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현균 내
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1 넙치연쇄구균증의발생현황및대책 1. 서론 병리연구과권문경 우리나라의넙치양식은 1970년대후반부터종묘생산이시작되어 1986년도에제주도에서종묘생산기술개발을계기로육상양식이시작되었다. 1997년도에는 5,500톤을생산하였으며 ( 허등, 2001), 이후급속도로발전하여 2008년에는 46,432톤을생산함으로서 11년만에약10 배의생산량증가를이루었다. 양식산업이발전함에따라시설규모도소규모에서대규모로전환되고사육방법또한고밀도로사육하는경우가많아사육관리부주의등으로각종질병이발생되고있으며, 고수온기기생충및세균에의한단독감염이주를이룬양식초기와는달리수온과상관없이연중다양한병원체가혼합감염의형태로질병을일으켜큰피해를나타내고있다. 해산양식어류에피해를주는세균성질병으로는어종에따라약간의차이는있으나, 연쇄구균증, 비브리오병, 에드워드병, 활주세균증등이보고되고있다 ( 심등, 1995; Oh et al., 1998) 세균성질병중연쇄구균증은아시아, 미국, 남아프리카, 호주, 이스라엘및유럽등전세계적으로양식어류에많은피해를유발하는질병으로서원인균으로 Streptococcus difficilis, S. agalactiae, S. iniae, S. parauberis, S. equi, S. equisimilis, S. faecium, S. pyogenes, Enterococcus faecalis subsp. liquefaciens, Lactococcus garvieae, L. lactis 등분류학적으로다양한균주들이관여하는것으로알려져있다 (Austin and Austin, 1999). 우리나라양식넙치에서도 L. garviae( 이등, 2001), β-haemolytic S. sp.( 허등, 2001), S. pyogenes 및 Enterococcus faecalis( 송등, 2003), S. iniae( 김과김, 2003) 와 S. parauberis( 우등, 2006) 등다양한병원체가넙치에대한병원성과관련하여보고되었다. 연쇄구균증은양식무지개송어 (Hoshina et al., 1958) 에서처음보고된이후연어, 숭어, 농어그리고넙치등다양한어종에감염된보고들이있으며, 급성감염의경우에는 3~7일만에 50% 이상의폐사를나타내기도하지만, 반대로만성감염일경우에는몇주동안매일약간의폐사만을일으키기도한다 (Park et al., 2009). 우리나라의넙치양식에서많은경제적손실을초래하는연쇄구균증의주요원인균으로 S. iniae와 S. parauberis가지목되고있어 ( 김등, 2005; 조등, 2007), 본질병에의한피해를최소화하기방안으로본병원체의감염현황, 병원체특성, 치료를위해사용되는항균제의효과및예방법에대해서논의하고자한다. 2. 감염현황 양식넙치에서발생되는질병에대하여효과적인방제대책수립을위해서는전국적, 지역적인발생상황이나양식장별발생양상등정확한모니터링및역학정보를수집하는등감염현황을파악하는것이중요하다. 양식넙치에감염되는병원성세균중연쇄구균증의감염율을조사하기위하여조등 (2008) 은양식넙치를무작위로채취하여조사한결과, 연쇄구균증의감염율이 16.4% 로넙치에서분리되는주요 5 종세균인 Vibrio 속세균, 연쇄구균, Photobacterium damselae, Edwardsiella tarda, Pseudomonas 중 2 번째로높은것으로보고하였다. 조등 (2008) 의연구방법과달리김등 (2006) 은외관상질병의증상이뚜렷한병어를대상으로실시하였을때도연쇄구균이 28.8% 로 2 번째로높은감염율을나타내어양식넙치에서주로검출되는세균은질병의발현과상관없이양식수계및넙치에대한감염기회에우점적위치를차지하고있을것으로추정하였다 ( 조등, 2008).

양식넙치의개체크기별연쇄구균감염율조사결과 ( 조등, 2007) 연쇄구균증은다른세균성질병에비하여 21-40 cm의비교적큰개체에서검출률이높아질병이발생할경우양식기간중소요되는비용이다소요되어진상태에서추가로약품비의소요및폐사로인한생산량감소등누적피해가증가하여경제적손실이큰질병이므로양식과정중질병의예방이무엇보다도중요한질병이라고보고하였다.

parauberis 가높은비율로검출되었다. 또한다른속세균과의혼합감염률도높은것으로나타났는데, 유사한연쇄상구균속과의혼합감염은검출되지않은반면 E. tarda 와 18.9%, P. damselae 와는 5.4%, Pseudomonas spp. 와는 2.7% 의혼합감염률을나타내었다. 3. 병원체의특징및넙치에서의감염증상 연쇄구균증의주요병원체인 S. iniae 와 S.

2 양식넙치의개체크기별연쇄구균감염율조사결과 ( 조등, 2007) 연쇄구균증은다른세균성질병에비하여 cm의비교적큰개체에서검출률이높아질병이발생할경우양식기간중소요되는비용이다소요되어진상태에서추가로약품비의소요및폐사로인한생산량감소등누적피해가증가하여경제적손실이큰질병이므로양식과정중질병의예방이무엇보다도중요한질병이라고보고하였다. 양식넙치에서연쇄구균의계절별감염율조사결과 ( 조등, 2007), S. spp. 의검출률은고수온기인 8 월부터검출률이증가하여저수온기동안에도 % 의높은검출률을나타내었으며, S. spp 는주로 S. parauberis 와 S. iniae 로동정되었으며, 고수온기에는주로 S. iniae 가저수온기에는주로 S. parauberis 가높은비율로검출되었다. 또한다른속세균과의혼합감염률도높은것으로나타났는데, 유사한연쇄상구균속과의혼합감염은검출되지않은반면 E. tarda 와 18.9%, P. damselae 와는 5.4%, Pseudomonas spp. 와는 2.7% 의혼합감염률을나타내었다. 3. 병원체의특징및넙치에서의감염증상 연쇄구균증의주요병원체인 S. iniae 와 S. parauberis 는모두그람양성의연쇄상구균형태를나타내나 ( 그림 1) 병원체의성상및감염시증상이상이하여병원성, 생물학적성상및감염증상에대하여각각의병원체에대하여연구가이루어지고있다. 그림 1. 연쇄구균 (A, 전자현미경사진 ; B, 그람양성의연쇄구균 ). 연쇄구균중 S. iniae 는 β- 용혈성을나타내는균주이며, 집락의형태학적특성과병원성에대한연구 ( 김등, 2005) 결과, 집락의형태에따라 viscous form( 점성형태 ) 과 non viscous form( 비점성형태 ) 으로나누었다. Viscous type 은세균세포주위로두꺼운 capsule 이형성되었으며, capsule 을갖지않는균주에비하여혈청의살균작용에대한생존율및병원성도높게나타났다. 이결과는 S. iniae 와질병의임상및병리학적증상이유사한 Lactococcus garvieae 에서도병원성에 capsule 이관여하여 capsule 이존재하는균주에서숙주의식세포의식작용에대한방어능및병원성이높아져 (Yoshida et al., 1996) 같은결과를나타내었다. S. iniae 에감염시넙치는힘없이떠다니다가수조바닥에가만히붙어정지해있으며선회운동을하기도한다. 체색이검어지고안구백탁및돌출, 눈가장자리및지느러미가붉어지며, 간장의충혈, 비대또는축소, 장관의염증및출혈, 뇌출혈및아가미뚜껑내부에농창이형성되는것이특징이다 ( 그림 2).

parauberis를인위감염시외부증상으로는체색흑화외에는다른증상을나타내지않아양식현장에서 S. parauberis 감염으로인한연쇄구균증발생시현장인지가늦음으로인해피해가커질것으로보고하였다. 김등 (2009) 은 S. parauberis의감염증상을파악하기위하여인위감염시켰으나감염된병어에서외관상체색흑화이외의특징적인증상은관찰되지않아이등과같은결과를나타내었다.

3 그림 2. Streptococcus iniae 감염된넙치 (A, 체색흑화 ; B, 아가미뚜껑내부출혈및내부장기출혈 ). S. parauberis는소유선염 (mastitis) 의원인균으로양식터봇에서처음으로분리되었으며표현형및혈청학적특성에따라 S. uberis genotype ⅡEnterococcus seriolicida 등으로동정되었다가, 이후 16SrRNA 분석결과 S. parauberis로재동정된균으로, 넙치, 터봇, 방어류등에감염되며포유류에서도병원성을나타낸다. S. parauberis는비용혈성의 γ-용혈성연쇄구균으로이등 (2007) 은S. parauberis를인위감염시외부증상으로는체색흑화외에는다른증상을나타내지않아양식현장에서 S. parauberis 감염으로인한연쇄구균증발생시현장인지가늦음으로인해피해가커질것으로보고하였다. 김등 (2009) 은 S. parauberis의감염증상을파악하기위하여인위감염시켰으나감염된병어에서외관상체색흑화이외의특징적인증상은관찰되지않아이등과같은결과를나타내었다. 해부소견으로는심장에염증소견이다수관찰되었으며 ( 그림 3), 일부개체에서는맑은복수가관찰되었다. S. parauberiss의주요감염장기로추정되는심장의병리조직학적변화를관찰한결과, 감염된넙치는 1주째부터심외막염이나타나기시작하여 3주째까지심해지다가 6주째에는회복되면서심외막염이완화된다고보고하였다. 또한스트레스가 S. parauberis의감염에미치는영향을조사한결과스트레스를받은넙치의심외막염이스트레스를받지않은넙치보다더심하게나타났으며, 심근에서백혈구계세포침윤이일어나심근염이나타났으며, 심근의섬유화로진행된개체도관찰된다고보고하였다. 따라서넙치양식시수질, 수온, 고밀도사육, handling과같은스트레스는넙치의연쇄구균증발병율을높일것으로사료된다.

그림. 2. 넙치, Paralichthys olivaceus 에 Streptococcus parauberis(2 108 CFU/fish) 로인위감염후심외막염관찰. 심외막의 moderative inflammation(a 와 B) and sever inflammation(c 와 D)( 김등, 2009). 4.

4 그림. 2. 넙치, Paralichthys olivaceus 에 Streptococcus parauberis(2 108 CFU/fish) 로인위감염후심외막염관찰. 심외막의 moderative inflammation(a 와 B) and sever inflammation(c 와 D)( 김등, 2009). 4. 진단법 일본의연쇄구균증에감염된방어에서분리된연쇄구균은처음에는 S. sp. 로발표되었던일본의연쇄구균증에감염된방어에서분리된연쇄구균은처음에는 S. sp. 로발표되었던것을그후 Enterococcus seriolicida 로명명하였다가, 다시 L. garvieae 로명명해온것처럼동정에어려움이있다. 최근에는연쇄상구균의종다양성을연구하고또병원균의역학조사를위하여많은분자생물학적기법들이이용되고있다. 이렇게양식어류의연쇄구균증에관여하는병원체가다양하게보고되고있는것은지역에따라질병에관여하는연쇄상구균의종류가다르기때문인것으로보고되고있지만, 연쇄상구균군을구성하고있는종조성자체가다양할뿐아니라, 표준화된분류방법이없다는것도다양성의원인으로추정하였다 ( 송등, 2003), 넙치에서연쇄구균증의원인균인 S. iniae 또는 S. parauberis 의감염유무를조사하기위하여분리된세균에대하여혈액한천배지에서의용혈성유무, 생화학적성상및 colony PCR 법등이동정에주로이용된다. S. iniae 는혈액한천배지에서 β- 용혈성을나타내며 10% bile agar 에서성장이가능하며, Arginine, Esculin, Starch 를가수분해하며, Glucose Glycerol, Maltose, Mannitol, Salicin, Sucrose 를분해하여산을생성하며 Methyl Red 에대하여양성반응을나타내는특징을가진다. S. iniae 검출을위한 colony PCR 법에사용되는 primer set 및 PCR 조건은표 1 과 2 와같으며증폭된 DNA 산물은각각 300bp 및 870bp 로나타난다. S. parauberis 는혈액한천배지에서무용혈성의 γ- 용혈성을나타내며, Voges-Proskauer 반응에서양성반응을나타내며 Arginin 을가수분해시키며 Galactosidase 에대해서는양성반응을나타내나 Glucuronidase 에대해서는음성반응을나타내며, Galactose, D-glucose, D-mannose, D-fructose, Maltose, Lactose, Cellobiose 를이용한다. S. parauberis 검출을위한 primer set 및 PCR 조건은표 1, 2 와같으며증폭된 DNA 산물은각각 220bp 및 718bp 로나타난다.

5 표 1. 연쇄구균분류에사용한 PCR primer set 병원체 Primer set 염기서열 (5'-3') 크기 (bp) 참고문헌 Streptococcus parauberis Streptococcus iniae psp-1 psp-2 Sin-1 Sin-2 TCCAGTCTTTCGACCTTCTT CAAAGAGATGTTCGGCTTG CTAGAGTACACATGTACT(AGCT)AAG GGATTTTCCACTCCCATTAC Zlotkin et al.(1998) Streptococcus parauberis Streptococcus iniae Spa2152 Spa2870 LOX-1 LOX-2 TTTCGTCTGAGGCAATGTTG GCTTCATATATCGCTATACT AAGGGGAAATCGCAAGTGCC ATATCTGATTGGGCCGTCTAA Mata et al.(2004) 표 2. PCR 조건 단계 온도및조건 Cycles pre-pcr 95, 5분 95, 1분 PCR Cycle 55, 1분 72, 1분 30 Last extention 72, 7분 5. 질병예방및대책 우리나라의고밀도화된넙치양식장은다양한감염성질병을유발시키는원인이되고있으며, 제주도의육상수조식양식장에서는연중지하해수 (16~18 ) 를이용하여적절한사육환경을조성하였으나양식장이대형화됨에따라각종감염성질병이빈번하게발생되고있다. 특히넙치의감염성질병중연쇄구균증은수온과관계없이연중발생하고있어치료를위해많은항균제가사용되고있으나항균제에대한내성균의출현도빈번하고그내성의정도가점점높아져항균제에의한치료효과를기대하기힘든실정이다. 또한 S. iniae 에감염된어류는감염초기에식욕감퇴로인해사료섭이량이급격히감소하기때문에약제감수성시험에서는여러약제가효과적인것으로나타나고있으나, 실제로양식장에서사용할겨우효과적이못한경우가많다. 어류병원세균의약제내성은여러종류의전이성 R plasmid 에있는내성유전자에의해나타나며, 이들 R plasmid 의구조형성에전이인자가관여하고있으며 (Kim and Aoki, 1994), 내성균출현을억제하기위해서는어류병원세균들의약제감수성경향및약제내성전이성 plasmid 에관한연구가필요하여, 김등 (2003) 은여수, 남해, 제주, 완도, 영광, 해남과고흥의넙치병어에서분리된연쇄구균을대상으로항생제감수성을조사하였다. 분리된대부분의균주는 ampicillin, doxycycline, erythromycin, florfenicol, flumequine, norfloxacin, oxolinic acid, oxytetracycline 의 2~5 약제에동시내성을나타내었으며, 이들내성균에서 R plasmid 가관여하고있었다고보고하였다. 본결과는허등 (2001) 이제주도의넙치병어에서분리된연쇄구균의감수성시험을하였을때 ampicillin, ciprofloxacin, doxycycline, gentamycin 에대해서는감수성을나타내었고 tetracycline, erythromycin, streptomycin 및

6 oxytetracycline에내성을나타낸결과와비교해볼때지역적으로차이가있기는하지만 2001년조사결과에비해내성균이증가하였다는것을알수있다. 또한 Lee와 Ha(1991) 의조사결과에서는 erythromycin에서도감수성이나타났으나이후에는내성을나타낸결과에서매년내성항생제의종류가증가고있는것을알수있다. 따라서약제사용을위해서는세심한주의가필요하며치료약제선택을위해서는주기적으로병원균을분리하여약제감수성경향을조사하는것이질병의치료효과를높이고, 약품의사용량과빈도를줄임으로써경제적인문제와공중보건학상으로발생될수있는문제들을예방할수있는하나의중요한방법이될것으로기대된다 ( 김등, 2003). Park et al.(2009) 은제주도의넙치병어에서분리된 S. iniae와 S. parauberis에서 tetracycline과 erythromycin 내성유전자의패턴을파악한결과, S. iniae(65균주 ) 는 cefotzcime, erythromycin, ofloxacin, penicillin, tetracycline과 vancomycin에대하여감수성을가졌으나, S. parauberis는 erythromycin에대해서는 86균주중 58%, tetracycline에대해서는 86균주중 63% 가내성을나타내었다. S. parauberis의 tet(s) 와 erm(b) 유전자는 erythromycin과 tetracycline의높은내성과관련이있는유전자로전위인자와관련되어 Streptococcus에서획득된항생제내성인자는세균들사이에전이될수있다. 따라서어류질병을치료하기위해무분별하게항생제를사용시쉽게내성균의증가를야기시킬수있고어체내약제의잔류로인해식품안전성의측면에서공중위생상의문제를유발하고있다. 따라서기존의약물에의한치료위주의방역대책에서예방백신을이용한근본적이면서새로운개념의질병예방기술이현장에도입되어야할것으로생각된다. 현재국제적으로시판되고있는수산용백신으로는은어와연어과어류의비브리오병백신, 연어과어류의구적병백신, 부tm럼병백신, 냉수성비브리오병백신, 방어의장구균증백신, 유럽농어의유결절백신, 미국메기의에드와드병백신, 담수어의콜롬나리스병백신, 방어의 α- 용혈성연쇄구균증불활화백신, 방어의 α- 용혈성연쇄구균증과비브리오불활화혼합백신등이있으며국내에서는에드와드예방백신, β-용혈성연쇄구균불활활백신이상용화되어있다. 연쇄구균증에대한예방백신으로는무지개송어를대상으로 S. iniae 및 L. garvieae의 formalin inactivated whole cells vaccine의효능을조사한바있으며 (Ghittno et al., 1995), 틸라피아에서 whole cells vaccine 및 bacterial protein extract의면역효과에대한보고 (Eldar et al., 1995) 및 S. iniae의 formalin killed cells 및 concentrated extracellular products(ecps) 에대한틸라피아의면역반응에대해보고된것이있다 (Klesius et al., 2000). 우리나라에서는농림수산식품부의수산동물질병예방백신공급사업에의거하여 2007년부터넙치양식어가에예방백신지원사업을수행하고있으며, 현재는수산용백신중 β-용혈성연쇄구균불활화백신에국한되어있다. 그러나매년백신에대한수요가급증하여 2007 년의백신지원비는 15억원에불과하였으나 2010년에는 31억4천8백만원으로계획되어있으며, 실제사용양식어가에서도질병치료에사용되는제반경비절감및생산량증대로큰효과를나타낸것을조사되므로연쇄구균증예방에서는탁월한효과를나타낸다고생각된다. 그러나현재연쇄구균불활화백신접종을위한주사법은치어기에대량으로주사처리시큰스트레스를유발하여면역력저하를야기할수있으며, 개체별접종에따른노동비및접종시간의장기화등불편한점이있어백신처리자동화시스템개발이시급하다고생각된다. 또한, 연쇄구균증은단독감염뿐만아니라다른세균성질병과의혼합감염율이높게나타나므로효과적인예방을위하여혼합백신의상용화가시급한실정이며백신의효과및지속기간을높이기위하여면역보조제첨가백신의개발도필요하다. 이와같이효과적인백신을개발하여넙치에스트레스를최소화할수있는방법으로접종가능할때연쇄구균증예방효과가더욱더클것으로기대되며, 무항생제처리넙치생산도가능할것으로기대된다.

7 Austin, A. and Austin, D.A.(1999) Bacterial fish pathogens, 3rd ed., Springer, London. Hoshina, T., Sano, T., Morimoto, Y.(1958) A Streptococcus pathogenic to fish. J. Tokyo Univ. Fish, 44권, Eldar, A., Shapiro, O., Bejerano,Y. and Bercovier, H.(1995) Vaccination with whole cell vaccine and bacterial protein extract protect tilapia against Streptococcus difficile meningoencephalitis. Vaccine, 13권, Ghittino, C., Eldar, A., Prearo, M., Bozzetta, E., Livvof, A. and Bercovier, H.(1995) Comparative pathology and experimental vaccination in diseased rainbow trout infected by Streptococcus iniae and Lactococcus garvieae, In Diseases of fish and shellfish. Eur. Ass. Fish., Pathol, Ⅶ Int Conf, Palma de Malloraca, p27. Kim, E. and Aoki, T.(1994) The transposon-like structure of IS26-tetracycline and kanamycin resistance determinant derived from transferable R plasmid of fish pathogens, Pasteurella piscicida. Microbiol. Immunol., 37권, Klesius, P.H., Shoemaker, C.A. and Evans, J.J.(2000) Efficacy of single and combined Streptococcus iniae isolated vaccine administered by intraperitoneal and intramuscular routes in tilapia(oreochromis niloticus). Aquaculture, 188권, Mata, A.I., Gibella, A., Casamayor, A., Blanco, M., Dominguez, L., Fernandez-Garayzabal, J.F.(2004) Multiplex PCR assay for detection of bacterial pathogens associated with warmwater Streptococcosis in fish, Appl. Environ. Microbiol, 70권, Lee, C.H. and Ha, D.S.(1991) A streptococcal disease of cultured flounder, Paralichthys olivaceus, J. Fish Pathol, 4권, Park, Y.K., Nho, S.W., Park, S.B., Jang, H.B., Cha, I.S., H, M.A., Kim, and Y.R., Dalvi, R.S., Kang, B.J. and Jung, T.S.(2009) Antibiotic susceptibility and resistance of Streptococcus iniae and Streptococcus parauberis isolated from olive flounder(paralichthys olivaceus). Veterinary Microbiology, 136권, Yoshida, T., Yamada, Y. and Sakai, M.(1996) Association of the cell capsule with antiopsonophagocytosis in β-hemolytic Streptococcus spp. isolated from rainbow trout. J. Aquat. Anim. Health, 8권, AZlotkin, A., Hershko, H., Eldar, A.(1998) Possible transmission of Streptococcus iniae from wild fish to cultured marine fish. Appl. Environ. Microbiol., 64권, 김종훈, 김은희 (2003) 넙치 (Paralichthys olivaceus) 병어에서분리된연쇄상구균의다양성, 한국수산학회지, 36권, 김진우, 정승희, 박명애, 도정완, 최동림, 지보영, 조미영, 김명석, 최혜승, 김이청, 이주석, 이창훈, 박종득, 박미선, 서정수 (2006) 2000~2006년하절기양식어류의병원체감염현황, 한국어병학회지, 19권, 김진우, 조미영, 원경미, 김병관, 최희정, 한명철, 박명애 (2009) Streptococcus parauberis 인위감염에의한넙치, Paralichthys olivaceus 심장의병리학적변화, 22권, 김현정, 우승호, 김진우, 박수일 (2005) Streptococcus iniae의형태학적특성과병원성, 한국어병학회지, 18권, 송진경, 김종훈, 김은희 (2003) 연쇄상구균의표현형적특성과 RAPD profiles 비교, 한국어병학회지, 16권, 이덕찬, 이재일, 박찬일, 박수일 (2001) 해산양식어류로부터분리된연쇄구균증의원인균, Lactococcus garvieae에대한연구, 한국어병학회지, 14권, 이창훈, 김필연, 고창식, 오덕철, 강봉조 (2007) 제주지역양식넙치 (Paralichthys olivaceus) 로

8 부터분리되는 Streptococcus iniae 와 Streptococcus parauberis 의생물학적특성, 20 권, 조미영, 김명석, 최혜승, 박경현, 김진우, 박미선, 박명애 (2008) 양식넙치, Paralichthys olivaceus 질병에대한통계적관찰, 한국어병학회지, 21 권, 조미영, 오윤경, 이덕찬, 김재훈, 박명애 (2007) 양식넙치에서분리한 Streptococcus parauberis 의동정방법에따른지역적비교, 한국어병학회지, 20 권, 허문수, 송춘복, 이제희, 여인규, 전유진, 이정재, 정상철, 이기완, 노섬, 최광식, 이영돈 (2001) 제주산양식넙치 (Paralichthys olivaceus) 로부터분리된 β- 용혈성연쇄구균 (β-streptococcus spp.) 의특성, 한국수산학회지, 34 권, * 본내용은 Aqua Info 6 월호에게재되었던내용입니다.

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42(3)-11(p ).fm The Korean Journal of Microbiology, Vol. 42, No. 3, September 2006, p. 199-204 Copyright 2006, The Microbiological Society of Korea e ³ w ³ w Á Á½ Áx Á 1 Á 2, * w w w w w w e ³ ³ w p w. e ³ w ù š» 30 cm.