DESIGNING PEPTIDES Handbook 독자개발한 Peptide 자동합성기로 17년동안 50,000여종의 Peptide를국내에서자체합성하였습니다. 전세계 30여개국의 500여기업연구소, 병원및대학에서 펩트론의 Peptide를사용하고있으며, 1,000여편이상의

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미경 장
6 years ago
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1 DESIGNING PEPTIDES Handbook 2nd Edition

2 DESIGNING PEPTIDES Handbook 독자개발한 Peptide 자동합성기로 17년동안 50,000여종의 Peptide를국내에서자체합성하였습니다. 전세계 30여개국의 500여기업연구소, 병원및대학에서 펩트론의 Peptide를사용하고있으며, 1,000여편이상의국내외 SCI 급논문에인용되었습니다.

3 펩트론은전국의대학, 병원외 500 여국가연구기관에 Peptide 를납품하고있으며, 아래표와같이전세계 30 여개국의대학및연구소에서도자사의 Peptide 를사용하고있습니다. 해외거래기관목록 국적기관국적기관 Australia The Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research Sudan University of New South Wales Sweden Karolinska Institute Institute of Endemic Diseases, University of Khartoum University of Salzburg Academia Sinica Austria Industrial Technology Research University of Vienna Taiwan Institute Belgium K.U.Leuven Quality Systems Inc. Instituto Pelé Pequeno Príncipe Netherlands Sanbio B.V. Brazil Universidad Federal do rio de Janeiro Turkey Genetic Engineering and Biotechnology Institude Universidade Federal do Paraná Durham University Czech Elis Int. United John Innes Centre University of Aarhus Kingdom The Sainsbury Laboratory Denmark University of Copenhagen University of Glasgow Catedra de Inmunologia-Facultad de Institut Pasteur Quimica France Plant Molecular Biology Institute, Centre national de la recherche scientifique Uruguay Facultad de Química, Universidad de la República University of Uruguay Germany Biomedizinisches Forschungszentrum Phillipps University Marburg TU Dortmund University University of Erlangen Free university of Berlin Access Bio, Inc. BD Biosciences-Pharmingen Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School Center for Heart and Regenerative Medicine/VTCRI Hong Kong The Chinese University of Hong Kong CHEMICON International, Inc. Biohouse Solutions Pvt. Ltd. C-CAMP Indian Immunologicals Limited USA ebioscience, Inc. Fox Chase Cancer Center Harvard University India Indian Institute of Science Institute of Bioinformatics and Applied Biotechnology International Centre for Genetic- Engineering and Biotechnology Jawaharlal Nehru Centre for Advanced Scientific Research HHMI/UC San Diego Howard Hughes Medical Institue, UCSD Invitrogen Drug Discovery Solutions Johns Hopkins University 04 ( 주 ) 펩트론

4 We Give Life to Every Peptide India Iran Ireland Israel Italy Japan Jawaharlal Nehru University Link Biotech National Brain Research Centre National Centre for Biological Sciences National Institute of Immunology University of Delhi South Campus Vector Control Research Centre School of pharmacy, Mashhad university of medical science Takapou Zist Co. Trinity College University College Cork Ariel University Center of the Shomron Ben-Gurion University of the Negev Hutchison Water Landspitali University Hospital National University Hospital Sheba Medical Center Tel-Aviv University M.B.S. S.R.L. Medical Biological Service Funakoshi USA Joslin Diabetes Center MD Anderson NCI/Rockland Inc. New York Blood Center NIH/NCI NYS Institute for Basic Research Oregon Health & Science University Pacific Northwest National Laboratory Provid Pharmaceuticals R&D Systems San Francisco State University Schering Plough Biopharma Stanford University Texas A&M University The Scripps Research Institue UC Davis UC Irvine UCLA UC San Diego University of Davis-California Sysmex Corporation University of Louisville Latvia Latvian Biomedical Research and Study Centre University of Maryland University of Latvia University of Massachusetts Medical School Mexico UNISSER, Fac. Medicina, UNAM. University of Texas at Dallas Peru Universidad Peruana Cayetano Heredia University of Texas-Houston Poland Academic Center for Biotechnology of Lipid Aggregates University of Washington Singapore Division of Biomedical Sciences, Johns Hopkins in Singapore Vanderbilt University Shizenature Pte Ltd Vanderbilt University/medical center/ radiation oncology Spain Universidad Politécnica de Madrid (UPM) Cajal Institute Universities Allied for Essential Medicines Vietnam Vietnam Academy of Science and Technology 05

5 1. Peptide 활용범위 2. 주문시알아야할사항 A. Peptide 서열디자인하기 B. Peptide Modification 종류 C. Unnatural Amino Acid 구조 D. 형광물질의종류와파장대 E. Peptide 항원 F. Peptide 순도제안 G. Peptide 주문방법 3. Peptide의합성및정제방법 4. 제공되는 Data Sheet 정보보는법 5. 합성후포함될수있는화합물 6. Peptide 녹이기 7. 용해된 Peptide의안정성 8. Peptide 20종아미노산구조 ( 주 ) 펩트론

Peptide 활용범위 합성 Peptide 는서열의다양성과많은실험적기법을적용할수있는장점이있어신약, 신소재등넓은분야의연구소재로활용되고있습니다. Epitope Mapping 단백질항원에대한항체의결합부위 (Epitope) 를찾는방법입니다. Epitope 은 Linear 형태와 Conformational 형태로나눌수있습니다.

6 Peptide 활용범위 합성 Peptide 는서열의다양성과많은실험적기법을적용할수있는장점이있어신약, 신소재등넓은분야의연구소재로활용되고있습니다. Epitope Mapping 단백질항원에대한항체의결합부위 (Epitope) 를찾는방법입니다. Epitope 은 Linear 형태와 Conformational 형태로나눌수있습니다. Linear 형태의경우, 단백질항원의아미노산서열을이용하여 Overlapping Peptide Library 를합성하고 Antibody Screening Test 를합니다. Conformational 형태의경우, 항원의정확한 3 차원적구조를알아야하고불연속적인서열로구성되어있기때문에 Peptide 를합성하여사용하는것이어렵습니다. Epitope 의 Identification 과 Characterization 은새로운치료제, 백신및진단키트의개발등에활용됩니다. Peptide Mimics (Peptidomimetic) Peptide의활성을향상시키기위해 Modification된아미노산을사용하는기술을말합니다. 이러한기술을통해기존의 Peptide의취약점이었던체내안정성증진은물론효능을최적화할수있습니다. 펩트론등록특허 생리적안정성을증가시킨 PAR 2 활성화 Peptide 및이를함유하는약제학적조성물. 07

7 Peptide 활용범위 Receptor-Binding Domain Screening 세포표면의수용체에결합하는 Peptide 를탐색하는기술입니다. 다양한군의 Peptide Library 가이용되고있으며, 수용체에결합하는 Peptide 의서열분석을통해새로운치료제, 진단키트의개발분야에활용되고있습니다. Phage Display 파지표면에다양한 Peptide 를발현시킨후, 특정대상에잘결합하는 Peptide 를탐색하는기술입니다. 파지에의한증폭과서열분석이가능하기때문에기능성 Peptide 를선별하는연구에활용되고있습니다. 선별된파지 Peptide 는반드시합성 Peptide 를이용하여활성을재확인하는과정이필요합니다. Cell Penetration Peptide (CPP), Skin Penetration Peptide (SPP) 세포막혹은상피세포층을투과하는 Peptide 에기반을두는약물전달기술입니다. 투과도가좋은 Peptide(Delivery) 에유효물질 (Cargo) 을링커로연결하여효과적인약물전달시스템으로활용되고있습니다. Delivery peptide Cargo (Drug, Etc) Linker 08 ( 주 ) 펩트론

8 주문시알아야할사항 A. Peptide 서열디자인하기 Peptide 의합성을시작하기전에여러사항을고려해야합니다. Peptide 를읽는방향은 N- 말단에서 C- 말단 ( 왼쪽에서오른쪽 ) 이지만, 실제합성은 C- 말단에서 N- 말단 ( 오른쪽에서왼쪽 ) 으로이루어집니다. 읽는방향 N-Terminal H 2 N O H N O N H O H N O OH C-Terminal 합성방향 Peptide 를구성하는아미노산하나를 1mer 라부릅니다. 위의예는 Glycine 3mer Peptide 로, 1 Letter Code 는 GGG, 3 Letter Code 는 Gly-Gly-Gly 로표기됩니다. Peptide 합성의난이도는서열을구성하는아미노산의수및종류와구성에따라크게달라집니다. A-1. 서열의길이 Peptide 의 mer 수가증가할수록합성의난이도는어려워집니다. 20mer 이하의 Peptide 들은합성이용이하며, 40mer 이상의 Peptide 부터합성수율이낮아지게됩니다. 예를들어, 만약매번아미노산의결합이 99% 의수율로이루어진다면, 20 개의아미노산으로구성된 Peptide 의경우전체수율은 81.8% 가됩니다 (100 x 0.99^20 = 81.79). 그러나 40 개의아미노산으로구성된 Peptide 는전체수율이 66.9% 가됩니다 (100 x 0.99^40 = 66.89). 이러한이유로 Peptide 의 mer 수가증가할수록수율이낮아지고합성회수량이현저히낮아지는원인이됩니다. 09

9 주문시알아야할사항 A-2. 서열의용해도 Peptide 의용해도는서열을이루는아미노산의종류및구성에따라크게영향을받습니다. 소수성 (Hydrophobic) 아미노산인 Leucine (L), Isoleucine (I), Valine (V), Methionine (M), Phenyl-alanine (F), Tryptophan (W) 이다수포함된 Peptide 들은수용액에서잘녹지않습니다. 낮은용해도는실험중 Peptide 의사용을어렵게만드는주원인이며, Peptide 의합성및정제의문제를발생시킬수있습니다. RRRRRLLLLL, KLKLLLLLKLK, RRRVVVVVV, IIIIIIIIII, RRRRRVVVVVV, MMMNMIM 10 ( 주 ) 펩트론

10 We Give Life to Every Peptide A-3. 합성이어려운아미노산서열 1. Cysteine (C) 이나 Methionine (M) 이포함된 Peptide 합성과정에서자발적산화반응이일어나기쉬운아미노산인 Cysteine (C) 이나 Methionine (M) 이포함되어있는 Peptide들은높은순도로얻기어렵습니다. 이러한아미노산들은다음과같이적절한아미노산으로치환하여합성할수있습니다. Methionine Cysteine Norleucine Serine 2. 연속적으로소수성 (Hydrophobic) 아미노산들이포함된 Peptide Glycine (G), Leucine (L), Isoleucine (I), Valine (V), Phenylalanine (F) 과같은소수성 (Hydrophobic) 아미노산들이 Peptide 서열내에연속하여다수 (4개이상 ) 존재할경우, 합성및정제의어려움이있습니다. H 2 N-LLLL-OH H 2 N-SSSS-OH 3. Serine (S) 이연속적으로포함된 Peptide Serine (S) 이 Peptide 서열내에연속하여 (3개이상 ) 존재할경우, Deletion된 Peptide가생길수있습니다. 4. Phospho 아미노산이포함된 Peptide Phospho 아미노산이후도입되는아미노산의합성은 Coupling Efficiency가크게감소하게되어합성난이도가높아집니다. 11

11 주문시알아야할사항 5. N-말단 (N-Terminal) 에 Glutamine (Q), Glutamic acid (E) 가포함된 Peptide N-말단에위치한 Glutamine (Q) 또는 glutamic acid (E) 는합성및보관과정에서 Pyroglutamate 구조로변성될수있습니다. 이를방지하기위하여다른아미노산으로대체하거나 N-말단에 Acetylation을할수있습니다. 위와같이 Peptide 서열내에합성이어려운아미노산이추가되면, 합성및정제의어려움이있으며, 실험시사용에제약이될수있습니다. 12 ( 주 ) 펩트론

12 We Give Life to Every Peptide B. Peptide Modification 종류 실험의목적에따라다양한 Peptide 의 Modification 이가능합니다. 1. 일반 Modification 펩트론에서제공해드리는일반 Modification의종류는아래의표1과같습니다. [ 표1: 일반 Modification] 구분 종류 약어 phospho-serine [ps] phospho-threonine [pt] phospho-tyrosine [py] Hydroxy Y(NO modification 2 )=nitro tyrosine [Y(NO 2 )] Y(SO 3 H)=sulfated tyrosine [Y(SO 3 H)] C(SO 3 H)=sulfated cysteine [C(SO 3 H)] A(SO 3 H)=sulfated alanine=l-cysteric acid [A(SO 3 H)] N-terminal Acetylation [Ac] N-terminal Formylation [Formyl] N-terminal 2-Mercaptoacetic acid [Mercaptoacetyl] N-terminal 3-Mercaptopropionic acid [Mercaptopropionyl] N-terminal 6-Mercaptohexanoic acid [Mercaptohexanoyl] Terminal Blocking N-terminal pyroglutamic acid [Pyr] N-terminal Succinimide acid [Suc] C-terminus amidation [NH 2 ] C-terminus Cystramine [Cysteamide] C-terminus methyl ester [OMe] C-terminus ethyl ester [OEt] C-terminus benzyl ester [OBn] Myristic acid [Myristoyl] Stearic acid [Stearoyl] Fatty Acids Palmitic acid [Palmitoyl] Cholesterole [Cholesteroly] 6-amino haxanoic acid [Ahx] 8-amino octanoic acid [Aoc] 8-Amino-3, 6-Dioxa-Octanoic acid [minipeg2] [dpeg2] minipeg [dpeg4] [dpeg6] [dpeg8] [dpeg12] 2-Chorobenzyloxy-carbonyl [Cbz] Protection t-butyl [tbu] 9-fluorenylmethyloxy-carbonyl [Fmoc] t-buthloxycarbony [Boc] 13

13 주문시알아야할사항 Biotin [Biotin] Fluorescein isothiocyanate [FITC] [5-(and-6)-carboxyfluorescein] [5(6)-FAM] [9-(2-carboxyphoeyl)-6-diehtylamino-3- xanthenylideone]-diehylammonium chloride [Rhodamine-B] 5-(6)-carboxytetramethylrhodamine [TAMRA] [Rhodamine] MCA:4-merhoxy coumarine acetic acid [MCA] AMC:7-amino-4-methyl coumarine [AMC] Labeling Dansyl [Dansyl] Dabcyl [Dabcyl] Edans:5-[(2-aminoethyl)amino]naphthalene- 1-sulfonic acid [Edans] 4-amino benzoic acid [Abz] 7-amino-4-tryfluoromethyl coumarinie [AFC] p-nitro anilide [pna] HCC=7-hydroxycoumarin-3-carboxylic acid [HCC] N-methyl anthranilic acid [Nma] DNP:2.4-Dinitrophenyl [DNP] AHA:Naphthylamide [AHA] Branched Peptide 4-branched MAP [4-MAP] 8-branched MAP [8-MAP] Single intra disulfide [C-C] Two intra disulfides [CX1-CX2, CX3-CX4] Disulfide homo dimer [homo dimer] hetro disulfide [hetro disulfide] Cyclo head to tail cyclic Cyclo[***] 선택적 cycle peptide [CX1-CX2, C3 free] Conjugation KLH, OVA, BSA (KLH or OVA or BSA) Affinity resin 제작 Affinity resin Isotope Stable Isotope labeled amino acids(d, 13C,15N) [A*] 2. 특수 Modification 특수 Modification은고객의요청에따라협의하에제공할수있습니다. 특수 Modification 의예 DOTA, DOPA, COT (trans-4'-cotininecarboxylic acid), Glycated, Folate(folic acid), Sarcosine, Methylene blue, Lipoylic acid, Pemetrexed, coumarin343, DABMI, DBCO, Cy5maleimide, Cy5.5maleimide, Ferrocenecarboxylic acid, Maleimide, Etc. 14 ( 주 ) 펩트론

14 We Give Life to Every Peptide C. Unnatural Amino Acid 구조 실험의목적에따라다양한 Unnatural 아미노산들을도입할수있습니다. 펩트론에서제공해드리는일반 Unnatural 아미노산들의종류는아래와같습니다. 아래에언급되지않은특수 Unnatural 아미노산은고객의요청에따라협의하에제공할수있습니다. Space Linker Beta Alanine [βa] Amino Butyric acid [GABA] 6-Amino Hexanoic acid [Ahx] Solubility Enhance & Space Linker 8-Amino-3,6-Dioxa-Octanoic acid [minipeg2] [dpeg2] Maleimido Linker for Thiol Conjugation 3-Maleimido Propionic acid [3-Maleimidopropionyl] 4-Maleimido Butyric acid [4-Maleimidobutyl] Thiol Linker Mercapto Acetic acid [Mercaptoacetyl] Mercapto Propionic acid [Mercaptopropionyl] Mercapto Hexanoic acid [Mercaptohexanoyl] 15

15 주문시알아야할사항 Diamine Diamino Propionic acid [Dap] Diamino Butyric acid [Dab] Ornithine [Orn] 4-Amino-Piperidine-4-Carboxylic acid [Pip] Etc. α-amino Butyric acid [Abu] Amino isobutyric acid [Aib] Sarcosine, N-Methyl Glycine [Sar] Pyroglutamic acid [Pyr] β-(1-naphthyl)-alalnine [1Nal] β-(2-naphthyl)-alalnine [2Nal] gamma Glutamic acid [rglu] 4-amino Benzoic acid [4-Abz] 4-AminomethylBenzoic acid [AM2BA] 16 ( 주 ) 펩트론

We Give Life to Every Peptide D. 형광물질의종류와파장대 Peptide 에형광체를 Conjugation 하면, 형광현미경으로 Peptide 의시각화가가능합니다. 이는분광학적검출기를이용한분석에이용됩니다. FITC conjugated Cy5 conjugated 펩트론에서 Conjugation 가능한형광물질의종류는아래의표 2 와같습니다.

naphthalene-1-sulfonic acid [Edans] 341 471 7-Amino-4-trifluoromethylcoumarin [AFC] 395 495 [5-(and-6)-carboxyfluorescein] [5(6)-FAM] 494 518 Fluorescein isothiocyanate [FITC] 490 520

16 We Give Life to Every Peptide D. 형광물질의종류와파장대 Peptide 에형광체를 Conjugation 하면, 형광현미경으로 Peptide 의시각화가가능합니다. 이는분광학적검출기를이용한분석에이용됩니다. FITC conjugated Cy5 conjugated 펩트론에서 Conjugation 가능한형광물질의종류는아래의표 2 와같습니다. [ 표 2: 형광물질의종류및파장대 ] 구분종류약어 Fluorophore Chromophore Excitation (nm) Emission (nm) (7-methoxycoumarin-4-yl)acetyl [MCA] amino-4-methyl coumarin [AMC] [(2-aminoethyl)amino]- naphthalene-1-sulfonic acid [Edans] Amino-4-trifluoromethylcoumarin [AFC] [5-(and-6)-carboxyfluorescein] [5(6)-FAM] Fluorescein isothiocyanate [FITC] (DimethylAmino)Naphthalene-1- Sulfonyl chloride [Dansyl] [9-(2-carboxyphenyl)-6- diethylamino-3-xanthenylidene]- [Rhodamine-B] diethylammonium chloride 5-(6)-carboxytetramethylrhodamine [TAMRA] [Rhodamine] Cyanine5 [Cy5] Cyanine5.5 [Cy5.5] , 4-Dinitrophenyl [DNP] 365 p-nitro anilide [pna] ((4-(dimethylamino)phenyl)azo) benzoic Acid [Dabcyl]

17 주문시알아야할사항 Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) FRET Peptide 는 Peptidase 의특이성연구를위한도구입니다. Peptidase 는특정 Peptide 의서열을인지하여그결합을끊는 Enzymatic Cleavage 능력이있습니다. FRET Peptide 가 Cleavage 되기전 Donor 에서방출된빛은 Acceptor 에서흡수하게되어색이나타나지않습니다. 그러나 Peptidase 가 Enzymatic Cleavage 를하면, Donor 에서방출된빛은 Acceptor 에서흡수할수없게되어색이나타나게됩니다. FRET Peptide 를합성하는경우 Efficiency 가좋은 FRET 형광체쌍을선택하는것과두형광물질사이의거리가중요합니다. 좋은 Efficiency 의 FRET 형광체쌍은아래의표 3 과같고, 두형광물질의최적거리는 15mer 이내입니다. 형광체쌍의거리가최적거리보다멀어질수록 FRET Efficiency 는낮아지게됩니다. [ 표3: FRET Peptide용형광체쌍 (Donor/Acceptor)] Donor Emission (nm) Peptide Acceptor Excitation (nm) [Ednas] mer 이내 [Dabcyl] 453 [MCA] mer 이내 [DNP] 348 [FAM] mer 이내 [Dabcyl] ( 주 ) 펩트론

18 We Give Life to Every Peptide E. Peptide 항원 Peptide 항원제작은효과적인면역반응을위해 Peptide 의항원성및 Carrier Protein 과의 Conjugation 을고려해야합니다. E-1. Peptide 항원의항원성 항원이될 Peptide 를정할수없는경우, 펩트론에서는무료로서열조사프로그램을이용하여항원의모체가되는단백질을분석해드립니다. Flexible Regions, Antigenic Index, Surface Probability 를고려하여항원성이높은서열을추천해드립니다. 항원성의분석은 Web 상에서도가능합니다. 분석가능한사이트들은다음과같습니다. 하지만계산에의한항원성 Peptide 는면역세포에서인식되지않아항체가생성되지않을수도있습니다. 따라서, 항원성분석을통해합성된 Peptide 가반드시항체가생성된다는것을보장하지는않습니다. 19

19 주문시알아야할사항 E-2. Peptide 항원제조 Carrier Protein과의 Conjugation KLH, BSA 그리고 OVA 중원하시는단백질과의 Conjugation을제공합니다. 단백질의 Amine 그룹을이용한 Conjugation 방법은다음과같습니다. 1) Carrier Protein의 Activation Carrier Protein의 Lysine 잔기에있는 Amine과 GMBS (N-γ-maleimidobutyryloxy succinimide ester) 를반응하여 Carrier Protein을활성화시킵니다. 2) Conjugation Epitope Peptide의 Thiol기를 Carrier Protein의 Maleimido기와반응시켜 Conjugation 합니다. 20 ( 주 ) 펩트론

20 We Give Life to Every Peptide F. Peptide 순도제안 > 70% - 항체제작 - 항체측정을위한 ELISA의표준물질 2차항체를이용하여, Sandwich 방식을이용하므로고순도의 Peptide가필요하지않을수있습니다. > 80%~90% - 비정량적인 Enzyme-substrate 연구 - Phosphorylation 반응 - Western blotting에서비정량적인 Blocking 연구 - immunocytochemistry와 in vitro Bioassays - Affinity purification 용도로 Resin에 Coupling할경우 - 조직배양플레이트에세포를붙이기위해코팅할경우 - Protein 전기영동에사용할경우 > 95% 이상 - 정량적인 ELISA나 RIA에표준물질로사용할경우 - Receptor-ligand 상호작용연구를정량적으로할때 - in vitro Bioassays - in vivo 연구 - 블로킹이나 Competition assay를정량적으로할때 - Protease 연구를정량적으로할때 - 효소연구 - Monoclonal antibody 제작 > 98% 이상 - NMR 연구 21

21 주문시알아야할사항 G. Peptide 주문방법 1) 견적의뢰아래의 6가지주문정보를포함하여견적의뢰를주시면, 30분이내에총알같이빠르게견적서를보내드립니다. * 주문정보 주문자이름 기관연락처서열순도양 2) 주문확인견적서를확인하신후, 꼭최종주문여부에대해연락바랍니다. ( 전화, 팩스, 이메일 ) 3) 주문접수주문접수완료시, Lot. No. 를이메일로알려드립니다. * 주문후, Lot. No. 를받지못하셨을경우주문이누락되었을경우가있으니, 꼭확인전화부탁드립니다. 견적의뢰방법 - 홈페이지접속후 주문및견적의뢰. - order@peptron.co.kr 로메일송부. - 전화나팩스로견적의뢰. Tel ~2 Fax H.P ( 주 ) 펩트론

22 We Give Life to Every Peptide Peptide 주문, 합성, 발송 Flow Chart 정제실패시 합성실패시 고객주문 합성분석정제 동결건조 발송 1 주일 1~2 일 1~2 일 2~3 일 택배발송후 1 일 1 차진행보고 2 차진행보고 1) 고객주문견적문의 견적서발송 주문접수 Lot. No. 부여 1 차합성기간 : 2 주일 2) 합성 20 mer 이하펩타이드의 1차합성기간은일주일정도입니다. 주문접수일주일후, 합성의진척사항을이메일로보고드립니다. 3) 분석합성완료후, 분석은 1~2일소요됩니다. ( 분석결과가좋지않으면, 고객에게보고후재합성을합니다.) 4) 정제분석완료후, 정제는 1~2일소요됩니다. ( 주문양에따라정제기간은늘어날수있습니다.) 정제진척사항을이메일로 2차보고드립니다. 5) 동결건조정제후, 동결건조는 2~3일소요됩니다. (Peptide가 Hydrophilic하여성상이 Crystal일경우, 재동결건조를진행합니다.) 6) 발송고객에게합성이완료됨을보고하고, Peptide를발송합니다. 23

Peptide 의합성및정제방법 Peptide 합성은유기화학적반응을이용하여, 연속적인

23 Peptide 의합성및정제방법 Peptide 합성은유기화학적반응을이용하여, 연속적인 Flow Condition 을통한고상 Fmoc Chemistry 방법을이용합니다. 이는각각의아미노산을정해진순서에따라 Resin 에하나씩합성해가는방법으로, 펩트론에서는자체개발한자동합성기를이용하여하나의기계가동시에 48 개의서로다른 Peptide 를합성합니다. 합성한 Crude Peptide 는역상 HPLC 를이용하여정제하고동결건조기를이용하여건조합니다. Peptide 자동합성기 정제용 Reverse-Phase HPLC 동결건조기 24 ( 주 ) 펩트론

24 We Give Life to Every Peptide Peptide 의 QC(Quality Control) 에는분석용 Reverse-Phase HPLC 와 LC/Mass 질량분석기를이용합니다. LC/Mass 분석용 Reverse-Phase HPLC 고객이의뢰한 Peptide 에대한모든정보는철저히기밀로유지되고있습니다. 주문조건에맞는 Peptide 의합성과정제가완료되면, HPLC 및 Mass Data 가첨부되어발송됩니다. 고객이요구하는순도의 Peptide 가완성되지않을경우, 상담후무상제공을원칙으로하고있습니다. 펩트론의모든 Peptide 합성서비스는철저한품질관리하에이루어집니다. (ISO9001 인증 ) 25

25 제공되는 Data Sheet 정보보는법 Peptide 발송시, Peptide Analysis Data Sheet 와함께 HPLC, Mass Data 가제공됩니다. A. Peptide Analysis Data Sheet Peptide 서열 Peptide 주문양 Peptide 발송양 HPCL 분석조건 순도 Mass Expected : 분자량 Mass Found : 분석값 (M+) Solubility test A. DW 10mg/ml로녹입니다. 녹지않으면, 1mg/ml로녹입니다. B. DMSO DW에녹지않을경우, DMSO로표기됩니다. Peptide Analysis Data Sheet 에는주문하신 Peptide 의기본자료 ( 서열, 주문양, 발송양, HPLC 분석방법, 순도, Mass 값및용해도 ) 가포함되어있습니다. 26 ( 주 ) 펩트론

26 We Give Life to Every Peptide B. HPLC Data Sheet HPLC Data 에는주문하신 Peptide 의순도 (Purity) 측정값이기재되어있습니다. Peptide 의검출은 220nm 에서이루어지고, Peak 의 Area% 를기준으로발송되는 Peptide 의순도가표기됩니다. 27

27 제공되는 Data Sheet C. Mass Data Sheet Mass Data 에는합성된 Peptide 의실제측정값이나타납니다. Molecular Weight 에표기된분자량을기준으로발송되는 Peptide 의분자량이표기됩니다. 28 ( 주 ) 펩트론

28 합성후포함될수있는화합물 Peptide 및포함될수있는화합물의종류는정제의여부에따라달라집니다. 정제된 Peptide 의화합물 원하는 Peptide 부반응이일어난 Peptide 서열중일부아미노산이빠진 Peptide TFA (Trifluoroacetic acid) 정제하지않은 Peptide 내의화합물 원하는 Peptide 부반응이일어난 Peptide 서열중일부아미노산이빠진 Peptide TFA (Trifluoroacetic acid) Peptide 합성에사용된시약 아미노산의보호기 아미노산의보호기가완전히제거되지않은 Peptide Cleavage 과정중변형된 Peptide * 정제된 Peptide 의경우, 정제하지않은 Peptide 와비교하면원하는 Peptide 이외의부생성물이크게줄어듭니다. 주문시알아야할사항 의정보를고려하여주문주시면부생성물의비율을크게낮출수있습니다. * TFA Salt 형태의 Peptide 이외에 Acetate 및 Ammonium 형태의 Peptide 도합성가능합니다. 29

29 Peptide 녹이기 Peptide 를녹이는과정은합성 Peptide 를이용하면서가장문제가될수있는부분입니다. 펩트론에서는 Peptide 가완성되면 DW 나 DMSO 에대한 Solubility Test 를해드립니다. Peptide 를녹이기전, Peptide Analysis Data Sheet 의 Solubility 를참고하여사용하는것을추천합니다. * 만약용매로 DMSO 를사용하셔야한다면, DMSO 에의한 Peptide 의변성및 Cell Damage 를낮추기위해고농도로 Stock Solution 을만든후, 사용하는용매에 Serial Dilution 을하여원하는농도로사용하는것을추천드립니다. * 고객님이사용하는용매가있는경우, 주문시말씀해주시면 Solubility Test 에포함해드립니다. * Peptide 의무게측정시, 차고건조한곳에서정전기에주의하여측정해야합니다. Peptide 는동결건조한물질의특성상쉽게대기중수분을머금어무게가증가할수있고, 정전기에의해날리거나주위물체표면에달라붙을수있습니다. 30 ( 주 ) 펩트론

30 용해된 Peptide 의안정성 Peptide 의화학적안정성은아미노산종류와구성따라결정됩니다. 고체상의 Peptide 는용매에녹아있는상태보다안정합니다. Peptide 가변성되는것을방지하기위해동결건조된상태로냉장보관합니다. 만약용매에녹아있다면 -20 이하로냉동보관하는것을추천드립니다. 다음사항에주의하십시오 회사용량씩소분해두는것이좋습니다. 사용할때마다반복적으로녹이고얼리는과정에서변성이생길수있습니다. 2. 대기중에노출되는것을최소화하는것이좋습니다. 대기중산소와반응하여산화물을형성할수있습니다. 3. ph 8 이상의조건이되지않도록해야합니다. 만일 Peptide 를사용하는조건이 ph 8 이상이면, 용액을차게유지하는것이좋습니다. 다음은용해된 Peptide 의 Pyro glutamate, Oxidation, Hydrolysis, Deamination 을통해변성이일어나는예입니다. Pyro glutamate N-term에위치한 Glutamine (Q) 는사용하는 Buffer의 ph에따라 Pyro glutamate 형태로변성됩니다. Glutamine Pyro glutamate 31

31 용해된 Peptide 의안정성 Oxidation Cysteine (C) 이나 Methionine (M) 의경우, 황 (Sulfur) 원자에산화반응이잘일어납니다. 특히 DMSO에녹인경우더욱잘일어납니다. Cysteine (C) 은산화반응을통해 Peptide의 inter 혹은 intra Disulfide 결합을형성할수있습니다. Inter Disulfide Intra Disulfide Methionine (M) 은산화반응을통해 Sulfoxide 가형성됩니다. Methionine Methionine Sulfoxide 32 ( 주 ) 펩트론

32 We Give Life to Every Peptide Hydrolysis Aspartic acid (D) 를포함하는서열에서드물게나타나는반응입니다. 물이제거되고 Succinimide 형태의중간체가형성된후, iso-aspartic acid가형성됩니다. Aspartic acid Succinimide Iso-Aspartic acid Deamination Asparagine (N) 를포함하는서열에서드물게나타나는반응입니다. Amine이제거되고 Succinimide 형태의중간체가형성된후, Aspartic acid 또는 iso-aspartic acid가형성됩니다. Iso-Aspartic acid 33

Peptide 20 종아미노산구조 Nonpolar(hydrophobia) Basic Polar, uncharged Acidic 1-Letter Amino Acid Code Relative Molecular Mass Mr-H2O Molecular Formula Hydrophobicity C 121.16 103.14 C3H7NO2S 0.

33 Peptide 20 종아미노산구조 Nonpolar(hydrophobia) Basic Polar, uncharged Acidic 1-Letter Amino Acid Code Relative Molecular Mass Mr-H2O Molecular Formula Hydrophobicity C C3H7NO2S 0.17 Cys Cysteine 3-Letter Amino Acid Code Chemical Structure Chemical Name F C9H11NO2 Phe A C3H7NO2 Ala L C6H13NO2 Leu M C5H11NO2S Met 2.5 Phenylalanine 1.0 Alanine 2.2 Leucine 1.1 Methionine I C6H13NO2 Ile W C11H12N2O2 Trp P C5H9NO2 Pro V C5H11NO2 Val 3.1 Isoleucine 1.5 Tryptophan 0.29 Proline 2.3 Valine H C6H9N3O2 His R C6H14N4O2 Arg K C6H14N2O2 Lys C C3H7NO2S Cys -1.7 Histidine -7.5 Arginine -4.6 Lysine 0.17 Cysteine G C2H5NO2 Gly Q C5H10N2O3 Gln N C4H8N2O3 Asn S C3H7NO3 Ser 0.67 Glycine -2.9 Glutamine -2.7 Asparagine -1.1 Serine Y C9H11NO3 Tyr T C4H9NO3 Thr E C5H9NO4 Glu D C4H7NO4 Asp 0.08 Tyrosine Threonine -2.6 Glutamic Acid -3.0 Aspartic Acid 34 ( 주 ) 펩트론

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