04 (08-13-OK).hwp

Size: px

Start display at page:

Download "04 (08-13-OK).hwp"

원배 자
5 years ago
Views:

1 J Koren Soc Food Sci Nutr 한국식품영양과학회지 43(2), 827~834(204) 천년초선인장줄기에탄올추출물의 HT-29 대장암세포증식저해효과 박수영 김영아 2 이선영 충남대학교생활과학대학식품영양학과 2 충남대학교산학협력선도대학육성사업단 Antiprolifertive Effect of Opunti humifus Ethnol Extrct on Humn rcinom HT-29 ells Soo Young Prk, Young A Kim 2, nd Sun Yung Ly Deprtment of Food nd Nutrition nd 2 Leders in Industry University oopertion, hungnm Ntionl University ABSTRAT olon cncer is the third highest cuse of deth in Kore. Known dietry cuses of colon cncer include diet rich in ft nd red met s well s indequte intke of dietry fier, fruits, nd vegetles. Therefore, recent reserch hs focused on the nticncer effects of nturl products. Opunti humifus is type of prickly per tht is known to contin iologiclly ctive compounds tht cn e used in the tretment of dietes mellitus, rteriosclerosis, nd hyperglycemi. The im of this study ws to determine whether or not O. humifus extrct ffects prolifertion, cell deth, nd DNA frgmenttion in humn crcinom HT-29 cells. O. humifus is rich in crohydrtes, minerls (Mg, K, nd ), nd totl phenolics. HT-29 cells were treted with extrcts of O. humifus t concentrtions of 0, 0.25, 0.5,, nd 2 mg/ml for 24 or 48 hours. O. humifus extrcts inhiited HT-29 cell growth in dose-dependent mnner. Hoechst 33342/PI doule stining nd omet ssy were performed to oserve chnges in nuclei of cncer cells undergoing cell deth. The results of oth tests showed tht O. humifus extrct induced cell shrinkge, DNA frgmenttion, nd chromtin condenstion dose-dependently in HT-29 cells. The results of this study suggest tht O. humifus extrct inhiits the growth of HT-29 vi induction of DNA frgmenttion nd chromtin condenstion. Key words: Opunti humifus, HT-29 cell, ntiprolifertive effect 서 대장암은세계적으로암의사망원인중 3위를차지하고있고특히미국, 유럽등지에서발병률이더높은데이는육류위주의식단을즐기는서구사회의식습관에의한것으로알려져있다 (). 최근우리나라의사망원인통계를보면대장암은폐암, 간암, 위암다음으로사망률이높은암으로나타나며그발병률또한 2002년 5.% 에서 20년 7.7% 로꾸준히증가하는추세에있다 (2). 대장암은유전요인보다는식이요인과밀접한관계를가지고있는것으로알려져있는데식사시식이섬유를적게섭취하고고지방육류를많이섭취하면대변의양이적고내용물이대장을통과하는시간이증가한다 (3). 또한담즙산과스테롤의분비가증가하여흡수되지않은담즙산은혐기성박테리아에의해대사되어발암물질로변화한다 (4). 이렇게대장암과식이요인간의 Received 2 August 204; Accepted 5 Septemer 204 orresponding uthor: Sun Yung Ly, Deprtment of Food nd Nutrition, hungnm Ntionl University, Dejeon , Kore E-mil: sunly@cnu.c.kr, Phone: 론 상관성이높은특성을고려하여식품중항암효과를보이는천연물질을섭취함으로써암을예방하고관리하고자하는욕구는지속적으로증대되어왔으며최근한국에서도관련연구가활발히진행되고있다. 손바닥선인장은건생식물로서주로건조기후또는반건조기후에서잘자라나뛰어난환경적응력으로인하여미국, 지중해, 아프리카, 중동, 호주, 인도, 한국등의다양한기후에서도 (5) 생육하고있다. 국내에는내륙지방에서재배되고있는천년초 (Opunti humifus; O. humifus) 와제주도의백년초 (Opunti ficus-indic vr. soten) 가식용으로이용되고있다. 이중천년초는작은솜털가시를가지며 -20 의겨울에도노지에서생장하는강인한생존력을가지고있다 (6). 또한천년초에는플라보노이드계열의 isorhmnetin, kempferol, quercetin, txifolin 등이존재하며 (7) 특히천년초에서분리한 txifolin이 α-tocopherol보다항산화능이더우수하다고보고되었다 (8). 최근연구에따르면천년초의 MF-7 유방암세포증식억제효과 (9), 간손상예방효과 (0), 3T3-L 세포에서지질축적감소 (), 기타항암, 항산화 (2) 등이보고되고있으나아직천년초의

2 828 박수영 김영아 이선영 대장암세포활성억제에대한연구는거의없는실정이다. 따라서본연구에서는천년초의일반성분을분석하고에탄올이나메탄올, 열수추출물중유효한효능을보이는추출물에대하여인체유래대장암세포인 HT-29 cell에미치는영향을평가하고천년초의대장암관련기능성식품의개발에대한기초적연구자료로활용하고자하였다. 재료및방법시험재료본연구에사용된시험재료는전남무안군의한농가로부터구입한 8년생천년초선인장줄기로서물로수세하고가시를제거한뒤동결건조와분쇄를거쳐성분분석및추출대상시료로사용하였다. 시료의알코올추출은시료량의 0배의 70% 에탄올이나메탄올을가하여상온에서 24시간동안교반하면서 3회반복추출하였다. 열수추출물은 00 에서 3시간동안 3회반복하여추출하였다. 추출액은여과지 (Whtmn No. 2, Advntec, Tokyo, Jpn) 를사용하여여과한뒤 40 rotry vcuum evportor(eyel, Tokyo, JAPAN) 에서감압농축하였다. 추출한분말은 -20 냉동고에서보관하면서실험에사용하였다. 시료의일반성분분석적외선수분측정기 (US/Retriever 50, Shinhn Scientific, Seoul, Kore) 를이용하여천년초선인장줄기동결건조분말시료의수분함량을측정하였으며 600 의회화로에서건식회화법으로조회분을측정하였다. 조단백분석은 micro-kjeldhl 법으로측정하였으며조지방함량은 Soxhlet법을이용하여측정하였다. 탄수화물함량을나타내는가용성무질소물 (nitrogen-free extrcts, NFE) 함량은공식, 00-( 수분 + 조회분 + 조단백 + 조지방 + 조섬유 ) 에의하여산출하였다. 무기질분석은시료를 microwve digestion system에서습식회화하여 Inductively oupled Plsm-Atomic Emission Spectrometer(IP-AES, Optim 3300DV, Perkin-Elmer Instruments, Snt lr, A, USA) 로측정하였다. 시료의총당함량은 phenol-h 2SO 4 법으로측정하였다. 총페놀함량은증류수로 80배희석한메탄올추출시료에 2 N Folin-Denis 용액 00 μl를넣고혼합한후 3분간방치하고 20% N 2O μl 가한뒤암실에서 2시간동안반응시켜 765 nm에서흡광도를측정하였다. 세포배양및세포증식인체유래대장암 HT-29 세포 (humn colon denocrcinom) 와 murine predipocyte인 3T3-L 세포는 Americn Type ulture ollection(at, Rockville, VA, USA) 에서구입하여사용하였다. 세포는 0% fetl ovine serum(fbs; Hylone Inc., Logn, UT, USA), 0% ovine clf serum(bs; Gico Lortories, Grnd Islnd, NY, USA) 과 % penicillin-streptomycin(ps; Gico Lortories) 을포함하는 Dulecco's modified Egle's medium(dmem, Gico Lortories) 배지를사용하여 37, 5% O 2 조건에서배양하였다. 세포는 75 cm 2 cell culture flsk(spl Life Science, Pocheon, Kore) 에서배양하였으며세포밀도가 70 80% 정도되는시점에 phosphtte uffered sline solution(pbs; Sigm hemicl o., St. Louis, MO, USA) 으로세척하고 trypsin ethylene-dimine-tetrcetic cid(edta; Sigm hemicl o.) 를처리하여세포를부유시킨뒤새로운 flsk 에계대배양을하면서실험에사용하였다. 천년초선인장줄기추출물은 dimethyl sulfoxide(dmso) 에녹여배양액에처리하였으며 HT-29 세포의증식에미치는영향을평가하기위하여 wter solule tetrzolium(wst) 을이용한 cell vile ssy kit(deil L Service, Seoul, Kore) 를사용하여세포생존율을측정하였다. Hoechst & PI 염색천년초선인장줄기추출물의처리에따른 HT-29 세포의핵을관찰하기위해 Hoechst & PI(propidium iodide; Sigm hemicl o.) doule stining을실시하였다. HT-29 세포를 24 well plte에 cells/well로분주하여 24시간배양한후천년초선인장줄기추출물시료를 0, 0.25, 0.5,, 2 mg/ml의농도로 48시간동안처리하였다. 이후 PBS에녹인 Hoechst 33342(Sigm hemicl o.) 로암실에서 25분동안염색하고다시 PBS에녹인 PI로 5분동안추가염색하였다. 배양액내각염료의최종농도는 2 μg/ml이었다. 염색이끝난후바로 200배율의형광현미경 (Olympus, Tokyo, Jpn) 하에서관찰하였다. omet ssy 에의한세포 DNA 손상 omet ssy를위하여농도별로처리한세포를 75 μl의 0.7% low melting grose gel(lm; Sigm hemicl o.) 과섞은후, 0.5% norml melting grose(nma; Sigm hemicl o.) 가미리코팅된슬라이드위에현탁액이골고루분산되게한다음 cover glss로덮어 4 냉장고에보관하였다. Gel이굳으면 cover glss 로벗기고그위에다시 0.7% LMA 용액한겹더덮었다. 미리준비해둔차가운 lkli-lysis uffer(ph 0.0) 에 % Triton X-00(Sigm hemicl o.) 을사용직전에섞은후여기에슬라이드를담가저온암실에서 시간동안침지시켜 DNA의 doule strnd를풀어주었다. Lysis가끝난후슬라이드를 electophoresis tnk에배열하고 4 의차가운전기영동 uffer를채워 40분동안 unwinding 시켜 DNA의 lkli-lile sites가드러나게한후 25 V/300 ma의전압을걸어 20분간전기영동을실시하였다. 전기영동이끝난후 0.4 M tris uffer에 5분씩담가세척하는과정을 3회반복하여슬라이

3 천년초의대장암세포증식저해효과 829 드를건조시켰다. Ethidium romide(sigm hemicl o.) 로슬라이드위의핵을형광염색하여 cover glss로엎은뒤형광현미경상에서관찰하였다. 세포핵의 imge는 softwre Komet 5.5 imge nlyzing system(kinetic Imging, Liverpool, UK) 을이용하여분석하였다. 세포내 DNA 분절은핵으로부터이동해서꼬리부분으로떨어져나간꼬리부분의 DNA%(til DNA), til length(tl) 그리고 til 내 DNA% 와 til length(tl) 로부터산출된 til moment (TM) 를측정하여나타내었다. 통계처리실험결과는 SPSS/Windows 20.0(hicgo, IL, USA) 을이용하여통계처리하였고, 평균값과표준편차를구하였다. 군간의평균값의차이를검증하기위하여일원배치분산분석 (one-wy ANOVA) 을한후, Duncn's multiple rnge test로변인간의차이를검증하였다. 모든통계적인유의성은 α=0.05 수준에서검증하였다. Tle. Proximte composition of lyophilized Opunti humifus stem omponents % (w/w) (dry sis) Moisture rude sh rude protein rude ft rude fier Totl sugr Nitrogen-free extrcts ) Mens±SD (n=3). 결과및고찰 수율및일반성분각추출물의수율은에탄올추출시 8.8%, 메탄올추출시 3.0%, 열수추출시 55.0% 로열수추출물의수율이월등히높았으며열수추출물의수율은 Lee 등 (3) 의연구결과와유사한경향이었으나에탄올추출물의수율 (30.24%) 은다소낮았다. 천년초선인장줄기의동결분말의일반성분을분석한결과는 Tle 과같다. 수분함량은 4.62%, 조회분함량은 7.278%, 조단백과조지방은각각 2.358% 와.354% 였다. 특히조섬유 (6.83%), 가용성무질소물 ( %), 총당 (24.250%) 의함량이높아탄수화물을많이포함하고있는것을알수있다. 천년초의성분분석치는연구팀에따라다르게보고되고있는데, 충남아산에서재배한천년초줄기의성분을분석한연구 (4) 에서는조회분 7.20%, 조단백 2.75%, 조지방 3.53%, 조섬유 8.04%, 가용성무질소물 58.24% 로본연구보다가용성무질소물을제외한모든성분의함량이높았으며, 전남여수에서재배한천년초줄기의성분을분석한다른연구 (5) 에서는수분 5.82%, 조회분 2.40%, 조단백 5.43%, 조지방.69%, 조섬유 4.05%, 가 4.62±0.86 ) 7.278± ± ± ± ± ±0.565 용성무질소물 7.95% 로조회분함량을제외한성분에서가장비슷한구성비를보였다. 손바닥선인장속은성장할수록조단백질, 조섬유, 조회분의함량이감소하고산성도, 카로틴, 총탄수화물이증가하는것으로보고된점으로보아 (6), 각연구에서의성분차이는천년초처리및분석방법의차이외에천년초의생육기간, 재배지역에따른일조량, 토양의구성비, 기후, 재배방법, 재배연도, 수확시기등에따른차이로판단된다. 무기질함량유도결합플라즈마분광광도계로천년초선인장줄기분말에대한무기질함량을측정한결과는 Tle 2와같다. 무기질함량은마그네슘이 mg/g으로가장함량이높았고이어칼륨 mg/g, 칼슘 mg/g 순이었다. 천년초선인장줄기분말의무기질을분석한 Jung 등 (5) 과 Yoon 등 (4) 의연구에서마그네슘함량은각각 mg/g,,0.86 mg/g으로보고되어함량의차이는있지만마그네슘과칼슘등의양이온이풍부하고 K 대비 N의비율 (0.97:) 이나 대비 P의비율 (5.40:) 이매우낮아건강에도움이될수있는무기물조성을보이고있었다. 총폴리페놀함량페놀성화합물은식물체가자외선에의한산화나자동산화로부터자신을보호하기위하여생성한 2차대사산물의하나로서다양한구조와분자량을가지며플라보노이드와탄닌이주성분이다. 이들은 phenolic hydroxyl(oh) 을가지기때문에단백질및기타거대분자들과쉽게결합하는성질을가지며항산화, 항암등의다양한생리활성을가진다 (7). 총폴리페놀함량은 Tle 3에나타내었다. 폴리페놀함량은메탄올추출물에서 2.330%, 에탄올추출물에서 2.259% 이었으며열수추출물에서는거의검출되지않았다. Hn 등 (8) 은천년초줄기의총폴리페놀함량으로 2.93% 라고보고하여본연구결과와유사한결과를보여주었다. 또한천년초의총폴리페놀함량은백년초추출물의함량 (0.8%) 에비하여 0배이상높은것으로보고되고있으며 (9) 이로인한항산화기능성이많은연구에서검증되고있다 (8,,20). Tle 2. Minerl contents of lyophilized Opunti humifus stem Minerl Mg K P N Zn Mn Fe u oncentrtions (mg/g) (dry sis)

4 830 박수영 김영아 이선영 Tle 3. Totl polyphenol contents of lyophilized Opunti humifus stem Extrcts ) oncentrtions (%, w/w) OM OE OW 2.330± ) 2.259± ) OM: O. humifus methnol extrct, OE: O. humifus ethnol extrct, OW: O. humifus wter extrct. 2) Mens±SD (n=3). 세포생존율측정 세포생존율을측정한결과는 Fig. 에나타내었다. HT- 29 세포에각추출물을 mg/ml의농도로처리한결과에탄올추출물은 48시간처리후에세포생존율이유의하게낮아졌으며농도의존적인결과를보여주었다. 메탄올추출물은 24시간배양후부터세포생존율이낮아지기시작하였으나 48시간후에처리농도에따른차이가보이기시작하였으며농도의존적인효과는에탄올추출물에서더욱확실하게나타났다. 반면열수추출물은 2 mg/ml의농도에서만유의한차이를보였으며그효과도상당히미미하였다. 따라서천년초줄기의건조분말시료는 70% 알코올추출에서만인체유래대장암세포인 HT-29 세포의생장을저해시키는것으로보이며암세포의증식억제효과는에탄올추출물이메탄올추출물에비해농도의존적으로더확실하게나타나는것으로판정되었다. 선행연구를통하여손바닥선인장의폴리페놀성분으로는 isorhmnetin, quercetin, kempferol, txifenol 등이알려져있으며 (7), 그중하 나인 isorhmnetin은인체대장암세포주인 HT-6에서세포사멸과세포괴사를유도하고세포주기중 G2/M기의 checkpoints에작용하여세포증식을억제하는것으로보고되었다 (2). 그외에도손바닥선인장류인 Opunti roust Gvi나 Opunti violcee Mordillo가 co-2 cell이나 P-3 prostte cncer cell의세포성장을억제하였다는연구 (22) 가있어손바닥선인장들에대한연구가좀더진행된다면다양한암세포에작용하는항암효능으로인하여 neutrceuticls로서의가치를창출할수있을것으로기대된다. 본연구결과로얻어진천년초줄기분말추출물의대장암세포증식억제능은세균 (Streptomyces peucetius) 에서분리된항생제로서, 각종암치료에보편적으로사용되어온항암제, doxoruicin의효능에비하여약 배활성이낮았다. Doxoruicin은역전사효소및 RNA 중합효소작용억제뿐아니라세포 DNA에결합하는유전자독성의특성을갖고있어 poptosis를유발하는것으로알려져있다 (23). 선행연구에의하면 HT-29 세포에 doxoruicin μg/ml를 48시간동안처리하였을때의세포생존율이본연구에서천년초 70% 에탄올추출물을 250 μg/ml를처리하였을시와비슷하게나타났다 (24). 그러나천연식품인오미자열수추출물을 mg/ml의농도로 HT-29 세포에처리하였을때세포사멸률이 0% 에불과하였으며, 2 mg/ml 의농도에서 70%, 4 mg/ml에서 88% 였던연구결과 (25) 에비교하면천년초추출물이오미자추출물에비해약 3배이상의활성을보이므로식품으로서는우수한자원으로볼수 A mg/ml 0.5 mg/ml mg/ml 2 mg/ml d c c B mg/ml 0.5 mg/ml mg/ml 2 mg/ml c dy 0 dy dy 2 0 dy 0 dy dy mg/ml 0.5 mg/ml mg/ml 2 mg/ml dy 0 dy dy 2 c Fig.. Inhiitory effect of extrcts from Opunti humifus stem on the growth of HT-29 cells. ells were treted with 70% ethnol extrct (A), 70% methnol extrct (B), nd hot wter extrct () of lyophilized O. humifus stem. Ech r represents the men±sd (n=3). Treted cells were estimted y the WST ssy. Vlues with different letters re significntly different (P<0.05) mong the tretments y Duncn's multiple rnge test.

천년초의대장암세포증식저해효과 83.4.2 0.8 0.25mg/mL 0.5 mg/ml mg/ml 2 mg/ml 하여이농도범위에서다음실험을진행하였다.

Fig. 2. Inhiitory effect of extrcts from Opunti humifus stem on the growth of murine predipocyte 3T3-L cell line. ells were treted with 70% ethnol extrct of lyophilized O.

05) y Duncn's multiple rnge test. 있다. 이와같은결과를얻었기에항암기전과관련한이후의실험은에탄올추출물을중심으로진행하였다.

5,, 2 mg/ml의농도로처리하였을때흡광도값은 dy, 2 모두대조군에비하여시료처치군에서유의하게낮아지지않았다. 따라서천년초 70% 에탄올추출물은 0.

33342 & PI 염색을실시하였다. Hoechst 계열의염색약은 DNA에특이적으로결합하여 350 nm의자외선파장으로부터자극을받으면푸른색의형광빛을분출하며이중에틸기가하나더부착되어있어세포투과성이좋은 Hoechst 33342를본연구에서사용하였다.

파란색으로표시된부분이 Hoechst 33342로염색된생세포의핵으로서용매대조군은핵고유의둥근형태를유지하는반면천년초시료를처치한군은농도가증가할수록핵이손상되었으며세포질분리, chromtin 응축등이나타나는 poptotic ody가관찰되었다.

5 천년초의대장암세포증식저해효과 mg/mL 0.5 mg/ml mg/ml 2 mg/ml 하여이농도범위에서다음실험을진행하였다. 선행연구에의하면천년초선인장줄기의 ethyl cette 추출물이나물분획물은,000 μg/ml의농도에서 humn firolst BJ 세포의증식을저해하지않았고오히려 ethyl cette 추출물은세포증식을유도하였다고하였다 (26) dy 0 dy dy 2 Fig. 2. Inhiitory effect of extrcts from Opunti humifus stem on the growth of murine predipocyte 3T3-L cell line. ells were treted with 70% ethnol extrct of lyophilized O. humifus stem. Ech r represents the men±sd (n=3). Treted cells were estimted y the WST ssy. Vlues with different letters ove ech r re significntly different (P<0.05) y Duncn's multiple rnge test. 있다. 이와같은결과를얻었기에항암기전과관련한이후의실험은에탄올추출물을중심으로진행하였다. 독성평가천년초 70% 에탄올추출물이 HT-29 세포의성장을저해하는효과가독성에의한것인지를판단하기위해정상세포주인지방세포 (3T3-L) 에천년초에탄올추출물을처리하여 WST를이용한세포생존율을측정한결과를 Fig. 2에나타내었다. 천년초 70% 에탄올추출물을 3T3-L 세포에 0, 0.25, 0.5,, 2 mg/ml의농도로처리하였을때흡광도값은 dy, 2 모두대조군에비하여시료처치군에서유의하게낮아지지않았다. 따라서천년초 70% 에탄올추출물은 mg/ml의농도에서세포독성을유발하지않는것으로판단 Hoechst & PI 염색암세포증식억제효능평가시험에서시료를 48시간처치한군에서는유의하게세포증식이감소하는효과를나타내었으므로이시점에서천년초추출물의처리가인체유래대장암세포인 HT-29의핵에미치는영향을알아보고, 세포사멸의형태를확인하기위해 Hoechst & PI 염색을실시하였다. Hoechst 계열의염색약은 DNA에특이적으로결합하여 350 nm의자외선파장으로부터자극을받으면푸른색의형광빛을분출하며이중에틸기가하나더부착되어있어세포투과성이좋은 Hoechst 33342를본연구에서사용하였다. 반면 propidium iodide는생세포의표면을통과할수없고죽은세포의세포막을통과하여핵을염색하므로 Hoechst dye는살아있는세포의핵의형상을관찰, PI는죽은세포의비율을판단할수있다. HT-29 세포의핵을염색하여관찰한결과는 Fig. 3에나타내었다. 파란색으로표시된부분이 Hoechst 33342로염색된생세포의핵으로서용매대조군은핵고유의둥근형태를유지하는반면천년초시료를처치한군은농도가증가할수록핵이손상되었으며세포질분리, chromtin 응축등이나타나는 poptotic ody가관찰되었다. 이러한 poptotic ody는농도의존적으로증가하였으며, 최고처리농도인 2 mg/ml에서는그이하의농도에서거의보이지않았던 PI 염색세포가발견되어세포의죽음을확인할수있었다. 따라서천년초추출물은농도의존적으로 HT-29 세포의죽음을유도하는것으로사료된다. Opunti humifus (mg/ml) (0 mg/ml) 0.25 mg/ml 0.5 mg/ml mg/ml 2 mg/ml Hoechst PI Fig. 3. Photomicrogrphs of HT-29 humn colon denocrcinom cells treted with Opunti humifus nd stined with Hoechst & PI. HT-29 cells were treted with 70% ethnol extrct of O. humifus t 0, 0.25, 0.5,, 2 mg/ml nd incuted for 48 hours. ellulr DNA ws stined with Hoechst (2 μg/ml) t 37 for 25 min nd then with PI (2 μg/ml) for 5 min. After successive incution, the cells were exmined y fluorescence microscope t 200 mgnifiction.

832 박수영 김영아 이선영 A B D E Fig. 4. FAS nlysis of HT-29 cells treted with Opunti humifus extrct. ells were incuted with O. humifus extrct t concentrtion of 0 (A), 0.25 (B), 0.

6 832 박수영 김영아 이선영 A B D E Fig. 4. FAS nlysis of HT-29 cells treted with Opunti humifus extrct. ells were incuted with O. humifus extrct t concentrtion of 0 (A), 0.25 (B), 0.5 (), (D), 2 (E) mg/ml for 48 hours nd then stined with Annexin V & PI. Apoptotic cell deth (right window) nd nonpototic cell deth (left window) were mesured y FAS-sed quntifiction. Annexin V & PI doule stining 앞의결과에서 HT-29 세포에천년초추출물을처리하였을때세포증식억제, poptotic ody가보였으므로, 천년초의효능이 poptosis에의해기인한것인지확인하기위해 Annexin V & PI doule stining을실시하였다. Apoptosis가유도되면세포내부에존재하던 phosphtidylserine 이세포외부로노출되고여기에 Annexin V가결합하고세포의죽음이급진적으로진행될수록 PI만염색되는원리를이용하여 poptosis와 necrosis의유발정도를측정하게된다. 천년초에탄올추출물을농도별로처리한결과는 Fig. 4 에나타내었다. Annexin V & PI doule stining은천년초가 HT-29 세포의성장억제에미치는영향에대하여정확하게알아보고자 48시간배양하여결과를도출하였다. 시료처치후 48시간배양한결과는대조군에비하여 0.25 mg/ ml 처리한군에서 erly poptosis가유의하게증가하였고 (33.% vs 2.4%), 0.5 mg/ml 처리한군에서는 erly poptosis.3%, lte poptosis 26.5% 로증가하여대조군에비하여저농도시료처치군에서는전반적으로 poptosis의비율이증가하였으나고농도 ( 2 mg/ml) 로처리한군에서는 ded cell이 84.7%, 89.3% 나타나세포가세포사멸과정을거쳐세포괴사로진행된것으로추측되었다. DNA frgmenttion 인체유래대장암세포 HT-29에서천년초 70% 에탄올추출물이 DNA 손상을이끌어내어세포의손상이나증식억제를유도했는지를확인하기위해천년초를처리한결과를 Tle 4에나타내었다. 본실험결과 til-dna, tilmoment, til length은용매대조군에비해추출물을 과 2 mg/ml로처리한군에서유의하게증가하였다. 특히 2 mg/ml로처리한군은 til-dna, til length, til-moment 가 3.24배, 2.58배, 5.75배높았다. 이결과는앞서 Hoechst Tle 4. Levels of DNA dmge expressed s til-dna, til length nd til moment in HT-29 cells treted with Opunti humifus extrct Group Til-DNA (%) Til length (μm) Til moment ±2.857 )2) 5.560± ± ±8.755 c ±2.872 c ± ±8.962 c ± ± c ±3.878 c 5.394± ± ± ±3.63 c 3.020±.83 c ) Men±SD (n=3). 2) Men with different letters in column re significntly different mong groups y Duncn's multiple rnge test t α= & PI 염색을나타난형태학적인변화에있어농도의존적으로 poptic ody가증가하였던것과연관성이있으며, 천년초추출물이 HT-29 세포에있어세포사를일으킬수있는 DNA 분절현상을이끌면서암세포의성장이나증식을억제하는효과와연관된다고할수있다. 천년초줄기분말의추출물이인체유래대장암세포주에서항암효능을보이는지평가한결과열수추출물은거의효과가없었으나알코올추출물이세포증식을억제하였으며, 특히 70% 에탄올추출물의효과가농도의존적으로나타났다. 천년초줄기의에탄올추출물은 HT29 대장암세포의사멸을유도하였고 DNA frgmenttion의결과와함께대장암예방소재로활용가능할것으로사료되었다. 그러나천년초가대장암세포에미치는영향에대한기전을파악하기위해 poptosis나세포주기에대한영향등심도있는연구가좀더진행되어야할것이며, 나아가동물실험과인체시험을통해천년초의항암효능이안전성과함께입증되어야활용가치가높아질것이다. 요 천년초에탄올추출물이인체대장암세포 HT-29 의세포사 약

7 천년초의대장암세포증식저해효과 833 멸에미치는영향과기능성식품소재로서의가능성을시사하고자본연구를수행하였다. 연구내용은천년초의일반성분분석과천년초에탄올추출물의처리농도에따른인체대장암세포의증식과세포사멸현상을비교관찰하고항암효과의가능성을확인하고자하였다. 천년초분말의일반성분분석을진행한결과탄수화물의함량과마그네슘등의양이온의함량이높았고 N/K의비율과 P:의비율이매우낮았다. 천년초 70% 에탄올, 메탄올, 열수추출물을 0.25, 0.5,, 2 mg/ml의농도로 HT-29 세포에 48시간처리하고 WST를이용한세포생존율을측정한결과는모든군에서세포증식이억제되었으며 (P<0.05), 특히에탄올추출물이농도의존적으로유의한효능을보였다. Hoechst & PI로이중으로핵을염색해서세포사를관찰한결과시료농도가증가할수록 poptotic ody가증가하였으며, 특히 mg/ml의농도이상에서급격히증가하여 2 mg/ml에서는세포사를관찰할수있었다. Annexin V & PI doule stining을통하여저농도 ( mg/ml) 시료처치군에서는전반적으로 poptosis의비율이증가하였고고농도 ( 2 mg/ml) 로처리한군에서는 ded cell이 84.7%, 89.3% 나타나세포가세포사멸과정을거쳐세포괴사로진행된것으로추측되었다. 또한 comet ssy를통해용매대조군에비해 2 mg/ml 농도에서유의하게 DNA가분절되었음을확인하였다 (P<0.05). 따라서천년초에탄올추출물은인체유래대장암세포 HT-29의세포증식을억제하고항산화효과가있는것으로나타나천년초의항암가능성을보여주었으나, 확실한효과와기전을파악하기위하여심도있는연구가필요로된다. 감사의글 이연구는충남대학교학술연구비에의해지원되었음 REFERENES. hn DS, Lu R, Aune D, Vieir R, Greenwood D, Kmpmn E, Nort T. 20. Red nd processed met nd colorectl cncer incidence: met-nlysis of prospective studies. PLoS ONE 6: e Sttistics Kore Annul report on the cuse of deth sttistics in 20. Sttistics Kore, Dejeon, Kore. 3. Kushi LH, Byers T, Doyle, Bnder EV, Mcullough M, McTiernn A, Gnsler T, Andrews KS, Thun MJ Americn ncer Society Guidelines on Nutrition nd Physicl Activity for cncer prevention: reducing the risk of cncer with helthy food choices nd physicl ctivity. A ncer J lin 56: Bernstein H, Bernstein, Pyne M, Dvorkov K, Grewl H Bile cids s crcinogens in humn gstrointestinl cncers. Mutt Res 589: Feugng JM, Konrski P, Zou D, Stintzing F, Zou Nutritionl nd medicinl use of cctus per (Opunti spp.) cldodes nd fruits. Front Biosci : Lee KS, Kim MG, Lee KY Antimicroil effect of the extrcts of cctus hounnyouncho (Opunti humifus) ginst food orne pthogens. J Koren Soc Food Sci Nutr 33: Kim H, Prk SH Metolic profiling nd discrimintion of two ccti cultivted in Kore using HPL- ESI-MS nd multivrite sttisticl nlysis. J Koren Soc Appl Biol hem 52: Lee KS, Lee KY Biologicl ctivity of phenol compound from cctus heonnyuncho (Opunti humifus) in Kore. J Koren Soc Food Sci Nutr 39: Yoon JA, Hhm SW, Prk J, Son YS Totl polyphenol nd flvonoid of fruit extrct of Opunti humifus nd its inhiitory effect on the growth of MF-7 humn rest cncer cells. J Koren Soc Food Sci Nutr 38: Prk MK, Lee YJ, Kng ES Heptoprotective effect of heonnyuncho (Opunti humifus) extrct in rts treted cron tetrchloride. Koren J Food Sci Technol 37: Yoon BR, Lee YJ, Kim SG, Jng JY, Lee HK, Rhee SK, Hong HD, hoi HS, Lee BY, Lee OH Antioxidnt effect of hot wter nd ethnol extrcts from heonnyuncho (Opunti humifus) on rective oxygen species (ROS) production in 3T3-L dipocytes. Koren J Food Preserv 9: Jung BM, Shin MO, Kim HR The effects of ntimicroil, ntioxidnt, nd nticncer properties of Opunti humifus stems. J Koren Soc Food Sci Nutr 4: Lee JN, Kim HE, Kim TS Anti-dietic nd nti-oxidtive effects of Opunti humifus cldodes. J Koren Soc Food Sci Nutr 43: Yoon JA, Hhm SW, Son YS Nutrients contents in different prts of pickly per (Opunti humifus) nd possile nti-rest cncer effect. Koren J Food & Nutr 22: Jung BM, Hn KA, Shin TS. 20. Food components of different prts of heonnyuncho (opunti humifus) hrvested from Yeosu, Jeonnm in Kore. J Koren Soc Food Sci Nutr 40: Rodriguez-Felix A, ntwell M Developmentl chnges in composition nd qulity of prickly per cctus cldodes (noplitos). Plnt Foods Hum Nutr 38: Yu MH, Lee S, Im HG, Kim HJ, Lee I Antioxidnt ctivities of Prunus slicin Lindl. cv. Soldm (plum) t different growth stges. Koren J Food Preserv : Hn IH, Lee KA, Byoun KE The ntioxidnt ctivity of Koren cctus (Opunti humifus) nd the qulity chrcteristics of cookies with cctus powder dded. Koren J Food ookery Sci 23: Lee Y, Hwng KH, Hn DH, Kim SD ompositions of Opunti ficus-indic. Koren J Food Sci Technol 29: Lee KS, Oh S, Lee KY Antioxidtive effect of the frctions extrcted from cctus heonnyuncho (Opunti humifus). Koren J Food Sci Technol 37: Jrmillo S, Lopez S, Vrel LM, Rodriguez-Arcos R, Jimenez A, Ai R, Guillen R, Murin FJ The flvonol isorhmnetin exhiits cytotoxic effects on humn colon cncer cells. J Agric Food hem 58: hvez-sntoscoy RA, Gutierrez-Urie JA, Sern-Sldívr SO Phenolic composition, ntioxidnt cpcity nd in vitro cncer cell cytotoxicity of nice prickly per (Opunti spp.) juices. Plnt Foods Hum Nutr 64: Tcr O, Srimornsk P, Dss R Doxoruicin: n

8 834 박수영 김영아 이선영 updte on nticncer moleculr ction, toxicity nd novel drug delivery systems. J Phrm Phrmcol 65: Prk W, Lee JK, Pk RK Role of p53 nd p38 MAPK on Doxoruicin nd Lovsttin-induced poptosis in colon cncer cells. J Koren Surg Soc 65: Ryu MJ, hung HS Antiprolifertive ctivity of Omij (Schizndr chinensis Billon) extrcts on colon cncer cell line (HT-29). Astrct No P-98 presented t Spring Meeting of the Koren Society of Applied Phrmcology. hungju, Kore. 26. Hhm SW, Prk J, Son YS Opunti humifus prtitioned extrcts inhiit the growth of U87MG humn gliolstom cells. Plnt Foods Hum Nutr 65:

Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No μ μ

Journal of Life Science 2011 Vol. 21. No. 8. 1120~1126 ISSN : 1225-9918 DOI : http://dx.doi.org/10.5352/jls.2011.21.8.1120 μ μ μ α β Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No. 8 1121 μ μ 1122 생명과학회지 2011,