ( 표 3) 25T-Flask에서는 72시간후 6.5배증가를보였고, 75T-Flask에서는 48시간후 12배, 175T-Flask에서는 48시간후 19배, 250ml-Shaking Flask에서는 60시간후 35배의증가되는것을알수있었다. Group 0h 12h 24h 36h 48h 60h 72h 84h 25T-Flask T-Flask T-Flask ml-Flask 표 3. HEK293.2sus 세포의무혈청배지성장수치. 라. 바이오리액터를이용한대량배양 이전연구에의하면 shaking flask 에서배양하여 10 9 개의부유배양세포를얻은후 Ad5FMD 바이러스 10 5 TCID 50 /ml 을접종한후 1 시간후에 1L 의부유배양배지를채우고바이오리액

49 터에충진한후 3일후에채득하는것이가장많은바이러스역가를얻을수있다고보고하였다 (Industrial Scale Suspension Culture of Living Cells, Hans-Peter Meyer, Diego Schmidhalter, 2014). 본연구진은세포숫자와바이러스접종량은이전연구를참고하여바이오리액터의생산성을평가하기위한실험을진행하였다. 상기의조건으로세포를준비하고바이러스를접종하고 1L의배지를충진하여접종 0, 24, 48, 72시간의세포접종액 10ml을채취하여 real-time 기법을통해아데노바이러스유전체의양을비교하고바이러스의역가를측정하였다. 그결과 ( 그림 36) 접종 3~4일후에구제역진천아데노바이러스 (Ad.JC) 의역가가최대치에도달하는것으로나타났으며약 5x10 7 TCID 50 /ml인것으로밝혀졌다. 이러한수치는정치배양법에비해서개선된수치라고할수는없지만 1회접종에 1L 가량의세포접종액을수득할수있으므로이점이있다고판단하여농축을진행하였다. 그림 36. 바이오리엑터 (Bioreactor) 를이용한구제역진천아데노바이러스시험생산결과 마. Labscale TFF system 을이용한구제역진천아데노바이러스 (Ad.JC) Labscale TFF system( 그림 37) 은액체를필터에통과시키는방법으로액체내부에들어있는단백질을필터에다량으로포집할수있으며후반작업을통해다시용출시킬수있다. 본연구팀의경험에의하면이러한특성을이용하면세포배양액을 TFF system에통과시킨후소량의배지에용출시키는것으로바이러스를농축할수있다. 또한 TFF system은다양한용량의장비구성이있기때문에향후대량정제에들어가더라도 labscale에서실험한것과동일한조건으로 scale-up이가능하다. 그러므로향후대량생산을고려했을때적합한시스템이라할수있으므로본연구에사용하였다

50 그림 37. Labscale TFF system. 그러므로상기의바이오리엑터 (Bioreactor) 기술로대량생산한구제역진천아데노바이러스 (Ad.JC) 3L를 Labscale TFF system을이용하여제조사의표준프로토콜에따라 100배이상농축을진행하였다. 그결과약 20두분량 (1ml/ 두 ) 의구제역진천아데노바이러스 (Ad.JC) 를생산할수있었으며최종적으로측정된역가는 8x10 9 TCID 50 /ml이었다. 바. 농축된구제역진천아데노바이러스 (Ad.JC) 의면역원성실험 상기에기술된바와같이본연구진은 8마리의 8주령돼지에 10 8 TCID 50 /ml의구제역진천아데노바이러스 (Ad.JC) 를 1ml접종한결과면역원성을보이기는하지만충분한면역을형성하지는못했다. 한편바이오리엑터 (Bioreactor) 를이용한대량생산결과 8x10 9 TCID 50 /ml의구제역진천아데노바이러스를 20두분량생산할수있었으며관련문헌을통해충분한면역력을발휘할수있을것이라판단하고접종실험하였다. 이를위해 S 농장에서 8 주령돼지 10 마리를선발하고이중 5 마리에는구제역진천아데노 바이러스 (Ad.JC) 를 1ml 씩접종하고 5 마리에는 M 사의상용백신을 2ml 씩접종하였다. 구제역진천아데노바이러스 (Ad.JC, 1ml) 상용백신 (1ml) 동물의수 5 5 표 4. 농축된구제역진천아데노바이러스 (Ad.JC) 의면역원성동물실험편성

51 그후 12주령에채혈하여혈청을분리하고 FMDV type O SP ELISA(Prionics AG, Switzerland) 을이용하여구제역특이항체를검사하였다. 그결과 ( 그림 38) 구제역진천아데노바이러스 (Ad.JC) 접종군에서는 5마리중 3마리가양성으로나타났으며 (60%) 상용백신접종군에서는 5마리중 5마리가양성으로나타났다 (100%). PI값의분포를 t-test로비교해본결과구제역진천아데노바이러스 (Ad.JC) 접종군과상용백신접종군간의 PI값에의미가있는차이는없는것으로 (P=0.074) 나타났다. 그림 38. 구제역진천아데노바이러스 (Ad.JC) 와상용백신의면역원성비교 2. 구제역홍콩아데노바이러스작제및구제역면역항원의생산 가. 구제역홍콩아데노바이러스 (Ad.HK) 의작제및대략생산 1 차년도연구에서사용한구제역아데노바이러스진천주의경우면역능이다소떨어지는 것으로밝혀졌다. 이에따라구제역 type O 홍콩주를이용한새로운구제역아데노바이러 스 (Ad.HK) 를제작하였다

52 그림 39. 구제역홍콩아데노바이러스 (Ad.HK) 의제작개념및 CPE 확인 제작한새로운구제역아데노바이러스 (Ad.HK) 를이전연구결과에서습득한바이오리엑터기술을이용하여대량생산하였다. 그후 Adeno-X Mega purification kit(clontech, USA) 와 Vivaspin 20(Sartorius, Germany) 를이용해서정제하고농축했다. Adeno-X Mega purification kit은 size exclusive filtration system의일종으로실험실수준에서사용할수있도록소형화하여제작되었다. 지난연구에서사용한 TFF system은다양한장점이있음에도불구하고소량시험에서는적합하지않고아데노바이러스이외의단백질또한농축된다는문제점이발견되어변경하게되었다. Vivaspin 20의경우단백질농축필터로서원심분리에의한단백질농축이가능하다. Adeno-X Mega purification kit을사용하여 1차정제및농축후용출액은바이러스의농도가목표치인 TCID 50 /ml에는도달하지못할것으로예측하고 Vivaspin 20을사용하여 2차농축하는것으로계획하였다. 그림 40. Adeno-X Mega purification kit 의개념도및사용예시

53 상기서술한방법으로 2차농축까지마친구제역홍콩아데노바이러스 (Ad.HK) 의역가를측정하기위해서면역염색법을이용하여역가를측정한결과 1.012x1010ifu/ml임을알수있었다. 학계보고에따르면 ifu는 pfu와동가인것으로밝혀져있다 (Bewig, B. & Schmidt, W. E., BioTechniques, 2000). 그림 41. 면역염색법을이용한역가측정예시및실험결과 나. 대량생산된구제역아데노바이러스의면역원성시험 최종적으로생산된구제역아데노바이러스 (Ad.HK) 의효능을평가하기위해서 8주령돼지를이용하여다음과같이군을설정하고동물실험을진행하였다. 먼저실험돼지 7마리를선발하고실험군 4마리와대조군 3마리로설정하였다. 실험군에는구제역홍콩아데노바이러스 (Ad.HK) 를 ifu/dose로접종하고대조군에는 PBS를 1ml 접종하였다. 실험군 대조군 구성 4마리 3마리 접종 1.0x10 10 ifu/dose PBS 채혈 접종후 0,1,2,3,4 주간채혈 표 5. 구제역홍콩아데노바이러스 (Ad.HK) 면역원성실험 접종 0, 1, 2, 3, 4, 5주후에채혈한혈액에서혈청을분리하고혈청으로부터 Priocheck FMDV type O ELISA kit(pirbright, UK) 와 FMDV type O LPB ELISA를이용하여구제역특이항체를분석한결과다음 ( 그림 42) 과같다. SP ELISA결과에서는접종후 4주까지모두구제역항체음성 (PI값을기준으로 50 이상일때양성판정 ) 을나타내었다. 그러나항체가증가하는경향성은확인할수있었다. LPB ELISA결과에서는접종 3주후부터구제역항체가가 1:16 이상을나타내고있으며한마리에한해서는 1:45을나타내어일정수준이상의구제역방어능을갖춘것으로확인되었다

54 그림 42. 구제역홍콩아데노바이러스 (Ad.HK) 면역원성실험결과. 결과적으로 1.0x10 10 ifu/dose 의용량으로 1 회접종할백신접종사실을확인할수있는수 준인 1:16 이상의항체를형성할수있지만구제역의감염을방어할수있는수준인 1:45 이상의항체를형성하지못하는것으로확인되었다. 다. 구제역홍콩아데노바이러스를이용한구제역 O 형항원의생산 아데노바이러스벡터는 DNA 전달체계의일종으로세포에감염하여벡터에삽입되어있는유전자를전달하여특정단백질을발현하도록하는수단의하나이다. 본연구팀은지난연구기간동아인간아데노바이러스타입 5가돼지에도감염한다는사실에착안하여구제역유전자중 P12A3C를아데노바이러스벡터에삽입하고돼지의체내 (in vivo) 에서구제역구조 (SP) 단백질이발현되도록하여백신을연구해왔다. 한편같은원리로구제역아데노바이러스는 in vitro상에서구제역 SP항원을생산할수있다. 그러므로본연구진은문헌조사 (Jia-Qi Chu et al., Journal of Bacteriology and Virology, 2012) 를통해돼지의신장유례세포의하나인 IB-RS2 세포에아데노바이러스가감염할수있다는사실을확인하고구제역항원의발현을확인하기위한실험을진행하였다. 먼저정치배양을통해 monolayer로준비된 IB-RS2 세포에구제역홍콩아데노바이러스 (Ad.HK) 를 1MOI로접종하고 0, 1, 2, 3일후에세포를수득하였다. 수득한세포는 3000rpm, 4, 30분조건으로원심분리하여세포 pallet과상층액으로분리하고 pallet만을실험에사용하였다. pallet은 lysis buffer(m-per, Thermo Scientific) 를이용하여용해시키고세포의 debris를제거하기위해서 3000rpm, 4, 30분조건으로원심분리하여상층액만을취하였다. 구제역 O형구조 (SP) 단백질의발현사실을확인하기위해서각각의용해액을 Western blot하여분석하였다. 1차항체로 mouse anti-fmdv type O VP1 IgG를사용하였으며 2차항체로 goat anti-mouse IgG IgG-HRP를사용하였다

55 그림 43. IBRS2 세포를이용한구제역항원 발현확인. 그결과 ( 그림 43) 접종후 1일부터구제역 VP1에반응하는밴드를얻어낼수있었으며그림에는누락되었지만마커를이용해밴드의크기를볼때약 23Kda임을확인할수있었다. 사용한항체와단백질의크기를고려했을때구제역 O형구조단백질중 VP1의발현을확인할수있었다. 다. 구제역 O 형구조항원의정제 문헌정보 (Jae-Ku Oem et al., Vaccine, 2007) 에따르면 5%~40% CsCl gradient에구제역구조 (SP) 단백질발현액을로딩하여 35000rpm, 4, 16시간조건으로초원심분리하면구제역구조 (SP) 단백질만을순수분리할수있다는내용을참고하여상기의구제역 O형구조 (SP) 단백질을정제하였다. 그림 44. 초원심분리를이용한구제역 O 형구조 (SP) 단백질의정제

56 그결과 ( 그림 44) 우측과같이 4개의밴드가형성되었다. 이중어느밴드에구제역구조항원이있는지알아보기위해초원심분리결과를밑에서부터 500ul씩분리하여 10ul를구제역항원진단 RAPID 킷에로딩하였다. 그결과왼쪽의사진과같이 6번, 7번, 9번, 10번, 11번, 12번분획에서상당히강한양성신호가나타났다. 상기한문헌에따르면 6번분획이온전한구제역구조 (SP) 단백질을의미하는것으로명기되어있어 6번분획에대한 SDS-PAGE 실험을진행하였다. 그림 45. 구제역 O 형항원정제결과. SDS-PAGE결과를 NC paper에 transfer한후 Ponceau S 염색하여그결과 ( 그림 45) 를확인하였다. 그림과같이단백질의순도가높았으며하단에 VP1, VP2, VP3에해당하는단백질을확인할수있었으며상단에 P1에해당하는단백질을확인할수있었다. 그러므로 IBRS2세포주에구제역홍콩아데노바이러스 (Ad.HK) 를접종하여생산해낸구제역 O형구조 (SP) 단백질은주요구제역구조 (SP) 단백질을모두함유하고있으며그순도가매우높다는점을알수있었다. 라. 구제역 O 형면역항원특허출원및산업화 상기기술한바와같이본연구진은구제역 O 형면역항원을성공적으로발현했으며이를이 용하여출원번호 , 발명의명칭 구제역바이러스에대한항체검출용조 성물 로서특허를출원하였다. 또한구제역항원, 항체진단키트개발업체인 메디안디노스틱과협업하여구제역 O형항체진단물질로서산업화가능성을연구중에있다. 이를위해서 메디안디노스틱연구소에구제역홍콩아데노바이러스 (Ad.HK) 와 Adeno-X 293세포주, 그리고 IBRS-2세포주를분양했으며연구소내부시설에세포와바이러스가정착할수있도록기술적지원을하고있다

57 그림 46. 메디안디노스틱연구소자료. 또한 메디안디노스틱은내부적으로구제역아데노바이러스를이용하여생산한구제역면 역항원을이용하여구제역항체진단 ELISA 킷의시제품 ( 그림 47) 을생산하고제품에대한 검증작업을진행중이다. 그림 47. 구제역항체 ELISA 시제품 구제역항체진단 ELISA 키트시제품에대해서 27 개의혈청을이용하여시험해본결과 ( 그 림 48) 다음과경쟁제품과경향성은비슷하지만정확도와민감도가미진한것으로나타났 다. 이에대해서추가실험을통해보완하고제품화할예정이다

58 메디안디노스틱연구소내부실험자료에따르면각세포주와바이러스가안정적으로정 착되었으며항원을생산할준비가완료되었다. 이에따라기술이전에대한협의가마무리되 었으며보고서를작성하는 2018 년현재행정적인절차만을남겨둔상태이다. 그림 48. 구제역항체 ELISA 키트시제품평가결과. 4. 아데노바이러스를이용한각종분자면역보조제생산및공동접종 가. 구제역백신효능증가와분자면역보조제 보고에따르면구제역백신의면역증강효과를위해 INF-alpha/beta/gamma 등을분자면역보조제로사용이가능하다는연구결과가있다 (Moraes MP et al., J Virol, 2007). 본연구진은이를참고하여각종돼지면역사이토카인을클로닝하고자시도했으며그중 INF-alpha/beta, IL2, CD40L의유전자를클로닝하고아데노바이러스벡터에삽입하는데성공했다. 이중 INF-alpha/beta는 type 1 interferon으로세포의초기면역에관여한다. 그러므로본연구진은인터페론알파아데노바이러스를우선실험하였다. 나. 인터페론알파작용저해제를이용한인터페론아데노바이러스의생산시험 본연구진이인터페론알파아데노바이러스를제작한후평판배양으로인터페론알파아데노바이러스를생산하고역가를측정한결과최고 10 4 TCID 50 /ml을넘지못했다. 문헌조사 (Terawaki S et al., J Immunol., 2011) 를통해배양세포에인터페론알파아데노바이러스를접종한결과고농도의인터페론알파의면역작용으로세포의자가사멸이촉진되었고그결과아데노바이러스가충분하게생산되지않는다는결론을얻었다

59 이를해결하기위해본연구진은다양한인터페론알파저해제를탐색하였고기존의인터페 론알파저해제는항암효과가있는제제로알려졌으나고가의제품이라서실험실이나축산 현장에서사용하기곤란한것을지난 년연구결과에서알수있었다. 본연구에서는새로운제제를탐색했고, 여러약제중 Fludarabine phosphate라는제품은주로사람 B세포성백혈병에사용되는약제이며가격이저렴하다. 이제제는 STAT1 inhibitor의일종으로type I interferon pathway를억제하는작용을하는것으로분자생물학적으로규명이되어있다. 따라서 Fludarabine phosphate를세포배양액에첨가하는것으로인터페론알파아데노바이러스의역가를높일수있을것으로예상하고실험을진행하였다. 군인터페론알파아데노바이러스 Fludarabine phosphate 음성대조 0 TCID 50 / ml 양성대 조 1.8x x x x x10 4 TCID 50 / TCID 50 / TCID 50 / TCID 50 / TCID 50 / ml ml ml ml ml 1.8x10 4 TCID 50 / ml 0mM 0mM 0mM 0mM 0mM 0mM 0mM 표 6. Fludarabine phospate 를이용한인터페론아데노바이러스의감염력증가확인실험군 Adeno-X 293 세포를 monolayer 로준비하고실험군 ( 표 4) 을편성하여바이러스접종 0, 3, 6, 9, 12, 18, 24, 36, 시간후에아데노바이러스 real-time PCR 기법을이용하여분 석하였다. 그림 49. Fludarabine phosphate 의인터페론알파억제효과확인. 그결과 ( 그림 49) Fludarabine phosphate 의용량과처리후시간에따른경향성을전혀확 인하지못했다. 결과적으로 Fludarabine phosphate 는 in vivo 에서는효과가있지만 in vitro

60 에서는효과가없다고할수있다. 해당실험의결과에따라 INF-alpha/beta 는아데노바이 러스벡터를이용하여대량으로생산하는데어려움이있을것으로예측하고본연구진은 IL2 아데노바이러스 (Ad.IL2) 를대량생산하여동물실험하는것이옳다고판단하였다. 다. IL2 아데노바이러스의생산및동물실험 본연구진은 IL2 아데노바이러스 (Ad.IL2) 를대량생산하기위하여평판배양을통해실험한결과최고 3.1x10 10 TCID 50 /ml의바이러스를수득할수있었다. 이에따라추가적인대량생산연구없이동물실험을진행할수있었다. SPF 3주령의 BALB/c 마우스 50마리를아래의표 ( 표 5) 와같이 4개의실험군으로준비하였다. A군 (15마리) 은 commercial vaccine과 IL2 아데노바이러스 (Ad.IL2) 를접종하였고, B군 (15마리) 은 commercial vaccine만접종하였다. 그리고 C군 (10마리) 은 Ad.IL-2만접종하였고, 마지막으로 D군 (10마리) PBS를접종했다. 접종 0, 1, 2, 3, 7, 14, 21, 28 후에채혈하여얻은혈액으로부터혈청을분리하였다. 그룹동물의수처치접종방법채혈방법 A. 시험군 15 Commercial vaccine 200ul + AdIL TCID 50 /dose 접종 B. 시험군 15 Commercial vaccine 200ul 접종 C. 시험군 10 AdIL TCID 50 /dose 접종 D. 대조군 10 PBS 접종 IM Facial vein 표 7. IL2 아데노바이러스와구제역백신의공동접종동물시험 ( 마우스 ) 실험군편성 라. SP ELISA 실험결과 PrioCHECK FMDV Type O antibody ELISA 를사용하여접종 0, 1, 2, 3, 7, 14, 21, 28 일후혈청을검사한결과다음그림 ( 그림 50) 과같다. 그림 50. 구제역 O 형 SP ELISA 검사결과

61 접종후 2 일까지는모두구제역항체음성을나타내었다. 그러나 3 일후부터항체가증가 하는경향성을확인할수있었다. 결과적으로구제역백신접종군과비교하였을때, 구제역 백신과아데노 IL2(Ad.IL2) 공동접종군의항체형성이낮음을확인할수있다. 마. LPB ELISA Screening test LPB ELISA( 액상차단효소면역법 ) 을사용하여구제역백신접종군과구제역백신과 IL-2 아데 노바이러스 (Ad.IL2) 공동접종군의구제역특이항체형성정도를확인하였다. 그림 51. IL2 아데노바이러스 (Ad.IL2) 와구제역백신공동접종시험 LPB-ELISA 결과. 구제역백신접종군과구제역백신과 IL-2 아데노바이러스 (Ad.IL2) 를동시접종군의접종후 0, 1, 2, 3, 7, 14, 21, 28일의혈청으로 LPB ELISA Screening test를진행한결과 ( 그림 51) 구제역특이항체의증가추세를확인할수있었다. SP ELISA 검사결과와는다르게 LPB-ELISA 검사결과에서는구제역백신과 IL2 아데노바이러스 (Ad.IL2) 공동접종군의항체생성이구제역백신접종군에비해빠르게증가하는것을확인할수있었다. 또한접종후 21일과 28일에는항체의양이더높게측정되는것으로나타났다. 바. 돼지를이용한 IL-2 아데노바이러스의목적동물적용실험 상기의마우스실험결과구제역백신과 IL-2 아데노바이러스의공동접종에의한효능증대효과가확인되어목적동물인돼지에실험을진행하였다. 9마리의돼지를 3개의군으로나누고각각구제역백신, 구제역백신 + IL-2 아데노바이러스, IL-2 아데노바이러스를접종하였다 ( 표 8). 그리고접종후 0, 1, 2, 3, 7, 14, 21일에채혈하여구제역바이러스를이용한

62 바이러스중화시험 (VNT) 를진행하였다. 그룹동물의수처치접종방법채혈방법 A. 시험군 15 Commercial vaccine 2ml + AdIL TCID 50 /dose 접종 B. 시험군 15 Commercial vaccine 2ml 접종 C. 시험군 10 AdIL TCID 50 /dose 접종 IM external jugular vein 표 8. IL2 아데노바이러스와구제역백신의공동접종동물시험 ( 돼지 ) 실험군편성 협동 - 농림축산검역본부의 BL3 시설에서진행한구제역바이러스중화시험 (VNT) 결과다음 그림 ( 그림 52) 과같이접종후 7 일차에서구제역백신단독접종군에비해공동접종군의 VNT 역가가높게나타났다. 그림 52. IL2 아데노바이러스 (Ad.IL2) 와구제역백신공동접종시험 VNT 결과 ( 좌 ) 마니사주, ( 우 ) 진천주. 사. 향후연구계획바이러스중화시험 (VNT) 결과에서마니사주의경우 3일과 7일, 진천주의경우 7일에서구제역백신단독접종군보다높은중화항체가를나타내었다. 그러나그수치가유의성을보일만큼큰차리를보이지않았기때문에추가적인연구를통해 IL-2 아데노바이러스의효능을보강할필요가있다. 그러므로본연구팀은 Poly I:C, CpG, dsrna 등 IL-2의기능을보강할수있는물질을탐색하고아데노바이러스와혼합을통해구제역백신의효능증대효과를보강하고자한다

63 4 장. 목표달성도및관련분야기여도 4-1 절. 목표달성도 코드번호 D poly IC 담지 Nanogel 담체제작 : 80% 가. 본연구진은 Basic-Nanogel(B-NG), RITC-Dextran-Nanogel(RD-NG), Poly IC-Nanogel, Poly IC-RITC-Dextran-Nanogel(Poly IC-NG) 등다양한 nanogel 을마우스유례세포에서스크리닝하여 RD-NG가담체로서적당하다는사실을확인하였다. 나. RD-NG를이용하여마우스 in vitro, in vivo 실험을진행한결과 nanogel 의면역증진및인터페론알파분비유도효과를유전자단계에서확인했으며 RD-NG는면역반응을유도하여구제역초기면역에기여할수있는우수한담체임을확인하였다. 이결과는출원번호 으로특허출원하였다. 다. RD-NG를목적동물인돼지에실험하기에앞서 in vitro상에서검증하고자 RN-NG에반응하는돼지유례모델을탐색했다. 이를위해서돼지유례세포주 (PAM, PAM-CD164, BAL, IBRS2), primary cell culture(tonsil, spleen), PBMC 등에대한 RD-NG의반응을관찰하였고그결과돼지 spleen primary cell culture와 PBMC에서반응성을확인하였다. 라. 그러나상기의세포는살아있는돼지에서만얻을수있는실험재료로서수급에어려움이있어최종적으로연구를완성하지못하였다. 지금까지습득한기술을이용하면추가연구를통해쉽게성과를낼수있을것이라판단하여목표달성도를 80% 로측정하였다. 2. 돼지인터페론알파 8 클로닝 : 100% 가. 우리나라돼지의인터페론알파 8 의유전자를성공적으로클로닝했으며 GenBank 에등재 되어있는돼지인터페론알파의유전자와는차이점이있었다는사실을밝혀냈다. 나. 우리나라돼지의인터페론알파 8 유전자염기서열은 GenBank 에등재되었다 (ACV42397). 3. 재조합돼지인터페론알파 8 의발현및정제 : 100% 가. 본연구진은상기에서클로닝한돼지인터페론알파 8 의유전자를대장균에서성공적으로 발현하고이를높은순도로정제했다. 나. 형질전환된대장균은유전자원은행에기탁했다 (KX275310). 4. 재조합돼지인터페론알파 8 의항바이러스효과검증 : 100% 가. 상기연구를통해획득한재조합돼지인터페론알파 8 의바이러스억제효과를다양한세 포에서확인하였고, 면역신호전달수준에서확인했다. 나. 그결과논문으로 Immune network 지에출간하였다

64 5. 구제역아데노바이러스의공장스케일대량생산기술확립 : 90% 가. 지난 2년간의연구결과와문헌자료를고려하였을때아데노바이러스벡터를이용한구제역백신이 1회단독접종으로충분한방어능을지니기위해서는 TCID 50 /dose의용량은부족하고 TCID 50 /dose의용량으로접종해야하는것으로예측된다. 나. 본연구진은바이오리엑터 (Bioreactor) 와다양한정제및농축방법을복합적으로연구하여 TCID 50 /dose 수준의생산능력을갖췄지만 TCID 50 /dose에는도달하지못하였다. 다. 연구초기 10 8 TCID 50 /dose 수준의기술이었지만연구과정에서대량생산및정제및농축기술을습득했고시간이충분히주어지면 TCID 50 /dose에도달할수있을것으로예측되기때문에목표달성도를 90% 로측정하였다. 6. 아데노바이러스를이용한각종분자면역보조제생산및공동접종 : 90% 가. 본연구진은 INF-alpha/beta/gamma, IL2, CD40L등분자면역보조제로사용될수있는유전자들을돼지의혈액에서스크리닝하고클로닝하여아데노바이러스벡터에삽입하는데성공했다. 나. 연구초기에는해외연구사례를참고하여 (Moraes MP et al., Vaccine, 2003) 인터페론알파아데노바이러스가가장유용할것이라고판단하고연구를진행하였으나인터페론알파의세포성장억제효과로인해유효아데노바이러스농도에도달하지못했다. 또한적절한인터페론알파억제제를스크리닝하는연구또한좋은결과를얻지못했다. 다. 이에따라 IL2 아데노바이러스를구제역백신과공동접종하는것을목표로연구를진행하였으며보고서를작성하는현재시점에마우스실험모델에서구제역백신과공동접종효과를확인하고있다. 라. 현재까지분석결과 IL2 아데노바이러스의면역증진효과가있는것으로나타나고있다. 보고서종료시점에완성된결과를재시하지는못했지만긍정적인결과가도출될것이라예측되기때문에목표달성도를 90% 로측정했다. 4-2 절. 관련분야기여도 1. poly IC 담지 Nanogel 담체 가. 지금까지연구결과를고려했을때 RD-ND는면역작용을증강시키고 INFα의분비를촉진하는것으로보인다. 이와같은특성은면역보조제 (adjuvant) 와매우비슷하다고할수있다. 나. 그러므로 RD-ND에항원을로딩하는것으로면역을증강시키는면역보조제로사용할수있으면향후백신시장에서새로운보조제로주목받을것이라고기대된다

65 2. 돼지인터페론알파 8 의항바이러스효과 가. 본연구진은이번연구를통해한국돼지의인터페론알파8의염기서열이해외돼지와는다르다는점을밝혀내었다. 또한이를통해재조합돼지인터페론알파8을발현하고정제하는데성공했다. 나. 연구결과를통해재조합돼지인터페론알파8은기존의다른치료법보다낮은세포독성으로바이러스감염을예방할것으로기대된다. 그러므로재조합 IFNα8 단백질은단족접종으로어린자돈에서초기면역증진을통해로타바이러스, TGEV, PEDV감염을예방하는제제로개발이가능할것으로보인다. 다. 더불어다른백신과공동접종하는것으로백신의효능은증가시키고백신의독성은감소시킬수있다. 이러한특성은백신의성능향상없이백신의효능을증진시킬수있는방법이므로동물약품시장에서각광받는기술이될것이다. 3. 구제역아데노바이러스백신의대량생산기술확립및분자면역보조제 가. 현재사용하고있는구제역백신은세포배양을통해생산후정제하여판매된다. 구제역바이러스는그위험성을고려하여 BL3 등급이상의연구및생산시설에서만취급할수있으며이에따라연구및생산에큰제약이있다. 아데노바이러스벡터는 BL2 등급의물질로서아데노바이러스의증식을돕는세포에서만자랄수있으며체내에서는증식능력이없어매우안전하다. 그러므로안전한구제역바이러스백신을빠르게국산화하여한국형구제역을방어하는것으로축산업에기여할수있다. 나. 또한상기한바와같이구제역백신연구와생산에는제약이있어현재로서는국내백신업체에구제역백신생산능력이없다. 하지만구제역아데노바이러스백신은제약이낮으므로빠른시일내에구제역아데노바이러스백신의생산능력을습득할수있을것으로보인다. 그러므로국내구제역백신시장에기여할수있다. 다. 한편축산업에서널리사용하고있는면역보조제 (Adjuvant) 는 mineral oil을근간으로하여제작한것으로조직독성이나타나는문제점이있다. 우리나라는구제역상시백신정책에따라서법적인구속을통해가축에게백신을하도록정하고있으나돼지의경우접종부위가상품가치가높은이근부이고전국적으로한해추산 1조원가량발생하고있는것으로집계되고있다. 아데노바이러스를이용한분자면역보조제는조직독성이없으므로농가소득에기여할수있다

66 5 장. 연구결과의활용계획 코드번호 D 절. poly IC 담지 Nanogel 담체제작 1. 이번연구기간동안마우스모델을이용한 in vitro, in vivo 실험을통해 RD-ND 에의한 면역활성및 INFα 분비증가를확인할수있었다. 이러한특성을이용하면구제역면역항 원을 nanogel 에 load 하는것으로백신의효능을증가시킬수있을것으로생각된다. 2. 이를확인하기위해서는목적동물인돼지모델을이용한실험이필수적이나적합한연구모 델을선별하기에는시간이부족했다. 그러므로돼지실험모델을통한 RN-ND 의면역증강 실험이필요하다. 3. Nanogel 담체는구제역뿐만아니라백신에의한면역이잘성립되지않는다양한바이러스에대해서백신의효능을증가시키는첨가제혹은면역보조제 (adjuvant) 로활용이가능할것으로기대된다. 그러므로이번연구를통해출원한특허를이용하여기술이전및산업화를진행할예정이다. 5-2 절. 돼지인터페론알파 8 의항바이러스효과 1. IFNα, IFNβ, IFNω 및 IFNτ는공통 1 형수용체인 IFNaR1 및 IFNaR2에결합하지만, 이들의결합과생물학적활성은아마도 1 형 IFN 리간드사이의 3 차원입체구조차이로인해서종, 조직및세포특이적차이를보인다. 따라서종에따라돼지 IFNα8의활성변화는돼지 IFNα8과인간 IFNα2 사이의아미노산서열의차이로인한것일수있지만돼지 IFNα 8의종특이적항바이러스활성에기여하는추가적인알려지지않은수용체성분이있다는것을배제할수는없다. 돼지 IFNα8의생물학적활성은돼지에서고친화성수용체를지니므로돼지세포에서최적활성을갖는다. IL-1 관련사이토카인리간드는결합수용체이외에보조수용체가필요하므로이미알려진 4 종류의 IFN 리간드에대한수용체는단 2 종류만알려졌으므로밝혀지지않은보조수용체에대한연구가필요하다. 2. 또한이번연구결과는세포를이용한 in vitro 실험에국한되어있다. 돼지인터페론알파 8 의단독접종혹은백신과공동접종을통한면역능증강을확인하기위해서는돼지를이용 한 in vivo 실험이필수적이다

67 5-3 절. 구제역아데노바이러스백신의대량생산기술및분자면역 보조제 1. 구제역아데노바이러스대량생산기술은현재까지연구결과로는 1회접종으로충분한면역을형성할수있는 TCID 50 /dose 까지도달하지못했다. 그러나충분한시간이주어진다면현재까지습득한기술을이용하여유효면역용량까지도달할수있을것으로기대된다. 구제역아데노바이러스의면역원성은이전연구를통해확증된바있으므로생산성개선을통해기술이전및사업화계획이다. 2. 아데노바이러스를이용한분자면역보조제중 IL2 아데노바이러스의면역증진능력에대한실험을보고서를작성하는현시점에서아직진행중이다. 지금까지도출한결과로는 IL2 아데노바이러스의면역증진능력이긍정적인것으로보이고있다. IL2 아데노바이러스와구제역백신공동접종에의한면역증진효과가확인된다면상기구제역아데노바이러스백신이 1회단족접종유효면역농도에도달하지못하더라도분자면역보조제와공동접종으로구제역에대한면역을확보할수있을것이다. 이에대한추가적인연구가필요하며기술이완성된다면기술이전을통해사업화할계획이다

68 6 장. 연구과정에서수집한해외과학기술정보 코드번호 D 절. Nanogel 담체의면역유도작용 1. RIG-1 유사수용체 (RIG-1 liker receptor, RLR) 연구동향 - 바이러스에존재하는 DNA 또는 RNA를인식하는중요한패턴인식수용체 (Pattern recognition receptor) 의하나이다. - RLR는바이러스에의해감염된세포내에서바이러스 RNA을인식하여 MAVS(Mitochondrial antiviral signaling protein) 와 IRF3(Interferon regulatory transcription factor 3) 등에신호를전달하고최종적으로 1형인터페론 IFN-a 또는 IFN-a을생성하는경로를활성화시킨다. - 생성된 1형인터페론은세포밖으로분비되어모든세포들이갖고있는인터페론수용체에결합하여새로운신호를전달하여바이러스가증식하는것을억제하는항바이러스유전자들의생성을유도한다. - 결과적으로 RLR 신호경로에의한 1형인터페론생성은항바이러스기능에핵심적인역할을수행한다. 2. Dextran 중합체나노물질연구및응용연구동향 - 덱스트란설페이트를포함하는블록공중합체로도포된산화철복합나노입자 ( 동맥경화진단용조영제 ) - PEG와덱스트란 (dextran) 을섞어서메타크릴레이트 (methacrylate) 기와락티드 (lactide) 기를도입한덱스트란의하이드로젤 ( 약물방출이조절되는약물전달체개발 ) - 덱스트란과리포익산으로구성된나노입자에 DTT(dithiothreitol) 를첨가하여가교된다기능성나노입자 ( 약물전달체로이용 ) - 다당류유도체, 폴리알데히드덱스트란 (polyaldehyde dextran) 을이용한 Au-나노입자중합체 ( 차세대광학나노장치의선구물질제조와생물학적적용 - 나노섬유를이용한약물전달시스템의발전방향 ( 나노섬유를이용한약물전달시스템 ) - 덱스트란과젤라팅을고정화한생의학용산화철나노입자의제조 ( 생희학용나노입자제조 ) - 덱스트란과락타이드ㅡ글리콜라이드공중합체를이용한이중층나노미립구제조 ( 나노미립구제조 )

69 3. 나노입자를이용한백신개발연구동향 - 지카바이러스용백신을위한맞춤형 RNA 나노입자 ( 지카바이러스를이용한백신제작 ) - 면역활성유도 DNA스마트나노입자개발 ( 각종질병에대한면역치료제및백신개발 ) -키토산나노입자를이용한약물전달시스템 ( 키토산나노입자를이용한암치료, 유전자치료 ) - 질병의면역치료돕는나노입자개발 ( 다양한질병의항원을나노입자에결합한백신 면역치료제를개발 ) - H1N1 항체생성을유도하는자가조립형나노입자독감백신 ( 독감백신개발 ) - 바이러스나노입자기반의진단분석 ( 나노입자진단분석 ) - 암세포보호막뚫는항암나노물질개발 ( 항암제나노물질개발 ) - 나노입자를이용한백신의합성 ( 감염예방, 자가면역질환치료 ) - 나노패치 : 주구나직접부착가능한새로운백신 ( 나노패치를이용한감염예방 ) - 나노입자를이용한약물전달체계의개선및암치료 ( 나노튜브를이용한단백을감별하는진단기구 ) 6-2 절. 아데노바이러스벡터를이용한백신과면역증강연구 1. A Recombinant Adenovirus Expressing P12A and 3C Protein of the Type O Foot-and-Mouth Disease Virus Stimulates Systemic and Mucosal Immune Responses in Mice, Yinli Xie, Peng Gao and Zhiyong Li, BioMed Research International Volume 2016 (2016), 9 pages - 본논문은구제역제조합아데노바이러스의근육및복강, 구강과안구접종에서의항체가형성에대해비교하였다. radv-p12a3c를이용한 T세포특이적항바이러스반응이백신접종후지속적으로나타난다는것을입증하였다. 불활화된 FMD 백신과 radv-p12a3c 구제역제조합아데노바이러스백터백신을각각마우스의근육과복강, 구강과안구에 3회접종하고각각의구제역특이적 IgA 항체를비교검출하였다. 또한, radv-p12a3c에의해자극된 IL-4 와 IFN- 의수준도기존에사용되는불활화 FMD 백신보다유의하게높았다. 이를통한안전성과면역반응유도측면에서충분히백신으로서가능성을나타내었다. 이를통해일부면역시스템이재조합된아데노바이러스를중성화시키는단점을보완했다고예상되며이러한결과는재조합된아데노바이러스백터백신접종후보다광범위한항체생산능력향상에새로운옵션을제공할수있을것으로생각된다

70 그림 1. 구제역아데노바이러스접종방법에따른항체형성 2. Foot-and-Mouth Disease (FMD) Virus 3C Protease Mutant L127P: Implications for FMD Vaccine Development, Michael Puckette, Benjamin A. Clark, Justin D. Smith, Traci Turecek, Erica Martel, Lindsay Gabbert, Melia Pisano, William Hurtle, Juan M. Pacheco, José Barrera, John G. Neilan, Max Rasmussena, J. Virol. November 2017 vol. 91 no. 22 e 본연구는구제역아데노바이러스백터백신의구성중, P1 polyprotein 을캡시트단백질로절단하기위해적용되는 C3 protease로인한숙주세포의독성을낮추기위해 wild-type 3C로치환하여도입유전자의생산량증가를확인하였다. 이새로운 wild-type C3 (L127P) 는 P1-C3 형질전환유전자를발현하는포유류및박테리아세포에서구제역아데노바이러스백터백신의서브유닛단백질의수율을증가시키고, 다중구제역-혈청형에서 P1 polyprotein을생성하는능력을유지하였다. 이러한 C3 돌연변이구제역아데노바이러스백터백신을이용한구제역백신생산의수율을증가시킬수있는가능성을제공하였다. 그림 2. 치환된 wild-type 3C(L127P) 클로닝및 wild-type 3C(C163A, C142T) 의 Luciferase reading 결과

71 3. Increased humoral antibody response of foot-and-mouth disease virus vaccine in growing pigs pre-treated with poly-γ-glutamic acid, Lee JH, Kang IJ, Kim AR, Noh YS, Chung HC, Park BK, J Vet Sci Jun 30;17(2): 본연구는 γ-pga의조기접종으로인한 FMDV O형항원에대한항체증가율을확인하였다. - 한국에서사용되는 FMD 백신은이중오일에멀젼 (double oil-based emulsion, DOE) 로불활성화된 (O1 Manisa + A Malaysia + Asia 1 Shamir) 가혼합된백신을사용한다. 하지만이러한 3가구제역백신을접종한돼지에서단일구제역백신을접종한돼지에비해면역유도가약하고면역기간이짧은몇가지단점이있다. 이러한단점을극복하기위해 γ-pga와이중오일에멀젼과의비교분석을통해 FMD의어주번트로서사용될수있다는가능성을설명할필요가있다. - 8주령돼지를 12마리씩 2그룹으로나누고한쪽그룹에만 FMD백신접종 3일전에 γ-pga 를근육주사하였다. 50 PI 값에기초하여, 백신접종 3일전 γ-pga가접종된 TS군과 HB군의양성반응은대조군보다높았다. - 이를통해백신접종 3일전 γ-pga의사전접종을인해구제역백신의항체반응이유의하게증가했다고볼수있으며, 구제역백신어주번트의다각적인접근을통해돼지의면역개선에매우효과적이라고볼수있어효과적지만, 실제구제역백신접종 3일전이라는변수가존재하고있어현장에서사용되기어려운문제가발생할수있다. 이러한단점을보완한합리적인백신어주번트의개발이필요할것으로보여진다. 그림 3. 백신접종전 γ-pga 투여에따른항체의변화

72 4. Evaluation of cross-protection against three topotypes of serotype O foot-and-mouth disease virus in pigs vaccinated with multi-epitope protein vaccine incorporated with poly(i:c), Yimei Cao, Zengjun Lu, Dong Li, Pengju Fan, Pu Sun, Huifang Bao, Yuanfang Fu, Pinghua Li, Xingwen Bai, Yingli Chen, Baoxia Xie, Zaixin Liu, Veterinary Microbiology, Volume 168, Issues 2 4, 31 January 2014, Pages 본연구는구제역 O형의 3가지 topotype에대해 poly(i:c) 로통합된 multi-epitope 백신의교차방어효과를입증하였다. 총 45마리에게 poly(i:c) 로통합된 multi-epitope 백신을각각다른용량으로접종하고, 접종후 28일째에 O/Mya/98 ( 동남아시아형 ), O/HN/CHA/93 (Cathay topotype) and O/Tibet/CHA/99 (PanAsia topotype) 을접종하여방어능을확인하였다. - 결과는모든돼지 (n = 15) 가 O / Mya / 98 및 O / HN / CHA / 93 FMDV에대해완전한방어를제공했으며그중 11 개는 O / Tibet / CHA / 99 FMDV로부터보호되었다. 이러한결과를통해 poly(i:c) 가포함된 multi-epitope 단백질백신의접종이돼지에서구제역을효과적으로예방할수있음을보여주었다. - 낮은면역원성과교차방어의약점은펩타이드또는에피토프기반단백질백신의주요한단점이다. 따라서다중 multi-epitope 단백질을강력한세포면역자극제와결합시키는것으로높은수준의 T세포면역을이끌어내고, 에피토프기반백신의면역원성을개선시키는효과적인전략일수있다. - 이전의연구에서는다중 multi-epitope 단백질과오일어주번트를혼합한백신에서는 FMD 에대한완벽한예방을볼수없었다. 이를통해 poly(i:c) 와다중 multi-epitope 단백질을혼합한백신에서는면역효과를향상시키는데사용될수있는매우강력한보조제이며응급백신으로사용될수있다고밝히고있다. 표 1. poly I:C 와구제역항원의공종접종후항체변화및공격접종후방어능변화

73 7 장. 연구개발결과의보안등급 코드번호 D-09 해당없음

74 8 장. 국가과학기술종합정보시스템에등록한연구시설 장비현황 코드번호 D-10 구입 기관 연구시설 / 연구장비명 규격 ( 모델명 ) 수량구입연월일 구입가격 ( 천원 ) 구입처 ( 전화번호 ) 비고 ( 설치 장소 ) NTIS 장비 등록번호

75 9 장. 연구개발과제수행에따른연구실등의안전조치이행실적 코드번호 D 절. 연구실안전점검체계및실시 1) 실험실안전점검 위험등급점검주기분류기준 A 등급 B 등급 C 등급 분기 1 회 반기 1 회 연 1 회 가연성가스, 인화성시약, 유해화학물질, 다량의폐액배출, 독극물, 생물및동물의취급, 방사성동위원소, 위험성이높은기계장비가설치된실험실일반시약, 소규모인화성시약, 불연성가스, 소량의폐수발생실험실이화학실험을수행하지않는전기, 설계, 컴퓨터관련실험실 2) 실험실정밀안전진단실시 실험실안전관리규정에의거실험실의위험정도에따라, A,B,C 로관리등급을분류하여, 실험 실환경안전점검을실시하고있으며, 안전점검실시결과실험실의재해예방과안전성확보등 을위하여필요하다고인정되는경우에는전문기관에의뢰하여정밀안전진단을실시함. 9-2 절. 교육훈련 1) 관련근거 : 연구실안전환경조성에관한법령제 18 조, 동법시행령제 17 조및동법실행규칙 제 9 조, 실험실안전관리규정제 16 조 ( 안전교육 ), 제 17 조 ( 안전교육의관리 ) 2) 교육대상 : 실험실을출입하는모든이용자 ( 연구책임자, 참여연구원및업체직원등 ) 3) 안전교육시간및수료인정기간 - 출입하는실험실의위험등급 (A,B,C 등급 ) 및전공특성 에따라안전교육을받아야하며, 1 년에 8 시간이상교육이수필수 - 수료인정기간은수 료증의수료인정기간까지 ( 유효기간이지나면재교육이수 )

76 4) 안전교육과정 - 전공특성에따라 A,B,C 코스로구분하여교육실시 - A코스 : 생물 방사선취급 - B코스 : 화학 가스취급 - C코스 : 전기 기계취급 5) 안전교육절차 9-3 절. 안전관리추진내용 년 ~2017 년실험실출입자에대한생물안전관리교육이수 년 ~2017 년각분기별사이버안전교육훈련이수 년 ~2017 년일일점검및정기점검실시 년 ~2017 년연구실일상점검실시및지적사항에따른보안조치