도면의간단한설명 도 1 은복분자나무메탄올조추출물을유기용매로추출하는과정을나타낸것이다. 도 2 는복분자주스를유기용매로추출하는과정을나타낸것이다. 도 3 은복분자주스의에틸아세테이트추출물에서분리한 BE7 용출물의 GC-MS 크로마토그램이다. 발명의상세한설명 발명의목적 발명이속하

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동근 돈
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1 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (51) Int. Cl. 7 A61K 35/78 (11) 공개번호 (43) 공개일자 년 09 월 08 일 (21) 출원번호 (22) 출원일자 2004년03월04일 (71) 출원인전라북도고창군전북 - 고창 - 고창 - 교촌 -275 (72) 발명자정인홍경기도수원시권선구탑동 호김재혁전라북도고창군고창읍읍내리대명아파트가동 205 호진기동전라북도고창군고창읍읍내리태양아파트가동 205 호이희권전라북도고창군부안면용산리산 13 번지이용님전라북도고창군부안면용산리산 3 번지박필재전라북도고창군고창읍읍내리 56-2 성산아파트 102 동 208 호이규석서울특별시관악구봉천동산 4-1 서울대학교가족생활동 931 동 105 호안용준서울특별시송파구신천동장미아파트 15 동 1106 호 (74) 대리인유미특허법인 심사청구 : 있음 (54) 복분자나무추출물또는이로부터유래한화합물을포함하는항산화성조성물 요약 본발명은복분자나무추출물또는이로부터유래한화합물을포함하는항산화성조성물에관한것이다. 특히본발명은인체에무해하며기존의합성항산화제를대체할수있는, 복분자나무뿌리의메탄올조추출물또는복분자에틸아세테이트추출물을유효성분으로포함하는항산화성조성물을제공한다. 대표도 도 1 색인어 딸기나무, 복분자, 항산화, 3,4- 디하이드록시벤조익산 명세서 - 1 -

2 도면의간단한설명 도 1 은복분자나무메탄올조추출물을유기용매로추출하는과정을나타낸것이다. 도 2 는복분자주스를유기용매로추출하는과정을나타낸것이다. 도 3 은복분자주스의에틸아세테이트추출물에서분리한 BE7 용출물의 GC-MS 크로마토그램이다. 발명의상세한설명 발명의목적 발명이속하는기술및그분야의종래기술 [ 발명이속하는기술분야 ] 본발명은복분자나무추출물또는이로부터유래한화합물을포함하는항산화성조성물에관한것으로, 더욱상세하게는복분자나무뿌리의메탄올조추출물또는복분자에틸아세테이트추출물을유효성분으로포함하는항산화성조성물에관한것이다. [ 종래기술 ] 모든생물체들은산소를이용하여생명유지에필요한에너지를발생하는과정에서활성산소들의상해에대한근본적인자기방어기구를가지고있다. 조직의방어기구에서해리되지못한활성산소는노화등의생리적변화나암, 관절염, 당뇨등의광범위한생체현상에관여하여직접또는간접적으로생체의장애를일으키는것으로알려져있다 (Halliwell B Drug antioxidant effects. Drugs 42: ). 유해산소로알려져있는활성산소는가장안정한형태인삼중합 산소가환원되면서슈퍼옥사이드음이온라디칼 (superoxide anion radical; O 2- ), 과산화수소 (H 2 O 2 ), 수산기라디칼 (OH - ), 지질과산화물 (ROOH) 과, 여기에서생기는유리라디칼 (ROO, RO ) 등의과산화지질로서, 이러한활성산소의과산화지질이정상적으로소거되지않았을때유리라디칼로인한산화적스트레스 (oxidative stress) 가생체내에가해져노화나암등의여러가지성인병의원인이되고있다 (Pryored, 1984). 또한생체내산소는활성산소생성기회를제공하여단백질, 효소및 DNA 손상을유발하고, 세포의생체막구성성분인다가불포화지방산을공격하여과산화지질이나산화분해물이 DNA 나 RNA 단백질막조직에질환을유발한다고알려져있다 ( 김삼인 농수산물에서항산화활성물질의검색. 단국대학교. 석사학위논문 1996). 또한최근의연구에의하면노화나성인병등의질환은활성산소의존재에의한것으로알려져, 활성산소를조절할수있는항산화제에관한연구가활발히진행되고있다. 항산화제로는효소계인슈퍼옥사이드디스뮤타제 (Superoxide dismutase: SOD), 카탈레이즈 (catalase) 및글루타티온퍼록사이드 (glutathione peroxide) 가있으며, 천연항산화제로는토코페롤 (tocopherol), 아스코르빈산 (ascorbic acid), 카로테노이드 (carotenoid), 플라보노이드 (flavonoid) 및글루타티온 (glutathione) 가있으며, 합성항산화제로 BHA(tert-butyl-4-hydroxyanisole), BHT(tert-butyl-4- hydroxytoluene) 및트록솔 (Troxol)-C 등이있으며, 그외에도다양한종류의항산제개발이이루어지고있다 (Kitahara K, Matsumoto Y, Ueda H A and Ueoka R Chem. Pharm. Bull 40: ; Hatano T Natural Medicines 49: ). 발명이이루고자하는기술적과제 본발명은복분자나무로부터추출한항산화성추출물을제공하는것을목적으로한다. 또한본발명은복분자나무유래항산화성화합물을제공하는것을목적으로한다. 발명의구성및작용 - 2 -

3 상기의목적을달성하기위하여, 본발명은 (a) 복분자나무뿌리의메탄올조추출물또는 (b) 복분자에틸아세테이트추출물을유효성분으로포함하는항산화성조성물을제공한다. 또한본발명은 3,4- 디하이드룩시벤조익산을유효성분으로포함하는항산화성조성물을제공한다. 이하본발명을상세히설명한다. 본발명은복분자나무 (Rubus coreanus) 추출물또는이로부터유래한항산화성화합물을유효성분으로포함하는항산화성조성물에관한것이다. 본발명의복분자나무추출물은복분자나무의특정부위예컨대, 열매, 잎, 가지, 뿌리, 줄기, 씨및꽃등을물또는유기용매로추출및 / 또는분획하여제조할수있다. 상기유기용매는탄소수 1 내지 5 의저가알콜또는알콜희석수, 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트및아세톤일수있으며, 상기저가알콜은에탄올, 메탄올, 부탄올, 프로판올및이소프로판올일수있으나, 이에한정되는것은아니다. 바람직하기로는메탄올로추출하거나또는메탄올추출이후에헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트및부탄올을순차적으로가한후각용매별로층분리하는것이다. 상기추출및층분리방법은통상이방법으로실시가능하며, 예컨대추출물, 이의분쇄물또는분말에물또는유기용매를 1: 1 내지 100 중량비로가한후, 추출액또는층분리된분액을분리하는방법으로실시할수있다. 추출및층분리온도는 4 내지 30 일수있으나, 이에한정되진않는다. 상기추출액및분액은이후감압여과및진공농축하여용매를제거할수있다. 본발명의복분자나무추출물은식물의추출부위및성숙시기에따라, 다양한항산화활성을나타낸다. 예컨대, 다양한복분자나무의추출부위를메탄올로추출한메탄올조추출물의항산화활성은, 원뿌리에서 IC 50 이 8.52 μg / ml으로매우우 수한반면에생엽및씨에서는 IC 50 이약 95 μg / ml이상으로매우낮다. 또한복분자나무의열매는성숙정도에따라항산 화활성이달리나타나, IC 50 이초기에는 14.42, 중기에는 μg / ml이고말기에는 μg / ml이다. 즉, 열매는성숙될 수록항산화활성이감소된다. 또한본발명의복분자나무추출물은추출용매에따라현저한항산화활성차이를나타낸다. 예컨대, 복분자의메탄올조추출물과, 상기조추출물에헥산, 클로로포름및에틸아세테이트를순차적으로가하여층분리한헥산추출물, 클로로포름추출물, 에틸아세테이트추출물및물추출물은 IC , >100, >100, 7.33, 및 μg / ml를나타낸다. 즉, 복분자에틸아세테이트추출물이가장우수한항산화활성을가진다. 또한, 본발명에서는복분자로부터항산화성화합물, 3,4- 디하이드록시벤조익산 (3,4-Dihydroxybenzoic acid) 을제공한다. 상기 3,4- 디하이드록시벤조익산은 IC 50 이 1.26 μg / ml으로, 공지항산화제인비타민 C(2.14 μg / ml ) 및 BHA(4.35 μg / ml ) 에비하여우수한항산화성을가진다. 따라서, 본발명의복분자나무추출물또는이로부터유래한항산화성화합물은, 활성산소의산화력으로인하여야기되는질병, 특히성인병및노화의예방또는치료제로사용할수있다. 이에, 본발명에서는상기에기재한복분자나무추출물또는이로부터유래한항산화성화합물을유효성분으로포함하는항산화성조성물을제공한다. 상기복분자나무추출물은바람직하기로는복분자나무뿌리의메탄올조추출물또는복분자에틸아세테이트추출물이며, 상기화합물은 3,4- 디하이드록시벤조익산이다. 본발명의항산화성조성물은, 상기유효성분을각각단독으로포함할수있으며, 이외제형, 사용방법및사용목적에따라약리학적으로허용가능한담체또는부형제를더욱포함할수있다. 혼합물로제공되는경우, 유효성분은항산화성조성물에 0.1 내지 99.9 중량 % 로포함될수있으나, 통상 내지 10 중량 % 의함량으로포함되는것이바람직하다. 상기담체또는부형제로는물, 덱스트린, 칼슘카보네이드, 락토스, 프로필렌글리콜, 리퀴드파라핀, 생리식염수, 덱스트로스, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로 - 3 -

4 즈, 메틸셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘스테아레이트및광물유가있으며, 이들은 1 종이상사용될수있으나, 이에한정되는것은아니며통상의담체및부형제는모두사용가능하다. 또한항산화성조성물을약제화하는경우, 통상의충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제또는방부제등을더욱포함할수있다. 본발명의항산화성조성물은식품, 식품첨가제, 약제또는건강식품으로사용가능하다. 약제로사용하는경우, 경구또는비경구모두사용할수있으나, 바람직하기로는경구투여이다. 상기조성물의제형은사용방법에따라달라질수있으므로하기기술한바에한정되는것은아니다. 제형의예로는경고제 (Plasters), 과립제 (Granules), 로션제 (Lotions), 산제 (Powders), 시럽제 (Syrups), 액제 (Liquids and Solutions), 연고제 (Ointments), 유동엑스제 (Fluidextract), 유제 (Emulsions), 현탁제 (Suspesions), 침제 (Infusions), 정제 (Tablets), 주사제 (Injections), 캅셀제 (Capsules) 및환제 (Pills) 등이있다. 본발명의항산화성조성물의투여량은, 조성물의사용용도및방법에따라적절히조절하는것이좋으며, 예컨대 1 회유효성분을기준으로하였을때 0.01 mg내지 5000 mg로, 1 일 1 내지 5 회투여할수있다. 이하, 본발명의이해를돕기위하여바람직한실시예를제시한다. 그러나하기의실시예는본발명을보다쉽게이해하기위하여제공되는것일뿐본발명의보호범위가하기의실시예에한정되는것은아니다. 실시예 1: 복분자나무의부위별메탄올조추출물제조 전북고창군에서재배한복분자나무의잎, 열매 ( 초기, 중기, 말기 ), 가지, 뿌리, 종자들을채집하였고, 상기각각의샘플로부터추출물을제조하였다. 열매는초기, 중기및말기로각각분류하여사용하였으며, 미숙과의녹색을띄며평균중량약 0.7g/ 개를나타내는열매를초기로분류하였으며, 성숙과의붉은색을띄며평균중량약 1.4g/ 개를나타내는열매는중기로, 말기과의검붉은색을띄며평균중량 2.0g/ 개를나타내는열매를말기로분류하여사용하였다. 채집한복분자나무의각부위는잘건조시킨후마쇄하여분말로만들었다. 각각의분말시료 50 g 씩을취하여 500 ml엘렌메이어플라스크 (Erlenmeyer flask) 에넣고메탄올 300 ml를부어잘흔든후에실온암실하에방치하였다. 3 일후감압여과하고회전진공농축기 (EYELA autojack NAJ-160, Japan) 로 40 에서감압농축하여메탄올조추출물을수득하였다. 실험예 1: 항산화활성검정 실시예 1 내지 4 에서제조한각각의추출물또는화합물은하기의방법으로실시하여항산화활성을측정하였다. 추출물또는화합물각각 10 mg을취해메탄올 10 ml로정용한후, 상기원액을메탄올 1 ml당 100, 50, 25, 12.5, 10, 5, 2.5 및 1.25 μl로희석하였다. 상기희석액각각 2 ml과 1.5 x 10-4 M/ ml ( 메탄올 ) 의 DPPH (Sigma, St. Louis, Mo, USA ) 용액 0.5 ml을균일하게혼합한다음실온에서 30 분간방치한후, 520 nm 에서 O.D(optical density, 최대흡광도 ) 값을측정하였다. 대조군으로합성항산화제인 BHA 와천연항산화제비타민 C 를사용하였다. 항산화활성의결과는대조군과비교해서 50 % 흡광도감소를나타내는검체의농도인 IC 50 으로나타내었고, 실험결과는 3 회반복실시하여평균을산출하 였다. 그결과는하기표 1 에나타내었다. 표 1. 실시예 1 의복분자나무추출물 IC 50 ( μg / ml ) - 4 -

5 복분자나무부위 열매초기 열매중기 열매말기 생엽 낙엽 원뿌리 8.52 곁뿌리 씨 100 가지 대조군 비타민 C 1.09 BHA 5.73 복분자나무는각부위별추출물에따라, 매우큰차이의항산화활성을나타내었다. 즉, 복분자의뿌리, 특히원뿌리에서가장우수한항산화능이관찰된반면에, 복분자나무의생엽과씨에서는항산화능이매우낮게관찰되었다. 또는복분자나무의추출부위의시기에따라서도서로다른항산화능이관찰되었다. 복분자나무의생엽은항산화능이매우낮은데반하여낙엽은높은항산화능을나타내었으며, 열매의수확시기에따라서도서로다른항산화활성을나타내었다. 실시예 2: 복분자유기용매추출물제조 간략한제조공정은도 1 로나타낸다 복분자헥산추출물 실시예 1 의복분자열매 ( 말기 ) 를사용하여제조한, 복분자메탄올조추출물 20 g 을증류수 800 ml에녹여 2 L 분액여두에넣고, 여기에동량의헥산을넣은후혼합한다음방치하여물층과헥산층으로층분리하였다. 약 30 분후에다른분액여두를이용해헥산층만을수득하였고, 물층에새로운헥산 800 ml를부어동일한방법으로 2 차의헥산층을뽑아내었다. 상기헥산층을모은후진공농축기로농축하여복분자헥산추출물을준비하였다 복분자클로로포름추출물 상기 2-1 실험후남아있는물층에동일한방법으로클로로포름을가하여, 복분자클로로포름추출물을준비하였다 복분자에틸아세테이트추출물 상기 2-2 실험후남아있는물층에동일한방법으로에틸아세테이트를가하여, 복분자에틸아세테이트추출물을준비하였다 복분자부탄올추출물 상기 2-3 실험후남아있는물층에동일한방법으로부탄올을가하여, 복분자부탄올추출물을준비하였다 복분자물추출물 상기 2-4 실험후남아있는물층을수득하고이를진공농축기로농축하여복분자물추출물을제조하였다. 실시예 3: 복분자주스또는박의유기용매추출물제조 전북고창복분자시험장에서분양한복분자 45 kg 를압착하여주스 21 L 과박 ( 복분자에서주스를제외한나머지부분 ) 을제조하였다. 복분자주스는상기실시예 2 와동일한방법으로헥산, 클로로포름및에틸아세테이트를가하여층분리하였고, 진공농축하여헥산추출물, 클로로포름추출물, 에틸아세테이트추출물및물추출물을수득하였다. 간략한제조공정은도 2 로나타낸다

6 복분자박은상기실시예 1 과동일한방법으로실시하여메탄올조추출물로준비하였다. 상기메탄올조추출물은실시예 2 와동일한방법으로헥산, 클로로포름및에틸아세테이트를가하여층분리하였고, 진공농축하여헥산추출물, 클로로포름추출물, 에틸아세테이트추출물및물추출물을수득하였다. 간략한제조공정은도 2 로나타낸다. 실시예 4: 복분자유래항산화성화합물분리및동정 상기실시예 3 에서제조한복분자주스의에틸아세테이트추출물을크로마토그래피로분획하였다. 복분자주스의에틸아세테이트추출물 10 g 을아세톤에용해시킨후, 실리카겔에흡착시키고, 용매를날려보낸후시료가흡착된실리카겔을잘게마쇄한후직접에틸아세테이트 100% 로충진되어있는실리카겔칼럼 (φ10 x 100 cm) 으로직접주입하고, 용출용매로헥산및에틸아세테이트를 1:99, 2:98, 3:97, 5:95, 10:90, 20:80, 30:70, 50:50, 100 % 에틸아세테이트부피비의농도구배로흘려준후순차적용출분획 10 개를 BE1 내지 BE10 으로수득하였다. 상기용출분획 BE1 내지 BE10 는각각진공농축하여이하항산화활성검정시료로사용하였다. 또한 BE7 분획은 GC-MS 를더욱실시하여화학식 1 의 3,4- 디하이드룩시벤조익산임을확인하였다 ( 도 3). ( 화학식 1) 실험예 2: 항산화활성검정 실시예 2 내지 4 에서제조한각각의추출물또는화합물은하기의방법으로실시하여항산화활성을측정하였다. 추출물또는화합물각각 10 mg을취해메탄올 10 ml로정용한후, 상기원액을ㅇ메탄올 1 ml당 100, 50, 25, 12.5, 10, 5, 2.5 및 1.25 μl로희석하였다. 상기희석액각각 2 ml과 1.5 x 10-4 M/ ml ( 메탄올 ) 의 DPPH (Sigma, St. Louis, Mo, USA ) 용액 0.5 ml을균일하게혼합한다음실온에서 30 분간방치한후, 520 nm 에서 O.D(optical density, 최대흡광도 ) 값을측정하였다. 대조군으로합성항산화제인 BHA 와천연항산화제비타민 C 를사용하였다. 항산화활성의결과는대조군과비교해서 50 % 흡광도감소를나타내는검체의농도인 IC 50 으로나타내었고, 실험결과는 3 회반복실시하여평균을산 출하였다. 그결과는하기표 2 내지 5 에나타내었다. 표 2. 실시예 2 의복분자유기용매추출물 IC 50 ( μg / ml ) 유기용매 헥산 >100 클로로포름 >100 에틸아세테이트 7.33 부탄올 물 대조군 비타민 C 2.09 BHA 5.56 실시예 2 의복분자유기용매추출물들중에서, 에틸아세테이트추출물의항산화활성이가장우수하여, IC 50 이 7.33 μg / ml으로확인되었다. 또한복분자물추출물도항산화활성을나타내었다

7 표 3. 실시예 3 의복분자주스의유기용매추출물 IC 50 ( μg / ml ) 유기용매 주스 헥산층 - 클로로포름층 >100 에틸아세테이트층 물층 박 헥산층 클로로포름층 에틸아세테이트층 물층 대조군 비타민 C 5.10 BHA 1.93 복분자주스의유기용매추출물들에선, 에틸아세테이트추출물의항산화활성이가장우수하였으나, 표 2 에기재된복분자에틸아세테이트추출물의항산화활성에비해선낮게확인되었다. 표 4. 실시예 4 의크로마토그래피분획 IC 50 ( μg / ml ) BE BE2 >100 BE3 >100 BE4 >100 BE5 >100 BE BE BE BE BE 비타민 C 4.3 BHA 2.4 실시예 3 의복분자주스의에틸아세테이트추출물을크로마토그래피하여수득한총 10 개의분획에서는, BE7 분획이가장우수한항산화능을나타내었다. 표 5. 화합물 IC 50 ( μg / ml ) 3,4-디하이드록시벤조익산 1.26 비타민 C 2.14 BHA 4.35 실시예 4 에서, 복분자주스의에틸아세테이트추출물로부터분리및동정한 3,4- 디하이드록시벤조익산은매우우수한항산화활성을나타내었으며, 또한기존의항산화제인비타민 C 및 BHA 에비하여높은활성을가진것으로확인되었다. 발명의효과 - 7 -

8 상기에언급한바와같이, 본발명의복분자나무뿌리의메탄올조추출물또는복분자에틸아세테이트추출물을유효성분으로포함하는항산화성조성물은, 인체에무해하며기존의합성항산화제대체용으로사용하여활성산소의산화력으로인하여야기되는질병, 특히성인병및노화의예방또는치료제로사용할수있다. (57) 청구의범위 청구항 1. (a) 복분자나무 (Rubus coreanus) 뿌리의메탄올조추출물또는 (b) 복분자메탄올조추출물에헥산, 클로로포름및에틸아세테이트를순차적으로가하여층분리한에틸아세테이트분획물을포함하는복분자에틸아세테이트추출물 을유효성분으로포함하는항산화성조성물. 청구항 2. 제 1 항에있어서, 상기뿌리는원뿌리또는곁뿌리인조성물. 청구항 3. 3,4- 디하이드룩시벤조익산을유효성분으로포함하는항산화성조성물. 청구항 4. 제 1 항내지 3 항중어느한항에있어서, 상기항산화성조성물은식품, 식품첨가제, 약제또는건강보조제로사용되는것인조성물. 도면 - 8 -

9 도면 1 도면 2-9 -

10 도면

Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No μ μ

Journal of Life Science 2011 Vol. 21. No. 8. 1120~1126 ISSN : 1225-9918 DOI : http://dx.doi.org/10.5352/jls.2011.21.8.1120 μ μ μ α β Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No. 8 1121 μ μ 1122 생명과학회지 2011,