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1 J Korean Med Ophthalmol Otolaryngol Dermatol 2014;27(4): pissn eissn Original Article / 원저아토피양접촉피부염유발 NC/Nga mouse 에서 도고온천수에첨가한게르마늄성분의효과 이진욱 a,c 고가연 a,c 정찬호 b,c 유선종 d 김윤희 a,c 안택원 a,c a 대전대학교한의과대학사상체질의학과, b 대전대학교공과대학교지질공학과 c 대전대학교온천의학연구소, d 아산시청 Effect of DOGO phreatic water containing germanium on Atopic Dermatitis in NC/Nga mouse Jin-Wook Lee a,c Ga-Yeon Go a,c Chan-Ho Jung b,c Sun-Jong You d Yun-Hee Kim a,c Taek-Won Ahn a,c a Dept. of Sasang Constitutional Medicine, College of Korean Medicine, Daejeon Univ. b Dep. of Geology, College of Engineering, Daejeon Univ. c Hot Spring Medicine Laboratory, Daejeon Univ. d City Hall of Asan. Abstract Objectives : The purpose of this study is to investigate the effects of DOGO phreatic water containing germanium on Atopic Dermatitis in NC/Nga mouse. Methods : We made DOGO phreatic water added germanium. After making atopic dermatitis caused by sensitizing NC/Nga mouse to DNCB(dinitrochlorobenzene), we made mouse swim in tanks each filled with distilled water, tap water, DOGO phreatic water, DOGO phreatic water(added germanium) for 30minutes everyday. 3weeks later, we analyzed skin clinical score, total IgE levels(by ELISA), WBC differential counting(neutrophils, Monocytes), absolute cell number of Neutrophil + Gr-1 +, CCR3 mrna expressions(by Real-time PCR), IL-4, IFN-Ɣ production levels(by ELISA), histologic test(by H&E staining, toluidine blue staining). Results : The results of making NC/Nga mouse induced atopic dermatitis swim in tanks filled with DOGO phreatic water(contain germanium) are as follows. c 2014 the Society of Korean Medicine Ophthalmology & Otolaryngology & Dermatology This is an Open Access journal distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License ( which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. 141

2 1. Skin clinical scores were decreased significantly in comparison to control group. 2. Total IgG levels were decreased significantly in comparison to control group. 3. WBC differential counting(neutrophils, Monocytes) were decreased significantly in comparison to control group. 4. Absolute cell number of Neutrophil + Gr-1 + were decreased significantly in comparison to control group. 5. CCR3 mrna expressions were decreased significantly in comparison to control group. 6. IL-4, IFN-Ɣ production levels were decreased significantly in comparison to control group. 7. The epithelial tissue thickness, leucocytes infiltration, erythema, edema, excoriation, scaling, mast cells infiltrations in dorsal skin were decreased in comparison to control group. Conclusions : These results indicate that DOGO phreatic water(contain germanium) can be used for helping treat atopic dermatitis. Key words : DOGO phreatic water; germanium; Atopic Dermatitis; NC/Nga mouse. Ⅰ. 서론 아토피피부염은대개유아기에발생하여피부건 조증, 소양감, 홍반, 부종, 삼출, 가피등의증상을동 반하는염증성피부질환으로만성적인경과를거친 다. 전세계적으로 8 20% 의유병률을보이며국내에 서도최근몇년동안증가하는추세를보이고있다 1-4). 아토피피부염의원인은다양한데유전적배경에 서부터음식알레르기, 면역학적이상, 피부장벽의 이상, 환경적, 사회적인자및심인성요인등이복합 적으로연관되어나타나는질환이며면역학적측면에 서발병기전을살펴보면 IgE 증가, mast cell, T 세 포, 호산구등과같은여러세포들과 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포비율의증가, Th2 매개 cytokine 간의 불균형등이기전으로알려져있다 5-7). 최근의연구 경향을살펴보면아토피피부염중약 80% 정도가 IgE 와관련되어있으므로 8) 면역조절을통해 IgE 생산 증가를억제시키는것과관련한연구들 9-12) 이진행되 고있으며현재까지알려진아토피피부염치료방법 인스테로이드제나항히스타민제는장기간사용시부 교신저자 : 안택원, 대전대학교한의과대학사상체질과충남천안시두정동 621 번지대전대부속천안한방병원 (Tel : , Fax : , twahn@dju.kr) 접수 2014/10/2 수정 2014/11/9 채택 2014/11/16 작용과역치값의상승을일으킴에따라근본적인치료가되지못해, 아토피피부염치료의대체요법들에대하여연구가활발히진행중이다 13,14). 아토피피부염치료의대체요법이용실태에대한조사에따르면한약, 온천및목욕, 건강보조식품. 식이요법등이대체요법으로이용되고있으며 100명의조사인원중 84명 (84%) 이대체의학을현재이용하고있거나과거이용하였던것으로조사되었다. 84명이총 181개의방법을사용하였고개인당평균 22개의대체의학을사용하였으며최고로 7개까지사용한경우도있었다. 경험한대체의학의종류중온천및목욕요법을이용한수가 47.6% 에달했다 15). 온천은일반적으로마그마성수증기에의해뜨거워진지하수가지표로용출되는열수를말하며한국에서는 1981년 4월 2일법률제 3377호로제정공포된온천법제 2조에서 온천이라함은지하로부터용출되는 25 이상의온수로서그성분이인체에해롭지아니한것을말한다 라고정의하고있다. 이러한온천은세포의신진대사를촉진하며류마티스. 신경통, 골수염. 신방광질환등에효능이있다고알려져한국에서도삼국시대이전부터광범위하게응용되어왔고또한많은온천들이개발되어왔다 16). 온천욕은다양한만성피부질환에서효과적으로이용되고있고특히건선과아토피피부염이대표적인질환으로알려 142

3 이진욱외 5 인 : 아토피양접촉피부염유발 NC/Nga mouse 에서도고온천수에첨가한게르마늄성분의효과 져있다 17). 충청남도아산시도고면기곡리와선장면신성리에있는파라다이스스파도고온천은 Ca(Na)- HCO3(SO4) 형알칼리성단순천으로수온은 이며삼국시대때백제와신라의전투에서부상당한신라의왕이이곳에서온천이용후완치되었다는구전이있다 18). 온천수는대부분황, 마그네슘, 셀레늄, 철, 리튬, 아연, 망간, 스트론툼등으로구성되어있으며온천수의화학적효과는온천수성분들의화학적, 물리적, 열적, 면역적관점에서설명할수있다 19). 게르마늄은무기게르마늄과유기게르마늄으로분류할수있는데무기게르마늄은인체내유입시빈혈, 근육장애와같은증상을유발하며유기게르마늄은항종양효과, 항돌연변이효과, 면역강화작용, 항염증작용, 해열. 진통작용등다양한약리작용을가지고있는것으로알려져있다. 최근에는이런작용을바탕으로기능성농산물생산을위한농자재에사용되고있으며그외주방용품이나욕조등생활, 가전제품에다용도로사용되고있다. 그러나아직까지온천수치료에있어게르마늄이가진효능을밝힌연구는거의전무한상태이다 20). 이에본연구에서는게르마늄성분이포함된도고온천수의아토피피부염에대한치료효과를확인하기위하여, 아토피양접촉피부염유발 NC/Nga mouse 를이용하여도고온천수와게르마늄이첨가된도고온천수의입욕수영을통하여피부발진점수를측정하고, 면역글로블린 -E, 백혈구내호중구및단핵구빈도, 등피부조직내총호중구세포수, 등피부조직의 Eoxatin 2와 CCR3 mrna 유전자발현, 비장세포배양상충액에서사이토카인수준측정, 등피부조직의변화관찰등을통하여유의한결과를얻었기에보고하는바이다. Ⅱ. 실험 1. 재료 1) 동물아토피피부염병변을관찰하기위하여수컷이며 7 주령의 20~22g NC/Nga mouse(slc, Inc, Japan) 를중앙실험동물에서공급받았다. 동물은실험당일까지고형사료 ( 항생제무첨가, 삼양사료 Co.) 와물을충분히공급하고온도 22±2, 습도 55±15%, 12시간 light-dark cycle의환경을유지하며 1주간적응시킨후실험에사용하였다. 동물실험의윤리적, 과학적타당성검토및효율적인관리를위하여대전대학교동물실험윤리위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee : IACUC) 의승인 ( 승인번호 : DJUARB ) 을받았다. 2) 온천수 1 명칭 : 파라다이스스파도고온천원수 2 공급자 : 아산시청 3 투여방법 : Water maze 에서 30분간매일오전 11시에수영 3) 수돗물 1 명칭 : 대전대학교한의과대학수돗물 2 투여방법 : Water maze 에서 30분간매일오전 11시에수영 4) 도고온천수 (DG-PW) 에첨가된게르마늄의함량및원적외선르마늄원석을분말형태로만든후분말을물속에녹여게르마늄이첨가된도고온천수 (DG-PW+ E ADD ) 를만들었다. 물속게르마늄함량을 3일에걸쳐검사한결과첫날 μg /l, 둘째날 μg /l, 다섯째날 μg /l이검출되었다. 게르마늄원적외선검 143

4 사결과는방사율 0.86, 파장 8-15μm이었으며음이온총량은 2.77% 이었다. 5) 시약및기기 1 시약본실험에사용된시약은 diethyl pyrocarbonate (DEPC), chloroform, trichloroacetic acid, isopropanol, Tris-HCl, KCl, MgCl2, 적혈구용혈액 (ACK lysis solution), DMEM 배양액, dulbecco's phosphate buffered saline(d-pbs), Sulforhodamin B(SRB), 2-isopropanol, Sodium dodecyl sulfate(sds), antibiotics, 표준시료로사용한 rutin과 quercetin 은 Sigma 사 (USA) 제품을사용하였으며, 우태아혈청 (fetal bovine serum, FBS) 은 Hyclone 사 (Logan, USA) 제품을, anti-cd3-pe(phycoerythrin), anti-cd4-fitc(fluorescein isothiocyanate), anti-b220-pe, anti-gr-1-pe, anti-cd8-fitc, anti-cd3 mab 등은 Pharmingen 사 (Torreyana, USA) 제품을, IL-4, IL-5, IFN-γ, IL-13 ELISA kit는 BioSource 사 (California, USA) 제품을, IgE ELISA kit는 SHIBAYAGI 사 (Shibukawa, Japan) 제품을, 기타일반시약은특급시약을사용하였다. 2 기기기기는열탕추출기 ( 대웅, DWT-1800T, Korea), 감압증류장치 (Rotary vaccum evaporator, BUCHI B-480, Switzerland), 동결건조기 (freeze dryer, EYELA FDU-540, Japan), CO2 배양기 (Forma scientific Co., U.S.A.), 원심분리기 ( 한일과학, Korea), plate shaker(lab-line, U.S.A.), spectrophotometer (Shimazue, Japan), Bio-freezer(Sanyo, Japan), Quantitative Real- Time PCR(Applied Biosystems, U.S.A.), ELISA leader(molecular Devices, U.S.A.), HPLC(Waters Co. Milford, MA, USA) 등을 사용하였다. 2. 방법 1) 피부염유도및시료처리 7주령의 NC/Nga mouse 를 1주일동안적응시킨후 NC/Nga mouse 의등에귀하단부에서부터꼬리상단부까지전체를제모하고 24시간방치후 1% 의 DNCB(dinitrochlorobenzene) 가들어있는아세톤 : 올리브오일 (3 : 1) 200 μl를제모부위에도포하고, 3 일후 2차도포하였다. 1차도포후 7일째부터는, 1주일에 3회씩 3주간 0.4% DNCB 용액 150 μl를재차도포 (10주령 13 주령 ) 하여아토피피부염을유발시켰다. 2) 실험군설정 NC/Nga mouse 를아무처리도하지않은정상군, 등을제모한후 0.4% DNCB 를 2주간도포하고증류수에서 3주간오전 11시에서 30분간입욕수영시킨군을대조군 (CT), 등을제모한후 0.4% DNCB 를 2 주간도포하고수돗물에서 3주간오전 11시에서 30분간입욕수영을시킨군 (TW), 등을제모한후 0.4% DNCB 를 2주간도포하고도고온천수에서 3주간오전 11시에서 30분간입욕수영을시킨군 (DG-PW), 등을제모한후 0.4% DNCB 를 2주간도포하고게르마늄첨가도고온천수에서 3주간오전 11시에서 30 분간입욕수영을시킨군 (DG-PW+GE ADD ) 으로나누어설정하였다 (Fig. 1). 3) 피부발진점수측정피부발진육안평가는 Yamamoto 21) 의평가항목을참고하여소양을동반한홍반, 구진 ( 살갖에돋는발진 ), 인설 ( 비듬 ), 가피 ( 딱지 ), 태선화등의증상을 0( 없음 ), 1( 경증 ), 2( 중증 ), 3( 고증 ) 으로개체마다육안평가하여아토피피부발진을판단하였다. 144

5 이진욱외 5 인 : 아토피양접촉피부염유발 NC/Nga mouse 에서도고온천수에첨가한게르마늄성분의효과 CT CT TW TW 4) 채혈및면역글로블린 -E 수준측정 NC/Nga mouse 의후안와정맥총에서 10주, 12주, 14주에 capillery tube를이용하여약 100 μl의혈액을채혈한후원심분리기 6,500 rpm에서 20분간원심분리한후 30 μl의혈청을분리하였다. 혈청은취하여 -70 에냉동보관하였고 NC/Nga mouse 의혈청내 IgE 농도측정은 ELISA 로 IgE 수준을측정하였다. 각 well에 NC/Nga mouse 에서 10주, 12주, 14 주에채혈한혈청 5 μl (1/10 dilution) 와 dilution buffer 45 μl를혼합하여각 well에분주하고, 2시간동안 25 실온에서방치한후 2회 washing 완충용액으로세척한다음, biotin- conjugated anti IgE를넣고 2시간방치하였다. 그리고다시 2회수세후완충용액으로세척한다음 Avidin-HRP conjugeted antibody 100 μl를처리하고 1시간실온에서방치한후다시세척하였다. 또한 TMB 기질을 100 μl씩분주하고암소에서 30분간방치한후 100 μl의 stop 용액을처리한후 ELISA reader 450 nm에서흡광도를측정하였다. 5) 혈액중백혈구와호중구, 호산구세포수의측정최종실험종료후 heparin (20 IU) 30 μl처리된 3 ml주사기로심장혈액 0.8 ml를채취하였다. 전혈을바이오톡스텍 ( 주 )( 청주, 충청북도 ) 에의뢰하여혈액중백혈구와호중구, 호산구의총세포수를자동혈액분석기로측정하였다. 6) 등피부조직에서 quantitative real-time-pcr 분석 Fig. 1. Swimming of NC/Nga mouse models caused atopic dermatitis CT : 0.4% DNCB + Distilled water swimming TW : 0.4% DNCB + Tap water swimming DG-PW : 0.4% DNCB + DOGO phreatic water swimming DG-PW+GE ADD : 0.4% DNCB + DOGO phreatic water added germanium swimming 1 NC/Nga mouse 의등피부조직에서 RNA 분리 Atopic dermatitis-like skin NC/Nga mouse 의등피부조직을적출하여각각에 RNAzol B 500 μl를넣고용해될때까지 homogenizer 로분쇄하였으며이조직분쇄혼합부유액에클로로포름 (CHCl 3 ) 50 μl를첨가한후 15초간다시혼합 145

6 하였다. 이를얼음에 15분간방치한후 13,000 rpm에서원심분리한후약 200 μl의상청액을회수하여 2-propanol 200 μl와동량혼합후천천히흔들고얼음에서 15분간방치하였으며, 이를다시 13,000 rpm에서원심분리한후 80% EtOH 로수세하고 3분간 vaccum pump 에서건조하여 RNA를추출하였다. 추출한 RNA는 DEPC 를처리한 20 μl의증류수에녹여 heating block 75 에서불활성화시킨후 first strand cdna 합성에사용하였다. 2 역전사 -중합효소연쇄반응역전사반응은준비된총 RNA 2 μg을 DNase I(10 U/ μl ) 2U/tube 를 37 heating block 에서 30분간반응한후 75 에서 10 분동안변성시켰고, 이에 2.5 μl 10 mm dntps mix, 1 μl random sequence hexanucleotides(25 pmole/25 μl ), RNA inhibitor 로서 1 μl RNase inhibitor(20 U/ μl ), 1 μl 100 mm DTT, 4.5 μl 5 RT buffer(250 mm Tris-HCl, ph 8.3, 375 mm KCl, 15 mm MgCl 2 ) 를가한후, 1 μl의 M-MLV RT(200 U/ μl ) 를다시가하고 DEPC 처리된증류수로서최종부피가 20 μl가되도록하였다. 이 20 μl의반응혼합액을잘섞은뒤 2,000 rpm에서 5초간원심침강하여 37 heating block 에서 60분동안반응시켜 first-strand cdna를합성한다음, 95 에서 5 분동안방치하여 M-MLV RT(Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase, Promega, USA) 를불활성화시킨후합성이완료된 cdna 를 PCR에사용하였다. 3 Real time quantitative RT-PCR Real time quantitative PCR은 7500 Real-Time PCR system 을이용하여수행하였으며 Mouse Olionucleotid 의염기배열은다음과같다. Cytokine 유전자발현은 SYBR R Green PCR Master mix를사용하였고, 내부기준은 GAPDH 로 Taqman probe 를사용하였으며, primer 의최종농도가 200 nm이되게반응시켰다. CCR3 와 Eotaxin mrna 발현은등피부조직에서관찰하였고 cdna 를합성하여분석하였다. Real time quantitative PCR의조건은전변성은 2min at 50, 10min 94, 그리고 40 cycles 을 0.15min at 95, 1 min at 60 에서수행하였다. hydrocortinsone 도포군과야생화추출물투여군의대조군은내부기준은 GAPDH 를사용하여목표그룹의 Quantitative PCR 은 y=x(1+e)n(x:starting quantity, y : yield, n : number of cycles, e : efficiency) 로계산하여 RQ(relative quantitative) 을측정하였다. 7) 비장세포분리및사이토카인측정 NC/Nga mouse 실험 14주후에실험을종료하고비장을적출하여 100 mesh 로비장세포를분리하였으 Table 1. Primer Sequence Gene Primer Sequence G3PDH Forward 5' TGAAGCAGGCATCTGAGGG 3' Reverse 5' CGAAGGTGGAAGAGTGGGAG 3' CCR3 Forward 5' AGCCTAACCCTGTTGGAGGT 3' Reverse 5' GTGATCGGCTTTTCTTGAGC 3' Eotaxin Forward 5' ATGCCCAACAAAGCAGAGAC 3' Reverse 5' TGAGAGAACCAGGGAGCTGT 3' 146

7 이진욱외 5 인 : 아토피양접촉피부염유발 NC/Nga mouse 에서도고온천수에첨가한게르마늄성분의효과 며, 전날 CD3 mab 1 μg / ml을 96well plate에코팅하여 4 냉장고에서하루밤을보내게한다음 D-PBS 로 2회수세하였다. 분리한비장세포는 ACK 용액으로 RBC를제거한후 DNCB extract 가코팅된각각의 well에 5x10 5 세포씩 5% FBS-DMEM 배양액에서 48시간동안배양한후, 원심분리기 2,000 rpm에서 3분간원심분리한후 200 μl의배양상청액을얻었으며배양상청액내의 IL-4(BioSource, USA) 와 IFN-γ (BioSource, USA) 의수준측정은 ELISA 로측정하였다. 각 well 에배양상청액 50 μl를분주하고, 2시간동안 25 실온에서방치한후 2회 washing 완충용액으로세척한다음 biotin conjugated anti-ige 를넣고 2시간방치하였으며, 다시 2회수세후완충용액으로세척한다음 Avidin-HRP conjugeted antibody 100 μl를처리하고 1시간실온에서방치한후다시세척하였다. TMB 기질을 100 μl씩분주하고암소에서 30분간방치한후 100 μl의 stop 용액을처리한후 ELISA reader 450 nm에서흡광도를측정하였다. 8) 비장세포에서 Th1/Th2 사이토카인발현변화 NC/Nga mouse 로부터비장을적출하여비장세포를분리하고 T cell-specific mitogen 인 CD3 mab(bd, USA) 와함께일정시간배양한후배양액으로부터 Th1(IFN-γ), Th2 사이토카인 (IL-4) 농도를 ELISA 로측정하였다. 아토피양접촉피부염이발생되면모든 Th2 사이토카인이 CD3 mab 자극에의해크게증가하게되며, 시험물질이 Th2 사이토카인을감소시키는지평가하였다. 9) 조직분석등쪽목부분의피부를떼어내어 10% paraformaldehyde 에서 24시간동안포르말린에고정하였으며그조직을파라핀으로포맷하였고, 5 μm두께로 block 을만들었다. 그조직부분은염증을일으키는표피, 진피, 각질세포, 호중구, 호산구, 그외다른세포와부종을식별하는 hematoxyline / eosin(h&e) 염색과 비만세포를염색하는 toluidine blue 염색으로비만세포의침윤을광학현미경 (x200, Nikon, Japan) 으로관찰하였다. 10) 통계분석각실험군결과값은 unpaired student's T-test 통계프로그램을사용하여통계처리하였으며, p<0.05 이하의수준에서유의성검정을실시하였다 (* : p<0.05, ** : p<0.01, *** : p<0.001). Ⅲ. 성적 1. 도고온천수 (DG-PW) 의성분분석도고온천수에서는불소 3.3 mg /l, 황산이온 30 mg /l 검출되었으며 ph7.8 로조사되었다 (Fig. 2). 2. 도고온천수 (DG-PW) 와게르마늄첨가도고온천수 (DG-PW+GE ADD ) 에의한피부발진점수측정대조군 (CT) 의피부발진점수는 DNCB 를도포한후계속증가하였고, 수돗물에서입욕수영시킨군 (TW) 에서는대조군 (CT) 에비하여차이가나타나지않았다. 도고온천수에서입욕수영시킨군 (DG-PW) 은대조군 (CT) 에비하여 28.3% 이상유의성있게 (p<0.01) 감소하였으며게르마늄을첨가한도고온천수 (DG-PW+GE ADD ) 에서수영시킨군은대조군 (CT) 에비하여 62.2% 이상유의성 (p<0.001) 있게감소하였다 (Fig. 3). 3) 도고온천수 (DG-PW) 와게르마늄첨가도고온천수 (DG-PW+GE ADD ) 에의한면역글로블린 -E 수준측정실험종료후 10주령, 12주령, 15주령에서채혈하여혈청내 IgE 수준을측정한결과, 10주령 NC/Nga mouse 에서자연적으로증가가되고 DNCB 를도포한 147

8 대조군 (CT) 은 15주에서 DNCB 를도포하지않은정상군보다약 37% 이상 IgE 수준이증가되었다. 수돗물에서입욕수영시킨군 (TW) 에서는대조군 (CT) 에비하여통계적의미를가지는차이가나타나지않았고최종 15주에서는도고온천수에서입욕수영시킨군 (DG-PW) 이대조군 (CT) 에비하여 21.7% 이상유의성있게 (p<0.01) 감소하였다. 게르마늄첨가한도고온천수에서입욕수영시킨군 (DG-PW+GE ADD ) 은대조군 (CT) 에비하여 27.9% 이상유의성있게 (p<0.01) 감소하였다 (Fig. 4). 4) 도고온천수 (DG-PW) 와게르마늄첨가도고온천수 (DG-PW+GE ADD ) 에의한백혈구내호중구및단핵구빈도측정실험종료후채혈하여 WBC 내의호중구및단핵구빈도 (%) 를측정한결과, DNCB 를도포하지않은정상군에비하여대조군 (CT) 이호중구및단핵구빈도 (%) 가증가하였다. 수돗물에서입욕수영시킨군 (TW) 과도고온천수에서입욕수영시킨군 (DG-PW) 은 WBC 내의호중구및단핵구빈도 (%) 가대조군 (CT) 에비하여감소하였지만통계적유의성을 Fig. 2. DOGO phreatic water component 148

9 이진욱외 5 인 : 아토피양접촉피부염유발 NC/Nga mouse 에서도고온천수에첨가한게르마늄성분의효과 Fig. 3. Skin clinical score of NC/Nga mouse Skin clinical score of NC/Nga mouse was evaluated by referring Yamato's way. The score was shown by adding up each subsections score. Subsections were divided into 5(erythema / hemorrhage, dryness / scarring, excoriation / edema / erosion, lichenification), then each subsections got scored 0 to 3 following none(0), mild(1), moderate(2), severe(3). The results represent the mean±s.e. Statistically signigicant value was calculated by compared with control group by student's T-test(* : p<0.05, ** : p<0.01, *** : p<0.001). DNCB-CT : 0.4% DNCB + Distilled water swimming DNCB-TW : 0.4% DNCB + Tap water swimming DNCB-DG-PW : 0.4% DNCB + DOGO phreatic water swimming DNCB-DG-PW+GE ADD : 0.4% DNCB + DOGO phreatic water added germanium swimming Fig. 5. WBC differential counting(neutrophils, Monocytes) of NC/Nga mouse After NC/Nga mice of each groups were treated with swimming in each tanks, WBC differential counting(neutrophils, Monocytes) were checked in serum. The results represent the mean±s.e. Statistically signigicant value was calculated by compared with control group by student's T-test(* : p<0.05, ** : p<0.01, *** : p<0.001). DNCB-CT : 0.4% DNCB + Distilled water swimming DNCB-TW : 0.4% DNCB + Tap water swimming DNCB-DG-PW : 0.4% DNCB + DOGO phreatic water swimming DNCB-DG-PW+GE ADD : 0.4% DNCB + DOGO phreatic water added germanium swimming 가지지는못하였다. 게르마늄을첨가한도고온천수에서입욕수영시킨군 (DG-PW+GE ADD ) 은 WBC 내의호중구빈도 (%) 감소는유의성을가지지못하였지만단핵구빈도 (%) 는대조군 (CT) 에비하여 38.5% 이상유의성있게 (p<0.05) 감소하였다 (Fig. 5). Fig. 4. Total IgE levels of NC/Nga mouse After age of 10, 12 and 15 weeks NC/Nga mice were treated with swimming in each tanks, total IgE levels were checked in serum. Total IgE levels were measured by ELISA. The results represent the mean±s.e. Statistically signigicant value was calculated by compared with control group by student's T-test(* : p<0.05, ** : p<0.01, *** : p<0.001). DNCB-CT : 0.4% DNCB + Distilled water swimming DNCB-TW : 0.4% DNCB + Tap water swimming DNCB-DG-PW : 0.4% DNCB + DOGO phreatic water swimming DNCB-DG-PW+GE ADD : 0.4% DNCB + DOGO phreatic water added germanium swimming 5) 도고온천수 (DG-PW) 와게르마늄첨가도고온천수 (DG-PW+GE ADD ) 에의한등피부조직내 Neutrophil + Gr-1 + MSC의총세포수측정실험종료후혈액에서 PBMC 와등피부조직에서세포를분리하여 Neutrophil + Gr-1 + MSC의총세포수와비율을측정한결과, DNCB 를도포하지않은정상군에비하여대조군 (CT) 의 Neutrophil + Gr-1 + MSC의총세포수와비율이현저하게증가하였다. 수돗물에서입욕수영시킨군 (TW) 에서는대조군 (CT) 에비하여차이가나타나지않았고도고온천수에서입욕수영 149

10 시킨군 (DG-PW) 은 Neutrophil + Gr-1 + MSC의총세포수비율이대조군 (CT) 에비하여 48.4% 이상유의성있게 (p<0.05) 감소하였다. 게르마늄첨가한도고온천수에서입욕수영시킨군 (DG-PW+GE ADD ) 은대조군 (CT) 에비하여 78.8% 이상유의성있게 (p<0.01) 감소하였다 (Fig. 6). 6) 도고온천수 (DG-PW) 와게르마늄첨가도고온천수 (DG-PW+GE ADD ) 에의한등피부조직 Eoxatin 2와 CCR3 mrna 유전자발현분석실험종료후등피부조직에서세포를분리하여 Eoxatin 2와 CCR3 mrna 유전자발현을분석한결과, DNCB 를도포하지않은정상군에비하여대조군 (CT) 이 Eoxatin 2와 CCR3 mrna 유전자발현이현저하게증가하였다. 수돗물에서입욕수영시킨군 (TW) 에서는대조군 (CT) 에비하여차이가나타나지않았고도고온천수에서입욕수영시킨군 (DG-PW) 은 Eoxatin 2(p<0.001) 와 CCR3 mrna(p<0.01) 유전자발현이대조군 (CT) 에비하여각각유의성있게감소하였다. 게르마늄첨가한도고온천수에서입욕수영시킨군 (DG-PW+GE ADD ) 역시 Eoxatin 2와 CCR3 mrna 유전자발현이대조군 (CT) 에통계적유의성을가지며큰폭으로 (p<0.001) 감소하였다 (Fig. 7). Fig. 6. Neutrophil + Gr-1 + absolute cells number in dorsal skin of NC/Nga mouse NC/Nga mice were sacrificed absolute cell number of Neutrophil + Gr-1 + were checked in dorsal skin. The results represent the mean±s.e. Statistically signigicant value was calculated by compared with control group by student's T-test(* : p<0.05, ** : p<0.01, *** : p<0.001). DNCB-CT : 0.4% DNCB + Distilled water swimming DNCB-TW : 0.4% DNCB + Tap water swimming DNCB-DG-PW : 0.4% DNCB + DOGO phreatic water swimming DNCB-DG-PW+GE ADD : 0.4% DNCB + DOGO phreatic water added germanium swimming Fig. 7. Eoxatin 2, CCR3 mrna expression in dorsal skin of NC/Nga mouse NC/Nga mice were sacrificed Eoxatin 2, CCR3 mrna expressions were checked in dorsal skin. Eoxatin 2, CCR3 mrna expressions were analyzed by Real-time PCR. The results represent the mean±s.e. Statistically signigicant value was calculated by compared with control group by student's T-test(* : p<0.05, ** : p<0.01, *** : p<0.001). DNCB-CT : 0.4% DNCB + Distilled water swimming DNCB-TW : 0.4% DNCB + Tap water swimming DNCB-DG-PW : 0.4% DNCB + DOGO phreatic water swimming DNCB-DG-PW+GE ADD : 0.4% DNCB + DOGO phreatic water added germanium swimming 150

11 이진욱외 5 인 : 아토피양접촉피부염유발 NC/Nga mouse 에서도고온천수에첨가한게르마늄성분의효과 7) 도고온천수 (DG-PW) 와게르마늄첨가도고온천수 (DG-PW+GE ADD ) 에의한비장세포배양상층액에서사이토카인수준측정실험종료후비장세포를분리하여 anti-cd3 로자극하며 48시간배양후비장세포배양상층액에서 IL-4와 IFN-Ɣ 의생산량을분석한결과, DNCB 를도포하지않은정상군에비하여대조군 (CT) 에서 IL-4와 IFN-Ɣ 의생산량이현저하게증가하였고수돗물에서입욕수영시킨군 (TW) 에서는대조군 (CT) 에비하여차이가나타나지않았다. 도고온천수에서입욕수영시킨군 (DG-PW) 은 IL-4와 IFN-Ɣ 의생산량이대조군 (CT) 에비하여그수치가감소하였고특히 IL-4는유의성있게 (p<0.01) 감소하였다. 게르마늄을첨가한도고온천수에서입욕수영시킨군 (DG-PW+ GE ADD ) 역시 IL-4와 IFN-Ɣ 의생산량이대조군 (CT) 에비하여수치감소하였고 IL-4는유의성있게 (p<0.01) 감소하였다 (Fig. 8). 8) 도고온천수 (DG-PW) 와게르마늄첨가도고온천수 (DG-PW+GE ADD ) 에의한등피부조직검사실험종료후등피부를절단하여 H&E 염색하여분석한결과, 정상군에비하여대조군 (CT) 의상피조직이부종으로현저하게확장되었고 leucocytes 의침윤, erythema, edema, excoriation, scaling 도보이고있다. 도고온천수에서입욕수영시킨군 (DG-PW) 과게르마늄첨가도고온천수에서입욕수영시킨군 (DG-PW+GE ADD ) 은대조군 (CT) 에비하여상피조직의두께가현저하게줄었고, leucocytes 의침윤및 erythema, edema, excoriation, scaling 등은보이지않아부종이거의사라진것을알수있다. 수돗물에서입욕수영시킨군 (TW) 에서는대조군 (CT) 에비하여차이가나타나지않았다. Fig. 8. IL-4, IFN-Ɣ production of NC/Nga mouse NC/Nga mice were sacrificed IL-4, IFN-Ɣ production levels were checked in spleen cell. IL-4, IFN-Ɣ production levels were measured by ELISA. The results represent the mean±s.e. Statistically signigicant value was calculated by compared with control group by student's T-test(* : p<0.05, ** : p<0.01, *** : p<0.001). DNCB-CT : 0.4% DNCB + Distilled water swimming DNCB-TW : 0.4% DNCB + Tap water swimming DNCB-DG-PW : 0.4% DNCB + DOGO phreatic water swimming DNCB-DG-PW+GE ADD : 0.4% DNCB + DOGO phreatic water added germanium swimming Fig. 9. Histologic test in dorsal skin of NC/Nga mouse NC/Nga mice were sacrificed, and dorsal skin were processed for histology and stained with Hematoxylin-Eosin & Toluidine Blue. DNCB-CT : 0.4% DNCB + Distilled water swimming DNCB-TW : 0.4% DNCB + Tap water swimming DNCB-DG-PW : 0.4% DNCB + DOGO phreatic water swimming DNCB-DG-PW+GE ADD : 0.4% DNCB + DOGO phreatic water added germanium swimming 151

12 또한등피부에침윤된비만세포를관찰하기위하여 toluidine blue 염색하여분석한결과, 정상군에비하여대조군 (CT) 의비만세포가현저하게증가되었고, 도고온천수에서입욕수영시킨군 (DG-PW) 과게르마늄첨가도고온천수에서입욕수영시킨군 (DG-PW+GE ADD ) 은대조군 (CT) 에비하여비만세포가거의사라진것을알수있다. 수돗물에서입욕수영시킨군 (TW) 에서는대조군 (CT) 에비하여차이를나타나지않았다.(Fig. 9). Ⅳ. 고찰보통아토피피부염의면역지표는혈액내 IgE의농도와호산구수의증가정도이다. 또한혈액내 IgG 는독성물질이나바이러스를없애며백혈구의식. 살균작용을보조한다. 혈액내 IgE의증가는혈액내 IgG1의증가에도관여한다. 아토피피부염은항원의자극을받아항체 IgE가생산되고. 비만세포의고친화성수용체와 IgE가결합한상태에서다시항원의자극을받을경우알레르기유발물질인 Cytokine, Histamine, Leukotrienes 를분비한다. 이알레르기유발물질들의분비로인해염증과가려움증을나타낸다. 아토피피부염에서의면역체계는 helper T cell(th) 세포의활성화를중심으로이루어지며활성화된 Th 세포는그들이분비하는사이토카인의종류에따라제1형과 2형으로나누어진다. 아토피성피부염은제2형 T 세포 (Th2) 가활성화되어나타난면역질환이다 22). 아토피피부염치료의대체요법이용실태에대한설문조사를살펴보면전체 100명의연구대상환자중 84명 (84%) 이대체의학을현재이용하고있거나과거이용하였던것으로조사되었다. 84명이총 181 개의방법을사용하였고개인당평균 2.2개의대체의학을사용하였으며최고 7개까지사용한경우도있었다. 경험한대체의학의종류로는한약이 73.8% 로가 장많았고온천과목욕요법이 47.6%, 건강보조식품 39.9%, 식이요법 25.0% 등이비교적자주이용되었고소수에서침을사용하였다. 목욕요법에는입욕제의개념으로녹차, 해초, 소금물, 쑥, 탱자, 뱀딸기풀, 어성초, 숯, 쌀뜨물, 버섯, 검정콩등다양한종류가이용되었다 15). 또다른아토피피부염환자의대체의학이용실태에관한연구를살펴봐도총 200명의조사인원중 156명 (78%) 이대체요법을이용한경험이있으며그중 115명 (73.7%) 이온천목욕. 요법을이용한적이있는것으로나타났다. 대체요법을이용한 156명에게치료효과를물어본결과 101명 (64.7%) 이 좋다, 20명 (12.8%) 이 나쁘다, 18명 (11.5%) 이 모르겠다, 17명 (10.9%) 이 보통이다 로답하여대체적으로치료효과가좋다고생각하는것으로나타났다 23). 아토피피부염치료의대체요법으로많이이용되는온천욕은일반적으로마그마성수증기에의해뜨거워진지하수가지표로용출되는열수를말하며온천학상의좁은뜻에서의온천은물리, 화학적으로보통의물과는성질이다른천연의특수한물이땅속에서지표로나오는현상을말하며, 1981년 3월 2일법률제 3377호로제정공포된온천법제 2조에서 온천이라함은지하로부터용출되는 25 이상의온수로서그성분이인체에해롭지아니한것을말한다. 라고정의하고있다 16,24). 우리나라는예로부터온천을귀하게여겨왔으며이것은설화뿐만아니라역사적인기록속에서도찾아볼수있다. 역사상에남아있는온천과관련된기록들인신정비, 고려사, 경국대전, 대전회통을통해온천을우리선조들이상당히귀한신물로서여기고있음을알수있다. 1476년성종에세운신정비는세조가 1458년온양에서온천욕을한후그효과가좋아서신정이라명명했다는이야기가새겨져있다. 고려사에는고려선종때병든부모의온천치료를하는관리에게휴가제를실시했다는기록이있다. 경국대전과대전회통에는 온천이있는곳의수령은욕장을관리하고병인을구호해야한다.', 온천을발견한자 152

13 이진욱외 5 인 : 아토피양접촉피부염유발 NC/Nga mouse 에서도고온천수에첨가한게르마늄성분의효과 는현직자의경우 3계급특진, 천인에게는입역을면제한다 ' 는기록이남아있다. 삼국사기 ' 에나타난온양온천기록을시작으로 16종의고문헌속에 43곳의온천이기록되어있다. 삼국유사에신라제상충원공이동래에서 온정목욕 ' 을했다는기록이있으며이를토대로삼국시대에온천을이용했다는것을알수있다. 고문헌에기록된총 144회정도의기록들중빈도수가가장높은온천은온양온천이고그다음으로이천온천, 동래온천, 평해온천등이다. 충청남도온양온천은우리나라에서가장오래된온천으로알려져있다. 조선시대여러왕들은중풍과피부병, 안질을치료하기위해이용하였고왕비들은부인병을치료하기위해내려온기록들이실록을통해전해지고있다. 온양온천은다른지역의온천보다수온이높은편이며중탄산나트륨천으로각종성인병과피부미용에효과가큰것으로알려져있다 25). 온천요법은함유성분의화학적효과, 물리적효과, 온열효과, 면역학적관점의효과가있으며화학적효과는광천수의구성성분과직접적으로연관이있다. 황은유황수에서유리이온이나결합이온으로존재하는데뜨거운유황수는항염증작용, 각질분해작용, 항소양작용, 항균작용, 항진균작용을한다. 따라서실험에사용된도고온천수와같은유황천은피부나점막을통해비교적쉽게체내로흡수되어환원력이강하다. 물리적효과의측면을살펴보면, 온천수에몸을담그는것은고압력샤워를통한수압마사지를받는것과같은변화를가져오는데수분과염분의이뇨, 혈액희석, 심장에서의혈액유출량의증가등과같은생리적변화를확인할수있다 16). 온열효과는혈관확장을일으키며혈액순환을촉진하고혈압을낮춘다그리고온열은신경의전도속도에영향을주고통증의역치를증가시켜통증을감소시키고열의진통효과는베타엔돌핀의농도증가로일부설명을할수있다. 온열의직접작용으로따뜻해진몸부분의온도가상승하고그에따라신진대사가증가하며모세혈관과소동맥의확장을가져오게한다. 이러한 효능에따라온천요법은심장병, 고혈압, 당뇨병, 신경통, 류마토이드관절염, 소화기질환, 혈액순환장애등에효과가크고피로회복및스트레스해소등의효과가있다 26,27,28). 면역학적인관점에서살펴보면광천수를피부에접촉하는것은피부에서다양한사이토카인의분비를증가혹은감소시킬수있다 16). 한의학에서바라보는온천은性味가辛熱하고약간의독이있어온천욕을하면疥癬과瘡毒을제거할수있고, 溫通經絡, 㓉暢氣血, 化瘀舒筋. 精神愉快의효능이있다고나와있다 29). 이는온천이가진화학적성질에대한인식으로온천의피부질환과에대한치료효능을나타낸다. 東醫寶鑑 에서는 石硫黃은性이大熱하며味는酸하며有毒하다. 心腹積聚, 邪氣, 冷癖과腰腎久冷, 冷風頑痺, 脚冷疼弱無力등에효과가있으며堅筋骨하고壯陽道하며頭禿, 惡瘡, 下部䘌瘡, 疥癬蟲을殺한다 라고되어있다 30). 온천에관한연구로는차등 9), 한 31) 의온천에대한문헌고찰에관한연구가있으며이등 32), 신등 33) 의온천요법의통증질환에대한연구가진행되어져있다. 최근아토피피부염치료에있어온천을이용한연구로는수소탄산나트륨형단순천알칼리성온천수로알려진유성온천에서아토피피부염환자를대상으로피부장벽지표중에서경표피수분손실량이유의성있게감소하는것을확인한 아토피피부염환자에서유성온천수를이용한온천욕의보조적치료효과와안전성에대한연구 34) 가있다. 또아토피피부염의동물모델인 Nc/Nga mouse 에게도고온천수내포함된황을제거한이후입욕요법을실시하여도고온천수유황성분의아토피피부염치료효과에대한효능을보여주는연구 35) 가있다. 이연구에서는유황성분을포함한온천수가단순보습작용을하는것을넘어아토피피부염환자의 IgE, 백혈구내호중구및단핵구수, IL-4와 IFN-γ 등의면역관련물질들이감소하여상피조직의두께, 백혈구침윤, 홍반, 부종등을감소시켜아토피피부염의증상을호전시킨것을밝혀내었다. 153

14 이에본연구에서는온천의효능중화학적효과에입각하여게르마늄성분이포함된도고온천수를이용하여아토피피부염에대한치료효과에대한연구를하였다. 본연구를시행한파라다이스스파도고온천은충청남도아산시도고면기곡리와선장면신성리에위치하고있으며약알카리천, 약염천에속하는유황천으로수온은 이며 2009 년보양온천으로지정되어있다 18). 이런약알칼리천, 약염천은우리나라에서비교적많이발견되는온천으로만성피부질환, 만성관절질환, 류머티즘, 신경통에효과가있다고알려져있다 36,37) 게르마늄은주기율표제4B족에속하는탄소족원소로토양, 식물, 약수등에분포해있다. 원소기호 Ge 로명명하며원자번호 32번이다. 게르마늄은유기성게르마늄과무기성게르마늄으로나누며무기성게르마늄은절대로복용할수없지만살갗에닿게하여통증을해소하는등성인병질환에는좋은효과가있다. 유기성게르마늄은현재복용할수있는합성용해성유기게르마늄이만들어져사용되고있다. 게르마늄은간독성경감, 돌연변이억제, 면역조절, 면역활성, 항암작용, 항바이러스작용, 혈압조절, 진통, 콜레스테롤저하등다양한방면에서치료효과를보이고있다. NC/Nga mouse 를이용하여아무처리하지않은정상군, 등을제모한후 0.4% DNCB 를 2주간도포하고증류수에서 3주간오전 11시에서 30분간입욕수영시킨군을대조군 (CT), 등을제모한후 0.4% DNCB 를도포하고수돗물에서입욕수영시킨군 (TW), 등을제모한후 0.4% DNCB 를도포하고도고온천수에서입욕수영시킨군 (DG-PW), 등을제모한후 0.4% DNCB 를도포하고게르마늄첨가도고온천수에서입욕수영시킨군 (DG-PW+GE ADD ) 으로나누어본실험을진행하였다 (Fig. 1). 먼저피부발진점수를살펴보면게르마늄을첨가한도고온천수에서입욕수영시킨군 DG-PW+ GE ADD ) 은대조군 (CT) 에비하여 62.2% 이상유의성 (p<0.001) 있게감소하였다 (Fig. 3). 실험종료후 10 주령, 12주령, 15주령에서채혈하여혈청내면역글로블린-E 수준을측정한결과, 게르마늄첨가한도고온천수에서입욕수영시킨군 (DG-PW+GE ADD ) 은대조군 (CT) 에비하여 27.9% 이상유의성있게 (p<0.01) 감소하였다 (Fig. 4). WBC 내의호중구및단핵구빈도 (%) 를측정한결과역시게르마늄첨가한도고온천수에서입욕수영시킨군 (DG-PW+GE ADD ) 의단핵구빈도 (%) 가대조군 (CT) 에비하여 38.5% 이상유의성있게 (p<0.05) 감소하였다 (Fig. 5). 실험종료후혈액에서 PBMC 와등피부조직에서세포를분리하여 Neutrophil + Gr-1 + MSC의총세포수를측정한하였다. 그결과게르마늄첨가한도고온천수에서입욕수영시킨군 (DG-PW+GE ADD ) 은대조군 (CT) 에비하여 78.8% 이상유의성있게 (p<0.01) 감소하였다 (Fig. 6). 또한등피부조직세포의 Eoxatin 2 와 CCR3 mrna 유전자발현을분석한하였을때도게르마늄첨가한도고온천수에서입욕수영시킨군 (DG-PW+GE ADD ) 의 Eoxatin 2와 CCR3 mrna 유전자발현이대조군 (CT) 에통계적유의성을가지며큰폭으로 (p<0.001) 감소하였다 (Fig. 7). 실험종료후비장세포를분리하여 anti-cd3 로자극하며 48시간배양후비장세포배양상층액에서 IL-4와 IFN-Ɣ 의생산량을분석한결과, 게르마늄을첨가한도고온천수에서입욕수영시킨군 (DG-PW+GE ADD ) 의 IL-4와 IFN-Ɣ 의생산량이대조군 (CT) 에비하여수치가감소하였고 IL-4는유의성있게 (p<0.01) 감소하였다 (Fig. 8). 실험종료후등피부를절단하여 H&E 염색하여분석한결과, 게르마늄첨가도고온천수에서입욕수영시킨군 (DG-PW+GE ADD ) 은대조군 (CT) 에비하여상피조직의두께가현저하게줄었고, leucocytes 의침윤및 erythema, edema, excoriation, scaling 등은보이지않아부종이거의사라진것을알수있었다. 또한등피부에침윤된비만세포를관찰하기위하여 toluidine blue 염색하여분석하였을때역시게르 154

15 이진욱외 5 인 : 아토피양접촉피부염유발 NC/Nga mouse 에서도고온천수에첨가한게르마늄성분의효과 마늄첨가도고온천수에서입욕수영시킨군 (DG-PW+GE ADD ) 이대조군 (CT) 에비하여비만세포가거의사라진것을확인할수있었다 (Fig. 9). 하지만이실험은사람이아닌아토피양접촉피부염동물모델을이용하였으며사람의아토피피부염유발시영향을끼치는유전적인요인을고려하지못했다는측면에서동물모델이사람의아토피피부염특성을반영하기에는어려움이있다 38). 따라서치료의보조용법으로사용되기전에아토피피부염환자들을대상으로한임상연구가필요할것으로사료되며, 향후이등 34), 장등 35) 의연구에서알려진온천의아토피피부염치료효과를이용한추가적인연구및임상연구가필요할것으로사료된다. 이상의결과를통해게르마늄성분이포함된도고온천수는아토피양접촉피부염유발 NC/Nga mouse 에서면역학적염증반응을효과적으로조절한다고볼수있으며이러한기전을바탕으로온천요법을이용하여아토피피부염에대체치료법으로이용가능할것으로판단된다. Ⅵ. 감사의글대전대학교 ( 참여기업 : 한국지에이티 ) 산학협력기술개발사업 ( 과제번호 C ) 의지원을받아수행되었음. Ⅴ. 결론아토피양접촉피부염유발 NC/Nga mouse 를도고온천수와게르마늄첨가도고온천수에서입욕수영을시켜아토피피부염치료에미치는영향을살펴본결과게르마늄성분이포함된도고온천수에서대조군과비교하여다음과같은유의한결과를얻었다. 1. 피부발진점수가유의성있게감소하였다. 2. IgE 수준이유의성있게감소하였다. 3. 백혈구내호중구및단핵구수가각각유의성있게감소하였다. 4. 등피부조직내 Neutrophil + Gr-1 + MSC의총세포수가유의성있게감소하였다. 5. 등피부조직 Eoxatin 2와 CCR3 mrna 유전자발현이각각유의성있게감소하였다. 6. 비장세포배양상층액에서 IL-4와 IFN-γ 생성량이각각유의성있게감소하였다. 7. 등피부조직의상피조직의두께, 백혈구침윤, 홍반, 부종, 찰과상, 딱지가감소하였으며비만세포도감소하였다. References 1. Korean Dermatological Association Textbook Compilation Committee. Dermatology 5th. Seoul:Ryo Moon Gak. 2008: Blume-Peytavi U, Metz M. Atopic dermatitis in children: management of pruritus. J Eur Acad Dermatol Venereol. 2012;26: Addor FA, Takaoka R, Rivitti EA, Aoki V. Atopic dermatitis: correlation between non-damaged skin barrier function and disease activity. Int J Dermatol 2012;51: Yu JS, Lee CJ, Lee HS, Kim J, Han Y, Ahn K, et al. Prevalence of atopic dermatitis in Korea: analysis by using national statistics. J Korean Med Sci 2012;27: Sandstrom MH, Faergemann J. Prognosis and prognostic factors in adult patient with atopic dermatitis : a long-term follow-up qeustionnaire study. Br J Dermatol. 2004;150:

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17 이진욱외 5 인 : 아토피양접촉피부염유발 NC/Nga mouse 에서도고온천수에첨가한게르마늄성분의효과 Graduate school of Kwangju Women's University master's thesis. 2011: Lee YH. A Cpmparative Study of Geological Characteristics Spa. Journal of Korean Geographical Society. 2007;42(6): Park GS, Lee YG, Lee SH. Culture : Korean Hot Spring Culture and Medical Tourism. Korea Institute of Idealogy and culture. 2011;57(0): Jo KD. Oncheon. Korea Hotspring Association Lee JH,, Kim MD. A study on the Interior Space of the Health Hot-spring Resort which it Sees with Cure Concept. Korean Society of basic Design & Art. 2009;10(6): Jeroza D,Vifas M, Tatar P, Jurcovicora J,Palat M. Rice in plasma beta-endorphin and ACTH in response to hyperthermia in sauna Horm Metab Res. 1985;17: National federation of department of rehabilitation medicine, colleges of oriental medicine. Oriental Rehabilitation Medicine. Seoul:SeoWonDang. 1995: Heo J. Dongeuibogam. Dongeuibogam Publishers. 2005:1992, 2254, Han KS. The history of hot spring and bathing in Korea. Korea Academic Society of Tourism Management ;27(5): Li YC, Choi BM, Jahng SJ, Ahn TW, Lee JM. The Clinical Study of Repeatedly Performed of Balneotherapy on Cervical Pain. J Oriental Rehab Med. 2013;23(3): Shin JH, Park JH, Ahn TW, Hong SY. The Clinical Study of Effect of Balneotherapy on Low Back Pain. J Oriental Rehab Med. 2012;22(1): Lee HE, Kim HR, Im M, Lee Y, Kim CD, JH Lee et all. Efficacy of Balneotherapy as an Adjuvant Treatment for Atopic Dermatitis at Yuseong Spa, Korea. Korean Journal of Dermatology. 2014;52(2): Jang, MH, Go GY, Ahn YC, Ahn TW. Effect of DOGO phreatic water containing sulphur on Atopic Dermatitis in NC/Nga mouse. J Korean Med Ophthalmol Otolaryngol Dermatol. 2013;26(3): Park JC, Park JH. Hydrotherapy. Seoul:HyunMoonSa. 1996:226, Chin HY, Jang HS, Jang BS, Jo JH, Kim MB, Oh CK, et al. A Study on Utilization of Alternative Medicine for Patients with Atopic Dermatitis. Korean Journal of Dermatology. 2005;43(7): Park YC, Lim JD, Park YK, Yoon MS, Lee SD. Review : Clinical Application and Efficacy of Herbal Medicines by Modulatiog Cytokines in Atopic Dermatitis-induced Animal Model. Kor. J. Herbology. 2012;27(4):