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경선 류(유)
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1 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 32(3): (2017) ISSN / eissn Research Paper 시판쌈장에서분리한용혈성 Bacillus cereus 의동정및특성조사 김동민 1, 박상국 2, 오계헌 2 * Identification and Characterization of Hemolytic Bacillus cereus Isolated from Commercial Ssam-jang Dong-Min Kim 1, Sang-Kook Park 2, and Kye-Heon Oh 2 * Received: 26 May 2017 / Revised: 21 July 2017 / Accepted: 26 July The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering 1 東京大学生命工學科 1 Department of Biotechnology, The University of Tokyo, Yayoi, Bunkyo-ku, Tokyo , Japan 2 순천향대학교생명시스템학과 2 Department of Life Science and Biotechnology, Soonchunhyang University, Chung-Nam 31538, Korea Tel: , Fax: kyeheon@sch.ac.kr Abstract: This study was undertaken to identify and characterize hemolytic Bacillus cereus isolated from commercial ssam-jang. The physiological and biochemical properties of isolate were first examined. Using the BIOLOG system, the isolate was identified and assigned to B. cereus MH-2. Phylogenetic tree of MH-2 was plotted based on 16S rrna sequence comparisons. Hemolytic activity was observed around wells of sheep blood agar plates seeded with MH-2 cultures; the zone of hemolysis gradually increased with increasing incubation time of the cultures. Zymographic analysis estimated the molecular weight of the presumed hemolysis-causing molecule to be about 30 kda. Survival rates of MH-2 cells decreased with increasing NaCl concentrations in the media. The stress shock proteins (e.g., DnaK and GroEL) induced by NaCl were reduced in proportion to the NaCl concentration and exposure period to B. cereus MH-2. Analysis of SDS- PAGE and Western blot revealed that the stress shock proteins, 70-kDa DnaK and 60-kDa GroEL were decreased proportionate to the NaCl concentrations as well as exposure period in exponentially growing cultures. Scanning electron microscopy demonstrated the presence of perforations and irregular rod forms with wrinkled surfaces in cells treated with NaCl. Keywords: Ssam-jang, Hemolysis, Sodium chloride, Bacillus cereus MH-2 1. INTRODUCTION 쌈장은고추장, 된장등과함께우리나라의고유전통발효식품으로자리잡아왔으며, 최근외식문화의발달로쌈장을비롯한다양한장류의소비량은증가추세에있다. 이에맞추어일부식품회사들에서는장류연구소를설립하여다양한장류를개발하고여러가지측면에서의연구를수행하고있다 [1]. 최근연구에따르면쌈장의원료인된장의기능성으로항산화, 항암, 혈당강하및혈전용해효과등다양한기능성이보고되고있어기능성된장및된장을원료로하는쌈장에대한관심이높아지고있다 [2]. 그러나쌈장의제조공정에서유입될수있는 Bacillus cereus 는식중독유발세균으로알려져있어건강상의문제를일으킬수있다. B. cereus 는물, 토양, 공기등의자연계에널리분포하고있으며장류뿐만아니라농산물, 곡류및곡류가공품, 과실및채소류, 즉석조리식품, 식육및식육가공품, 유제품, 생식제품등에서많이분리되고있다 [3]. B. cereus 는그람양성의호기성세균으로서내생포자를형성하는것으로알려져있으며, 식품가공에서열처리후에도조리된식품을실온에보관할경우내생포자가발아, 증식하여독소를생산하여식중독을유발시키는것으로알려져있다. 또한 B. cereus 는 Staphylococcus, Escherichia, Vibrio, Salmonella 등과함께식중독세

2 180 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 32(3): (2017) 균으로보고되고있다 [4]. B. cereus 에의한식중독은구토형과설사형식중독으로구분되어지며, 구토형식중독은용혈독소인 hemolysin BL (Hbl) 에의해설사형식중독은 cereulide 에의해발생된다고보고되었다. 특히일부 B. cereus 균주가생성하는설사형독소인 Hbl 은 binding component B, lytic proteins L1, L2 등으로구성되어있으며, 각각 hbla, hbld, hblc 유전자에의해제어되며, 피부괴사및혈관침투활성을가지는것으로보고되어, hemolysin 이용혈성 B. cereus 에서주요독소로인식되고있다 [4]. 장류와젓갈류는예로부터보존성을증진시키기위하여고농도의식염을사용하여왔다. 그러나이들식품은염분함량이평균 30% 정도로, 염도가 2% 정도인김치에비해매우높으며 [5], 현재 WHO 에서는 1 일나트륨섭취량을 2,000 mg 이하로권고하고있으나, 우리나라국민의하루평균나트륨섭취량은이러한권고치의 2~3 배를초과하는것으로보고되었다 [6]. 이와같은과다한소금의섭취는다양한만성질환의발병가능성을높이는위험요인이되는것으로보고되면서, 최근에는소비자들이고염도식품에대한소비를기피하여그수요가점차감소하고있다 [7]. 소득수준향상으로인한건강지향적인식품을선호하는소비자들이증가하고있어여러식품기업들에서는저염도의식품을개발하는데관심이집중되고있으며, 특히장류와젓갈등의고염도의식품에서식품보존을위한저염도의기준을정하는것이주목받고있다. 그러나제조공정에서다양한식중독세균이유입될수있으며, 특히내생포자를형성하며효율적인멸균법이잘알려져있지않은 B. cereus 는일정수준의염도에서생존이가능한것으로보고되고있어큰문제가되고있다 [8]. 본연구에서는시판되고있는쌈장에서용혈성 Bacillus cereus MH-2 를분리하여형태학적및생리화학적특성을조사하였으며, BIOLOG 분석시스템을사용하여분리세균을동정하였다. 16S rrna 염기서열분석을통해분리세균의분자유전학적계통수를작성하였으며, 분리세균의용혈활성의특성을조사하기위하여 zymography 를실시하였다. 또한 MH-2 의 NaCl 에노출에따른세포반응을조사하기위하여생존율조사와 NaCl 에의해유도되는스트레스충격단백질인 DnaK 와 GroEL 의변화를 SDS-PAGE 와 Western blotting 을통하여조사하였다. 또한 NaCl 에노출된세포의외부형태를주사전자현미경으로관찰하였다. 2. MATERIALS AND METHODS 2.1. 균주의확보및배양조건시판되고있는쌈장에서농화배양기법을통하여용혈성을가지는 Bacillus cereus 를분리하였다. 시료 5 g 을채취하여 100 ml 의멸균된생리식염수 (physiological saline) 이담긴플라스크에넣고혼탁한후, 상등액 100 L 를 5% sheep blood agar (Difco Co., MO, USA) 에도말하고, 30 o C 의배양기에서 24 시간동안배양하였다. 균주의생육과정에서용혈활성을나타내어집락주변에투명환 (clear zone) 을형성하는균주를선별하였으며, 선별된균주를 5% sheep blood agar 에서 3 회에걸친도말평판법을통한순수배양으로최종적으로세균을분리하였다. 분리세균을 LB (Luria-Bertani, Difco Co., Sparks, NV, USA) 액체배지에접종하고진탕배양기 (30 o C, 160 rpm) 에서배양을유지하며본실험에이용하였다 분리세균의형태학적관찰및생화학적특성조사분리세균을 LB 고체평판배지에도말하여단일집락의형태를관찰하고, 그람염색을실시하여위상차현미경을이용하여분리세균의형태학적특성을조사하였다. 또한분리세균에대한여러가지생화학적특성을조사하기위하여포도당이용여부, 녹말과젤라틴이용여부, citrate 이용여부, 인돌 (indole) 생성유무, methyl red-voges proskauer (MR-VP) 시험, catalase 와 oxidase 활성시험, klingler iron agar (KIA) 시험, 리트머스우유 (litmus milk) 시험등을실시하였다 분리세균의동정분리세균의동정을위해 GP2 Micro Plate 을사용하여다양한탄소원이용능력에근거한특성을조사하였다. 순수배양된단일집락을 5% sheep blood agar 에도말한후, 30 o C 에서 24 시간배양하였다. 배양된균주를생리식염수에현탁하여 GP2 Micro Plate 에접종한후, BIOLOG automated Micro- Station instrument 을이용하여각분리균주의탄수화물이용여부를조사하여균주를동정하였다 S rrna 염기서열분석및계통수작성분리세균의유전학적계통수 (phylogenetic tree) 를작성하고자, 16S rrna 에대하여 PCR (polymerase chain reaction) 을실시하였다. 8F primer (5 -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ) 와 1541R primer (5 -AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3 ) 를사용하여 16S rrna 유전자를증폭하였으며, PCR Premix (Gen- DEPOT, USA) 를이용하여 PCR 을수행하였다. 증폭된부분적인염기서열을 ABI373 Automated sequencer (Foster City, CA, USA) 를이용하여서열을결정하였으며, BLAST database (NCBI, Bethesda, MD, USA) 를통하여분석하였다. 분석된 16S rrna 염기서열은 Clustal X software ( clustal.org) 를이용하여정리하였으며 MEGA4 package (Biodesign Institute, Tempe, AZ, USA) 를이용하여계통수를작성하였다 분리세균 B. cereus MH-2 의농축배양상등액제조분리세균 MH-2 의용혈활성이생장기간동안생성되는독소에의해나타나는것인지확인하기위하여배양상등액을 5% sheep blood agar 에주입하여투명환 (clear zone) 의생성여부를관찰하였다. 먼저분리세균을 LB 액체배지에접종하여 30 o C 에서배양하였다. 배양기간중용혈활성의변화를확인하기위하여, 배양기간에따른배양상등액을 15 L 씩주입

3 용혈성 Bacillus cereus 의동정및특성조사 181 하여최대용혈활성을조사하였다. 48 시간동안배양된배양액을 4,000 rpm 에서 30 분간원심분리하여균체를제거하고, 상등액만취하여공극 0.45 m 인 syringe filter 로여과하여 cell debris 를제거한후동결건조하였다. 건조된시료를멸균된증류수에녹여 20 배로농축하였다 Zymography 분리세균의용혈환성을가지는단백질의분자량을측정하기위하여변형된 Leber 등 [9] 의방법으로 zymography 를실시하였다. Zymography 를위한시료는 20 배로농축된배양상등액을사용하였으며, zymography 의수행조건은 Kleiner 등 [10] 의조건에따라실시하였다. 전기영동완료후 gel 은 Triton X-100 에담구어 4 o C 에서 2 시간동안교반하여 gel 에남아있는 SDS 를제거하였다. SDS 를제거한 gel 을증류수로 3 회세척한후, 5% sheep blood agar 에부착하여 37 o C 에서 24 시간배양하여용혈활성을확인하였다. 용혈활성이일어나는부분의분자량을확인하기위하여용혈현상이일어난위치를표준마커와비교하여분자량의크기를확인하였다 NaCl 에노출된 B. cereus MH-2 의생존율측정 NaCl (sodium chloride) 노출에따른분리세균 MH-2 의생존율을알아보기위하여분리세균을 LB 액체배지에배양하였다. 대수생장기를거치면서파장 600 nm 에서혼탁도가 0.8 일때, 배양액을 10 분간원심분리 (4 o C, 13,000 rpm) 하여얻어진균체 PBS buffer 로 3 회세척하고, 다시동일조건하에원심분리를실시하여얻어진균체를다양한농도 (0~10%) 의 NaCl 에노출시켰다. 1 시간간격으로 LB 고체평판배지에 100 μl 씩평판도말하여 30 o C 에서 24 시간배양한후, 형성된집락을계수하여 NaCl 농도와노출시간에따른분리세균의생존율을각각조사하였다 스트레스충격단백질 (SSPs) 발현조사 NaCl 에노출된분리세균 MH-2 의스트레스충격단백질 (SSPs) 의발현변화를조사하기위하여 SDS-PAGE 와 Western blotting 을통하여 SSPs 의변화를조사하였다. 분리세균을다양한농도의 NaCl 에노출시킨후균체를회수하고 PBS buffer 로 3 회세척한후시료를준비하였다. 단백질추출은기존에기술된방법 [11] 에따라단백질을추출하였으며, Bradford 방법 [12] 으로각시료들을정량하였다. 추출한단백질을 Kim 등 [11] 의방법을따라 SDS-PAGE 를실시하였으며, SSPs ( 예, DnaK, GroEL) 의발현을조사하기위하여전기영동한 gel 을이용하여 western blotting 을수행하였다. Western blotting 에사용한 1 차항체는 anti-dnak 와 anti-groel (StressGen Biotechnologies Corp.) 을사용하였고, 2 차항체는 anti-mouse IgG HRP conjugate (Promega) 를사용하였다. 반응검출을위하여 Western blot detection system (GenDEPOT, Barker, TX, USA) 을사용하여 X-ray film (AGFA, Mortsel, Belgium) 에현상한후, 스트레스충격단백질의발현을비교분석하였다 NaCl 노출에따른세포외부형태관찰 NaCl 에노출된분리세균의외부형태변화를주사전자현미경을통하여관찰하였다. 세균을 LB 액체배지에접종하여 12 시간동안배양시킨후, PBS 로 3 회세척하여균체를준비하였다. 준비한균체를 10% 의 NaCl 에 4 시간동안노출시킨후, 배양액을원심분리하여균체를회수하고, 여과지에부착하여고정및탈수한후, hexamethyldisilazane (HMDS) 원액에 10 분간반응시켜공기중에서건조하였다. 건조시킨 membrane filter 를 slide glass 위에부착하여 sputter coater (IB-3, Giko Engineering Co., Tokyo, Japan) 를사용하여 gold coating 한후, 주사전자현미경으로관찰하였다. 3. RESULTS AND DISCUSSION 3.1. 분리세균의분리, 형태학적관찰, 특성조사시판되고있는쌈장으로부터균주를분리하여 5% sheep blood agar 에서투명대를형성하는용혈성 Bacillus cereus 를분리하여본실험에이용하였다. 분리세균을 LB 고체평판배지에도말하여배양된집락은크림색을나타내었으며, 그람염색후위상차현미경으로관찰한결과, 그람양성의간균으로관찰되었다. 분리세균에대하여다양한생화학적특성조사를실시하였다. Glucose, starch, gelatin 이용여부는모두양성으로, 그리고 indole 형성여부에있어서음성으로각각나타났다. Methyl red 시험은양성이었으며, voges-proskauer 시험은음성으로조사되었다. KIA 배지에서조사한 disulfhydrase 에의한 H 2 S 형성과 oxidase 존재여부는모두음성으로나타내었다. Litmus milk 시험에서는단백질을분해여산성으로나타났으며, 펩톤화 (peptonization) 는이루어지지않았다 분리세균의동정분리세균을동정하기위하여 BIOLOG 시스템을이용하였으며, 그람양성세균동정에이용되는 GP2 Micro Plate 에분리세균을접종하여나타난다양한탄소원이용여부에근거하여분리세균을동정하였다. 분리세균은 MicroLog database software 를이용한결과분석을통하여 Bacillus cereus 로동정되었으며, Bacillus cereus MH-2 로명명되었다 (Table 1) S rrna 염기서열분석및계통수작성분리세균 MH-2 의유전학적계통수작성을위하여 16S rrna 에대하여 PCR 을실시하였다. 1,138 bp 의부분적인염기서열을증폭하였으며, PCR Premix (GenDEPOT, USA) 를이용하여 PCR 을수행하였다. 변성 (94 o C, 30 초 ), 냉각 (60 o C, 30 초 ), 신장 (72 o C, 45 초 ) 의세단계를 35 회반복한후, 72 o C 에서 15 분간유지하였다. 증폭된염기서열데이터는 NCBI 의 Blast 를이용하여유전적상동성을비교하였다. 그결과, Bacillus cereus 와 99% 의유전적상동성을보여주었다. 이를바탕으로다른 Bacillus cereus 균주들과의유연관계를 Fig. 1 에제시하였다.

4 182 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 32(3): (2017) Table 1. Physiological and biochemical characterization of Bacillus cereus MH-2 using the BIOLOG analysis system Physiological & biochemical tests Water α-methyl-d-galactoside L-Malic acid α-cyclodextrin β-methyl-d-galactoside Methyl pyruvate β-cyclodextrin 3-Methylglucose Mono-methyl succinate Dextrin α-methyl-d-glucoside Propionic acid Glycogen β-methyl-d-glucoside Pyruvic acid Inulin α-methyl-d-mannoside Succinamic acid Mannan Palatinose Succinic acid Tween 40 D-Psicose N-Acetyl-L-glutamic acid Tween 80 D-Raffinose L-Alaninamide N-Acetyl-D-glucosamine L-Rhamnose D-Alanine N-Acetyl-D-mannosamine D-Ribose L-Alanine Amygdalin Salicin L-Alanyl-glycine L-Arabinose Sedoheptulosan L-Asparagine D-Arabitol D-Sorbitol L-Glutamic acid Arbutin Stachyose Glycyl-L-glutamic acid Cellobiose Sucrose L-Pyroglutamic acid D-Fructose D-Tagatose L-Serine L-Fucose D-Trehalose Putrescine D-Galactose Turanose 2,3-Butanediol D-Galacturonic acid Xylitol Glycerol Gentiobiose D-xylose Adenosine D-Gluconic acid Acetic aicd 2-Deoxy adenosine α-d-glucose α-hydroxybutyric acid Inosine m-inositol β-hydroxybutyric acid Thymidine α-d-lactose γ-hydroxybutyric acid Uridine Lactulose p-hydroxy-phenyl acetic acid Adenosine-5'-monophosphate Maltose α-ketoglutaric acid Thymidine-5'-monophosphate Maltotriose α-ketovaleric acid Uridine-5'-monophosphate D-Mannitol Lactamide D-Fructose-6-phosphate D-Mannose D-Lactic acid-methyl ester α-d-glucose-1-phosphate D-Melezitose L-Lactic acid D-Glucose-6-phosphate D-Melibiose D-Malic acid D-L-α-Glycerol phosphate +: Positive reaction, : Negative reaction. Fig. 1. Phylogenetic analysis of B. cereus MH-2 ( ) related Bacillus cereus group based on 16S rrna sequence comparisons. Bar, substitutions per nucleotide position.

cereus MH-2. Gels were stained Coomassie brilliant blue R-250 (A), and zone of hemolysis was shown by the overlapped gel on 5% sheep blood agar (B). M, marker; S, 20-fold concentrated sample. 3.4.

5 용혈성 Bacillus cereus 의동정및특성조사 183 Fig. 2. Time course of hemolytic activity from concentrated B. cereus MH-2. Clear zones were measured during the incubation period of (a) 6 h, (b) 12 h, (c) 24 h, (d) 36 h, (e) 48 h, respectively. Fig. 3. SDS-PAGE and zymographic analysis of concentrated supernatant form the B. cereus MH-2. Gels were stained Coomassie brilliant blue R-250 (A), and zone of hemolysis was shown by the overlapped gel on 5% sheep blood agar (B). M, marker; S, 20-fold concentrated sample 분리세균의배양기간중의용혈활성변화배양기간중분리세균 MH-2 가생성하는용혈독소의용혈활성의변화를관찰하였다. 용혈독소의최대활성을조사하기위하여분리세균을 LB 액체배지에접종하여 48 시간동안매 6 시간마다배양액을취하여 5% sheep blood agar 에주입하여생긴용혈환의크기를비교하였다. 용혈환은배양 6 시간후부터관찰되었으며, 용혈환의크기는배양 48 시간경과후최대활성을보여주었다 (Fig. 2). Beecher 등 [13] 은젤확산법 (gel diffusion assay) 을통하여용혈성 B. cereus 의용혈패턴을분석한결과, 배양 30 분부터용혈환이생성되는것을관찰하였으며, 28 o C 에서 36 시간배양하였을때최대활성을관찰하였다고보고하였다. B. cereus 에의해발생하는용혈현상은설사형독소인 Hbl 에의해일어나며 [14], 또한그활성은온도, ph 등의환경요인에의해변화된다는것이보고되었다 [15]. 따라서 B. cereus 에서용혈활성을조사하는것은사람의건강에관련되는중요한사항으로, 용혈활성을가지는 B. cereus 에서독소생성의최소화를위한부가적인연구가필요할것으로보인다 분리세균이생성하는용혈독소의분자량측정분리세균 MH-2 가생성하는용혈독소의분자량은 zymography 를통하여확인되었다. 배양중인 MH-2 에서생성되는용혈독소의분자량을측정하기위하여 zymography 를수행한결과, 용혈독소의크기는약 28~30 kda 로관찰되었다 (Fig. 3). 발표된연구결과에따르면용혈독소인 hemolysin 은용혈성을가지는균주에따라위치가다양하게관찰되는것으로보고되었다. Allison 등 [16] 은용혈성 E. coli 와 P. melaninogenica 에서 zymography 를수행한결과, hemolysin 의분자량은약 39~45 kda 로, Yang 등 [17] 은 Vibrio vulnificus 에서생성하 Fig. 4. Survival of B. cereus MH-2 cells after exposure to NaCl. MH-2 cells were maintained at the concentrations of 0% ( ), 2.5% ( ), 5% ( ), 7.5% ( ), and 10% ( ) NaCl. Error bars represent standard deviations based on three independent replicates. 는 hemolysin 의분자량은약 45 kda 정도로보고하였다. 또한 Rossignol 등 [18] 은용혈현상에관여하는 phospholipase C 의분자량이약 40 kda 에서관찰되었다고보고하였다. 따라서 hemolysin 은용혈현상을나타내는균주의종류에따라크기가다양한것으로판단되며, 분리세균에서관찰된용혈독소의명확한규명을위해서보다추가적인연구가필요할것으로사료된다.

184 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 32(3): 179-186 (2017) 3.6. NaCl 에노출된 B. cereus MH-2 의생존율측정다양한 NaCl 농도와노출시간에따른분리세균 MH-2 의생존율을조사하였다.

5% NaCl 에노출된세균과미노출된세균에서의생존율차이는거의관찰되지않았으며, 5% NaCl 에노출된세균에서는노출 4 시간이내에생존율이감소하였으나, 6 시간이후에는다시생존율이증가하였다고보고하였다. 세포생존율의감소는세포외부의급격한삼투압의변화로인한세포막손상에기인한다고보고하였으나, 노출 6 시간이후생존율이증가하는이유에대해서는제시하지못하였다 [19]. B.

6 184 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 32(3): (2017) 3.6. NaCl 에노출된 B. cereus MH-2 의생존율측정다양한 NaCl 농도와노출시간에따른분리세균 MH-2 의생존율을조사하였다. NaCl 에노출된분리세균 MH-2 의생존율은노출시간과농도에비례하여집락수가점차감소하는양상을보여주었으며, 10% NaCl 에노출된분리세균의생존율은감소하여노출 5 시간이후집락이관찰되지않았다 (Fig. 4). Besten 등 [19] 은 0~5% 의 NaCl 에노출된 B. cereus ATCC 에서세포의생존율을조사한결과, 2.5% NaCl 에노출된세균과미노출된세균에서의생존율차이는거의관찰되지않았으며, 5% NaCl 에노출된세균에서는노출 4 시간이내에생존율이감소하였으나, 6 시간이후에는다시생존율이증가하였다고보고하였다. 세포생존율의감소는세포외부의급격한삼투압의변화로인한세포막손상에기인한다고보고하였으나, 노출 6 시간이후생존율이증가하는이유에대해서는제시하지못하였다 [19]. B. cereus 는내생포자를형성하는세균으로 NaCl 에서는노출초기의삼투압변화로세포막이손상되어생존율의감소가관찰된다고알 려져있다는정도로알려져있으며, 식품에존재하는 B. cereus 의 NaCl 에대한저항성과관련된연구는그중요성에비하여명확한결과가제시되어오지못한것이사실이다. 향후저염도식품의식품안전기준을마련하기위한추가적인연구들이필요할것으로사료된다 스트레스충격단백질의발현조사분리세균 MH-2 가다양한농도의 NaCl 에노출되었을때, 스트레스충격단백질 ( 예, DnaK, GroEL) 의발현양상을조사하기위하여 SDS-PAGE 와 Western blotting 을실시하였다. 다양한농도의 NaCl (0~10%) 에노출된 MH-2 에서노출농도와시간이증가함에따라약 70 kda 의 DnaK 와 60 kda 의 GroEL 의발현양은점차감소하는것으로관찰되었다 (Figs. 5 와 6). Periago 등 [20] 은외부요인 ( 예, 4% ethanol, ph 5, 2.5% NaCl) 의특정조건에노출된 B. cereus 에서여러가지종류의열충격단백질의발현에대하여연구하였으며, 이들요인에노출 30 분경과후, 열충격에대한내성이증가하였다고보고하였 Fig. 5. Induction of stress shock protein (SSPs) in B. cereus MH-2 treated with different NaCl concentrations for 3 h; 0 % (lane 1), 2.5% (lane 2), 5% (lane 3), 7.5% (lane 4), 10% (lane 5). The SSPs were analyzed by SDS-PAGE (A), and western blot with anti-dnak (B), and anti- GroEL (C) monoclonal antibodies, respectively. DnaK and GroEL signals were decreased depending on the increasing NaCl concentrations. Fig. 6. Induction of stress shock proteins (SSPs) in B. cereus MH-2 treated with 10% NaCl for different exposure period; 0 h (lane 1), 1 h (lane 2), 2 h (lane 3), 3 h (lane 4), 4 h (lane 5). The SSPs were analyzed by SDS-PAGE (A), and western blot with anti-dnak (B), and anti-groel (C) monoclonal antibodies, respectively. DnaK and GroEL signals were gradually decreased depending on the increasing NaCl exposure period.

7 용혈성 Bacillus cereus 의동정및특성조사 185 Fig. 7. Scanning electron micrographs of B. cereus MH-2. (A) untreated cells, (B) cells treated with 10% NaCl for 3 h. 다. DnaK 와 GroEL 은손상된단백질을정상으로회복시키는역할을하는열충격단백질로서, E. coli 에서처음발견되어발현조사가이루어졌으나, 최근전통장류의제조공정에서사용되는 B. subtilis 에서뿐만아니라, 식중독세균인 Salmonella, Aeromonas 등에서도외부환경변화에의해발현이유도되는것으로보고되었다 [20-22]. 본연구는 Western blot 기법을이용하여 B. cereus 에서 NaCl 의다양한농도와노출시간에따른결과를보여주는것으로스트레스충격단백질의변화패턴을관찰한연구결과는거의보고된바없다 NaCl 노출에따른세포외부형태관찰분리세균 MH-2 가 NaCl 에노출되었을때발생되는세포외부형태의변화를주사전사현미경을이용하여관찰하였다. NaCl 에미처리된 MH-2 세포는정상적인둥근간균으로보여주었으나, 10% 농도의 NaCl 에노출된세균은세포의표면이심하게손상을입은것으로관찰되었다 (Fig. 7). B. cereus 세포외부의형태적변화는녹차카테킨인 EGCG 에노출되었을경우에다른양상으로일어난다는것이보고되었다. Kim 등 [11] 은 EGCG 에노출된 B. cereus 에서노출농도및시간이증가함에따라세포표면이울퉁불퉁해지고, 특정부분이돌출되는것을보고하였으며, Shigemune 등 [23] 은 B. cereus JCM 2152 세포가 EGCG 에노출되었을때세포표면이심하게주름이지고, 손상되는모습을관찰하였다. 본연구에서는 NaCl 에노출되었을때일어난형태적변화를관찰한것으로 EGCG 노출에서관찰된것에비하여더욱손상된것으로나타났는데, 노출물질의종류에따른손상기작이다른지에대한연구는추가적인연구가필요할것으로사료된다. 최근에 B. cereus 에의한식중독사례가증가하는추세에있어식중독세균으로서의 B. cereus 가관심의대상이되고있다. 특히본연구에서국민들의기호식품인쌈장에서용혈성 B. cereus 가검출된것은상온으로유통되고있는장류의식품안전성에대한적신호로이를극복하기위한대안이필요한상황이다. 최근국민건강을위하여장류, 젓갈류등의저염화가이루어지고있으나, 저염도에서다양한식중독세균 의생존이지속적으로보고되고있다. 따라서식품안전을위하여저염도의기준을정하는것이주목받고있다. 향후본연구에서의결과를바탕으로용혈성 B. cereus 가생산하는용혈단백질의특성과저해기작의규명에대한연구가진행되어야할것이다. 4. CONCLUSIONS 본연구는시판되는쌈장에서용혈성의 Bacillus cereus MH-2 를분리동정하고특성조사를하기위하여수행되었다. 먼저 MH-2 의생리학적및생화학적특성을조사하였다. 분리균주는 BIOLOG 분석시스템을사용하여 B. cereus MH-2 로동정하였다. MH-2 의 16S rrna 염기서열비교분석하여유전학적계통수를작성하였다. MH-2 배양액으로채워진 sheep blood 평판배지의 wells 주변에서용혈활성이관찰되었으며, 용혈대는 MH-2 배양액의배양시간에따라서서히증가하였다. Zymography 분석을통해서용혈현상의원인이되는분자의분자량은약 30 kda 가량되는것으로관찰되었다. MH-2 세포의생존율은배지내에포함된 NaCl 의농도에따라감소하였다. 스트레스충격단백질생성 ( 예, DnaK 과 GroEL) 은 NaCl 의농도와노출시간증가에따라감소되었다. 대수생장기의배양에서 70-kDa DnaK 와 60-kDa GroEL 의스트레스충격단백질은 NaCl 농도증가와노출기간이길어짐에따라발현은비례하여감소되는것이 SDS-PAGE and Western blot 분석을통해서관찰되었다. NaCl 에처리된세포에서구멍이뚫리고주름이있는불규칙한형태가주사전자현미경분석을통해서관찰되었다. Acknowledgements 본연구는순천향대학교의학술연구지원사업의일부지원으로수행되었음.

8 186 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 32(3): (2017) REFERENCES 1. Kwon, S. H., K. B. Lee, K. S. Im, S. O. Kim, and K. Y. Park (2006) Weight reduction and lipid lowering effects of Korean traditional soybean fermented products. Kor. J. Food Sci. Nutr. 35: Kwak, C. S., M. S. Lee, and S. C. Park (2007) Higher antioxidant properties of cheonggukjang, a fermented soybean paste, may be due to increased aglycone and malonylglycoside isoflavone during fermentation. Nutr. Res. 27: Park, Y. B., J. B. Kim, S. W. Shin, J. C. Kim, S. H. Cho, B. K. Lee, J. J. Ahn, and D. H. Oh (2009) Prevalence, genetic diversity, and antibiotic susceptibility of Bacillus cereus strains isolated from rice and cereals collected in Korea. J. Food Prot. 72: Granum, P. E. and T. Lund (1997) Bacillus cereus and its food poisoning toxins. FEMS Microbiol. Lett. 157: Do, S. D., Y. M. Lee and H. G. Chang (1993) The study on kinds and utilities of jeot-kal (fermented fish products). Kor. J. Soc. Food Sci. 9: World Health Organization (2007) Reducing salt intake in populations. Report of a WHO Forum and Technical Meeting, Geneva, Switzerland. 7. Choi, S. A. and M. S. Cho (2012) Changes in quality characteristics of eggplant pickles by salt content and drying time during storage. J. Kor. Soc. Food Cult. 27: Raevuori, M. and C. Genigeorgis (1975) Effect of ph and sodium chloride on growth of Bacillus cereus in laboratory media and certain foods. Appl. Microbiol. 29: Leber, T. M. and F. R. Balkwill (1997) Zymography: A single-step staining method for quantitation of proteolytic activity on substrate gels. Anal. Biochem. 249: Kleiner, D. E. and W. G. Stetlerstevenson (1994). Quantitative zymography: Detection of picogram quantities of gelatinases. Anal. Biochem. 218: Kim, D. M., S. K. Park, and K. H. Oh (2016) Cellular responses and proteomic analysis of hemolytic Bacillus cereus MH-2 exposed to epigallocatechin gallate (EGCG). Kor. J. Microbiol. 52: Bradford, M. M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: Beecher, D. J. and A. C. Wong (1994) Identification of hemolysin BL-producing Bacillus cereus isolates by a discontinuous hemolytic pattern in blood agar. Appl. Environ. Microbiol. 60: Beecher, D. J., J. L. Schoeni, and A. C. Wong (1995) Enterotoxic activity of hemolysin BL from Bacillus cereus. Infect. Immun. 63: Dietrich, R., C. Fella, S. Strich, and E. Märtlbauer (1999) Production and characterization of monoclonal antibodies against the hemolysin BL enterotoxin complex produced by Bacillus cereus. Appl. Environ. Microbiol. 65: Allison, H. E. and J. D. Hillman (1997) Cloning and characterization of a Prevotella melaninogenica hemolysin. Infect. Immun. 65: Yang, H. O., M. S. Cha, and M. J. Kim (1998) Studies on the hemolysin produced by Vibrio vulnificus ys-1. Kor. J. Life Sci. 8: Rossignol, G., A. Merieau, J. Guerillon, W. Veron, O. Lesouhaitier, M. G. Feuilloley, and N. Orange (2008) Involvement of a phospholipase C in the hemolytic activity of a clinical strain of Pseudomonas fluorescens. BMC Microbiol. 8: den Besten, H. M., C. J. Ingham, van Hylckama Vlieg, J. E., Beerthuyzen, M. M., M. H. Zwietering, and T. Abee (2007). Quantitative analysis of population heterogeneity of the adaptive salt stress response and growth capacity of Bacillus cereus ATCC Appl. Environ. Microbiol. 73: Periago, P. M., W. van Schaik, T. Abee, and J. A. Wouters (2002) Identification of proteins involved in the heat stress response of Bacillus cereus ATCC Appl. Environ. Microbiol. 68: Chuang, S. E. and F. R. Blatiber (1993) Characterization of twenty six new heat shock genes of Escherichia coli. J. Bacteriol. 175: Kim, D. M. and K. H. Oh (2016) Characterization of hemolytic Aeromonas sp. MH-8 responding to the green tea catechin, EGCG. KSBB 31: Shigemune, N., M. Nakayama, T. Tsugukuni, J. Hitomi, C. Yoshizawa, Y. Mekada, M. Kurahachi, and T. Miyamoto (2012) The mechanisms and effect of epigallocatechin gallate (EGCg) on the germination and proliferation of bacterial spores. Food Control 27:

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04_HM hwp Korean Journal of Microbiology (2016) Vol. 52, No. 3, pp. 260-268 pissn 0440-2413 DOI http://dx.doi.org/10.7845/kjm.2016.6044 eissn 2383-9902 Copyright c 2016, The Microbiological Society of Korea Article