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지섭 어금
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1 한국어병학회지제26권제2호 (2013) J. Fish Pathol., 26(2) : 111~116 단보 유카추출물과 didecyldimethylammonium chloride 를주성분으로하는살균소독제아쿠아팜세이프의어류병원체에대한살균효과 서정수ㆍ전은지ㆍ황지연ㆍ정승희ㆍ박명애 * ㆍ이성민 ** ㆍ이은혜 1) 국립수산과학원병리연구과, * 수산생물방역과, ** 우성양행 Biocidal effect to fish pathogens of Aqua farmsafe composed of yucca extract and didecyldimethylammonium chloride Jung Soo Seo, Eun Ji Jeon, Jee Youn Hwang, Sung Hee Jung, Myoung Ae Park *, Sung Min Lee **, Eun Hye Lee Pathology Division, National Fisheries Research & Development Institute (NFRDI), Busan , Korea * Aquatic Life Disease Control Division, NFRDI, Busan , Korea ** Woosung Co. Ltd, Daejeon Korea In this study, the disinfectant efficacy of Aqua farmsafe, composed of didecyldimethylammonium chloride (DDAC) and yucca extract was evaluated against Salmonella typhimurium and fish pathogens. Determination of the anti-microbial or anti-viral efficacy of the disinfectant was based on Animal, Plant and Fisheries Quarantine and Inspection Agency Regulation No , Korea. Anti-bacterial efficacy test by broth dilution method was used to determine the lowest effective dilution of the disinfectant following exposure to test bacteria for 30 min at 4. Aqua farmsafe and test bacteria or virus were diluted with distilled water (DW), standard hard water (SW) or organic matter dilution (OM) according to treatment condition. Under the our results, disinfectant efficacy of Aqua farmsafe possesses 30~40 fold against fish pathogens including bacteria and virus compared to that on animal pathogenic bacteria, S. typhimurim. As the efficacy of Aqua farmsafe against fish pathogen was investigated in vitro, a controlled field trial is required to determine whether the use of Aqua framsafe will be able to reduce fish diseases. Key words : didecyldimethylammonium chloride, yucca extract, disinfectant, anti-bacterial efficacy test, anti-viral efficacy test 수산양식산업의발달과연안의오염으로한층증가되고있는어류질병문제는우리나라수산업이직면한주요현안문제중하나이다. 이러한질병은양식생물의누적폐사로인한직접적인경제적피해와 Corresponding Author : Eun Hye Lee, PhD Pathology Division, NFRDI, South Korea Tel.: ; Fax.: lehyaho@daum.net 더불어수산용약제의사용증가와관리인력비용증가등제반생산비용을증가시켜수산생물생산성을저하시킴으로서심각한경제적피해를유발하고있다. 최근질병의발생후항생제를이용한치료보다질병예방및차단에관심이높아지면서양식현장에서다양한소독제의사용이증가하고있는실정이다 ( 박등, 2008).

2 112 서정수ㆍ전은지ㆍ황지연ㆍ정승희ㆍ박명애ㆍ이성민ㆍ이은혜 국내에서허가된양식장용소독제는 11종 17개제품 (2011 수산용의약품제품요약해설집 ) 이며대부분이화학제제를기반으로하여품목허가후판매되고있는실정이다. 수산용으로품목허가신청중인살균소독제 아쿠아팜세이프 (Aqua farmsafe ) 는양이온암모니움화합물인 didecyldimethylammonium chloride (DDAC) 와유카추출물 (Yucca extract) 을주요성분으로하는살균및살바이러스소독제로서, 어류양식장에상재하는병원성세균, 바이러스등의살균소독, 그리고운반용차량등의살균및소독을목적으로생산된제품이다. DDAC는 4급암모늄으로세균의세포벽에빠르게흡수하여강한살균력을지니는물질로알려져있다 (Ioannou et al., 2007). DDAC는산업현장및농업현장, 병원, 축사및실생활에서광범위하게사용되는물질이다 (Gosselin et al., 1984; Henderson, 1992). 유카추출물은용설란과에속하는식물인 Yucca schidigera로부터추출한천연물질로항진균및항균활성이뛰어난물질로알려져있다 ( 길등, 1994). 또한, 유카추출물은어류및새우양식장의암모니아오염저감및양식생산력을증진시키는능력을가졌다고알려져있다 (Santacruz-Reyes and Chien, 2012; Tidwell et al., 1992). 본연구에서는 DDAC 및유카추출물을기반으로만들어진아쿠아팜세이프 를농림수산검역검사본부고시 호, 소독제효력시험지침에기초하여아쿠아팜세이프의소독효력능을확인하고자수행하였다. 재료및방법대상균종및균주표준균주인 Salmonella typhimurium ATCC 은 ATCC로부터분양받아사용하였으며, 넙치로부터분리하여국립수산과학원병리연구과에보관중인세균 4종 Edwardsiella tarda KCTC 11145BP (1주), Vibrio harveyi KCCM (1주), Streptococcus iniae KCTC11634BP (1주), Streptococcus parauberis KCTC11980BP (1주) 및어류바이러스 1종 Viral hemorrhagic septicemia virus KCTC12153BP을대상으로본연구에사용하였다. 또한, 본실험에사용된세균의농도는 CFU/ml 이상이되도록하여사용하였으며, 바이러스의경우는대조군의바이러스감염량에비하여소독제처리군의바이러스감염량이 TCID 50 /ml 이상사멸또는불활화가인정되는희석농도로이용하였다. 소독제제조국내에서품목허가를받기위해제조된아쿠아팜세이프 (( 주 ) 우성양행, 한국 ) 는용량 1L에 didecyldimethylammonium chloride (DDAC) 50 g, 유카추출물 (Yucca extract) 및 ethanol로구성되어져있으며, 소독제는실온의어두운곳에서보관하였으며, 사용시희석및사용법은농림수산검역검사본부고시 호, 소독제효력시험지침에따라수행하였다. 소독제희석액준비소독제희석액은소독제효력지침에따라다양한희석액을제작하였다. 간단히설명하면경수 (SW) 는증류수 (DW) 1L에 CaCl g과 MgCl 2 6H 2 O 0.139g (w/v) 를녹여제조한후, 고압멸균 (121, 15 분 ) 하여 4 에보관하며사용하였다. 유기물 (OM) 희석액은세균검사용일경우는효모추출물 (yeast extract) 20% 가함유되도록경수에용해한다음고압멸균 (121, 15분 ) 하여 4 에보관하면서, 사용시에는경수로 4배희석하여효모추출물 5% 함량의유기

3 유카추출물과 DDAC 로구성된아쿠아팜세이프의어류병원체에대한살균효과 113 물희석액으로만들되, 1N 수산화나트륨 (NaOH) 으로 ph 7.0이되도록조정하였다. 바이러스의경우는 1% (v/v) 소태아혈청 (fetal bovine serum; FBS) 을함유하도록멸균된경수에용해하여사용하였다. 소독제처리과정소독효력평가를위하여소독대상병원체를함유한증류수희석액 (DW), 경수 (SW) 희석액또는유기물 (OM) 희석액을동량의소독제를함유한증류수, 경수희석액및유기물희석액과각각동량혼합한후, 4 에서 30분간처리하여 Table 1과같은조건하에서소독제효력을평가하였다. 간단히설명하면, 공시균주인 S. typhimurium에대한희석은 DW 조건의경우는증류수에각각 1/40부터단계희석비율로, SW 조건의경우는경수에각각 1/50 부터단계희석비율로, OM 조건의경우는세균용 5% 유기물희석액에각각 1/10부터단계희석비율로소독제를혼합하였다. 주요어병세균인 4종 (E. tarda, V. harveyi, S. iniae, S. parauberis) 에대하여서는 DW에각각 1/2,400부터단계희석비율로, SW조건의경우는경수에각각 1/1,800부터단계희석비율로, OM 조건의경우는세균용 5% 유기물희석액에각각 1/600부 터단계희석비율로소독제를혼합하였다. 주요어병바이러스인 Viral hemorrhagic septicemia virus에대하여서는증류수및경수조건의경우는 1/2,700부터단계희석비율로유기물조건의경우는 1/1,300부터단계희석비율로소독제를혼합하였다. 각반응 (4, 30분 ) 이끝난후, 소독제를중화한후, 각소독제희석별로 5개의영양배지에서배양하여 2일동안세균증식여부를판별하거나, 바이러스의경우는미리 96 well에키워둔 EPC 주화세포에 3 반복씩접종하여 5일동안세포내의세포변성효과여부를판정하여유효희석배수로결정하였다. 세균의증식여부판정및소독제의유효희석배수결정은 5개의동일소독제희석배수의배지에서 2개이상증식이인정되지않는최종소독희석단계를유효희석배수로하며, 최종유효희석배수는 20% 의오차범위내의 3회반복실험결과의중위수 (median) 로하였다. 바이러스의경우는대조군의바이러스감염량에비하여소독제처리군의바이러스감염량이 TCID 50 /ml 이상사멸또는불활화가인정되는희석농도를유효농도로하고, 최종유효희석배수는 3반복시험결과의중위수로하였다. Table 1. Experimental design for the determination of the biocidal efficacy of aqua farmsafe Contents according to treatment conditiona Treatment condition DW SW OM Disinfectant Pathogen Distilled water (DW) condition Standard hard water (SW) condition Organic matter (OM) condition Bacteria control DW control a : +, presence; -, absence

4 114 서정수ㆍ전은지ㆍ황지연ㆍ정승희ㆍ박명애ㆍ이성민ㆍ이은혜 Final valid dilution of aqua farmsafe 결과 공시균주, 어병세균 4종에대하여 5회반복실험을통해분석한유효희석농도별소독효과는 Fig. 1에서나타내었다. Fig. 1에서보는바와같이축산에서주요한질병병원체인살모네라균 (S. typhimurium) 을표준균주로정하여아쿠아팜세이프의유효희석농도는증류수에서는평균 60배, 경수조건하에서는평균 70배, 유기물조건하에서는평균 40배로나타났다. 주요어병세균 4종을대상으로측정하였을시에는증류수 (DW) 조건하에서는 2,000 ~ 3,600배로, 경수 (SW) 조건하에서는 2,200 ~ 3,000배로, 유기물하에서는 E. tarda, V. harveyi, S. iniae는 1,800배, S. parauberis 는 800배유효희석농도에서소독효과가나타났다. S. typhimurium E. tarda V. harveyi S. iniae S. parauberis DW SW OM Dilution condition of disinfectant incubation Fig. 1. Antibacterial efficacy of aqua farmsafe solution against Salmonella typhimurium and fish bacteria Abbreviation; DW, distilled water; SW, standard hard water; OM, organic matter 주요어병바이러스인바이러스성출혈성패혈증 (VHSV) 에대한아쿠아팜세이프의소독효과를조사하였다. 증류수, 경수및유기물조건하에서 VHSV에대하여소독효과는증류수에서는 3,600배, 경수는 3,300배, 유기물하에서는 2,000배로나타났다 (Fig. 2). Final valid dilution of aqua farmsafe Viral hemorrhagic septicemia virus DW SW OM Dilution condition of disinfectant incubation Fig. 2. Antiviral efficacy of aqua farmsafe solution against viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV) Abbreviation; DW, distilled water; SW, standard hard water; OM, organic matter 고찰 본연구에서아쿠아팜세이프 는어류양식장의방역및질병차단을위한소독제로서사용하기위해개발되었다. 아쿠아팜세이프 의주요성분인 DDAC 는의약분야, 식품산업및환경산업분야에걸쳐효과적인소독제로서이용되고있으며 (Gosselin et al., 1984; Henderson, 1992), 유카추출물의경우는식음료, 환경방부제및다양한산업현장에서이용되고있다 (Irish G, 2000). 공시균주인 S. typhimurium은돼지축사, 소및인체의식중독질병을일으키는주요한세균으로알려져있다 (Katsuda et al., 2006; Sharan et al., 2011). 공시균주를이용하여 5회반복실험을통하여아쿠아팜세이프의유효농도별소독희석효과를측정하였을시에증류수에서는 60배, 경수는 70배, 유기물하에서는 40배로나타났다. 그에반해, 양식어류의주요어류질병병원체인 4종에대하여 5회반복실험을통해분석한유효희석농도별소독효과는병원체별로약간의상이한점이나타나나, 대체적으로공시균주

5 유카추출물과 DDAC 로구성된아쿠아팜세이프의어류병원체에대한살균효과 115 에비하여 30~40배이상높은희석농도에서소독효과를나타내었으므로그만큼어병세균에대한소독효능이더좋은것으로보아진다. 이는공시균주의경우는 37 배양조건에따라수행하였으나, 어병세균의경우는 25 의적정배양조건에의한실험결과에따라차이가나는것으로보아진다. 이런점은최근에품목허가받은수산용소독제의경우일반세균에대한희석배수보다어병세균에대한희석배수가보통 10배이상차이가남에서알수있다 (2011 수산용의약품제품해설집 ). 일반적으로소독제는세균에대한소독효과가증류수, 경수, 유기물조건으로갈수록희석농도가높아지는이유는경수및유기물내의성분들이소독효과를방해하는것으로보아진다. 또한, 병원체별로증류수조건하에서소독효과를조사하였을시에그람음성세균인에드와드균과비브리오균에대한소독효과는각각 2,000배, 2,600 배유효희석농도로나타나나, 그람양성세균인연쇄구균에대한소독효과는각각 3,000배, 3,600배유효희석농도로나타나며이러한차이는 DDAC의세균에대한기작의차이로보아진다 (Ioannou et al., 2007). 넙치양식현장에서가장큰피해를입히는것으로알려진바이러스성출혈성패혈증 (VHS) 을유발하는원인체인 VHSV에대한소독효과는증류수에서는 3,600배, 경수는 3,300배, 유기물하에서는 2,000배희석으로나타났다 (Fig. 2). DDAC와다른종류의 4급암모늄을주성분으로하여가축용소독제인 Citra-kill 의인체바이러스인 Avian Influenza Virus의소독효과를조사한논문에따르면증류수조건하에서는 2,000배로나타난다 (Cha et al., 2012). 그러나, 이러한결과들은유효성분의종류및함량에따라많은차이가날수있으므로비교하기는힘들다고본다. 더불어, 소독제효력지침에따른실험및분석 방법으로조사하였을때의아쿠아팜세이프의소독효과는어병세균보다 VHSV에대하여더높게나타남을알수있었다. 이번연구의결과는 in vitro 실험방법에따른소독효과를측정한것으로서실제양식현장에서의결과를유추하기에는많은문제점을안고있다. 따라서, 소독제효력지침에따른유기물 (OM) 조건하의실험결과를바탕으로하여어류양식장, 수조, 배관, 뜰채, 그물, 물차등에적용할수있을지에대한추가연구가필요하다고보아지며향후양식현장의야외적용시험을통해실제적용에따른효과를확인할필요가있을것으로사료된다. 요약본연구에서는 4급암모늄에속하는 didecyldimethylammonium chloride (DDAC) 와유카추출물 (Yucca extract) 의합제인아쿠아팜세이프 의어류질병병원체에대한살균효과를확인하기위하여농림수산검역검사본부의소독제효력시험중세균및바이러스소독제효력시험에따라수행하였다. 소독제와병원체를증류수, 경수그리고유기물조건에서반응시킨후, 중화액을이용하여중화시킨다음, 중화된용액을배지및주화세포에서접종시켜세균의성장및세포변성효과를통해소독제의효력배수를결정하였다. 본연구의결과, 아쿠아팜세이프 는식중독을일으키는공시균주살모넬라균 (S. typhimurim) 에비하여, 어병세균이 30~40배이상높은희석농도에서소독효과를나타내었으며, VHSV에대하여서는 2,000~ 3,600배의유효한효력배수를나타내었다. 따라서, 향후, 야외적용시험을통해실제적용에따른효과를확인할필요가있을것으로사료된다.

6 116 서정수ㆍ전은지ㆍ황지연ㆍ정승희ㆍ박명애ㆍ이성민ㆍ이은혜 감사의글본연구는국립수산과학원연구비지원으로수행되었습니다. 참고문헌 Cha, C.-N., Lee, Y.-E., Kang, I.-J., Yoo, C.-Y., Park, E.K., An, S., Kim, S., and Lee, H.-J.: Antiviral Efficacy of Citra-kill, Disinfectant Solution Against Avian Influenza Virus. J. Fd Hyg. Safety. 27: 18~23, Katsuda, K., Kohmoto, M., Kawashima, K. and Tsunemitsu, H.: Frequency of enteropathogen detechtion in sucking and weaned pigs with diarrhea in Japan. J. Vet. Diagn. Invest. 18: , Sharan, R., Chhibber, S. and Reed, R.H.: A murine model to study the antibacterial effect of copper on infectivity of Salmonella Enterica Serovar Typhimurium. Int. J. Environ. Res. Public Health, 8: 21-36, Irish, G.: Agaves, Yuccas, and Related Plants: a Gardener's Guide. Timber Press. 18, Ioannou, C.J., Hanlon, G.W. and Denyer S.P.: Action of disinfectant quanternary ammonium compounds against Staphylococcus aureus. Antimicrob. Agents Chemother., 51: , Gosselin, R.E., Hodge, H.C. and Braddock, J.E.: Clinical Toxicology of Commercial Products. 5th Edition. Williams & Wilkins, Baltimore, MD Henderson, N.D.: A review of the environmental impact and toxic affects of DDAC. Canadian Cataloguing in Publication Data, 1-45, Santacruz-Reys, R.A. and Chien, Y.: The potential of Yucca schidigera extract to reduce the ammonia pollution from shrimp farming. Biores. Tech. 113: , Tidwell, J.H., Webster, C.D., Clark, J.A. and Yancey, D.H.: Effects of Yucca schidigera extract on water quality and fish growth in recirculatingwater aquaculture systems. The Prog. Fish- Culturist 54: 길지용, 조남기, 김범석, 이상락, 맹원재 : Yucca extract 의첨가가사료와축분의 in vitro 발효성상및젖소의유생산성에미치는영향. 한국동물자원학회지, 36: , 박경희, 김석렬, 강소영, 정성주, 오명주 : 시판소독제의넙치 Paralichthys olivaceus, 조피볼락 Sebastes pachycephalus, 감성돔 Acanthopagus schlegelii에대한독성. 한국양식학회. 21: 7-12, 농림수산식품부국립수산과학원병리연구과 : 2011 수산용의약품제품요약해설집. Manuscript Received : April 08, 2013 Revised : July 17, 2013 Accepted : August 09, 2013

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1. 2010 6 1, 2 4 Ⅰ,Ⅱ 2013,, -,. - Human Cell.. -,., Biosand Filter(BSF) - BSF Main Filtering (Biofilm) BSF, BSF ( ),. -, BSF BSF. - BSF BSF ( ),,. BSF -,,,. - BSF,. -. -. -. - 2. BSF -, rrna, BSF. 2. -