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1 J Koren Soc Food Sci Nutr 한국식품영양과학회지 45(), 1391~1397(216) In Vitro 및 In Vivo 알코올유도간손상에대한신선초추출물의효과 이정윤 1 안연주 1 김지원 1 최효경 2 이유현 1 1 수원대학교식품영양학과 2 한국식품연구원대사영양연구본부 Effect of Angelic keiskei Koidzumi Extrct on Alcohol-Induced Heptotoxicity In Vitro nd In Vivo Jeong Yoon Lee 1, Yeon Ju An 1, Ji Won Kim 1, Hyo-Kyoung Choi 2, nd Yoo-Hyun Lee 1 1 Deprtment of Food Science nd Nutrition, University of Suwon 2 Division of Nutrition nd Metolism Reserch Group, Kore Food Reserch Institute ABSTRACT We investigted the heptoprotective effects of Angelic keiskei Koidzumi extrct (AK) in HepG2- overexpressing cytochrome P452E1 (CYP2E1) nd C57BL/6J mice. In HepG2 cells expressing CYP2E1, cell viility nd ctlse ctivity in the ethnol-ak co-treted group significntly incresed compred to those in the ethnol-treted group. In the in vivo study with C57BL/6J mice, the AK-supplemented group with ethnol liquid diet showed significntly reduced heptic mrkers, including serum sprtte minotrnsferse, lnine minotrnsferse, nd γ-glutmyl trnsferse, compred to the ethnol group without AK supplementtion. AK supplementtion (2 mg/kg BW/d) lso significntly ttenuted rective oxygen species genertion nd mlondildehyde level. Notly, low dose of AK supplementtion (2 mg/kg BW/d) suppressed expression of heptic CYP2E1 nd inhiited CYP2E1 enzyme ctivity. These dt indicte tht low dose of AK supplementtion could restrin lcohol-induced heptic dmge medited y CYP2E1. Key words: CYP2E1, lcohol, oxidtive stress, Angelic keiskei Koidzumi 서 2년우리나라의월간음주율은 19세이상성인기준으로남성이 77.8% 이며, 성인남성중연간월 1회이상폭음하는비율은 65.5% 에이르는것으로나타났으며, 신체및정신건강악화및다양한사고에위험요소로작용하는것으로나타나고있다 (1). 문제가되는과량혹은지속적음주는간지방증, 간염, 간섬유화, 간암등의간질환으로발전될수있으며 (2), 알코올대사과정에서발생하는산화적스트레스는알코올성간질환을일으키는중요한요인으로작용할수있다 (2,3). 지속적인음주시간에서의알코올대사는마이크로좀알코올산화계 (MEOS, microsoml ethnol oxidizing system) 의 cytochrome P452E1(CYP2E1) 효소를유도하고활성을 증가시켜 (3), 산화적스트레스를증가시키고항산화효소를 고갈시킨다 (4). CYP2E1 효소는그촉매과정에서과산화수 소 (H 2O 2), 과산화물음이온 (O 2 - ), 히드록실라디칼 (OH - ) 등 Received 13 June 216; Accepted 21 June 216 Corresponding uthor: Yoo-Hyun Lee, Deprtment of Food nd Nutrition, University of Suwon, Hwseong, Gyeonggi 18323, Kore E-mil: cremut@suwon.c.kr, Phone: 론 의활성산소 (ROS, rective oxygen species) 의과량생산을동반하게되는데, 이결과로체내항산화기전의감소가일어나고간손상으로연결된다 (2,5). 이러한알코올대사중에발생하는활성산소의제거를위해서효소적, 비효소적항산화제를상승시키는방안이간세포보호를위해다양하게연구되고있다 (6,7). 본연구의소재로사용된신선초 (Angelic keiskei Koidzumi) 는미나리과에속하는다년생초본으로고혈압, 당뇨등에효과가있다고알려져채소, 녹즙등의형태로섭취되어왔다 (8,9). 신선초에는항산화성폴리페놀이다량함유되어있으며 (9) 혈청지질함량을낮추고 (), 항암효과 (11) 가있다는연구가있다. 신선초는특히 in vitro계에서알코올대사효소인 lcohol dehydrogense 및 ldehyde dehydrogense에대한활성촉진효과가있다고보고되었으며 (12), 습관성음주자를대상으로진행한임상시험에서알코올로상승한 gmm-glutmyl trnsferse(ggt) 를유의적으로낮추는연구결과 (13) 가보고되었다. 본연구는알코올성간손상을유발한 in vitro 및 in vivo 시스템에서신선초추출물의간세포보호효과및간지표와항산화효소등에미치는효과를검토하였으며, 최종적으로 CYP2E1 효소의발현과활성변화를통하여보호효과의

2 1392 이정윤 안연주 김지원 최효경 이유현 기전을밝히고자하였다. 재료및방법신선초추출물의제조본연구에서사용한신선초는강원, 충청, 전라도등지에서수확된국내산신선초의잎부위를 ( 주 ) 풀무원 (Seoul, Kore) 으로부터감별과정을거친후적합품을선별하여공급받아세척하고건조하였다. 95% 에탄올을원재료의 7배 (W/V) 로넣고 55~6 C에서 3시간동안 1차추출을시행하였고, 1차추출을마친원재료에다시 7배 (W/V) 의 3% 에탄올을넣고 7 C에서 3시간동안추출하고여과 농축하여사용하였다. Tle 1. Composition of Lieer-DeCrli diet Ingredient Control diet Ethnol diet Csein ( mesh) L-Cystine DL-Methionine Corn oil Olive oil Sfflower oil Dextrin mltose Cellulose Choline itrtrte Xnthn gum Slt mix Vitmin mix Ethnol 세포의배양인간간암세포주인 HepG2(ATCC, Mnsss, VA, USA) 는 modified Egle's medium(mem) 배지에서 % fetl ovine serum(fbs, Gico BRL, Grnd Islnd, NY, USA), 1% ntiiotics/ntimycotics(gico BRL) 를첨가하여 37 C, 5% CO 2 조건의습윤한 incutor에서배양되었으며, humn CYP2E1 cdna가클로닝된 vector(14) 를 Lipofectmine 2 trnsfection regent(invitrogen, Crlsd, CA, USA) 로 trnsfection 하여사용하였다. Cell viility CYP2E1 과발현 HepG2 cell을 24 well에 5 4 cells/ well로분주하고배양 24시간후, phosphte uffered sline(pbs, ph 7.4) 으로 2회세척을하고 2% FBS가포함된배지로교체한다음신선초추출물 (Angelic keiskei Koidzumi extrct, AK) 을, 5, μg/ml의농도로처리하고배양하였다. 1시간후 2 mm의에탄올을처리하고다시 24시간동안배양을시행하고, 이를 3회반복시행하였다. 3회반복시행이끝난후 3-(4,5-dimethylthizol-2-yl)- 2,5-diphenyltetrzolium romide(mtt; Sigm-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 를배지에첨가하여 2시간동안배양하고형성된 lue formzn을 DMSO에녹여 microplte reder(biotek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA) 로 57 nm와 63 nm에서 sornce를측정하였다. 실험동물및식이실험에사용된동물은 ( 주 ) 대한바이오링크 (Eumsung, Kore) 7주령의수컷 C57BL/6J 마우스를구입하여사용하였다. 실험동물은 3일간환경에적응시킨후 마리를한군으로난괴법에의해 4군으로분류하였다. 각실험군은정상식이군 (Control), 알코올식이군 (EtOH), 알코올-신선초 2군 (EtOH-AK2), 알코올-신선초 군 (EtOH-AK) 으로나누었다. 동물실험에사용된식이는 Lieer-DeCrli 액체식이 (Dyets, Bethlehem, PA, USA) 로적응을위해일 주일간급여한후, 본액체식이의탄수화물인 mltose dextrin 대신에탄올로일부열량을대치하는액체식이를제조하여 Control군을제외한나머지군에급여하였다 (Tle 1). 신선초추출물은 EtOH-AK2군의경우 2 mg/kg BW/ d, EtOH-AK군은 mg/kg BW/d로동일한시간에경구투여하였다. 식이는매회섭취량을기록하였으며총 6주간사육하였다. 실험동물은희생후혈액과간을수집하고, 혈액은혈청으로분리하고, 간은무게측정후각실험에사용시까지 -7 C에보관하였다. 본동물실험은수원대학교동물실험윤리위원회의승인을받아진행하였다 (USW-IACUC-R ). CYP2E1 효소활성측정간조직에 4배의 potssium phosphte uffer(kpb, ph 7.4) 를첨가하여균질화하고 3, rpm에서 분간원심분리 (Logene, Seoul, Kore) 하여상층액을얻었으며, 여기서 CYP2E1 효소활성을측정하였다. CYP2E1 효소활성은특이적기질인 p-nitrophenol(pnp) 을이용하여측정하였는데,.1 M KPB(pH 7.4), 1 mm PNP,.2 mg 간균질액에최종농도.5 mm NADPH를가하여반응을개시하였으며, 37 C 에서 3분간반응시킨후.2 ml의 2% trichlorocetic cid(tca) 를가하여종결시켰다., rpm에서 5분간원심분리하여얻은상층액에.5 ml의 2 M NOH를가하여발색시켜 535 nm(biotek Instruments, Inc.) 에서측정하였으며, 표준곡선은본반응의생성물인 4-nitroctechol을사용하였다. 항산화효소의활성간조직에서항산화효소인 ctlse(cat) superoxide dismutse(sod), glutthione S-trnsferse(GST), glutthione peroxidse(gpx), glutthione reductse(gr) 활성을측정하였다. CAT 활성은 Aei(15) 의방법으로측정하였고, SOD, GST, GPx 및 GR의활성은 kit(biovision,

3 알코올성간손상에대한신선초추출물의효과 1393 Milpits, CA, USA) 을이용하여분석하였다. MDA의측정 Mlondildehyde(MDA) 의양은조직을.38% TBA와 15% TCA로구성된 TBA regent에넣어 3분간끓인후, 5, rpm에서 2분간원심분리하였다 (Thermo Scientific Sorvll, Wlthm, MA, USA). 상등액을회수하여 microplte reder(biotek Instruments, Inc.) 로 535 nm에서측정한후 MDA 표준곡선에따라 nm/mg protein으로표기하였다. 간의조직학적분석알코올급여마우스에서신선초추출물투여에따른간조직의병리학적분석을위하여 4% pr formldehyde (Sigm-Aldrich Co.) 로처리하여파라핀블록을만들고슬라이스하여 hemtoxylin-eosin 염색을하고광학현미경으로관찰하였다. Western lot 간에 4배의 RIPA uffer를넣고균질화하여 3, rpm 에서 5분간원심분리하였다. 상등액을수거하고 Brdford 법으로단백질을정량한후, 각군간 4 μg protein을기준으로 % SDS gel에전기영동하고 western lot을시행하였다. Nitrocellulose memrne에 trnsfer 한후 5% skim milk로 4 C에서 16시간동안 locking을시행하였으며, 다시 primry 및 secondry ntiody를처리한후 X- ry film에인화하였다. 본실험에사용된 ntiody의정보는다음과같다. Rit polyclonl IgG CYP2E1(CYP2E1, diluted 1:1,; Snt Cruz Biotechnology, Snt Cruz, CA, USA), ctin-mouse MA(diluted 1:1,; Sigm- Aldrich Co.), got nti-rit IgG-HRP-conjugted(diluted 1:1,; Snt Cruz Biotechnology) 가사용되었다. 통계처리본연구에서는세포실험은최소 3반복에대한평균및표준편차 (men±sd) 로표시하였으며, 동물실험은평균및표준오차 (men±se) 로표현하였다. 각실험군간의통계적유의성은 Duncn's multiple rnge test를사용하여 P<.5에서통계학적유의성을검정하였다. 통계검정은 SPSS (version 2, IBM Corportion, Armonk, NY, USA) 를이용하였다. 결과및고찰 In vitro에서에탄올처리에대한신선초추출물의효과 In vitro에서에탄올처리에대한신선초추출물이간세포에미치는영향을검토하기위하여 CYP2E1을과발현시킨 HepG2 cell에서 MTT ssy를시행하였다. 과발현시킨 CYP2E1은 western lot으로그발현을확인하였다 (Fig. 1A). Fig. 1B에서와같이 2 mm 에탄올처리에따라세포생존률은 Control군과비교하였을때약 4% 유의적으로감소하였으며, μg/ml의신선초추출물을처리한 EtOH- AK군의세포생존률은 Control군수준으로유의적으로증가하는것을볼수있었다 (P<.5). Fig. 1C에서에탄올처리에따라유의적으로감소한 CAT 활성은신선초추출물의처리로다시증가하는것을볼수있다 (P<.5). 위의 A β-ctin CYP2E1 B Cell viility (%) C Ctlse ctivity Control EtOH EtOH+5 EtOH+ Control EtOH EtOH+5 EtOH+ Fig. 1. Effects of Angelic keiskei extrct on HepG2 cells overexpressing CYP2E1 ginst ethnol-induced toxicity. Dt express the men±se. Different letters (,) ove the rs re significntly different (P<.5). (A) CYP2E1 expression ws mesured y western lot (lne 1: HepG2, lne 2: trnsfected HepG2), (B) effect of A. keiskei extrct on cell viility, (C) effect of A. keiskei extrct on ctlse ctivity in HepG2 overexpressing CYP2E1. In (B) nd (C), Control group is non-treted group, EtOH group ws treted with 2 mm ethnol, EtOH+5 group ws treted with 5 μg/ml A. keiskei extrct plus 2 mm ethnol, nd EtOH+ group ws treted with μg/ml A. keiskei extrct plus 2 mm ethnol.

4 1394 이정윤 안연주 김지원 최효경 이유현 Tle 2. Chnges in the ody nd liver weights in ethnol-induced mice Group 1) Body weight (g) week 6 weeks Control EtOH EtOH-AK2 EtOH-AK 19.95± ± ± ± ± ± ± ±1.35 Weight gin (g) 4.81±.37 NS2) 4.34± ± ±.3 Liver weight (g) 1.14±.15 NS 1.18± ± ±.13 Vlues re expressed s men±se of mice. 1) Control: non-treted mice, EtOH: ethnol-treted mice, EtOH-AK2: ethnol mice supplied with 2 mg/kg BW/d of Angelic keiskei Koidzumi extrct, EtOH-AK: ethnol mice supplied with mg/kg BW/d of Angelic keiskei Koidzumi extrct. 2) Not significnt. 결과는 CYP2E1에의한에탄올대사중발생하는활성산소에의해세포생존률이감소했다고생각되며, 이와같은에탄올유도산화적스트레스는 Fig. 1B와같이신선초추출물의처리로세포내 ctlse와같은항산화효소의증가로연결되어세포생존률의증가를가져왔다고생각된다. 이같은결과는 Bk 등 (16) 의연구에서 CYP2E1 과발현 HepG2에서왕머루에서분리한 procynidin 처리로세포생존률과 CAT 활성이증가하였다는보고와같이 CYP2E1의알코올대사에서발생한 ROS로인한산화적스트레스를신선초추출물이 CAT와같은항산화효소를높여세포손상을감소시켰다고생각된다. In vivo에서신선초추출물투여에따른체중과간무게변화 In vivo에서알코올유도간손상에대한신선초추출물의효과를검토하기위하여총 6주간의 Lieer Decrli 액체알코올식이를급여하며 2, mg/ody weight/d의신선초추출물을경구투여하였으며, 이를각각 EtOH-AK2, EtOH-AK군으로명명하였다. 신선초추출물의농도는앞서시행된신선초추출물의인체적용시험결과 (13) 를기반으로 1, mg/6 kg BW와유사한 2 mg/kg BW의농도를설정하였고, 고농도에서효과의변화를확인하기위하여 mg/kg BW의식이농도를선택하여사용하였다. 전실험기간동안실험동물은모두생존하였으며실험동물을희생시키고부검한결과상기의두가지농도에서간조직외의다른조직에서변화, 손상등은나타나지않았다. 실험동물의체중변화와간무게는 Tle 2와같다. 체중변화는각군에서유사하게증가하여각군당유의적차이는보이지않았으며각군당간무게도유의적인차를보이지않았다. 혈액의생화학적지표 Control군과 EtOH군, 그리고신선초각군의혈청 ALT, AST 및 GGT 결과는 Tle 3과같다. 혈액에서의모든생화학적지표는 EtOH 군에서급격히상승하였다. ALT와 AST 는가장많이측정되는간질환의지표로, EtOH군의 AST 및 ALT는 Control군과비교하여각각 2배와 2.7배각각이상상승하였으며, EtOH-AK2과 AK군에서유의적 Tle 3. Effects of Angelic keiskei Koidzumi extrct on heptic mrkers in mice serum Group 1) Control EtOH EtOH-AK2 EtOH-AK AST (Krmen) 66.79±5. 2) ± ± ±15.84 ALT (Krmen).23± ±4.2.24± ±3.71 Υ-GTP (ng/ml) 1.24± ± ± ±.15 Vlues re expressed s men±se of mice. 1) Refer to Tle 2. 2) Mens with different letters in column re significntly different (P<.5). 으로감소하였다 (P<.5). 본연구결과는사염화탄소투여로상승한 AST와 ALT를신선초녹즙을투여하여유의적으로억제한 Jung 등 (9) 의연구와일치하였다. GGT는 EtOH 군에서 2배이상상승하였고 AK2과 AK군에서 Control군과유사하게유의적으로감소하는경향을보였다 (P<.5). GGT는 glutthione 항상성에관여하는막효소로 (17), 알코올섭취시 glutthione의고갈로산화적스트레스가유도되고세포내 GGT가증가하므로 (13) 산화적스트레스의지표혹은알코올섭취로인한간질환의진단에널리이용되어왔다 (17,18). Noh 등 (13) 의연구에서습관적음주자에신선초추출물을급여한경우 GGT가유의적으로감소하는변화를보였으며, 본연구에서도에탄올을급여한마우스에서상승했던 GGT가신선초의투여로유의적감소하므로일치한다고할수있다. 또한, 저농도인 EtOH-AK2군및고농도인 EtOH-AK군간의생화학적지표상의차이도유의적으로나지않아본실험에서사용한농도에서시료자체의독성은없다고생각하였다. 알코올급여마우스의간에서신선초투여에따른조직학적변화희생후각군당간의조직학적분석을위하여간조직을 4% pr formldehyde로처리하여파라핀블록을만들고슬라이스하여 hemtoxylin-eosin 염색을실시하였다 (Fig. 2). Fig. 2B의 EtOH군의간조직에서는 periportl region 의 mcrostetosis와 microstetosis가관찰되었으며, neutrophil과함께주변세포의변성이나타난 focl necrosis가관찰되었다. 그러나 EtOH-AK2군 (Fig. 2C) 과

알코올성간손상에대한신선초추출물의효과 1395 A B 4 C D Mlondildehyde (mm/mg protein). 3 2 1 c c Control EtOH EtOH+AK2 EtOH+AK Fig. 2. Histopthologicl exmintion of mouse liver fed liquid diet with ethnol or ethnol plus A.

keiskei extrct, (D) EtOH- AK group: ethnol mice supplied with mg/kg BW/d of A. keiskei extrct (hemtoxylin & eosin stining). EtOH-AK군 (Fig. 2D) 에서는 Control군 (Fig.

과량의 ROS는세포막에존재하는다가불포화지방산 (polyunsturted ftty cid) 과반응하여과산화지질을형성하게되는데, 이것의최종산물인 MDA는산화적스트레스의지표로사용된다 (2). 본연구에서 6주간신선초추출물의공급이간조직내항산화효소에미친영향은 Tle 4와같다.

Effects of Angelic keiskei Extrct on MDA contents in ethnol-induced mouse liver. Dt express the men±se. Different letters (-c) ove the rs re significntly different (P<.5).

5 알코올성간손상에대한신선초추출물의효과 1395 A B 4 C D Mlondildehyde (mm/mg protein) c c Control EtOH EtOH+AK2 EtOH+AK Fig. 2. Histopthologicl exmintion of mouse liver fed liquid diet with ethnol or ethnol plus A. keiskei extrct, compred to Control group. (A) Control group: non-treted mice, (B) EtOH group: ethnol-treted mice, (C) EtOH-AK2 group: ethnol mice supplied with 2 mg/kg BW/d of A. keiskei extrct, (D) EtOH- AK group: ethnol mice supplied with mg/kg BW/d of A. keiskei extrct (hemtoxylin & eosin stining). EtOH-AK군 (Fig. 2D) 에서는 Control군 (Fig. 2A) 과같이염증, 괴사, stetosis 등의특별한병변이관찰되지않았다. 항산화효소및 MDA의변화알코올유도된산화적스트레스는 ROS를생성하고이들은간세포내의 SOD, GSH 등항산화효소에의한항산화방어계를무너뜨려세포내항산화능을고갈시킨다 (7,18). 과량의 ROS는세포막에존재하는다가불포화지방산 (polyunsturted ftty cid) 과반응하여과산화지질을형성하게되는데, 이것의최종산물인 MDA는산화적스트레스의지표로사용된다 (2). 본연구에서 6주간신선초추출물의공급이간조직내항산화효소에미친영향은 Tle 4와같다. EtOH군은 Control군보다 CAT, GST, GPx, GR 활성이유의적으로낮아졌으나, SOD(inhiition rte%) 는유의적으로상승하였다. 신선초투여군인 EtOH-AK2군과 EtOH-AK군에서다시상승하는경향을보였다. 특히저농도인 EtOH-AK2군에서 CAT, GPx, GR 활성이 EtOH Fig. 3. Effects of Angelic keiskei Extrct on MDA contents in ethnol-induced mouse liver. Dt express the men±se. Different letters (-c) ove the rs re significntly different (P<.5). Control: non-treted mice, EtOH: ethnol-treted mice, EtOH-AK2: ethnol mice supplied with 2 mg/kg BW/d of A. keiskei extrct, EtOH-AK: ethnol mice supplied with mg/kg BW/d of A. keiskei extrct. 군보다유의적으로증가하였다 (P<.5). 간조직에서 MDA 생성역시항산화효소의변화와일치하는결과를보였는데 (Fig. 3), EtOH군은 Control군에비해유의적으로과산화지질이증가하였으며, 신선초급여군중특히 EtOH+AK2 군에서유의적인감소를보였다 (P<.5). 알코올급여마우스간에서 CYP2E1 발현과활성의검토앞선결과에서와같이알코올에의해유도된산화적스트레스에대한신선초추출물의효과에대한기전을이해하기위하여간조직에서 CYP2E1의발현과효소활성을측정하였다. CYP2E1은에탄올을아세트알데히드로전환하는효소로알코올섭취시그발현과활성이유도되며 (2), 과량의 ROS를발생시키는결과를초래하여세포내효소적, 비효소적항산화제의억제와고갈을유도하게된다 (2,4,19-21). Fig. 4A에서와같이 CYP2E1의단백질발현은 EtOH군에서 Control군보다증가하였으며 EtOH+AK2군에서 Control 군수준으로감소하는것을볼수있었다. CYP2E1 효소활성에서도발현과유사한결과를보였는데 EtOH군에서 CYP2E1의활성은 2배정도유의적으로높아졌으나 EtOH +AK2군에서다시유의적감소했다 (P<.5). Tle 4. Effects of orl dministrtion of Angelic keiskei Koidzumi on enzymtic ntioxidnt ctivities of mice in chronic lcohol exposure Group 2) Control EtOH EtOH+2 EtOH+ SOD1) (Inhiition rte%) 77.82±2.21 3) 83.92± ± ±1.65 CAT.9± ±.53 c 9.22± ±.3 GST.7±.3.56±.2.66±.4.69±.5 GPx 7.7± ± ± ±.19 GR 12.96±1.36.± ± ±.62 Vlues re expressed s men±se of mice. 1) SOD: superoxide dismutse, CAT: ctlse, GST: glutthione-s-trnsferse, GPx: glutthione peroxidse, GR: glutthione reductse. 2) Refers to Tle 2. 3) Vlues with different letters in column re significntly different (P<.5).

1396 이정윤 안연주 김지원 최효경 이유현 A β-ctin 요 약 B 4-Nitroctechol (μmol/μg protein) 3 2 CYP2E1 EtOH - + + + AK - - 2 c Control EtOH EtOH+AK2 EtOH+AK Fig. 4. Effects of Angelic keiskei on protein expression nd enzyme ctivity of CYP2E1 in ethnol-induced mouse liver.

6 1396 이정윤 안연주 김지원 최효경 이유현 A β-ctin 요 약 B 4-Nitroctechol (μmol/μg protein) 3 2 CYP2E1 EtOH AK c Control EtOH EtOH+AK2 EtOH+AK Fig. 4. Effects of Angelic keiskei on protein expression nd enzyme ctivity of CYP2E1 in ethnol-induced mouse liver. (A) Western lot nlysis of CYP2E1 in ethnol-induced mouse liver, (B) p-nitrophenol ssy for CYP2E1 enzyme ctivity in ethnol-induced mouse liver. Dt express the men±se. Different letters (-c) ove the rs re significntly different (P<.5). Control: non-treted mice, EtOH: ethnol-treted mice, EtOH- AK2: ethnol mice supplied with 2 mg/kg BW/d of A. keiskei extrct, EtOH-AK: ethnol mice supplied with mg/kg BW/d of A. keiskei extrct. 본연구에서 in vitro 및 in vivo에서알코올유도된간손상에대하여신선초추출물의보호효과를검토하였다. 여러연구자의신선초잎추출물에관한연구에서 hyperoside 등의 quercetin 유도체를비롯하여 () luteolin, protoctechuic cid 등이있으며 (8), 그외에도다양한페놀성화합물과 chlcone(22) 등의분리가보고되었다. 알코올성간세포손상의주요인자인산화적스트레스에대한보호효과는페놀성화합물 (14) 및 chlcone이보고된바있으며 (23), flvonoid인 luteolin은만성적알코올급여마우스에서간손상을완화시키는것으로보고되었고 (24), hyperoside의아세트아미노펜유도간손상에대한효과도보고된바있다 (25). 최근연구에서감태의 polyphenol이 CYP2E1 효소활성을억제하고, 이영향으로 ROS의생성이연쇄적으로억제된다는보고 (26) 와 chlcone 계열의물질이 CYP 2E1 효소활성을저해한다는보고 (27) 가있었으며, 신선초추출물에포함된 polyphenol과 chlcone 계열물질등의효과로 CYP2E1의발현및활성이억제되고 (Fig. 4), 그에따라 ROS의생성도줄어드는한편, 발생한 ROS에대한보호효과를확인할수있었다 (Tle 4) 고생각한다. 단지고농도보다저농도에서효과적인결과를보였으며, 이것은추출물에함유된다른성분들에의한영향이라고생각한다. 그러므로앞으로의연구에서는신선초농도별효과에대한검토및예상되는단일물의효과검토가필요하다고생각한다. 본연구에서는다양한약리활성및항산화활성이높다고보고된신선초추출물을대상으로 in vitro 및 in vivo계에서알코올성간세포손상을유도하여그효과를검토하였다. 알코올산화효소인 cytochrome P452E1(CYP2E1) 이과발현된 HepG2 세포에서 2 mm의알코올과신선초추출물을투여하였을때농도의존적으로세포생존률및 ctlse(cat) 활성이증가하였다. In vitro에서신선초추출물의보호효과를확인한후 7주령의 C57BL/6J 마우스에알코올과신선초추출물 2, mg/kg BW/d를급여한결과혈중 ALT, AST, GGT의농도는대조군보다유의적으로증가한알코올군에비해신선초추출물을급여한군에서유의적감소했음을확인할수있었다. 그뿐만아니라알코올투여로세포변성과지방구가보이는간조직의변화가신선초투여로의해대조군과유사하게관찰되었다. 항산화효소의변화와지질과산화수준은대조군보다알코올군이유의적증가했으며, 신선초추출물급여군에서감소하는결과를보였고, 특히신선초 2 mg/kg BW/d로급여한군에서 CAT, glutthione peroxidse, glutthione reductse, mlondildehyde(mda) 등의유의적감소를보였다. 이같은변화를매개했다고생각되는 CYP2E1의발현과활성은대조군보다알코올투여군에서유의적으로상승하였으며, 특히항산화효소와 MDA 함량에서유의적감소했던 2 mg/kg BW/d의신선초투여군에서유의적감소하는것으로나타났다. 그러므로이는신선초추출물에함유된 luteolin, quercetin, chlcone 화합물등의성분에의해알코올유도산화적스트레스가감소하였다고생각되며, 신선초추출물은알코올대사과정에서산화적스트레스를억제하여간보호효과가있을것으로생각한다. REFERENCES 1. Lee SY, Lee SM, Prk JH, Lee MS The study of drinking ehviors, helth sttus nd mentl helth service -Hevy drinker who hve visited emergency center of pulic hospitl in Seoul. The Mentl Helth 3: Co YW, Jing Y, Zhng DY, Zhng XJ, Hu YJ, Li P, Su H, Wn JB The heptoprotective effect of queous extrcts of Penthorum chinense Pursh ginst cute lcohol-induced liver injury is ssocited with meliorting heptic stetosis nd reducing oxidtive stress. Food Funct 6: You Y, Yoo S, Yoon HG, Prk J, Lee YH, Kim S, Oh KT, Lee J, Cho HY, Jun W. 2. In vitro nd in vivo heptoprotective effects of the queous extrct from Trxcum officinle (dndelion) root ginst lcohol-induced oxidtive stress. Food Chem Toxicol 48: Veermchneni S, Ausmn LM, Choi SW, Russell RM, Wng XD. 28. High dose lycopene supplementtion increses heptic cytochrome P452E1 protein nd inflmmtion in lcohol-fed rts. J Nutr 138: Lee YH, Lee J, Im EJ, Jun W, Cho HY. 29. Modultion

7 알코올성간손상에대한신선초추출물의효과 1397 of ethnol-induced P45 enzyme ctivities nd ntioxidnts in mice y Hordeum vulgre extrct. J Koren Soc Food Sci Nutr 38: Jin DC, Jeong SW, Prk PS. 2. Effects of green te extrct on cute ethnol-induced heptotoxicity in rts. J Koren Soc Food Sci Nutr 39: Yu KH, Lee SY, Yng HM, Hm YA, Lee SU, Che SW, Lee YJ Effect of fermented wter extrcts from Ligulri fischeri on heptotoxicity induced y D-glctosmine in rts. J Koren Soc Food Sci Nutr 44: Jo HW, Prk JC. 28. Phenolic compounds isolted from the leves of Angelic keiskei showing DPPH rdicl scvenging effect. Kor J Phrmcogn 39: Jung HK, Prk PS, Huh NC, Kim SO, Kim KS, Lee MY Inhiitory effect of Angelic keiskei Koidz green juice on the liver dmge in CCl 4-treted rts. J Koren Soc Food Sci Nutr 27: Choe KH, Choe SN, Choo JJ, Lee JY, Kim JY, Kim JW, Choi JS, Prk KS, Prk KH. 27. Tissue concentrtion of quercetin, isoquercitrin nd hyperoside, nd lipid profile chnges following 8-week feeding of Angelic keiskei powder in rts. Koren J Food Sci Technol 39: Jeong YJ, Nm MK, Kng KJ The effect of Angelic keiskei ethnol extrct on prolifertion, potosis, nd ROS ccumultion in humn rest cncer MDA-MB-231 cells. J Est Asin Soc Diet Life 21: Kim MJ, Lim SW, Ahn HJ, Jun J, Kng MJ Effect of fruit-vegetle juices contining Angelic keiskei on lcohol metolizing enzyme ctivities in vitro. KSBB J 31: Noh HM, Ahn EM, Yun JM, Cho BL, Pek YJ Angelic keiskei Koidzumi extrcts improve some mrkers of liver function in hitul lcohol drinkers: rndomized doule-lind clinicl tril. J Med Food 18: Lee YH, Ho JN, Dong MS, Prk CH, Kim HK, Hong B, Shin DH, Cho HY. 25. Trnsfected HepG2 cells for evlution of ctechin effects on lcohol-induced CYP2E1 cytotoxicity. J Microiol Biotechnol 15: Aei H Ctlse in vitro. Methods Enzymol 5: Bk MJ, Truong VL, Ko SY, Nguyen XN, Ingksuprt P, Jun M, Shin JY, Jeong WS Antioxidnt nd heptoprotective effects of procynidins from wild grpe (Vitis murensis) seeds in ethnol-induced cells nd rts. Int J Mol Sci doi:.339/ijms Qin ZJ, Zhng C, Li YX, Je JY, Kim SK, Jung WK Protective effects of emodin nd chrysophnol isolted from mrine fungus Aspergillus sp. on ethnol-induced toxicity in HepG2/CYP2E1 cells. J Evidence-Bsed Complementry Altern Med doi:.1155/211/ Choi K, Kim BI, Cho YK, Prk CY, Sohn JI, Jeon WK, Kim H, Chung ES, Keum DG, Lee HY, Lee SJ Dignostic usefulness of serum γ-glutmyl trnsferse (GGT) ctivity in ftty liver nd reltionship with other fctors. Koren J Med 57: Ngt J, Morino T, Sito M. 27. Effects of dietry Angelic keiskei on serum nd liver lipid profiles, nd ody ft ccumultions in rts. J Nutr Sci Vitminol 53: Xu Y, Leo MA, Lieer CS. 23. Lycopene ttenutes rchidonic cid toxicity in HepG2 cells overexpressing CYP2E1. Biochem Biophys Res Commun 33: Stice CP, Liu C, Aizw K, Greenerg AS, Ausmn LM, Wng XD Dietry tomto powder inhiits lcohol-induced heptic injury y suppressing cytochrome p45 2E1 induction in rodent models. Arch Biochem Biophys 572: Chng HR, Lee HJ, Ryu JH Chlcones from Angelic keiskei ttenute the inflmmtory responses y suppressing nucler trnsloction of NF-κB. J Med Food 17: Ajioye TO Lophirones B nd C ttenute cetminophen-induced liver dmge in mice: studies on heptic, oxidtive stress nd inflmmtory iomrkers. J Biochem Mol Toxicol doi:.2/jt Liu G, Zhng Y, Liu C, Xu D, Zhng R, Cheng Y, Pn Y, Hung C, Chen Y Luteolin llevites lcoholic liver disese induced y chronic nd inge ethnol feeding in mice. J Nutr 144: Xie W, Jing Z, Wng J, Zhng X, Melzig MF Protective effect of hyperoside ginst cetminophen (APAP) induced liver injury through enhncement of APAP clernce. Chem Biol Interct 246: Ymshit H, Goto M, Mtsui-Yus I, Kojim-Yus A Eckloni cv polyphenol hs protective effect ginst ethnol-induced liver injury in cyclic AMP-dependent mnner. Mr Drugs 13: He W, Wu JJ, Ning J, Hou J, Xin H, He YQ, Ge GB, Xu W Inhiition of humn cytochrome P45 enzymes y licochlcone A, nturlly occurring constituent of licorice. Toxicol In Vitro 29:

Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No μ μ

Journal of Life Science 2011 Vol. 21. No. 8. 1120~1126 ISSN : 1225-9918 DOI : http://dx.doi.org/10.5352/jls.2011.21.8.1120 μ μ μ α β Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No. 8 1121 μ μ 1122 생명과학회지 2011,