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경아 군
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1 Korean Journal of Microbiology (2016) Vol. 52, No. 3, pp pissn DOI eissn Copyright c 2016, The Microbiological Society of Korea Article Epigallocatechin Gallate (EGCG) 에노출된용혈성 Bacillus cereus MH-2 의세포반응및프로테옴분석 김동민 박상국 오계헌 * 순천향대학교자연과학대학생명시스템학과 Cellular responses and proteomic analysis of hemolytic Bacillus cereus MH-2 exposed to epigallocatechin gallate (EGCG) Dong-Min Kim, Sang-Kook Park, and Kye-Heon Oh* Department of Life Science and Biotechnology, Soonchunhyang University, Asan 31538, Republic of Korea (Received July 28, 2016; Revised August 12, 2016; Accepted August 12, 2016) ABSTRACT: The aim of this work was to investigate the cellular responses and proteomic analysis of Bacillus cereus MH-2 exposed to EGCG. Strain MH-2 was isolated from commercial Ssamjang and has the hemolytic activity. Survival of the MH-2 strain with time in the presence of different concentrations of EGCG under sublethal conditions was monitored. The amount of alginate from MH-2 strain decreased depending on the increasing concentrations of EGCG and increased depending on the exposure time at any particular EGCG concentration. Analysis of SDS-PAGE and Western blot using anti-dnak and anti-groel revealed that two stress shock proteins, 70 kda DnaK and 60 kda GroEL were found to decrease in proportion to the EGCG concentration in exponentially growing cultures. Scanning electron microscopic analysis demonstrated the presence of protrusions and fused rod forms on the cells treated with EGCG. 2-DE of soluble protein fractions from MH-2 cultures showed 20 protein spots changed by EGCG exposure. These proteins involved in enterotoxins (hemolysin BL lytic component L1 and hemolysin BL-binding protein), chaperons (DnaK and GroEL), cell defense (peptidase M4 family proteins), and various biosynthesis and energy metabolism were identified by peptide mass fingerprinting using MALDI-TOF. These results provide clues for understanding the mechanism of EGCG-induced stress and cytotoxicity on B. cereus MH-2. Key words: Bacillus cereus MH-2, EGCG, epigallocatechin gallate, hemolysis 고추장및쌈장등의장류는우리나라의고유전통발효식 품으로자리잡아왔으며, 최근웰빙음식으로서한식의국제화 를선도하는일부식품기업들에서는장류연구소를설립하여 집중적으로장류에대한여러가지측면에서의연구를수행하 고있다. 최근쌈장의원료인된장의항암, 혈당강하, 항산화효 과, 돌연변이억제및혈전용해능등다양한기능성이보고되 고있어기능성쌈장에대한관심이높아지고있다 (Kwak et al., 2007). 그러나쌈장의제조공정에서식중독을유발할수 있는 E. coli, S. aureus, B. cereus 등이유입될수있다. 특히내 생포자를형성하는 B. cereus 는재료준비과정부터다른균주 들과비교하여상대적으로많은양이유입될수있으나, 효율 *For correspondence. kyeheon@sch.ac.kr; Tel.: ; Fax: 적인멸균법이알려져있지않아오랫동안문제가제기되어오고있다. B. cereus에의한세균성식중독은커다란건강상의문제를일으키는것으로보고된바있으며 (Granum and Lund, 1997; Guinebretière and Broussolle, 2002; Arnesen et al., 2008), 이를관리하기위하여우리나라에서는 2005년부터식품의약품안전처에서 1 g당 1,000 CFU 이하로규제하는지침을제정해놓고있는상태이다. 기업및식품업체등에서는이를해결하기위해서사용되는물과재료의열처리, 또는각종첨가물을이용하는등의물리화학적방법으로생산되고있으며, 최근천연물질을첨가하여저장성및품질을향상시키기위한연구가진행중이다 (Lee et al., 2001; Kang et al., 2013). B. cereus에의한식중독은일부균주가생성하는설사형독

2 EGCG 에노출된 B. cereus MH-2 의세포반응및프로테옴분석 261 소인 hemolysin BL (HBL) 과구토형독소인 cereulide에의해발생된다고보고되었다 (Yokoyama et al., 1999; Guinebretière and Broussolle, 2002). 우리나라에서 B. cereus에의한식중독사례는매년증가추세에있어이를효율적으로예방하는대책이필요할것으로사료된다 (Choi et al., 2011). Epigallocatechingallate (EGCG) 는 epigallocatechin (ECG), epicatechhingallate (ECG), epicatechin (EC), gallocatechingallate (GCG) 와함께녹차에함유된주요카테킨의한종류로서, 항산화효과, 노화방지, 암세포분화방지, 항바이러스효과, 충치예방효과등의다양한효과가있는것으로알려져있다 (Yu et al., 2004). 녹차추출물 (tea polyphenol) 은식중독관련미생물, 구강미생물등다양한미생물들에대하여항균효과가있는것으로보고된바있다 (Cho et al., 2010, 2011; Song et al., 2010). B. cereus의제거를위하여제조공정의변화나화학첨가제첨가가제기되어왔으나, 최근에항미생물효과와더불어건강상의이유로다양한기능성을가지는천연물질을이용한활용하는방안의필요성이주목을받고있으며, 이러한다양한기능을충족시킬수있는물질로서 EGCG가관심의대상이되어왔다. 본연구에서는시판되고있는쌈장에서용혈성 B. cereus MH-2를분리하여, EGCG에노출시켰을때나타나는세포반응에대하여조사하였으며, EGCG의다양한농도와시간에노출된 B. cereus MH-2에서 alginate의생성을관찰하였다. 또한이세균이 EGCG에의해유도되는스트레스충격단백질인 DnaK와 GroEL의변화를 Western blot을통하여조사하였으며, EGCG에노출된세포의외부형태변화를주사전자현미경으로관찰하였다. 또한 EGCG에의한단백질발현의변화를 2-D PAGE와 MALDI-TOF를활용하여프로테옴분석을실시하였다. 재료및방법 세균의분리및배양시중에서판매되고있는쌈장 (C사, 한국 ) 으로부터농화배양기법을통하여용혈성 Bacillus cereus를분리하였다. 5% sheep blood가첨가된 blood agar (Difco Co.) 에시료를도말하여배양하였다. 이후고체평판배지상의집락주변에투명대가형성된집락을선별하여, 선별된균주를 blood agar 배지에 3회에걸친도말평판법을통한순수배양기법으로투명대 (clear zone) 를형성하는세균을분리하여최종선발하였다. 분리세균은 LB 액체배지에접종하여, 진탕배양기 (37 C, 160 rpm) 에서유지하며, 본실험에이용하였다. EGCG 에대한분리세균의생존율조사분리세균에대한 EGCG의살균효과를알아보기위하여균주를 LB 액체배지에배양하였다. 대수생장기를거치면서파장 660 nm에서혼탁도가 1.0일때, 배양액을 4 C를유지하며 13,000 rpm에서 10분간원심분리하였다. 얻어진균체를 PBS buffer로 3회세척하고, 다시동일조건하에원심분리를실시하여얻어진균체를다양한농도의 EGCG에노출시켰다. 2시간간격으로 LB 고체평판배지에 100 μl씩평판도말하여 37 C 에서 24시간배양한후, 형성된집락을계수하여 ECGC 농도와노출시간에따른분리세균의생존율을각각조사하였다. EGCG 노출에의한 alginate 생성량측정 EGCG의노출시간과농도에따른 alginate의생성량변화는이미보고된방법 (Chang et al., 2007) 을이용하여, 상등액에포함되어있는 alginate를정제하여측정하였다. 다양한농도의 EGCG (1,000 3,000 μg/ml) 가첨가되어있는 LB 액체배지에각각분리세균을접종하여 EGCG에노출시킨후, 2시간마다상등액을취하여 ice ethanol (-20 C) 을첨가한후, -20 C 에서 18시간동안처리하였다. 처리된시료를원심분리기를이용하여 4 C를유지하면서 13,000 rpm에서 1시간원심분리하여얻은상등액을동결건조시킨후, 증류수에녹여 alginate 를얻었다. 얻어진 alginate 시료 100 μl와 5% phenol solution 100 μl를잘혼합한후, 500 μl의 sulfuric acid를첨가한뒤, 30 초동안잘혼합하여 80 C에서 30분간반응시켰다. 반응시킨튜브를식힌뒤 490 nm에서흡광도를측정하여 alginate를정량하였다. 정량은 sodium alginate (Sigma) 에의해만들어진표준곡선을활용하였다. 표준곡선은 5, 10, 25, 50, 100 μg의 alginate를제조하여반응시킨후, 490 nm에서흡광도를측정하여작성하였다. 단백질획득및정량분리세균을 EGCG에노출시킨후, 13,000 rpm에서 10분간원심분리하여얻어진균체를 10 mm phosphate buffer (ph 7.0) 로 3회세척하였다. 이후동일 buffer에균체를현탁하여 4 C를유지하면서, 초음파분쇄기를이용하여 50 W로 30초간 15회반복하면서파쇄하여단백질을추출하였다. 파쇄된세포는 13,000 rpm에서 30분간원심분리한후, 단백질을포함하고있는상등액을취하여 Bradford 방법 (Bradford, 1976) 으로단백질을정량하였다. 정량은 bovine serum albumin (BSA) 에 Korean Journal of Microbiology, Vol. 52, No. 3

3 262 Kim et al. 의해만들어진표준곡선을활용하였다. EGCG 노출에따른세포외부형태의관찰 EGCG에노출된세균세포의외부형태변화를주사전자현미경을통하여관찰하였다. 세균을 LB 액체배지에접종하여 12시간동안배양시킨후, PBS로 3회세척하여균체를준비하였다. 준비한균체를 2,000 μg/ml의 EGCG에각각 2시간, 8시간동안노출시킨후, 배양액을원심분리하여균체를회수하고, 여과지에부착하여고정및탈수한후, hexamethyl disilazane 원액에 20분간반응시켜공기중에서건조하였다. 건조시킨 membrane filter를 slide glass 위에부착하여 sputter coater (IB-3, Giko Engineering Co.) 를사용하여 gold coating 한후, JSM-6700F 주사전자현미경 (JEOL) 으로관찰하였다. SDS PAGE 와 Western blot 분석추출한단백질을 Bollag 등의방법 (1996) 에따라 SDS-PAGE 를실시하였다. Separating gel은 12% acrylamide gel을사용하고, stacking gel은 4% acrylamide gel을사용하였다. 전기영동후 gel은 staining solution (0.1% Coomassie brilliant blue R-250, 45% methanol, 10% acetic acid) 으로 1시간염색하였고, destaining solution I (50% methanol, 10% acetic acid) 과 destaining solution II (5% methanol, 7% acetic acid) 로탈색하였다. 스트레스충격단백질 ( 예, DnaK와 GroEL) 을분석하기위하여 Sambrook 등의방법 (2001) 에따라 Western blot을실시하였다. 1차항체는 anti-dnak와 anti-groel (StressGen Biotechnologies Corp.) 을사용하였고, 2차항체는 anti-mouse IgG HRP conjugate (Promega) 를사용하였다. 반응검출을위하여 Western blot detection system (Intron) 을사용하여 X-ray film (AGFA) 에현상한후, 스트레스충격단백질의발현을비교분석하였다. 2 DE와 in gel digestion EGCG에노출된분리세균의단백질변화를분석하기위하여대상균주를 2,000 μg/ml 농도의 EGCG에 2시간동안노출시킨후획득된단백질시료와대조군으로 EGCG에노출되지않은균주에서얻은단백질시료를각각준비하여기존에기술된방법으로이차원젤전기영동 (2-DE) 을실시하였다 (Ho et al., 2004). 염색된단백질 spots는젤에서잘라내어, 30 mm potassium ferricyanide와 100 mm sodium thiosulfate를 1:1로혼합한용액을사용하여탈염색하고, 증류수로세척하였다. 세척된 gel은 50% acetonitrile과 100% acetonitrile으로각각 15분간반응후, 100 mm ammonium bicarbonate (ph 7.8) 를넣고 5분간반응시켰다. 반응시킨 gel에 100% acetonitrile을넣고 gel이흰색으로변하면 acetonitrile를제거하였으며, 진공원심분리농축기로남아있는여액을제거하고, 건조시켰다. 건조된 gel은 0.2 μg trypsin (Promega sequence grade) 으로 37 C에서 16시간동안처리하여 gel에있는단백질을 peptide 로분해시켰다. 분해된 peptides를추출하기위하여 25 μl의 elution buffer [50% acetonitrile, 5% trifluoroacetic acid (TFA)] 를첨가하여실온에서 1시간동안교반시켰다. 반응시킨 elution buffer를새로운 1.5 ml 튜브로옮기고진공원심분리농축기로농축하였으며이과정을 2회반복하였다. MALDI TOF/MS 를이용한단백질동정농축된 peptides는 0.1% TFA 용액에녹인후, zip-tip C18 pipette tips (Millipore) 를사용하여탈염하였다. Peptides는 CHCA solution (10 mg/ml CHCA in 0.5% TFA/50% ACN, 1:1) 을첨가하여분석용시료를만들었으며, PTFE (polytetrafluoroethylene) 필름으로코팅된 96 well plate (Applied Biosystems Inc.) 에 1 μl씩주입하였다. Mass spectra는 4700 Proteomics Analyzer (Applied Biosystems) 를사용하였으며, 각단백질은 MASCOT ( 의 NCBI DB 활용에근거하여 MALDI fingerprint data로부터동정되었다 (Cottrell and London, 1999). 결과및고찰 세균의분리및배양시중에판매되고있는쌈장으로부터농화시킨배양액에서 5% sheep blood가첨가된 blood agar에서투명대가관찰되는균주를선별하여 blood agar에서 3회에걸친도말평판법을통한순수배양으로투명대가뚜렷한세균인 Bacillus cereus MH-2를선별하였다. 선별된균주는 LB 액체배지에접종하여, 진탕배양기에서 37 C에서 160 rpm의배양조건을유지하면서본실험에이용하였다. EGCG 에대한분리세균의생존율조사분리세균 MH-2에대한 EGCG의농도와노출시간에따른생존율을알아보기위한실험을실시하였다. 전반적으로노출시간과농도에비례하여세균의집락의수가점차감소하는양상을보였으며, 4,000 μg/ml의 EGCG 농도에노출시킨분리 미생물학회지제 52 권제 3 호

4 EGCG 에노출된 B. cereus MH-2 의세포반응및프로테옴분석 263 Fig. 1. Survival rate of Bacillus cereus MH-2 following exposure to EGCG. MH-2 cells were maintained at the concentrations of 0 μg/ml ( ), 1,000 μg/ml ( ), 2,000 μg/ml ( ), 3,000 μg/ml ( ), and 4,000 μg/ml ( ) EGCG. At intervals, the numbers of colonies (CFU/ml) were measured. 세균은빠르게생존율이감소하여 6시간이후집락을관찰할수없으며, 3,000 μg/ml의농도에노출시킨세균은 8시간이후집락이관찰되지않았다 (Fig. 1). Shigemune 등 (2012) 은 500 μg/ml의농도의 EGCG에노출된 B. cereus 균주의내생포자형성이억제되어생존율이감소하였으나, 6시간이후부터는내생포자형성이증가하여, 발아하는세포의수가증가한다고보고하였다. 본연구결과에따르면 4,000 μg/ml 이상의고농도의 EGCG에노출된세균의사멸이급격히이루어져, 노출 6 시간이후에집락이관찰되지않았다. 이는일정농도이상의 EGCG는 B. cereus에대하여뛰어난살균효과를가지는것으로사료된다. Fig. 2. Exopolymer production as alginate equivalents by Bacillus cereus MH-2. The cells were grown in LB only ( ), or LB in the presence of the concentrations of 1,000 μg/ml ( ), 2,000 μg/ml ( ), and 3,000 μg/ml ( ) EGCG. The standard curve for alginate quantification was shown as the inner box in Fig. 2. These data represent the mean±sd based on triplicate studies. 으로널리알려진 Pseudomonas 속 (genus) 에서 alginate 생산과관련된연구는많이보고되었다. 열, 독성화학물질, 폭약, 항생제등외부환경요인의노출에따른 alginate 생성량의변화를관찰한연구결과는 Ps. syringae와 Ps. putida에서각각보고되었다 (Keith and Bender, 1999; Lee et al., 2008). 이러한결과들을바탕으로 EGCG에노출된 B. cereus에서도외부환경적스트레스요인에저항하고세포생존을위한수단으로서 alginate를생성하는것으로사료된다. EGCG 노출에따른 alginate 생성량변화분리세균인 MH-2가다양한농도의 EGCG에노출되었을때생성되는 alginate의양을측정하였다. Alginate 생성량은 EGCG의농도가증가함에따라감소하였으며, 특정 EGCG 농도에서노출시간이진행됨에따라생성량은증가하는것으로나타났다 (Fig. 2). 16시간의배양기간동안 alginate 최대생성량은 1,000 μg/ml의 EGCG에서 12시간경과후 59 μg, 그리고 2,000 μg/ml과 3,000 μg/ml에서 10시간경과후, 각각 37 μg과 14 μg으로측정되었다. EGCG 노출에따른 B. cereus의 alginate의생성량을측정한연구결과는거의알려진바없다. 그러나 alginate의생산은열악한주변환경에서세균들이생존하는데중요한요인으로알려져있다. 병원성및토양세균 EGCG 노출에따른세포외부형태의관찰분리세균인 MH-2의 EGCG 처리농도와시간에따른세포외부형태변화를주사전자현미경을이용하여관찰하였다. 미처리된 MH-2 세포는정상적으로둥근간균의매끈한세포표면이관찰된반면에, 2,000 μg/ml의농도에서 2시간동안노출된세균은세포의표면이울퉁불퉁해지고, 특정부분이돌출되기시작하는것을관찰할수있었다. 8시간노출된세균에서는세포의표면이더욱불규칙해지고, 크고작은돌출부의생성과함께세포의뭉그러진형태도관찰되었다 (Fig. 3). EGCG 에노출된후의형태변화는세균의종류에따라다른것으로보고되었다. Shigemune 등 (2012) 은 EGCG에노출된 B. cereus JCM2152의세포에서표면이심하게주름이지고, 찌그러지 Korean Journal of Microbiology, Vol. 52, No. 3

5 264 Kim et al. 는 모습을 관찰하였으며, Klebsiella pneumonia에서는 저농도 균주 MH-2를 다양한 농도의 EGCG (1,000 4,000 μg/ml)에 노 에서는 천공이 관찰되었으며, 농도가 증가함에 따라 심하게 출시킨 후, 스트레스 충격단백질인 DnaK와 GroEL의 발현과 일그러지고 뭉그러지는 것으로 보고하였다(Cho et al., 2011). (Fig. 4), 3,000 μg/ml의 EGCG에서 1시간 간격으로 노출에 의 EGCG의 사멸효과에 대해서는 두 가지 기작이 제시되었다; 해 유도 발현되는 DnaK와 GroEL을 조사하였다(Fig. 5). Fig. 4 (1) 세포막의 손상에 의한 세포사멸을 유도한다는 기작(Ikigai 에서 보여주는 바와 같이, EGCG 농도에 따른 세균에서 발현 et al., 1993)과 (2) EGCG가 직접적으로 펩티도글리칸에 결합 되는 DnaK와 GroEL의 양은 EGCG의 농도가 증가함에 따라 하여 세포벽을 손상 및 세포벽 생합성을 방해한다는 기작이다 발현량이 점차 감소하였으며, 노출 시간이 증가함에 따라 (Shimamura et al., 2007). 본 연구 결과에 따르면 외부형태의 DnaK와 GroEL의 발현량이 급격히 감소하였다(Fig. 5). 일반 심각한 변화로 보아 세포벽의 손상을 초래하여 세포 사멸을 일 적으로 스트레스 충격단백질인 DnaK와 GroEL은 열과 으킨 것으로 판단되나, 구체적으로 세포에 영향을 미치는 기작 NaCl과 같은 스트레스 요인들에 의해서도 발현이 변화하는 을 명백히 밝히기 위한 더 많은 연구가 진행되어야 할 것이다. 것으로 알려져 있다. Periago 등(2002)은 스트레스 요인으로 서 열과 NaCl에 노출된 B. cereus ATCC 균주에서 여러 SDS빥PAGE와 Western blot 분석 가지 단백질의 변화를 관찰하였으며, 특히 DnaK와 GroEL 발 스트레스 충격단백질의 발현양상을 조사하기 위하여 분리 (A) 현은 변화로 노출 시간이 증가할수록 유도되는 양이 증가한 (B) (C) Fig. 3. Scanning electron micrographs of Bacillus cereus MH-2. (A) untreated cells, (B) cells treated with 2,000 μg/ml EGCG for 2 h, and (C) cells treated with 2,000 μg/ml EGCG for 8 h. (A) (B) (C) Fig. 4. Induction of stress shock protein (SSPs) in Bacillus cereus MH-2 treated with different EGCG concentrations for 1 h; 0 μg/ml (lane 1), 1,000 μg/ml (lane 2), 2,000 μg/ml (lane 3), 3,000 μg/ml (lane 4), 4,000 μg/ml (lane 5), The SSPs were analyzed by SDS-PAGE (A), and western blot with anti-dnak (B), and anti-groel (C) monoclonal antibodies, respectively. 미생물학회지 제52권 제3호

6 EGCG 에노출된 B. cereus MH-2 의세포반응및프로테옴분석 265 후에일정하게유지되는것을보고하였다. 본실험을통해서사용된 EGCG는노출농도및시간이증가함에따라유도되는 DnaK와 GroEL은점차사라지는것으로관찰되었는데, 이는 EGCG가세포독성물질로작용하여세포사멸을유도한결과로스트레스충격단백질의발현이감소하는것으로열이나 NaCl의노출결과발현되는정도에서차이가있는것으로사료된다. EGCG 에노출된분리세균에서프로테옴발현변화먼저 EGCG에노출되었을때, 분리세균 MH-2에서나타난 다양한프로테옴발현변화를이차원전기영동 (2-DE) 을통하여비교관찰하였다. 2,000 μg/ml의 EGCG에 2시간동안노출된 B. cereus MH-2 균주의프로테옴발현변화양상을관찰한결과, ph 4 7의범위에서약 20개의단백질이 EGCG 노출에의해비교적크게증가하거나감소하는 spot들이관찰되었다 (Fig. 6). 2-DE에서증감이관찰된 spot들은 MALDI-TOF에의한 peptide mass fingerprinting을이용하여동정을실시하였다. MALDI-TOF 분석결과는 Table 1에요약되었다. 이들단백질가운데, EGCG에노출된 MH-2 세포에서다양한기능을 (A) (B) (C) Fig. 5. Induction of stress shock proteins (SSPs) in Bacillus cereus MH-2 treated with 3,000 μg/ml EGCG for different exposure times (h). The SSPs were analyzed by SDS-PAGE (A), and western blot with anti-dnak (B), and anti-groel (C) monoclonal antibodies, respectively. (A) (B) Fig. 6. Two-dimensional gel electrophoresis pattern of total Bacillus cereus MH-2 proteins in Luria-Bertani broth without EGCG (A) or in the presence of 2,000 μg/ml EGCG for 2 h (B). The number associated with MALDI-TOF/MS identified spots is listed in Table 1. Korean Journal of Microbiology, Vol. 52, No. 3

7 266 Kim et al. 수행하는단백질들, 특히스트레스충격단백질 (DnaK, GroEL), alginate 생합성단백질 (alginate biosynthesis protein, AlgB), 세포방어요소 ( 예, peptide M4 family proteins) 의증가가확인되었다. Western blot에서 EGCG 노출농도와시간이증가함에따라아치사조건 (sub-lethal condition) 에도달하여세포의치사로인한스트레스충격단백질의발현감소가관찰되었으나, 2-DE에서사용된 EGCG 농도에서는이들단백질이증가되는것으로나타났다. 스트레스충격단백질을포함하여증가된단백질들은저농도의 EGCG에노출된분리세균에서증가됨으로서, 세포가열악한환경에노출되었을때세포를방어하거나세포의생존을돕는데중요한역할을하는것을시사한다. Periago 등 (2002) 은 B. cereus ATCC 14579에서온도, ph, ethanol, NaCl과같은외부환경요인의변화에의해서 DnaK와 GroEL의발현이유도되는것으로보고하였다. 또한장독소 (enterotoxins) 와물질대사에관여하는여러가지단백질들이감소하는것으로확인되었다. 특히본연구에서사용된용혈성 MH-2 균주가 EGCG에노출되었을때, 용혈독소인 hemolysin BL lytic component L1과 hemolysin BL-binding protein의발현이감소되는것은흥미로운일이다. Hemolysin BL은 binding component B, 그리고두가지의 lytic components L1과 lytic components L2가결합하여구성되며, B. cereus로인한설사형식중독을일으키는주독소라는것을발표하였다 (Ryan et al., 1997). 또한 hemolysin은 B. cereus 뿐만아니라, Escherichia coli O157, 일부 Streptococcus 속, Table 1. Proteins identified by MALDI-TOF/MS fingerprinting Spot No. Identified protein Accession Sequence coverage (%) Fold change Chaperone 1 Chaperone protein, DnaK AIY Chaperone protein, GroEL KC Enterotoxins 3 Hemolysin BL lytic component L1 WP_ Hemolysin BL-binding protein WP_ Energy metabolism, pathway factors 5 Aconitate hydratase WP_ Phosphoglyceromutase WP_ Phenylalanine racemase, partial WP_ Proteases 8 Alkaline serine protease WP_ Transporter 9 Peptide ABC transporter permease WP_ Biosynthesis, biosynthesis of cofactor, protein synthesis 10 Alginate biosynthesis protein, AlgB CUB Peptidyl-tRNA hydrolase WP_ Thioredoxin WP_ Phosphotransferase WP_ MecA protein WP_ Cell envelope 15 Penicillin binding protein WP_ Cell division protein, FtsN WP_ Wall-associated protein WP_ Cell defence factor 18 Peptidase M4 family proteins WP_ Cell lysis factor 19 ArpU family phage transcriptional regulator WP_ Flagellum components 20 Phage tail length tape measure protein WP_ 미생물학회지제 52 권제 3 호

8 EGCG 에노출된 B. cereus MH-2 의세포반응및프로테옴분석 267 Listeria 속의세균에서도발견되는주요용혈독소로보고된바있다. Friedman 등 (2006) 은 B. cereus와 B. anthracis에서생성되는독소가 EGCG의 phenolic OH 기 (group) 와결합하여독소를불활성화시킨다고보고하였는데, 이는 EGCG가 B. cereus가생성하는독소의발현을억제하는데관여한다는것으로연관지어볼때매우흥미로운내용이다. 본연구에서용혈성을나타내는분리균주 MH-2 세균이 EGCG에노출되었을때, hemolysin 관련단백질발현의감소는 EGCG의용혈독소억제및무독화소재로의가능성과나아가식품산업에서용혈성을가진세균및식중독세균을조절할수있는기능성소재로서의이용가능성을제시할수있다. 쌈장이나고추장등에포함되어있는용혈성 B. cereus 오염에대한문제는국민건강에문제가될수있다. 이를극복하기위한몇가지대안이제기되고있으며, 그가운데천연식품첨가물은종류에따라다양한기능성을가지고있어서건강에이로운측면을제공할수있다. 그러나이를활용하는데있어서천연물자체가가지는맛이나향으로인하여본래의물성이변화할수있기때문에기호식품으로서문제가될수도있다. 따라서이문제를해결하기위한고려도있어야할것으로사료된다. 녹차와그추출물은다양한측면에서이용하려는노력이있어왔으나, 식품보존을위한천연식품첨가물로서의연구는여전히미비한편이다. 따라서본연구에서는식중독원인세균인용혈성 B. cereus에대한 EGCG 노출에따른다양한특성조사를실시하였다. 향후이들결과를기초로하여용혈성 B. cereus가가지는독성단백질의저해기작을규명하는방향으로추진되어야할것이다. 적요 본연구의목적은시중에판매되고있는쌈장에서용혈성을가지는 Bacillus cereus MH-2를분리하여, EGCG 노출에따른 MH-2 균주의세포반응과프로테옴분석을위해수행되었다. 다양한농도의 EGCG에노출된 MH-2 균주는노출시간이증가함에따라생존률은점차감소함을보였다. MH-2 균주의 alginate 생성량은 EGCG의농도가증가함에따라감소하였으며, 특정 EGCG 농도에서노출시간이진행됨에따라그생성량은증가하는것으로나타났다. SDS-PAGE 및 anti-dnak 와 anti-groel의단일항체를이용한 Western blot 통한분석으로, 두가지스트레스충격단백질인 70 kda의 DnaK와 60 kda의 GroEL의발현은대수생장기의배양에서 EGCG의농 도에비례하여감소하는것을확인하였다. EGCG 에노출된 세균의세포외부형태변화를주사전자현미경을이용하여관 찰한결과, 세포표면의돌출부생성과함께세포의뭉그러짐 이관찰되었다. EGCG 에노출된 Bacillus cereus MH-2 배양의 수용성단백질부분에대한 2-DE 에서 20 개의단백질스팟이 EGCG 노출에의해크게변화하는것이확인되었다. 장독소 (hemolysin BL lytic component L1, hemolysin BL-binding protein), chaperon (DnaK, GroEL), 세포방어요소 (peptidase M4 family proteins), 에너지및물질대사등에수반되는이들 단백질은 MALDI-TOF 를사용한 peptide mass fingerprinting 에의해동정되었다. 이들결과는 B. cereus MH-2 에대한 EGCG- 유도스트레스와세포독성의기작을이해하는데중요 한단서를제공할것이다. 감사의말 본연구는순천향대학교의학술연구지원사업의연구비지원하에수행되었습니다. References Arnesen, L.P., Fagerlund, A., and Granum, P.E From soil to gut: Bacillus cereus and its food poisoning toxins. FEMS Microbiol. Rev. 32, Bollag, D.M., Rozycki, M.D., and Edelstein, S.J Protein methods. 2nd ed. New York, Wiley-Liss, USA. Bradford, M.M A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, Chang, W.S., van-de-mortel, M., Nielsen, L., de-guzman, G.N., Li, X., and Halverson, L.J Alginate production by Pseudomonas putida creates a hydrated microenvironment and contributes to biofilm architecture and stress tolerance under water-limiting conditions. J. Bacteriol. 189, Cho, Y.S., Oh, J.J., and Oh, K.H Antimicrobial activity and biofilm formation inhibition of green tea polyphenols on human teeth. Biotechnol. Bioproc. Eng. 15, Cho, Y.S., Oh, J.J., and Oh, K.H Synergistic anti-bacterial and proteomic effects of epigallocatechin gallate on clinical isolates of imipenem-resistant Klebsiella pneumoniae. Phytomedicine 18, Choi, K.B., Lim, H.S., Lee, K., Ha, G.Y., Jung, K.H., and Sohn, C.K Epidemiological investigation for outbreak of food poisoning caused by Bacillus cereus among the workers at a local company in J. Prev. Med. Public Health 44, Korean Journal of Microbiology, Vol. 52, No. 3

9 268 Kim et al. Cottrell, J.S. and London, U Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis 20, Friedman, M., Henika, P.R., Levin, C.E., Mandrell, R.E., and Kozukue, N Antimicrobial activities of tea catechins and theaflavins and tea extracts against Bacillus cereus. J. Food Prot. 69, Granum, P.E. and Lund, T Bacillus cereus and its food poisoning toxins. FEMS Microbiol. Lett. 157, Guinebretière, M.H. and Broussolle, V The enterotoxigenic pro files of food-poisoning and food-borne Bacillus cereus strains. J. Clin. Microbiol. 40, Ho, E.M., Chang, H.W., Kim, S.I., Kahng, H.Y., and Oh, K.H Analysis of TNT (2,4,6-trinitrotoluene)-inducible cellular responses and stress shock proteome in Stenotrophomonas sp. OK-5. Curr. Microbiol. 49, Ikigai, H., Nakae, T., Hara, Y., and Shimamura, T Bactericidal catechins damage the lipid bilayer. Biochim. Biophy. Acta. 1147, Kang, B.R., Im, G.E., and Kim, D.H Effect of anti-microbial materials on storages of Ssamjang. J. Appl. Biol. Chem. 56, Keith, L.M. and Bender, C.L AlgT (σ 22 ) controls alginate production and tolerance to environmental stress in Pseudomonas syringae. J. Bacteriol. 181, Kwak, C.S., Lee, M.S., and Park, S.C Higher antioxidant properties of cheonggukjang, a fermented soybean paste, may be due to increased aglycone and malonylglycoside isoflavone during fermentation. Nutr. Res. 27, Lee, K.I., Moon, R.J., Lee, S.J., and Park, K.Y The quality assessment of doenjang added with Japanese apricot, garlic and ginger, and samjang. Korean J. Soc. Food Cookery Sci. 17, Lee, B.U., Park, S.C., Cho, Y.S., and Oh, K.H Exopolymer biosynthesis and proteomic changes of Pseudomonas sp. HK-6 under stress of TNT (2, 4, 6-trinitrotoluene). Curr. Microbiol. 57, Periago, P.M., van Schaik, W., Abee, T., and Wouters, J.A Identification of proteins involved in the heat stress response of Bacillus cereus ATCC Appl. Environ. Microbiol. 68, Ryan, P.A., Macmillan, J.D., and Zilinskas, B.A Molecular cloning and characterization of the genes encoding the L1 and L2 components of hemolysin BL from Bacillus cereus. J. Bacteriol. 179, Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T Molecular cloning, pp Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA. Shigemune, N., Nakayama, M., Tsugukuni, T., Hitomi, J., Yoshizawa, C., Mekada, Y., Kurahachi, M., and Miyamoto, T The mechanisms and effect of epigallocatechin gallate (EGCg) on the germination and proliferation of bacterial spores. Food Control 27, Shimamura, T., Zhao, W.H., and Hu, Z.Q Mechanism of action and potential for use of tea catechin as an antiinfective agent. Anti-Infect. Agents Med. Chem, 6, Song, Y.J., Cho, Y.S., and Oh, K.H Antibacterial effects and cellular responses of imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa exposed to green tea polyphenols. J. Microbiol. 38, Yokoyama, K., Ito, M., Agata, N., Isobe, M., Shibayama, K., Horii, T., and Ohta, M Pathological effect of cereulide, an emetic toxin of Bacillus cereus, is reversible in mice. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 24, Yu, M.O., Chun, J.W., and Oh, K.H Effect of tea catechin, EGCG (epigallocatechin gallate) on killing of oral bacteria. Korean J. Microbiol. 40, 미생물학회지제 52 권제 3 호

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DBPIA-NURIMEDIA Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 31(4): 228-236 (2016) http://dx.doi.org/10.7841/ksbbj.2016.31.4.228 ISSN 1225-7117 / eissn 2288-8268 연구논문 녹차카테킨 EGCG 의노출에따른식중독세균인용혈성 Aeromonas