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세창 뇌
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1 원전이벼 미너겨 μdn11 보 학셔시7r 과ιζ대한임상병리사회지 : 제 19 권제 1 호 1987 Neisseria gonorrhoeae 보존에대한배지의비교과꺼t 랜상희조선대학교대학원 박정평 원광대학교문리과대학화학과 김영옥 Comparison of Various Storage Media for the Preservation of Neisseria gonorrhoeae Shin Moo Kim, Sun Hee Park Dept. 01 Clinical Pathology, Won Kwang P.μ blic Health Junior College Chung Pyong Park The Grad;μα te School, Chos;μη University Young k Kim Dept.ol Chemistry, the College 01 Liberbel Arts aηd Sciences, Won Kwang University = Abstract= To seek a inexpensive and simple method to preserve Neisseγ'ia gonor 깨 oeae, a few methods were compared. The authors also gave the method a trial the survival of the strains according to temperature during transit from transport media. The following results were obtained. The following methods kept the culture alive for a week : tryptic soy agar with 15 % glycerol at -20 o C : 10% skim milk at -20 o C ; cystine tryptic agar at 35 0 C. Gonococci survived for more than 8 weeks in the one half strength dextrose starch agar and one half strength dextrose starch with VCN, but GC medium-1/2 could be preserved for average 4.4 weeks. It is recommended that preservation of gonococci in one half strength dextrose starch agar with VCN, which produces less frequent contamination is a practical to maintain cultures for teaching and quality control. The survival period of gonococci with Stuart s transport media at 35 0 C, room temperature and 4 oc were retained for 24 hours respectively. Stuart s transport with 1 % charcoal survived for more than 4 days at room temperature and 4 oc, but alive for 24 hours at 35 0 C -11-

2 1 서론 Neisseria gonorrhoeae 는성병중에서흔히발생 하는 1) 임질의원인균으로세계적인전염성질환이 며주로생식요도계에감염이많은호기성세균이 다 2) 이세끌은분리배양이복잡할뿐아니라오랫 동안보관하는것이매우까다봅다 3) 그러나이균 주의세균학적연구와역학적조사옥적으록임상검 체에서분리한균주의보존이필요하며, 교육용과 정도관리를위해서도매우중요하다. 셰균의보존방 법은동결건조 4) (lyophilization) 법이널리알려졌지 만장비구입이비싸고, 술식이복잡하여소규모실 험실에서는용이하지않으며액체질소 5) 에넣어동 결시키는방법역시쉬운일은아니다. 그러나 Vera 는 1948 년에 cystine tryptic aga~) 를 Difco (1971 년 ) 회사는 dextrose starch agar- 1! 2 7) 을각각 35 0 C 에 서임균의보존을시도하였다. 이방법들은특이한 기구와복잡한술식없이상품화된배지로쉽게준비 할수있다. La scolera 는 tryptic soy broth with 15% glycerol (TSB-G) 에임균을접종하여 C 에보존하면오랫동안생존하는것을보고하였다. 본실험실에서일반셰균은주로 10% skim milk 어 l 접종하여 C 에보존하고있다. 본연구에서 TSB-G 와 10% skim milk 는 C 에 CT A-D, DSA -1/2 빛 GC medium base -1/2 배지는 35 0 C 에서임균의생존기간을비교하였다. 임 률은산소분압이낮은조건에서는저온에생존이더 오래지속되는것으로알려졌다 9) 임상검체수송에 많이이용되는 Stuart s transport 배지는검체를면 봉으로채취하여설온보관으로많이이용되고있다. 그러나 Neisse 깨 a gonorγhoeae 는한천에포함된지 방산에의해서억제된다고하였으며 Klaesson 은지 방산을중화시키기위해서 charcoal 과같은흡착제 를첨가하는것을보고하였다 10) 또한본설험은 Neisseria gonorrhoeae 를임상검체에서분리배양하 기위해서수송배지로써사용되고잇는 Stuart s transport 배지와 Stuart s transport with charcoal 을 35 0 C, 실온빛 4 0 C 에보존하여생존을비교하였 다. 11. 실험재료및방법 TSB(Difco) 에 15 % glycerol 을넣은 TSB-G 와 10% skim milk 를나사마개시험관에.5ml 씩넣어 I 궐캄하였다. CT A (Difco) 에 o. 5 % dextrose 를넣은 CT A-D, DSA -1/2, DSA -1/2 with VCN 및 GC medium-1/2 은 75x100mm 나사마개유리시험관 에넣어준비하였다. DSA-1/2 성분은 proteose peptone N 0. 3 (Difco) 0.75 %, bacto dextrose. 1%, soluble starch (Difco) 0.5%, sodium chloride 0.25%, disodium phosphate 0.15%, gelatin 1 %, bacto agar 0.5%, 25 0 C 에 ph 7.3:t 0.2 이며상품화된 DSA -1/2 (Difco) 는 1, 000ml 증 류수에 32.5g 을녹혀사용했다. DSA - 1/2 with VCN 은 DSA-1/2 을멸늄후 50 0 C 에식혀서 1% VCN (BBL) 을넣었다. GC medium base - 1/2 은 이배지에 0.45% soluble starch, 1 % gelatin 빛. 1 % dextrose 를첨가하였다. Neisse 서 'a gonorrhoeae 는 1987 년 5- 월에전북 옥구군보건지소에서 Thayer Martin 배지를사용 해서분리한균주이며 chocolate 에 24 시간계대배양 하여사용하였다. TSB-G 와 10% skim milk 에 3 mm loop 를이용해서 chocolate agar 에배양된집 략을두껍게접종하여마개를꽉막고즉시 C ( 냉동고 ) 에넣었다. CT A-D, DSA -1/2, DSA -1/ 2 with VCN 맺 GC medium base-1/2 은증류수 5ml 에 chocolate agar 에서집락을채취하여 MacFarland nephelometer N.3 시험관의탁도 에맞추어멸균된 Pasteur pipette 으로균부유액을 3-4 방울씩떨어뜨려 3mm loop 로천자하여접 종하였다. 접종된배지는마개를막고 35 0 C 에보관 한후 gonococci 의생존을확인하기위해서 1-2 주마다계대배양하였다. TSB-G 와 10% skim milk 는냉동고에서꺼내어빨리녹인다음즉시배양 하였다. 계대배양은 chocolate agar 에 3mm loop 로접종하여 35 0 C 에 48 시간 candle jar 로배양후육 안적으로판단하여집략이보이면생존균주록판정 하였다 실험성적 1987 년 5- 월사이에전북옥구군보건지소에 서외래환자로부터분리한 Neisseria gono γrhoeae 주를이용하여기초실험으로 TSB-G, 10% skim milk 어 l 접종후 C 에보관한바 주모두각각 의배지에서 1 주간생존하였으며 CTA-D 역시 35 0 C 에서동일하였다. 그러나가장생존기간이좋은 배지는 DSA-l l2 이었으며 균주모두 4 주이상 보존되었다 (Table 1). 이결과로 DSA-1/2 에서더규명하기위해서 gonococci 보존배지로선택하였다. DSA-1/2, DSA -1/2 with VCN 및 GC medium -1/2 에 균 주를접종하였다. DSA-1/2 과 DSA -1/2 with VCN 은생존기간이각각 8 주 ( 평률 10 주 ) 이상이었 12

3 Table 1 Survival time of N 낭 issι 11<α gìl rrlzoeaι cultures on various storage media -20 0C Numbers of culture 35 0 C Survival (\Veekl less than TSB \vith 15% glycerol o TSB : tryptic soy broth CT A : cystine tryptic agar Skim milk 10% 0 DSA - 1/2 : 1/2 strength dextrose starch agar. CTA with 0.5% dextrose DSA-1/2 ou U ζu으며 GC medium -1/2 은 4-5 주 ( 평균 4.4 주 ) 였 다 (Table 2). 임상겸체수송용배지인 Stuart s transport 배지 는 35 0 C 에서 gonococci 의생존기간이 1-4 일 ( 평 끌 1. 9 일 ), 실온에 1-4 일 ( 평균 2.2 일 ) 및 4 0 C 에 서는 1-3 일 ( 평균 2 일 ) 였으며 Stuart s transport with charcoal 은 35 0 C 에서 1 일실온에서 4 - 일 ( 평균 4.7 일 ), 4 oc 에서 4-7 일 ( 평균 5 일 ) 였 cf- (Table 3). Table 3. Survival time of Neisseria gonorrhoeae cultures in Stuart s transport and Stuart s transport with 1% charcoal medium Survival (day) 1i? Stuart s transport Stuart s transport medium with 1% charcoal medium RT 이4 0 C q/ι/ nι끼/ qj A35 0 C AA1 n 끼?ι35 0 C F RT 4 0 C Table 2. Survival time of Neisseria gonorrhoeae cultures in DSA -1/2, DSA -1/2 with VCN and GC medium base-1/2 Survival (Week) m m Total Mean survival time DSA-1/2 au Aa1 N umbers of cultures GC medium ou ι / 4-디UP?i Total Mean 1.9 survival time base-1/2 3 j4 nι nι 9.3 DSA-1/2 with VCN n/ j IV. 고 2 찰 n 1 Aa1 n4 n 4.7 Neisseria gonorrhoeae 는주로생식요도계에감염 이많으나불임빛신생아결막염등의질환이매우 심각하다 11) 이셰균분리율은정등 12) 의보고에의 하면특정집단에서 198 년에 22.7% 였고권등 13) 은 년사이의종합병원입원빛외래환자중 남자생식기에서 13.9%, 여자생식기에서 4.8% 그 리고눈검체는 3.3% 였다. 미국에서임질은 1950 년 에급증하였고 1), 1980 년대부터는일부선진국 14, 15, 1) j4 n/ ] -13-

뿐아니라우리나라에서도 Chlamydia trachomatis 감염이 Neisse,ψ gonorγhoeae 보다도더많다는보 고가 1ψ) 관심의대상이되고있으나아시아일부빛 아프리카에서임균감염환자가많은것으로알려졌 다 18) 또한최초로 197 년에 PPNG (penicillinase producing Neisse 서 'a gonorrhoeae) 가분리되었고아

4 뿐아니라우리나라에서도 Chlamydia trachomatis 감염이 Neisse,ψ gonorγhoeae 보다도더많다는보 고가 1ψ) 관심의대상이되고있으나아시아일부빛 아프리카에서임균감염환자가많은것으로알려졌 다 18) 또한최초로 197 년에 PPNG (penicillinase producing Neisse 서 'a gonorrhoeae) 가분리되었고아 시아지역중필리핀이나싱가폴에서처음발생지역 으로추측하고있으며 19, 20) 국내에서는 1979 년에정 등 21) 에의해서 1 예가분리되었다. CDC 는 년사이에미국에서이균주의분리수는 2419 명 22), 싱가폴에서는 23) 1979 년에 32.1%, 국내에 서는 1982 년에 34.1%, 1983 년에 38.% 였으나 1984 년에는약간감소되었다 13) 그러나최등 24) 은특수 지역대상에서 1984 년 12 월 년 3 월사이에 gonococci 의분리율은 25.3% 였으나 PPNG 는 50. % 의매우높은치를보고하였다. PPNG 출현으로 임균에대한관심은더욱높이지고있으며이균주 에대한세균학적연구및역학조사목적으로보존 은매우중요하다하겠다. Neisse 깨 'a gonorrhoeae 의배양은 시간이적 당한것으로알려져있으나 25, 2, 27) chocolate agar 에 서는접종후 3TC candle jar 에배양시 48 시간까지 생존하였으며 TSB-G 와 10% skim milk 는 C 에서 1 주정도보존되는것은정등 12) 의보고와비 슷하였다. CTA 에서 gonococci 는 35 0 C 에서 10 일또 는그이상생존 ) 하는것으로알려졌으나이실험에 서는 CTA-D 를사용하여 1 주정도로짧았으며정 등 12) 은평균 2 주정도보존되는것으로보고하였 다. Gonococci 보존의가장좋은방법은 % 젖당 (lactose) 이포함된 tryptic soy broth 에서동결건조 (lyophilization) 시켜 4 0 C 에보관하는것이다 (Heckly, 191).28) 그러나소규모실험실에서는이 러한조건이어려우며실제적으로경제적이면서간 단히준비할수있는보존배지로서 DSA-1/2 이추 천된다. 이배지에서 35 0 C 에보관시평균 9.3 주로 Difco 회사 7) - 8 주보다는다소연장되었으나정 등 12) 의평균 9. 주와는비슷하였다 Neisseria gonorrhoeae 는냉온과자가용해에감수 성이있으므로종종계대배양이필요하다. 계대배양 시섬요 (fimbriae) 와같은중요한항원인자는상실 할수있으므로 18) 이런분야의연구를위해서는이 인자의보존도시도되어야겠다. DSA-1/2 은 35 0 C 에서 gonococci 보존시다른세군과곰망이가종종 오염되기도한다. 이러한문제점을해결하기위해서 는 Thayer-Martin 배지에첨가하는항생제즉 vancomycin, colistimethate 및 nystatin 을포함시 킨 DSA -1/2 with VCN 을 35 0 C 에서보존시평균 10.7 주가생존되었으며정등 12) 의평균 11.5 주와는 큰차이는없었다. 또한 GC medium -1/2은정등 12) 에의하면 ph 7.2에서 DSA~1/2과비슷한것 으로보고되었으나본실험에서는평균 4.4 주로써 생존기간이매우짧았다. Stuart s transport 배지에서온도에대한임균의 보존은잘안려지지않았다. 본실험에서는 35 0 C 에 평균 1. 9 일, 실온빛 4 0 C 에서는각각 2.2 일, 2 일 이었으며, 온도에따른큰차이는없었다. 이수송 배지에서임균의안전한수송을위해서는 24 시간이 내해야겠다 Ley 와 Mueller 는 194 년에일반한천 에들어있는지방산은 Neisseria 와같은균주에해 로운것으로보고하였다 1 이일반적으로국내종합병 원에서겸체채취시주로면봉을사용하고있기때 문에만약면봉에지방산이있다면 Neisse 서 a gonorrhoeae 의배양에영향이미칠것으로생각된 다. Klaesson 은이와같은지방산을중화시키기위 해서활성탄과같은흡착제훈합을발표하였다 10) 한편 Short 등은 9) gonococci 에대해서혐기성조건 에서는 3TC 보다 2TC 에더잘보존되는것으로보 고하였다. 저자들은 Stuart s transport 배지에 1% 활성탄 (activated charcoal) 을넣은배지에서온도 에따라생존기간을비교한바 35 0 C 에서는 1 일, 실 온에서는 4- 일 ( 평균 4.7 일 ), 그리고 4 0 C 에서 는 4-7 일 ( 평균 5 일 ) 이생존하였다. Neisseria gono γrhoeae 배양목적으로검체를수송하기위해서 는 Stuart s transport with charcoal 배지를사용하 면은실온빛 4 0 C 에서 4 일까지는안천하게보존될 수있다하겠다. V. 결론 Neisse 서 a gono γrhoeae 의보존을위해서경제적이 면서간단한방법을알기위해서몇가지배지를비 교하였다. 저자들은수송배지에서수송하는동안온 도에따라균주의생존을시도하여다음과같은결 론을얻었다. Tryptic soy broth with 15 % glycerol 과 10% skim milk 는 C 에 cystine tryptic agar 는 35 0 C 에보존시 1 주생존하였다. DSA-1/2 과 DSA -1/2 with VCN 8 주이상생존 하였지만 GC medium base -1/ 2 은평균 4.4 주보존 되었다. 오염된세균을억제시키고임균을보존할 수있는 DSA -1/2 with VCN 은교육용과정도관리 목적으로사용할수있는추천되는배지이다. Stuart s transport 배지에서 35 0 C, 실온빛 4 0 C 에 gonococci 의생존기간은각각 24 시간이었다. Stuart s transport with charcoal 에서실온빛 4 0 C -14-

5 에 4 일이상생존하였 A 나 35 0 C 에서는 24 시간이었 다. 참고문헌 1. Spencer, D. J., and Staff of laboratory division. Emerging diseases of man animals. 25 : 45, Koneman, E. W., Allen, S. D., Dowell, Y. R., and Sommers, H. M. : N eisseria in color atlas and textbook of diagnostic microbi 이 ogy, Lippincott, 1983, p Stokes, E. J. : Clinical bacteriology, 3rd ed. London Edward Arnold, 1970, p Bartlett, R. C. : Medical microbiology. Quality cost and clinical relevance. N ew Y ork J ohn Wiley and Sons, 1974, p Ward, M.E., Watt, P.J.: The preservation of gonococci in liquid nitrogen. J. Clin. Path., 24: 122 ~ 123, Vera, H. D. : A simple medium for identification and maintenance of the gonococcus and other bacteria. J. Bact., 55: 531 ~ 535, Difco : Difco manual of dehydrated culture media and reagents for microbial and clinical laboratory procedures, 9th ed. Detroit Difco laboratories, 1971, p La Scolea, L.J. Jr., Dul, M.J., Young, F. E. : Stabi1ity of pathogenic colony types of Neisse1ψ gonorγhoeae in liquid culture by using the parameter of colonal morphology and deoxyribonucleic acid transformation. J. Clin. Microbiol., 1: 15 ~ 170, Short, H. B., Clark, V. L., Kellogg, JR. D.S., and Young, F.E.: Anaerobic survival of clinical isolates and laboratory strains of Neisseria gonorrhoeae: Use in transfer and storage. J. Clin. Microbiol., 15 : 915~919, Gibco. : Products for microbiology, 2nd ed. Gibco, 1983, p Holms, K. K., and Martin, D.: Sexually transmitted disease. Postgrad. Med , Chong, Y., Kim, S. 0., Lee, S. Y. : Modified dextrose srarch agar for the preservation of Neisseria go η orrhoeae. Yonsei Med. J., 19: 70~74, Kwun, Y.J., Chong, Y., Lee, S.Y. Isolation of Neisseria gonorrhoeae at Y onsei medical center in 1975~ 1984 and penicillinase producing and antimicrobial susceptibility of the is 이 ates. J. Korea Soc. Microbiol., 20: 13 ~ 171, Kiviat, N. B., Paavonen, J. A., Brockwav, J., Critcholw, C.W., Brunham, R.C., Stevens, C.E., Stamm, W.E., Kuc, C.C., ReRouen, T., and Holms, K. K. : Cytologic manifestations of cervical and vaginal infections. J. Am. Med. Assoc., 253: 989, Schachter, J., and Caldwell, H. D. Chlamydia. Ann. Rev. Microbiol., 34 : 285, Schachter, J. : Sexually transmitted Chlamydia trachomatis infection. Postgrad. Med., 72: 0, 김대원, 김혜연, 이갑노, 백승룡 : Chlamydia tγc1chomatis 감염에관한검색, 대한임상병리학 회지, 4: 99, WH Scientific Group: Neisse 서 a gonorrhoeae and gonococcal infections, WH, Geneva, Philips, 1.: Beta-lactamase producing penicillin resistant gonococcus. Lancet ii 5~57, Ash ford, W.A., Golash, R.G., and Hemming, V. G. Penicillinase-producing Neisseria gonorrhoeae. Lancet ii : 57, Chong, Y., Park, H.J., Kim, H.S., Lee, S. Y., and Ahn, D. W. : Isolation of β lactamase-producing Neisseria gonor γhoeae. Y onsei Med. J., 20: 133, Perine, P. L., Westbrook, W. G., Biddle, J.W., Lewis, ].S., and Martin, J.E., JR. : Culture medium for confirmation of penicillin-resistant and penicillinase - producing Neisseη~a gonorrhoeae, J. Clin. Microbiol., 15: 85~88, Yoshida, S., Urabe, S., and Mizugushi, Y. : Antibiotic sensitivity patterns of penicillinase-positive and pecillinase-negative strains of Neisseria gono γrhoeae isolated -15-

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( )Kju225.hwp 비임균성비뇨생식기감염에서 의진단적효용성 Usefulness of the Mycofast Test (MYCOFAST Evolution 2) for the Diagnosis of Nongonococcal Genitourinary Infections Hang Ro Park, Yang Hyun Kim, Ho Jae Lee, Jea Sang Oh, Hyoung Jin