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설아 주
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1 ORIGINAL ARTICLE Korean J Clin Lab Sci. 2016;48(4): pissn eissn Korean J Clin Lab Sci. Vol. 48, No. 4, December Analysis of the Effects of Bone Marrow Biopsy Decalcification Methods on Histopathological Examination Ji Young Park, Kyung Hee Han Department of Pathology, Yonsei University Severance Hospital, Seoul 03722, Korea 골수생검조직의조직병리검사에서탈회방법에따른결과분석 박지영, 한경희 연세대학교세브란스병원병리과 Decalcification is routinely performed to obtain a pathological diagnosis using bone marrow biopsy. During the decalcification process using a conventional acidic solution, such as HCl, the antigenicity of tissue is damaged. Especially DNA and RNA in the bone marrow are impaired. Hence, there is the need for a standardized decalcification protocol that preserves the antigenicity of tissue. To this end, we compared the effects of two commonly used decalcifiers: Commercial decalcifier (Calcl-Clear Rapid, HCl) and the EDTA (12.5%, ph 7.0). Bone marrow biopsies sampled from 71 patients were decalcified in accordance with the protocols of respective groups HCI versus EDTA. The differences of decalcification protocols were analyzed with respect to Hematoxylin & Eosin staining, Gomori sreticulum staining, and immunohistochemical staining and molecular analysis. Immunohistochemical staining used Ki-67, CD20 and CD138 as primary antibodies and molecular analysis was conducted through the DNA concentration analysis, in situ hybridization (ISH) and immunoglobulin heavy chain (IGH) gene rearrangement. On the routine histopathology analysis, there was no difference between HCl and EDTA. Moreover, in case of immunohistochemical staining, the cytoplasmic membrane or cytoplasmic CD markers was well preserved. However, nuclear proteins, such as Ki-67, were stained with low quality. Conversely, according to the molecular analysis, the EDTA protocol preserved the DNA and RNA compared with the HCI. The differences of DNA quantity and quality were statistically significant between protocols of HCl and EDTA. We used 38 cases in HCl and 12 cases in EDTA. Consequently, the EDTA protocol maintains the antigenicity of the protein on tissue and is acceptable for examination with molecular base analysis. Decalcification of bone marrow biopsy by EDTA is highly recommended for the examination of immunohistochemical staining and molecular analysis. Key words: Bone marrow biopsy, Decalcification, HCl, EDTA Corresponding author: Kyung Hee Han Department of Pathology, Yonsei University Severance Hospital, 50-1 Yonsei-ro, Seodaemun-gu, Seoul 03722, Korea Tel: Fax: hankh9121@yuhs.ac This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License ( which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Copyright 2016 The Korean Society for Clinical Laboratory Science. All rights reserved. Received: September 5, 2016 Revised 1 st : September 30, 2016 Revised 2 nd : October 5, 2016 Revised 3 rd : October 5, 2016 Revised 4 th : October 5, 2016 Accepted: October 5, 2016 서론 골수는뼈의내부를구성하는성분으로조혈작용을통해인체의면역을담당하는적혈구및백혈구를생성하는조직이다. 환자로부 터의골수천자를시행하는것은다발성골수종과같은악성종양이나재생불량성빈혈증혹은결핵과같은감염병을진단하기위하여이루어진다. 이렇게채취된골수생검조직은병리학적진단을위하여일반적으로 10% 중성완충포르말린용액에고정을거친후골수

2 372 Ji Young Park and Kyung Hee Han. Decalcification Methods of Bone Marrow Biopsy 조직에포함된칼슘을제거하는탈회과정을거친다. 이때탈회과정에사용되는용액은성분에따라크게 3가지로나뉜다. 첫째, HCl과 nitric acid 같은강산을희석해서사용하는것으로탈회속도가빠르다는장점때문에폭넓게사용되고있으며, 기존에상품화된제품들이강산을주요성분으로만들어져있다. 그러나조직내의 DNA나 RNA에손상을가해면역조직화학염색이나분자병리검사에영향을미치는것으로보고되어있다 [1]. 둘째, formic acid와같은약산을희석하여사용하는것으로 HCl 보다는탈회속도가느리고세포에손상을적게준다고알려져있으나, formic acid에의한탈회과정시 DNA가손상된다고보고되었다 [2]. 셋째, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 와같은 chelating agent로써검체내에칼슘이온과천천히반응하여세포내손상을최소화하며조직내에단백질및 DNA와 RNA를안정적으로잘보존하여면역및분자검사에적합하다고알려져있다 [3,4]. 이에본연구는세브란스병원에내원한환자의골수생검조직을크게두그룹으로나누어각각 HCl과 EDTA 가포함된탈회용액으로처리한후일반적인조직병리학적검사, 면역병리학적검사, 분자병리학적검사결과에어떤영향을미치는지알아보기위해실험을진행하였다. 정성적으로는골수생검조직의일반염색과특수염색및면역조직화학염색을시행하여두가지탈회방법에따른결과를비교하여 EDTA 탈회가우수한가를검증하였다. 또한골수조직으로부터 DNA를추출하여 EDTA 로탈회한골수조직이 HCl로탈회한골수조직에비해 DNA 농도가유의하게높은가를정량적으로분석하였고, 동시에추출한 DNA로 IGH gene rearrangement 검사를시행하여 EDTA 탈회가분자병리검사에도적합한가를확인하였다. 재료및방법 1. 연구재료 세브란스병원에서 2014년도에골수천자가시행된 38 예의골수생검조직과 2015년도에골수천자가시행된 33 예의골수생검조직을연구재료로사용하였다. 본실험에사용된검체는연세의료원세브란스병원연구심의위원회의승인을받아시행하였다 ( 승인번호 : YUHS, SH ). Table 1. The decalcification methods Decalcifying agent Processing time Processing temperature HCl (Calci-Clear Rapid) 8 hr Room temperature EDTA (12.5%, ph7.0) 24 hr Room temperature Abbreviation: HCl, hydrochloric acid; EDTA, ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate. 2. 조직병리학적검사 골수천자가시행된골수생검조직을 10% 중성포르말린용액 (neutral buffered formalin, NBF) 에 24시간고정한후크게두그룹으로나누어 HCl 탈회용액에 8시간, EDTA 탈회용액에 24시간을각각탈회시켜파라핀블록을만든후조직슬라이드표본을제작하였다. 상용 HCl 탈회용액은 Calci-Clear Rapid (National Diagnostics, Atlanta, USA) 을사용하였으며, EDTA 탈회용액은 EDTA (Sigma, St. Louis, USA) 와 NaOH (Sigma, Staint Louis, USA) 를이용하여 12.5% (ph7.0) 농도로제조하여사용하였다. EDTA 탈회용액의 ph는최근간행물을참조하여제조하였다 [3,5]. 파라핀블록은 3 m로박절하여절편을제작하였으며조직병리학적진단을위해시행하는 hematoxylin & eosin 염색과골수조직내에세망섬유의변화를확인하기위해 Reticulum II 염색키트 (Ventana, Tucson, USA) 를이용하여 Bench Mark XT 자동염색기 (Ventana, Tucson, USA) 로 reticulum 염색을시행하였다 (Table 1). 3. 면역조직화학적검사 골수생검조직의탈회과정에서사용된용액에따른면역조직화학적검사결과의차이를분석하기위해 BenchMark XT 자동염색기 (Ventana) 장비를사용하였다. 면역조직화학염색시내인성과산화효소를차단하기위하여 3% H 2O 2 를 10분간처리하였으며, 항원부활방법으로는 tris based buffer를주성분으로 ph 8.4로하는 CC1 (Ventana) 용액을사용하여 30분간반응시켰다. 1차항체로핵내단백질인 Ki-67과세포질및세포막단백질인 CD20과 CD138을사용하여실온에서 1시간반응시킨후 Ultra View Universal DAB Detection 키트 (Ventana) 를이용하여발색하였다 (Table 2). 4. 분자병리학적검사 골수생검조직의탈회과정에서사용된용액에따른분자병리학적검사결과의차이를각검사별로시행하여분석하였다. 우선, in situ hybridization (ISH) 검사를시행하였다. 다발성골수종의정확한병리학적진단을위해 kappa와 lambda의 immunoglobulin (Ig) light chain에대한 ISH 검사를시행하였다 [6]. Kappa와 lambda light chain의발현양을검출하기위하여 mrna probe Table 2. Primary antibodies for immunohistochemical staining Antibody Dilution Clonality Clone Company Ki-67 1:150 Monoclonal MIB-1 Dako CD138 1:400 Monoclonal M115 Dako CD20 1:10 Monoclonal L26 Dako

Korean J Clin Lab Sci. Vol. 48, No. 4, December 2016 373 (Ventana)를 사용하였으며 Bench Mark XT 자동염색기(Ventana) 염색을 시행하였다. 골수 조직 내 세망섬유의 경우 발현양에 따라 장비로 시행하였다.

3 Korean J Clin Lab Sci. Vol. 48, No. 4, December (Ventana)를 사용하였으며 Bench Mark XT 자동염색기(Ventana) 염색을 시행하였다. 골수 조직 내 세망섬유의 경우 발현양에 따라 장비로 시행하였다. 그 다음, 환자로부터 채취된 골수생검조직 중 0 4까지 등급을 정해 보조적인 진단으로 사용하였다. 그 결과 HCl 용액으로 탈회과정을 거친 38 예와 EDTA 용액으로 탈회과정 hematoxylin & eosin 염색상과 마찬가지로 탈회용액에 따른 발현 을 거친 12 예에 대하여 DNA를 추출한 후 농도를 측정하였다. 양의 차이는 발견되지 않았다(Fig. 1). Maxwell CSD DNA FFPE 키트와 Maxwell 16 핵산추출기 (Promega, Madison, USA)를 사용하여 DNA를 추출하였으며, 2. HCl과 EDTA 탈회용액에 처리 후 면역조직화학적 검사결과의 Nanodrop 2000 spectrophotometer (Thermo, Waltham, USA) 차이 로 DNA의 농도를 측정하였다. 마지막으로 추출된 DNA를 이용하 세포증식 표지자로써 핵 내 단백질인 Ki-67의 경우에는 두 탈회 여 다발성골수종의 확진에 필요한 B-cell의 IGH gene rea- 용액에 따른 염색상의 차이가 발견되었다. 골수생검조직을 HCl 탈 rrangement 검사를 Identiclone IGH gene clonality assay 키트 회용액에 처리한 경우 36 예의 골수조직 중 20 예에서 뚜렷한 염색 (Invivoscribe, San Diego, USA)를 사용하여 시행하였다. 상을 얻은 반면, EDTA 탈회용액에 처리한 경우 33 예의 골수 조직 중 32 예에서 우수한 염색결과를 얻었다. 이 때 EDTA 탈회용액 처 5. 통계처리 리 후 Ki-67에 염색되지 않은 1 예 슬라이드를 관찰한 결과 조직내 DNA의 추출 후 농도와 유의성 평가를 SPSS 버전 21 통계 프로 의 세포성분의 부족에 기인한 것으로 판단되었다. 그 다음 실험은 그램(IBM, Armonk, NY USA)을 이용하여 평균치와 표준오차를 B-cell 전구세포나 성숙한 B-cell의 세포질 또는 세포막에서 발현 계산하였으며, 결과해석의 유의 수준은 p 0.05로 시행하였다. 하는 CD20과 B-cell 분화 마지막 단계에 발현하는 CD138의 면역 조직화학염색을 시행하였고 그 결과 HCl과 EDTA 탈회용액에 따 결 과 른 염색결과의 차이를 발견할 수 없었다. CD20의 경우 HCl 탈회용 액에 처리한 경우 5 예의 골수조직 중 4 예의 양성 염색상이 관찰되 1. HCl과 EDTA 탈회용액에 처리 후 조직학적 검사결과의 차이 었고, EDTA 탈회용액에 처리한 경우 4 예의 골수생검조직 중 4 예 두 종류의 탈회용액에 따른 핵과 세포질의 조직학적 차이는 모두 양성 염색상이 관찰되었다. HCl 탈회용액에 처리 후 CD20에 hematoxylin & eosin 염색을 통해 관찰하였다. HCl과 EDTA 탈회 염색되지 않은 1 예의 경우에는 골수 내 모든 세포가 형질세포로의 용액에 따른 세포나 조직염색의 차이는 없었으며 조직학적 특징들 세포분화가 완료되었음을 CD138 추가 면역조직화학염색으로 확 을 잘 관찰할 수 있었다. 또한 골수생검조직에서 hematoxylin & 인할 수 있었다. 또한 CD138의 경우에는 HCl 탈회용액에 처리 후 eosin 염색과 더불어 통상적으로 염색하는 Gomori s reticulum 염색을 시행한 9 예 모두에서 양성 염색상이 관찰되었고, EDTA 탈 Fig. 1. The results of H&E and Reticulum stain according to decalcification methods ( 200). The results of hematoxylin & eosin stain (A) and reticulum stain (B) after HCl decalcification. The results of hematoxylin & eosin stain (C) and reticulum stain (D) after EDTA decalcification.

374 Ji Young Park and Kyung Hee Han. Decalcification Methods of Bone Marrow Biopsy 회용액에 처리한 후 염색을 시행한 16 예 모두에서도 뚜렷한 양성 로 처리한 경우에는 면역조직화학염색에서의 결과와 동일한 kappa 염색상이 관찰되었다(Table 3, Fig. 2).

4 374 Ji Young Park and Kyung Hee Han. Decalcification Methods of Bone Marrow Biopsy 회용액에 처리한 후 염색을 시행한 16 예 모두에서도 뚜렷한 양성 로 처리한 경우에는 면역조직화학염색에서의 결과와 동일한 kappa 염색상이 관찰되었다(Table 3, Fig. 2). light chain-restriction을 확인할 수 있었다(Fig. 3). 3. HCl과 EDTA 탈회용액에 처리 후 분자병리학적 검사결과 1) In situ hybridization (ISH) 2) DNA의 추출 및 농도측정 환자로부터 채취된 골수생검조직 중 HCl 탈회용액에 처리한 38 ISH 검사는 골수생검조직 내에서 발현되는 RNA양을 확인하기 예와 EDTA 탈회용액에 처리한 12 예에 대하여 DNA를 추출한 후 위한 검사법으로 이미 다발성골수종으로 진단된 환자의 골수생검 순도 및 농도를 측정하였다. 순도의 측정은 spectrophotometer의 조직을 연구재료로 사용하여 kappa와 lambda light chain의 과발 A260/280 nm의 비율로 확인할 수 있으며 HCl 탈회용액에 처리한 38 현 여부를 알아보았다. ISH 시행 전 면역조직화학염색을 통해 HCl 예의 경우 1.64±0.33, EDTA 탈회용액에 처리한 12 예의 경우 탈회용액으로 처리한 골수생검조직과 EDTA 탈회용액으로 처리한 1.88±0.04로 DNA의 순도가 측정되었다. DNA 농도의 경우에도 골수생검조직 모두 kappa light chain-restriction이 발현됨을 확 HCl과 EDTA 탈회용액에 처리한 골수생검조직은 각각 16.5±19.3, 인한 후 동일한 골수생검조직에서 ISH 검사를 시행하였다. HCl 탈 32.6±15.4로 측정되었으며, EDTA 탈회용액에 처리한 검체가 회용액으로 처리한 경우에는 kappa와 lambda light chain의 ISH HCl 탈회용액에서 보다 두 배 이상 DNA의 농도가 높음을 확인 할 검사에서 적절한 검사 결과를 얻을 수 없었으나 EDTA 탈회용액으 수 있었다(Table 4, Fig. 4). 3) IGH 유전자 재배열검사를 시행하여 추출된 DNA의 질 평가 Table 3. The results of immnohistochemical staining according to decalcification methods Antibody HCl* EDTA* Ki-67 CD20 CD138 20/36 4/5 9/9 32/33 4/4 16/16 *Positive case/total tested case. B-cell에서 유래된 질환 중 악성여부를 감별하기 위한 분자병리 검사법으로 multiplex PCR법에 기반을 둔 IdentiClone IGH clonality assay를 시행하였다. 이때, 검사에 사용된 DNA의 순도 와 농도가 우수할 때 정확한 결과를 얻어낼 수 있다. HCl 탈회용액 에 처리된 임의 검체 A, B 와 EDTA 탈회용액에 처리된 임의의 검체 C, D를 사용하여 진행하였다. A와 B검체의 농도와 순도는 각각 Fig. 2. The results of immunohistochemical stain according to decalcification methods ( 200). The results of Ki-67 (A), CD20 (B), CD138 (C) after HCl decalcification. The results of Ki-67 (D), CD20 (E), CD138 (F) after EDTA decalcification.

Korean J Clin Lab Sci. Vol. 48, No. 4, December 2016 375 Fig. 3. The results of in situ hybridization (ISH) according to decalcification methods (x200).

5 Korean J Clin Lab Sci. Vol. 48, No. 4, December Fig. 3. The results of in situ hybridization (ISH) according to decalcification methods (x200). The results of kappa ISH (A) and lambda ISH (B) after HCl decalcification. The results of kappa ISH (C) and lambda ISH (D) after EDTA decalcification. Fig. 4. Quality and quantity of DNA according to decalcification methods ng/ L, 1.80, 5.2 ng/ L, 1.02 측정되었고, C와 D 검체의 농도 체는 모두 IGH gene rearrangement 검사에서 악성질환 여부를 와 순도는 각각 36.7 ng/ L, 1.84, 55.7 ng/ L, 1.85로 측정되었다. 감별 할 수 있는 결과를 얻었다(Fig. 5). IdentiClone IGH clonality assay에 사용된 primer는 5종류로 V-J영역의 conserved framework (FR1-JH, FR2-JH) 및 joining 고 찰 regions (FR3-JH)과 diversity (DH-JH) 및 joining regions (DH7-JH)을 사용하였다. HCl 탈회용액에 처리한 A 검체는 순도와 최근에는 환자에서 채취된 골수생검조직의 최종적인 진단과 치 농도가 우수한 것으로 선택하였고, B 검체는 순도와 농도가 매우 낮 료를 위해 분자기법에 기인한 병리검사를 많이 시행하고 있다. 이 은 것으로 선택하였다. 이에 A 검체는 IGH gene rearrangement 에 골수생검조직의 탈회 과정은 최종적인 병리진단 결과에 영향을 검사 결과 악성질환 여부를 감별할 수 있었으나, B 검체는 어떤 결 줄 수 있는 만큼 중요한 단계로 여겨진다[7]. 기존에 짧은 탈회시간 과도 전혀 얻을 수 없었다. 반면 EDTA 탈회용액을 처리한 C, D 검 과 저렴한 비용으로 인해 많이 사용되던 HCl 탈회용액에 의한 탈회

376 Ji Young Park and Kyung Hee Han. Decalcification Methods of Bone Marrow Biopsy Table 4. Quantity and quality of DNA according to decalcification methods HCl EDTA p-value A 260/A 280 nm 1.64±0.

6 376 Ji Young Park and Kyung Hee Han. Decalcification Methods of Bone Marrow Biopsy Table 4. Quantity and quality of DNA according to decalcification methods HCl EDTA p-value A 260/A 280 nm 1.64± ±0.04 <0.000 DNA yield (ng/ L) 16.5± ±15.4 <0.007 Fig. 5. The results of immunoglobulin heavy chain gene rearrangement (IGH). The sample A and B after HCl decalcification vs sample C and D after EDTA decalcification are compared by IGH. Abbreviation: M, size marker; P, positive control; N, negative control; A D, sample. 과정은이미많은논문을통해조직내의 DNA와 RNA를손상시키고, 단백질을변성시킨다고보고되어있다 [8]. 또한최근논문에서는 EDTA 탈회용액에의한탈회과정이골수조직의다양한병리검사결과에우수하다고알려져있으며, 특히 real-time PCR과 in situ hybridization 과같은유전학적검사에서탁월한검사결과를보여준다고발표되었다 [5]. 본논문에서는세브란스병원에내원한환자의골수생검조직을연구재료로하여 HCl과 EDTA 탈회용액에의한탈회과정에따라병리검사결과의차이를일반염색, 특수염색, 면역조직화학염색및분자병리검사를시행하여분석하였다. HCl 탈회용액으로처리한경우, 형태학적변화를확인하기위한 hematoxylin & eosin 염색에서핵과세포질이뚜렷하게염색되어병리학적변화양상을관찰할수있었고, 세망섬유의변화를관찰하기위한 reticulum 염색또한뚜렷하게염색되었다. 반면면역조직화학염색의경우에는표적항원의발현위치에따라염색결과에차이를보였다. Ki-67과같이핵내에서발현하는항원의경우일부검체에서염색결과를얻을수없었다. 그러나세포증식표지자의경우에는세포막혹은세포질에서발현하는단백질로 HCl 탈회용액에의한염색결과의영향은받지않아양호한염색결과를얻을수있었다. 이러한항체발현위치에따른면역조직화학염색결과를토대로 HCl 탈회용액이핵내성분의염색결과에만영향을미치고있음을알수있었다. 구체적으로 HCl 탈회용액의핵내영향을알아보기위하여다발성골수종의대표적인진단방법인 kappa와 lambda ISH 검사를시행하였고, 그결과표적 RNA가파괴되어염색상태가불량하였다. 이를토대로 HCl 탈회용액이조직내 RNA를손상입혔음을추론할수있었다. 또한 DNA 손상여부확인을위한 DNA 추출및 IGH gene rearrangement 검사에서도면역조직화학염색결과와동일하게 Ki-67 염색결과가불량한검체의경우추출된 DNA의농도가매우낮았으며, IGH 검사결과도전혀얻을수없었다. IGH 검사는다발성골수종의단클론성을확인하기위한것으로, 중합효소연쇄반응을한후전기영동결과를바탕으로모든 primer중한개의 primer 에서라도양성대조군과같은단일밴드가나타날때 B-cell 의단클론성증식이있는것으로확인한후종양성질환으로판독한다 [9]. 일반적으로종양성질환일경우 FR1-JH, FR2-JH, FR3-JH primer 에서종종단일밴드가나타난다. 그러나 HCl 탈회용액으로처리후 DNA를추출하여그순도와농도를측정한결과모든골수조직이손상된것은아닌것으로확인할수있었다. EDTA 탈회용액으로처리한경우에는, HCl 탈회용액보다긴반응시간을필요로하며, 조직의크기에따른반응속도에도민감한단점이있다 [10]. 그러나면역조직화학염색결과는 HCl 탈회용액에탈회시불량한염색소견을보였던 Ki-67 과같은핵내항원뿐아니라 CD20 혹은 CD138같은세포질, 세포막을표적항원으로하는모든항체에서잘염색되었다. 또한추출된 DNA는높은농도와순도를나타내어 IGH gene rearrangement 검사를시행함에있어서정확한분자병리검사결과를얻을수있었다 [11]. 이연구를통해서 EDTA 탈회방법이골수생검조직을이용한병리검사에서 HCl 탈회방법에비해우수하다는것을다시한번입증할수있었다. 특히 EDTA 탈회방법이면역병리검사및분자병리검사결과의질을향상시켜병리과에서환자의질병을정확히진단하는데기여할것으로판단된다. 요약탈회방법은골수조직의병리학적진단을위해서항상시행되는과정이다. HCl 탈회용액과같이주로사용하고있는산성용액은탈회과정동안에조직내의항원성에손상을입힌다. 특히, 골수조직내의 RNA나 DNA에심하게손상을준다. 따라서조직의항원성을보존하기위한표준화된탈회방법이필요하다. 본연구는일반적으로가장많이사용되는 HCl 기반의상품화된탈회용액과직접제조한 EDTA 탈회용액이골수조직의탈회과정에어떤영향을미치는지분석하였다. 환자로부터채취된 73예의골수생검조직을 HCl 탈회와 EDTA 탈회의두그룹으로나누어탈회과정을진행하였다. 골수생검조직의탈회과정후결과의차이는 hematoxylin & eosin

7 Korean J Clin Lab Sci. Vol. 48, No. 4, December 염색과 reticulum 염색, Ki-67, CD20, CD138 의항체를이용한면역조직화학염색, DNA 추출및분석, in situ hybridization, IGH gene rearrangement 와같은분자병리검사를시행하여분석하였다. 일반적인염색과특수염색에서는두탈회용액간의차이는없었다. 또한세포증식표지자와같은세포막혹은세포질에서발현되는항체는탈회용액간의차이없이잘염색되었다. 반면 HCl 탈회용액에처리한후핵내단백질인 Ki-67의염색상은현저히불량한것으로관찰되었다. HCl 탈회용액과비교하여 EDTA 탈회용액에서의골수생검조직내의 DNA와 RNA가잘보존되었음을다양한분자병리검사를통해확인할수있었다. 특히 HCl 탈회용액에처리한 28예와 EDTA 탈회용액에처리한 12예의 DNA의순도와농도을비교한결과통계학적으로유의한수준으로차이가있음을확인하였다. 이로써 EDTA 탈회용액이조직내의항원성을잘유지시키며, 면역조직화학염색과분자병리검사에적합한방법임을확인할수있었다. Acknowledgements: None Funding: None Conflict of interest: None References 1. Choi MS, Lee HS, Kwon HC, Bae MH, Ko YH, Kim HJ, et al. Optimal fixation and decalcification methods for bone marrow biopsy. Korean J Clin Lab Sci. 2015;47(4): dx.doi.org/ /kjcls Sarsfield P, Wickham CL, Joyner MV, Ellard S, Jones DB, Wilkins BS. Formic acid decalcification of bone marrow trephines degrades DNA: alternative use of EDTA allows the amplification and sequencing of relatively long PCR products. Mol Pathol. 2000;53: Dimenstein IB. Bone grossing techniques: helpful hints and procedures. Ann Diagn pathol. 2008;12: Quintanilla-Martinez L, Tinguely M, Bonzheim I, Fend F. Bone marrow biopsy: processing and use of molecular techniques. Pathologe. 2012;33(6): Choi SE, Hong SW, Yoon SO. Proposal of an appropriate decalcification method of bone marrow biopsy specimens in the era of expanding genetic molecular study. J Pathol Transl Med. 2015;49: Erber WN, Asbahr HD, Phelps PN. In situ hybridization of immunoglobulin light chain Mrna on bone marrow trephines using biotinylated probes and the APPAAP. Pathology. 1993;25(1): Alers JC, Krijtenburg PJ, Vissers KJ, Dekken HV. Effect of bone decalcification procedures on DNA in situ hybridization and comparative genomic hybridization: EDTA is highly preferable to a routinely used acid decalcifier. J Histochem Cytochem. 1999;47(5): Singh VM, Salunga RC, Huang VJ, Tran Y, Erlander M, Plumlee P, et al. Analysis of the effect of various decalcification agents on the quantity and quality of nucleic acid(dna and RNA) recovered from bone biopsies. Ann Diagn Pathol. 2013; 17: j.anndiagpath Sandberg Y, Van Gastel-Mol EJ, Verhaaf B, Lam KH, Van dongen JJM, Langerak AW. BIOMED-2 multiplex immunoglobulin/ T-cell receptor polymerase chain reaction protocols can reliably replace southern blot analysis in routine clonality diagnostics. J Mol Diag. 2005;7(4): Castania VA, Silveira JW, Issy AC, Pitol DL, Castania ML, Neto AD, et al. Advantage of a combined method of decalcification compared to EDTA. Micro Res Tech. 2015;78: / jemt Haiyan H, Weijun F, Hua J, Juan D, Lili Z, Chunyang Z, et al. The clinical characteristics and prognosis of IGH deletion in multiple myeloma. Leukemia Research. 2015;39: dx.doi.org/ /j.leukres

Jkbcs016(92-97).hwp

Jkbcs016(92-97).hwp Expression of bcl-2 and Apoptosis and Its Relationship to Clinicopathological Prognostic Factors in Breast Cancer - A Study with Long Term Follow-up correlated with the survival rate.(journal of Korean