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소희 노
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1 Polymer(Korea), Vol. 4, No. 2, pp (27) ISSN X(Print) ISSN (Online) Methylcellulose 조성온도감응성졸 - 젤유착방지제 김진 천서영 신동일 이창문 *, 이기영 **, 전남대학교신화학소재공학과, * 전남대학교의공학과, ** 전남대학교화학공학부 & 바이오코스모스 (26 년 월 2 일접수, 26 년 2 월 22 일수정, 26 년 2 월 23 일채택 ) Adhesion Barrier of Methylcellulose Based Thermo-Responsive Sol-Gel Jin Kim, Seo Young Cheon, Dong Il Shin, Chang Moon Lee*,, and Ki-Young Lee**, Department of Advanced Chemicals and Engineering, Chonnam National University, Gwangju 686, Korea *Department of Biomedical Engineering, Chonnam National University, Yeosu 59626, Korea **School of Chemical Engineering and Biocosmos Co., Chonnam National University, Gwangju 686, Korea (Received November 2, 26; Revised December 22, 26; Accepted December 23, 26) 초록 : 유착방지막을제조하기위해 methylcellulose(mc) 와 xanthan gum(xt) 조성의온도감응성졸 - 젤을제조하였다. MC/XT 졸 (sol) 은사람의신체온도 (37 o C) 에서 분안에젤화 (gelation) 가일어나는것을보였다. Rat 에온도감응성졸 - 젤을주입하여생체적합성및생체분해성을확인하였다. 또한온도감응성졸 - 젤이장기및조직의유착방지에효과가높은것을관찰하였다. 그결과 MC/XT 졸 - 젤은조직유착방지막의좋은후보물질임을확인하였다. Abstract: Thermo-responsive sol-gel was prepared from methylcellulose (MC) and xanthan gum (XT) for adhesion barrier. The prepared MC/XT sol-gel showed transition temperature and gelation around body temperature (37 o C) within min. In vivo biocompatibility and biodegradability of the MC/XT sol-gel were validated by implantation of the gel in rats. Also, the MC/XT sol-gel was highly effective for the prevention of tissue and organ adhesion. Therefore, the MC/ XT sol-gel can be a good candidate material as a tissue adhesion barrier. Keywords: methylcellulose, xanthan gum, sol-gel, adhesion barrier. 서 온도감응성고분자는온도변화에민감하게반응하는성질을가지고있어그응용범위가다양하다. 현재온도감응성졸-젤의경우, 외부자극에반응하는고분자의물리화학적특성을이용하여약물전달시스템과조직공학에응용하기위해많은연구가진행되고있다. 이러한온도감응성졸-젤을의료용으로응용하기위해서는체온에서수분내에젤이형성되고체내에서생분해가일어나야한다. 2 특히, 생체적합성을가지고있어야하며체내에서분해후세포와대사장기에손상이없어야한다. 졸-젤전이를보이는온도감응성고분자로는 poly(nisopropylacrylamide), pluronic, poloxamer(peg-ppg-peg, triblock copolymer) 가사용되고있다. 3,4 국내에서생산된유착방지제의대부분에는 poloxamer가포함되어있다. 5 온도감 론 To whom correspondence should be addressed. cmlee@jnu.ac.kr; kilee@chonnam.ac.kr 27 The Polymer Society of Korea. All rights reserved. 응성고분자는식약청고시총 8 가지유형의창상피복재중 3 등급에속하는심부체강창상피복재로서수술후조직의유착방지제로활용된다. 현재시판중인제품으로는제네웰의 Guardix-SG 와 CG-Bio 의 Mediclore 제품이있는데 poloxamer 에알지네이트를첨가시킨것과 poloxamer 에젤라틴과키토산을첨가시킨졸의형태로판매되고있다. 의료용소재로활용이가능한알지네이트, 히알루론산, 덱스트란, 키토산등의천연고분자는뛰어난생체친화성과생분해성을갖는생체재료로많은연구가되어왔으나, 온도감응성을적용시킨연구는많이보고되지않았다. 6 최근, 일부셀룰로오스유도체가온도감응성졸 - 젤전이특성을갖는것으로보고되었다. 하지만, 온도범위가체온정도일때졸 - 젤전이가일어나생체내에활용하기위해서는추가적인연구가필요하다. Methylcellulose 소재는 EU, FDA, FAO/WHO 에서식품원료로허가된소재로다양한점도를가진제품으로구성되어있어안정제, 증점제, 유화제, 코팅제, 현탁제, 기능성식품및의약품캡슐등다양한용도로광범위하게사용되고있다. Lin 의연구에는 methylcellulose 을이 38

2 Methylcellulose 조성온도감응성졸 - 젤유착방지제 39 용한졸 - 젤전이관련연구가있다. 이를바탕으로체내에적용이가능하며의료용으로유용하게응용될수있을것으로기대된다. 7 본연구에서는온도감응성및생체적합성이뛰어난 methylcellulose 를생체재료로활용하기위해다양한조건에서온도감응성을확인하고유착방지제를제조하여생체적합성과체내생분해성을갖는유착방지막으로의활용가능성을알아보고자한다. 실 시약및재료. Methylcellulose(MC, 5 cp, 4 cp, 4 cp), Xanthan Gum(XT,8-2 cp), NaCl, CaCl 2, Na 2 HPO 4 는 Simga 사 (St. Louis, MO, USA) 에서구입하여사용하였다. 대조군으로사용한온도감응성유착방지제는 CG-Bio 의 Mediclore 였다. L-929 세포주는한국세포주은행에서구입하였고세포배양용 Dulbeco modified Eagle medium (DMEM) 과 trypsin-ethylenediamine tetra acetic acid (EDTA) 는 Gibco laboratories(grand Island, NY, USA) 에서구입하였다. Fetal bovine serum(fbs) 은 Hyclone laboratories(logan, UT, USA) 에서, 96 well tissue culture plates 및 tissue culture dish 는 Nunc Inc.(North Aurora Road, IL, USA) 에서구입하였다. 그외의세포배양에필요한기구는 Life Technologies (Gaithersburg, MD, USA) 에서구입하고, 그외모든시약은 급또는특급을사용하였다. MC 조성졸의제조. 4: 비율의 MC 와 XT 를증류수에넣은후.3 M NaCl, CaCl 2, Na 2 HPO 4 을첨가하여졸을제조하였다. 제조한졸을저온에방치한후균일하게교반하였고제조한졸의안정화를위해제조후 4 시간동안 4 o C 에서방치하였다. 온도에따라졸 - 젤의최적비를찾기위해 5, 4, 4 cp 점도를가진 MC 를졸형태로만들어실험하였다. 특성분석. 졸 - 젤상변화특성규명은각조성용액을각각 8mL 씩정량한후, 항온조에서일정한온도간격으로승온시키면서각각의온도에서상변화현상을관찰하였다. 측정온도는 25 에서 5 o C 이며, 이때승온간격을 o C 로하여지속적으로상변화를관찰하였다. 또한, 조성물의젤화속도는 37 o C 에서각각의샘플의젤이되는시간이다. 8 졸 - 젤상전이온도측정. Tube inverting method 를통해 MC 와 XT 혼합조성물의졸 - 젤전이온도를측정하였다. 혼합조성물을증류수에녹인후 4 o C 에서하루이상보관하였다. 고분자수용액을.5 o C/min 의속도로승온하면서졸 - 젤전이현상을관찰하였다. 졸 - 젤전이온도는 vial 을뒤집어 3 초후에도흐름이관찰되지않는온도로정의하였다. MC 조성젤의특성분석. 제조된 MC 와 XT 혼합조성물 ml 을마이크로튜브에넣어항온조 (Jeiotech, Korea) 에서 25 부터 5 o C 까지 o C 씩올려주면서 5 분유지시켜각각의젤 험 화온도를측정하였고, 젤화시간은항온조의온도를 37 o C 로고정하고젤화되는시간을육안으로확인하여측정하였다. 온도증가에따른점도변화측정을위해점도계 (Brookfield, USA) 를사용하여샘플 4g 을 spindle CP-2, speed 5 rpm 조건에서온도를올려가면서점도를측정하였다. 세포독성실험. 국제표준화기구기준 (ISO 993) 에제시된시험방법으로평가하였다. MC 와 XT 혼합조성졸 - 젤의세포독성은 MTT-assay 를이용하였다. 졸 - 젤을 37 o C 에서 72 시간동안세포배양액에용출시켜실험에사용하였다. MTT assay 법에서 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) 시약은세포내로흡수된후미토콘드리아의 succinate dehydrogenase 에의해 formazan 을형성한다. 96 well plate 에각 well 당 L-929 세포 5 4 cells/well 를분주하고 24 시간후다양한농도로제조한시트용출액을함유한 DMEM 배양액으로갈아준후 24 시간동안 37 o C, 5% CO 2 조건에서배양하였다. Well 당 2 µl 의 MTT 용액을첨가하여 4 시간동안반응시킨후, 배양액을버리고 DMSO µl 씩넣어 formazan 이형성된정도를 ELISA 측정기 (ELX 88, Biotek Instruments, Vermont, USA) 를이용하여 57 nm 에서분광학적방법으로측정하였다. 생분해성평가. 국제표준화기구기준 (ISO 993-6) 에제시된시험방법으로평가하였다. Sprague-Dawley rat(orient bio, Kyeonggi, Korea) (7 주령, 22 g) 의 backside 의피하조직 (subcutaneous tissue) 에졸상태의용액을 23G 주사기바늘로주입하였다. 피하에주입후이식물의캡슐화정도와염증의정도를평가하고대식세포의뭉침의유무도확인하였다. 9 동물실험. MC 와 XT 혼합조성졸 - 젤의유착방지효과와분해거동을확인하기위하여 Sprague-Dawley rat(orient bio, Kyeonggi, Korea) (5 주령, 5~8 g) 모델을이용하여평가하였다. 본실험은전남대학교동물실험윤리위원에서허가를받은후실시하였다 (CNU IACUC-YB-26-4). 마취제로는케타민과럼푼을이용하였고, 젤의분해시험은 rat 의등피하에 cc 주입하여시간대별로부피를측정하여분해정도를확인하였다. 유착방지효과를확인하기위하여 rat 의복부를절개하여맹장표면과복막에 cm 2 크기의인위적인상처를내서강제유착을일으켰다. 상처를낸부위에졸을처리하여 주일후쥐의맹장과복막의유착정도를평가하였다. 유착정도는 ~3 까지구분하였다. 유착정도는 ; 유착이일어나지않은경우, ; 박리가쉽게되는유착이매우적게일어난경우, 2; 유착이중간정도일어난경우, 3; 유착이심하게된경우로구분하여평가하였다. 조직학적평가. 조직학적평가를위해수술부위를근육층과경막을포함하여떼어낸후 % 중성포르말린용액에 24 시간동안넣어고정시킨다음, 탈수화용액에 48 시간넣어서충분히탈수시킨후알코올로건조시키고파라핀블록 Polymer(Korea), Vol. 4, No. 2, 27

3 32 김진 천서영 신동일 이창문 이기영 을만들었다. 이블록을 6~8 µm 두께로절편을만들어헤마톡실린 - 에오신 (hematoxylin-eosin) 염색을하였고현미경을통해관찰하였다. 결과및토론 MC 조성졸 - 젤의물리적특성. 졸 - 젤전이가가능한생체적합성고분자를이용하여 37 o C 에서빠르게젤화되는용액을제조하였다. 상온에서액체상태로존재하며주사기제제로의활용이가능함을확인하였다. MC 는 heterogeneous 고분자로 hydrophobic 과 hydrophilic 으로구성되어있다., 온도와염 (salt) 에따라고분자의물성변화가자유로워다양한분야에폭넓게활용할수있다. Figure 에서 MC 의농도와염에따라달라지는졸 - 젤전이온도를확인하였다. 농도가높을수록낮은온도에서빠른젤화가이루어지는것을확인할수있었다. Figure 2 에서는 MC 의점도에따라달라지는졸 - 젤전이현상을나타낸다. MC 2%, XT.5% 로고정하고다양한농도의 NaCl, CaCl 2, Na 2 HPO 4 가첨가된졸이젤화되는것을확인하였다. 낮은점도의 MC 에서는염의농도가 M 일때 37 o C 에서졸 - 젤이형성되었다. Figure 2(c) 는 4 cp 의점도를가진 MC 조성에.3 M 의 Na 2 HPO 4 를첨가했을때 37 o C 에서졸 - 젤전이가빠르게형성되는것을나타냈다. 졸 - 젤상전이온도측정..3M 의 Na 2 HPO 4 가첨가된 MC/ XT 조성의졸은농도에따라민감하게젤화되는것을관찰하였다 (Figure 3). 온도가올라갈수록점도가증가하였다. 기존연구에서제시된키토산에글리세롤인산염나트륨을처리한온도감응성졸 - 젤조성과비교한결과, Na 2 HPO 4 가첨가된 MC/XT 조성의졸은 분내에젤로전이됨을관찰할수있었다. 체내주입시빠른젤화가필요로하는경우에효율 적으로활용될것으로판단된다. 2 CG-Bio의 poloxamer 조성의온도감응성졸은 7분정도에졸에서젤로변화되지만 MC 조성은 분내에졸에서젤로전이되는것을확인하였다 (Table ). 세포독성평가. 온도감응성졸-젤제조에사용된 MC와 XT는세포독성이없는물질이며화장품, 식품, 의약품에쓰이고있다. 유착방지제로활용하기위해염을처리한졸-젤 Figure. Gelation temperature of different salt depending on the MC sol with the increase of concentration. Figure 2. Sol-gel transition temperatures measured by tube inverting method. MC/XT sol with varying viscosity: (a) MC 5 cp; (b) MC 4 cp; (c) MC 4 cp. 폴리머, 제 4 권제 2 호, 27 년

Methylcellulose 조성 온도 감응성 졸-젤 유착방지제 32 Figure 3.

Figure 4. Cell viability of L929 cells assess of via MTT assay in the presence of.25 to % MC/XT and MC/XT - Na2HPO4 sol-gel extracts after culturing for 24 h. 조성의 독성 평가를 진행하였다.

Figure 5(b)에서의 조직학 적 평가를 관찰한 결과 조직 내에서 초기에 염증세포를 관찰 할 수 있었으며 시간이 경과됨에 따라 주입한 졸-젤이 분해 되고 염증세포가 감소하는 것을 조직학적 평가에서 확인할 수 있었다. In vivo 결과를 통해 Na2HPO4 첨가한 MC/XT 조 성의 졸-젤은 생체적합하고 및 생분해가 가능한 소재임을 확 인했다.

4 Methylcellulose 조성 온도 감응성 졸-젤 유착방지제 32 Figure 3. Temperature dependent viscosity changes of MC/XTNa2HPO4 samples measured at 2 oc/min heating rate and sol-to-gel image of MC, XT-sensitive gel: the sol state at 25 oc; the gel state at 37 oc. Figure 4. Cell viability of L929 cells assess of via MTT assay in the presence of.25 to % MC/XT and MC/XT - Na2HPO4 sol-gel extracts after culturing for 24 h. 조성의 독성 평가를 진행하였다. L-929 세포를 이용하여 MTT assay 방법으로 실험을 수행하였다. 8%이상의 생존율을 관 찰하였으며 인체내 적용이 가능한 물질로 판단하였다(Figure 4). 어 사라진 것을 확인할 수 있었다. Figure 5(b)에서의 조직학 적 평가를 관찰한 결과 조직 내에서 초기에 염증세포를 관찰 할 수 있었으며 시간이 경과됨에 따라 주입한 졸-젤이 분해 되고 염증세포가 감소하는 것을 조직학적 평가에서 확인할 수 있었다. In vivo 결과를 통해 Na2HPO4 첨가한 MC/XT 조 성의 졸-젤은 생체적합하고 및 생분해가 가능한 소재임을 확 인했다.3 복막 유착방지효과. Figure 6에서 음성대조군(non-treatment) 은 맹장과 복벽에 강하게 유착된 것으로 확인되었다. 또한 주 사제형(졸-젤)으로 처치한 양성대조군 5마리 중 한 마리에서 유착이 발생하였다. 실험군인 Na2HPO4가 첨가된 MC/XT 조 생분해성 평가. Na2HPO4가 첨가된 MC/XT 조성 졸이 담 지된 주사기에 바늘(23 G)을 이용하여 rat의 backside에 피하 주사(subcutaneous)하였다. 주사 후 3분에 사진을 촬영하였 다(Figure 5, day). Na2HPO4가 첨가된 MC/XT 조성의 졸젤 형태를 나타냈다. 일에서 7일의 사진은 졸-젤이 점차 팽 윤되어 부피가 늘어난 것을 확인할 수 있었다. 4일에서부터 점차 졸-젤의 부피가 감소되었다. 3일이 경과되면서 분해되 Figure 5. Photos of MC/XT- Na2HPO4 sol-gel after subcutaneous injection into backside tissues of SD rats (a); H&E staining of histological evaluation at, 7, 4, 3 days after injection of MC/XT- Na2HPO4 sol-gel surgery (b). Polymer(Korea), Vol. 4, No. 2, 27

5 김 진 천서영 신동일 이창문 이기영 322 Figure 6. In vivo anti-adhesion effects of the control and the experiment group in rats: (a) a negative control not treated with gel; (b) a positive control treated syringe type solution; (c) MC/XT- Na2HPO4 sol-gel. Adhesion was apparent in the non-treated rat and in the syringe type solution treated rat after surgical damage of the surfaces of the abdominal wall and cecum. No adhesion was observed in the MC/XT-Na2HPO4 sol-gel treated rat at 7 and 4 days after the surgery and the wound to the peritoneum and cecum were healed. Table. Composition and Gelation Characteristic of Sol-Gel Solution Temperature (oc) Temperature change Gelation time (min) (at 37 oc) MC(4 cp, 2%), XT(.5%), Na2HPO4(.3 M) sol sol->gel gel 32->37->4 Chitosan(.5%), Glycerol phosphate(8%) sol sol->gel gel 32->37->4 6 CG-Bio sol sol->gel gel 32->37->4 7 Sample Table 2. Postoperative Adhesion Formation Ratio, Grades and Score for 3 Groups Group No. of rats Negative control Adhesion grades a Mean of score b Adhesion ratio (%) /5() Positive control /5(2) MC/XT -Na2HPO /5(2) a Mean of score = (adhesion grades adhesion number)/total number. badhesion ratio = (adhesion number/total number) %. 성의 졸-젤을 처치한 그룹에서 5마리 중 한 마리에서 유착이 발생한 것이 확인되었다. 유착의 정도에 따라 에서 3단계까 지 분류하여 Table 2에 나타냈다. 동물실험 결과 음성 대조 군에서 복벽과 맹장에 유착이 발생하였다(유착점수 2.6). 양 폴리머, 제4권 제2호, 27년 성 대조군으로 poloxamer 조성 온도감응성 액체타입의 주사 제형을 처리한 군에서는 유착점수가.2로 유착이 거의 발생 되지 않았다. 실험군에서도 Na2HPO4가 첨가된 MC/XT 조성 의 졸-젤을 처치한 군에서는 유착점수가.2로 유착이 거의

6 Methylcellulose 조성온도감응성졸 - 젤유착방지제 323 발생되지않았으며상처가수복된조직을관찰할수있었다. 실험군에서유착이거의형성되지않은것은 Na 2 HPO 4 가첨가된 MC/XT 조성졸 - 젤이상처부분에서젤화되어적절한조직유착방지기능과역할을수행한것으로판단된다. 4-6 조직학적평가. 실험후희생시킨 rat 의조직학적평가를 Figure 6 에나타냈다. 실험군조직은이물반응으로약한정도의염증세포침윤및섬유화현상의소견이보였다. 맹장과복벽사이에삽입시킨 Na 2 HPO 4 가첨가된 MC/XT 조성의졸 - 젤은조직에서서히흡수되는것을관찰할수있었다. 또한졸 - 젤을처치하였을때세포증식과혈관형성을위한분해및흡수과정의반복으로조직간의장벽에중피층 (mesothelial layer) 이형성된것을관찰할수있었다. 연구결과, MC/XT 조성의졸 - 젤은유착방지효과를보임으로써유착방지제로의활용가능성을확인하였다. 결 본연구에서는 Na 2 HPO 4 가첨가된 MC/XT 조성의온도감응성졸 - 젤의유착방지막으로의적용가능성을평가하였다..3 M 의 Na 2 HPO 4 가첨가된 MC(4 cp, 2%)/XT(.5%) 의조성이 37 o C 에서졸 - 젤로빠르게전이되는것을관찰하였다. 또한 Na 2 HPO 4 가첨가된 MC/XT 조성의졸 - 젤을 rat 에주입하여생체내적합성및생분해성을평가한결과생체내무독성이며 3 일이내에분해되는것을확인하였다. 또한유착방지막의기능을평가하기위해, 복강내유착을일으켜 Na 2 HPO 4 가첨가된 MC/XT 조성의졸 - 젤을복강내에주입하여유착방지막으로서의역할을확인하였다. 체내에서안정적으로젤이형성되어유착방지역할을하는것이확인되었다. Na 2 HPO 4 가첨가된 MC/XT 조성의졸 - 젤은다양한장점을보유함으로써유착방지제및생체의료용응용분야에다양하게활용될수있을것으로기대된다. 론 감사의글 : 이논문은 25 년도정부 ( 교육부 ) 의재원으로한국연구재단의지원을받아수행된기초연구사업임 (No. 25HCA35894), 26 년도정부 ( 교육부 ) 의재원으로한국연구재단의지원을받아수행된기초연구사업임 (No. 26RA6A3A935439). 참고문헌. Y. Li, J. Rodrigues and H. Tomas, Chem. Soc. Rev., 4, 293 (22). 2. A. Gutowska, B. Jeong, and M. Jasionowski, Anatom. Record., 263, 342 (2). 3. R. Namgung and W. J. Kim, Biomater. Res., 4, 86 (2). 4. L. Klouda and A. G. Mikos, Eur. J. Pharm. Biopharm., 68, 34 (28). 5. J. K. Park, J. W. Nah, and C. Y. Choi, Polym. Korea, 39, 48 (25). 6. H. S. You, M. O. Cho, I. S. Cho, Z. Li, N. H. Kim, M. K. Jang, S.-W. Kang, and K. M. Huh, Polym. Korea, 4, 328 (26). 7. L. Lin, Macromolecules, 35, 599 (22). 8. J. K. Park, K. J. Lee, D. H. Son, C. Choi, M. K. Jang, and J. W. Nah, J. Chitin Chitosan, 6, 45 (2). 9. J. K. Kim, Y. W. Won, K. S. Lim, and Y. H. Kim, Pharm. Res., 29, 525 (22).. K. Kabayashi, C. Huang, and T. P. Lodge, Macromolecules, 32, 77 (999).. N. Sarkar and L. C. Walker, Carbohydr. Polym., 27, 77 (995). 2. L. Li, H. Shan, C. Y. Yue, Y. C. Lam, K. C. Tam, and X. Hu, Langmuir, 8, 729 (22). 3. K. Elham, G. Fariba, T. Mohsen, and S. Maryam, Iran Polym. J., 22, 785 (23). 4. Z. Liu and P. Yao, Carbohydr. Polym., 32, 49 (25). 5. A. G. Oh, Biomater. Res., 7, 38 (23). 6. J. Kim, E. B. Cho, C. M. Lee, and K. Y. Lee, Polym. Korea, 4, 36 (26). Polymer(Korea), Vol. 4, No. 2, 27

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(15-184).fm Polymer(Korea), Vol. 40, No. 3, pp. 397-404 (2016) http://dx.doi.org/10.7317/pk.2016.40.3.397 ISSN 0379-153X(Print) ISSN 2234-8077(Online) Gellan Gum/Chondroitin Sulfate 조성유착방지제의개발 김진 신동일 이기영 *, 전남대학교신화학소재공학과,