Propidium monoazide 와 real-time PCR 을이용한살아있는 Enterococcus faecalis 의선택적인검출 Propidium monoazide와 real-time PCR을이용한살아있는 Enterococcus faecalis의선택적인검출 김신영

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수경 장
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1 Propidium monoazide와 real-time PCR을이용한살아있는 Enterococcus faecalis의선택적인검출 김신영 이승종 김의성 서덕규 송윤정 정일영 * 연세대학교치과대학치과보존학교실 ABSTRACT SELECTIVE DETECTION OF VIABLE ENTEROCOCCUS FAECALIS USING PROPIDIUM MONOAZIDE IN COMBINATION WITH REAL-TIME PCR Sinyoung Kim, Seungjong Lee, Euiseong Kim, Deoggyu Seo, Yoonjung Song, Ilyoung Jung* Department of Conservative Dentistry, College of Dentistry, Yonsei University Polymerase chain reaction (PCR) can detect bacteria more rapidly than conventional plate counting. However DNA-based assays cannot distinguish between viable and dead cells due to persistence of DNA after cells have lost their vitality. Recently, propidium monoazide (PMA) treatment has been introduced. The purpose of this study is to evaluate the applicability of the PMA treatment and real-time PCR method for cell counting in comparison with plate counting and to evaluate the antibacterial efficacy of 2% CHX on E. faecalis using PMA treatment in combination with real-time PCR. Firstly, to elucidate the relationship between the proportion of viable cells and the real-time PCR signals after PMA treatment, mixtures with different ratios of viable and dead cells were used. Secondly, relative difference of viable cells using PMA treatment in combination with real-time PCR was compared with CFU by plate counting. Lastly, antibacterial efficacy of 2% CHX on E. faecalis was measured using PMA treatment in combination with real-time PCR. The results were as follows : 1. Ct value increased with decreasing proportion of viable E. faecalis. 2. There was correlation between viable cells measured by real-time PCR after PMA treatment and CFU by plate counting until Optical density (OD) value remains under 1.0. However, viable cells measured by real-time PCR after PMA treatment have decreased at 1.5 of OD value while CFU kept increasing. 3. Relative difference of viable E. faecalis decreased more after longer application of 2% CHX. [J Kor Acad Cons Dent 33(6): , 2008] Key words: E. faecalis, real-time PCR, propidium monoazide, chlorhexidine - Received , revised , accepted I. 서론 근관내에서살아있는세균의수를정확하게측정하는것은매우어려운일이다. 전통적으로세균의검출은 plate counting 을비롯한다른 cultivation-based approach 를 * Corresponding Author: Ilyoung Jung Department of Conservative Dentistry College of Dentistry, Yonsei University 134, Shinchon-dong, Sudaemoon-gu, Seoul, Korea Tel: Fax: juen@yuhs.ac.kr 통해서이루어졌다. 그러나이런방법은시간소모적이고배지의선택이나대사활성도, 술자의경험에따라편차가생길수있다. 대조적으로 polymerase chain reaction (PCR) 방법에따른검출은배양가능한세균과배양불가능한세균을모두빠르게검출할수있다 1). 하지만 PCR 방법은살아있는세균과죽은세균을구분하지못하기때문에, 검출된세균이현재살아있는세균인지아니면살아있다가후에죽은세균인지구분하는것이불가능하다. 세포가죽은후에도세균의 DNA 는장기간동안존재할수있기때문에 2),3) 죽은세균의 DNA 가일부분이남아서 PCR 에의해검출되고증폭될수있다. 따라서 537

2 대한치과보존학회지 : Vol. 33, No. 6, 2008 DNA 에기초한세균수의측정은과측정되거나허위양성반응의결과가나타날수있다. 최근에 Nocker 등 4),5) 은 DNA 추출전에 propidium monoazide (PMA) 를세균표본에처리하면살아있는세균만선택적으로검출할수있다고주장하였다. 이방법의원리는세균세포막의완전함에있는데 PMA 는손상된세포막만통과하여들어갈수있는염료이기때문이다. 그후 PMA 의 azide group 은빛노출하에서죽은세포의 DNA 와공유결합을하게된다. 따라서 PMA 방법은빠르고간단하게완전한세포막을가진세균의 DNA 만한정적으로분석할수있다. 성공적인근관치료를위해서는근관내의세균을완전히제거하는것이필요하다. 근관내의세균을제거하기위해서는 file 을이용한기계적인제거뿐만아니라약제를이용한화학적인제거도필요하다. 여러임상연구들에의하여수산화칼슘등이효과적인약제로써추천되었고널리사용되어왔다. 그러나최근에는 Enterococcus faecalis 와같이약제에저항성이있는세균이밝혀졌고, 이런세균이괴사된치수에서근관치료의실패에중요한원인인자로생각되고있다. Molander 등 6) 은치근단병소가있는근관치료된치아의 32% 에서 E. faecalis 를발견하였으며, Möller 7) 는 29%, Sundqvist 등 8) 도 38% 의 E. faecalis 를치근단병소가있는근관치료된치아에서배양할수있었다. 또한재발한치근단질환을가진한국인의치아에서배양한세균을살펴본연구에서, 가장많이발견된세균이 E. faecalis 이며전체의 64% 를차지하고있었다 9). E. faecalis 에대한관심은이들이통상적인근관내약제인수산화칼슘에저항성을가지기때문에더욱높아졌는데, 이러한사실은여러연구가에의해서실험적으로밝혀졌다 10). E. faecalis 의제거를위해 chlorhexidine (CHX) 이사용된것은실험을통해효과가밝혀진후부터인데, CHX 은넓은범위의항균성을가지며, 상아질상에결합하여장기간효과를가져온다고알려졌기때문이다. 약제의효과와연관하여또다른고려해야할사항은근관내에서세균은 biofilm 을형성하며존재하여약제에대한저항성을가진다는사실이다 11). Mah 등 12) 은이러한저항성은다당류기질이물리적, 화학적으로항생제의확산을막고세균자체도제한된영양분에의해천천히자라기때문에대사활동이저하되어항생제에저항성을가진다는가설을제시하였다. 이러한 biofilm 의약제에대한저항성에대한연구들중에 Lima 등 13) 은 E. faecalis biofilm 의 CHX 에대한저항성이통상의 planktonic 상태의세균보다높다는실험결과를제시했다. E. faecalis 의약제에대한저항성및 biofilm 상태의세균이가지는저항성을생각한다면, 이러한세균들에의해발생하는근관치료의실패가능성에대하여인지하고이를제거하기위한전략적접근이필요 하다. 이번연구의목적은세균수의측정에있어서, PMA 처리와 real-time PCR 방법의적용가능성을기존의 plate counting 방법과비교하여알아보는것이다. 또한 E. faecalis 에대한 2% CHX 의살균효과를 PMA 처리후 realtime PCR 방법을사용하여알아보는것이다. 1. PMA 의효과검증 II. 재료및방법 1.1 세균표본의준비 E. faecalis (ATCC 29212, KCCM 11814, DSM 2570; KCCM, Seoul, Korea) 를표본으로사용하였다. Brain heart infusion agar (BHI agar) (Difco, Becton Dickinson and Company, Sparks, MD, USA) plate 에서한개의 colony 를채취하여 10 ml BHI (Difco, Becton Dickinson and Company, Sparks, MD, USA) broth 에접종한후, 37 에서 12 시간동안배양하였다. 배양된 suspension 에서 100 μl 를덜어내어 20 ml BHI broth 에서재배양하였다. 이후 optical density (OD at 600nm) 값이 1.0 에도달할때의 suspension 을덜어내어살아있는세균으로준비하였다. 또한 E. faecalis 를 2% CHX 을이용하여 40 분간처리하여완전히죽은세균으로준비하였다. 이는예비실험에서 plate counting 을통해세균이모두죽을때의시간을측정한후시행한것이다. 2% CHX 은 20% chlorhexidine gluconate (Sigma Co., St. Louis, MO, USA) 를 10 배희석하여사용하였다. 이후죽은세균을살아있는세균과적절한비율로섞어서살아있는세균의양이전체의 0%, 0.1%, 1%, 10%, 100% 가되도록하였다. 1.2 Propidium monoazide crosslinking Propidium monoazide (PMA) (phenanthridium, 3- amino-8-azido-5-[3-(diethylmethyl ammonio)- propyl]-6-phenyl dichloride; Biotium Inc., Hayward, CA, USA) 는 20% 의 dimethyl sulfoxide (DMSO) (Ducksan Pure Chemicals Co., Ansan, Korea) 에녹여서 20 mm 로몰농도를맞춘후, -20 에서보관하였다. 각표본을 500 μl 씩 1.5 ml eppendorf tube 에옮겼다 μl 의 PMA 를처리하여최종몰농도를약 50 μm 이되도록했다. 이후 eppendorf tube 를은박지에싼후 5 분동안 shaker 위에서 incubation 하였다. 650W halogen light (sealed beam lamp, DWE 41667, 110V, 3200K, GE Lighting; General Electric Co., Fairfield, CT, USA) 를이용하여표본에 2 분동안빛을노출시켰다. 표본은과도한 538

3 열을피하기위하여얼음위에수평으로눕히고, halogen light 로부터 20 cm 의거리를유지하도록하였다. 빛에의한 crosslinking 이일어난후에, 표본은 8000 rpm 으로 5 분동안원심분리하여상부의액을제거한후 PBS 로처리하였다. 1.3 DNA extraction DNA 는 AccuPrep Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer Co., Daejeon, Korea) 를이용하여추출하였다. Proteinase K 를 1.5ml eppendorf tube 에 20μl 씩넣고여기에준비한표본을 200 μl 씩넣은후, Binding buffer 를 200μl 넣고즉시 Vortex 를이용하여혼합하였다. 10 분동안 60 에서 incubation 한후, 100μl 의 Isopropanol (Duksan Pure Chemicals Co., Ansan, Korea) 을넣고 pipet 을이용하여섞었다. 액을 Binding column tube 로옮긴후, 8000 rpm 으로 1 분동안원심분리하였다. Binding column tube 를새로운 2 ml tube 로옮긴후, Washing buffer 1 을 500μl 처리한후, 8000 rpm 으로 1 분동안원심분리하였다. 하부의액을버린후, Washing buffer2 를 500μl 처리하고다시원심분리하였다. Binding column tube 를새로운 1.5ml tube 로옮긴후, Elusion buffer 를 200μl 처리하고상온에서 5 분동안기다렸다. 마지막으로 8000 rpm 으로 1 분동안원심분리하였다. 1.4 Real-time PCR Real-time PCR 과 data 분석은 MiniOpticon Real- Time PCR System (Bio-Rad Co., Hercules, CA, USA) 을이용하여시행하였다. Cycle threshold (Ct) value 는 MiniOpticon 에의해자동적으로계산되었다. 추출된 genomic DNA 1μl 에 PCR mixture 19μl 를넣은후 pipet 을이용하여기포가생기지않도록혼합하였다. PCR mixture 는 SYBR Green (iq SYBR Green Supermix, Bio-Rad Co., Hercules, CA, USA) 과 10 pmol 의두개의 primer (Bioneer Co., Daejeon, Korea), 그리고멸균증류수를포함한다. Quantification 을위해사용된 primer 는 EF-Forward (TCG GTG ATT AAC CCT CGT CA) 와 EF-Reverse (ACG GAG ATA ACA CCG GAA CC) 이다. 사용된 primer 는 universal primer pair 를사용하였고, 먼저 primer 가제대로역할을하는지확인후사용하였다 14). E. faecalis 를 quantification 하기위한 cycling 순서는다음과같이진행하였다. 먼저 95 에서 10 분간유지하였다. 이후 95 에서 30 초, 57 에서 30 초, 72 에서 30 초를 45 cycles 를반복하였다. 마지막으로 72 에서 5 분간유지하였다. Melting curve 의분석은 0.2 간격으로 65 에서부터 95 까지상승시켰다. 이후 30 에서 5 분간유지하였다. 2. Real-time PCR 의적용가능성 2.1 Real-time PCR BHI agar plate 에서한개의 colony 를채취하여 10 ml BHI broth 에접종한후, 37 에서 12 시간동안배양하였다. 배양된 suspension 에서 100μl 를덜어내어 20 ml BHI broth 에서재배양하였다. 이후주기적으로 OD 값을측정하여각 OD 값에해당하는 suspension 을 500μl 씩두개준비하여 1.5ml eppendorf tube 에옮겼다. 준비된 500μl 의표본중에하나에만 1.25μl 의 PMA 를처리한후, 위에제시한방법대로 PMA crosslinking 을시행하고 DNA extraction 을한후에 real-time PCR 을시행하였다. 2.2 Plate counting 각 OD 값에해당하는 suspension 을덜어내어이들을각각 10 배의연속희석 (10 5,10 6,10 7,10 8 ) 을시행하고, 희석된 sample 들을 BHI agar plate 에 20μl 씩세부위에나누어접종한후 37 에서배양하였다. 24 시간후에 colony 의수를세어정리한후, 1ml 안에있는 colony 의수로환산하였고 log CFU 로표시하였다. 3. 2% CHX 의 E. faecalis 에대한살균효과 3.1 세균표본의준비 BHI agar plate 에서한개의 colony 를채취하여 10 ml BHI broth 에접종한후, 37 에서 12 시간동안배양하였다. 배양된 suspension 에서 100 μl 를덜어내어 20 ml BHI broth 에서재배양하였다. 이후 OD 값을 1.0 이되도록조정하여, 이때의 suspension 을표본으로사용하였다. 3.2 E. faecalis biofilm 의재현 E. faecalis 의 biofilm 은멸균된 membrane filters (0.2 μl pore size, 13mm diameter; Whatman International Ltd., Maidstone, U.K.) 를사용하여형성하였다 15). BHI agar plate 상에 membrane filters 를올려놓고 OD 값이 1.0 으로조정된 suspension 을 90μl 접종하였다. 접종후에 10 분정도건조시킨후, 37 에서 3 일동안배양하였다. 이는 starvation phase 의 E. faecalis 를만들기위해서시행한것이다 16). 3.3 CHX 의처리 Membrane filter 를 3ml PBS 가담긴 tube 로옮긴후, 1 분간 Vortex 를이용하여 membrane filter 상의세균을떨어지게하였다. 이중에서 500μl 씩따로덜어내어 1.5ml eppendorf tube 에옮긴후, 8000 rpm 으로 5 분동안원심분리하여상부의액을제거하였다. 각각 2% CHX 을 1ml 539

대한치과보존학회지 : Vol. 33, No. 6, 2008 씩 5 분,15 분,30 분,40 분동안처리하고, 대조군으로 PBS 를 1ml 처리한것을사용하였다. 이후원심분리하여상부의액을제거한후에 CHX inactivating agent 를 1ml 씩 10 분간처리하였다. CHX inactivating agent 는 TWEEN 80 (Sigma Co., St.

4 대한치과보존학회지 : Vol. 33, No. 6, 2008 씩 5 분,15 분,30 분,40 분동안처리하고, 대조군으로 PBS 를 1ml 처리한것을사용하였다. 이후원심분리하여상부의액을제거한후에 CHX inactivating agent 를 1ml 씩 10 분간처리하였다. CHX inactivating agent 는 TWEEN 80 (Sigma Co., St. Louis, MO, USA) 3 ml 을 0.43% 의멸균된식염수 97ml 에희석하여제작하였다 17). 이후위에제시한방법대로 PMA crosslinking 을시행하고 DNA extraction 을한후에 real-time PCR 을시행하였다. 1. PMA 의효과검증 III. 결과 먼저 37 에서 12 시간동안배양한 E. faecalis 를단계적으로 10 배의연속희석을시행하였다. 각표본을 DNA extraction 시행한후에 real-time PCR 을시행하였다. 연속적으로 Ct value 를계산한결과, 가장높은 Ct value 는 10 5 배연속희석을시행한표본 A 에서관찰되었고가장낮은 Ct value 는 10 배희석을시행한표본 E 에서관찰되었다 (Figure 1). 즉 E. faecalis 의양이단계적으로증가할수록 Ct value 는단계적으로감소하였다. 다음으로살아있는세균과죽은세균을적절하게다른비율로섞어서 (Figure 2A) PMA 를처리한후에각비율에대한 real-time PCR 을시행하였다. 그결과살아있는세균의비율이증가할수록, 즉표본 I 에서 V 로갈수록 Ct value 는단계적으로감소하였고 (Figure 2B), PCR 기계에서나타난세균의 relative difference 는단계적으로증가하였다 (Figure 2C). 표본 I 의경우에는죽은세균만존재하기때문에 relative difference 가거의없는것으로나타났고, 표본 V 에서는살아있는세균만존재하기때문에 relative difference 가가장많이나타났다. Figure 1. Ct value measured by real-time PCR after serial dilutions of E. faecalis (A dilution, B dilution, C dilution, D dilution, E. 10 dilution) 2. Real-time PCR 의적용가능성 시간에따라 OD 값을측정한결과 OD 값이 0.5 일때부터 1.0 일때까지세균이급속하게성장하는것을알수있었다. 그리고 OD 값이 1.0 부터 1.5 에도달할때까지는세균의성장속도가저하되었다. 각 OD 값을시간에따라측정하여 OD 값이 0.23, 0.53, 1.0, 1.5 일때의표본을구하여 real-time PCR 을시행한결과, OD 값이 1.0 일때까지는 PMA 를처리한것 (Figure 3, group A) 과처리하지않은것 (Figure 3, group B) 사이에살아있는세균의 relative difference 가거의비슷하게나타났다. OD 값이 1.5 일때의표본에서는 PMA 를처리한것과처리하지않은것사이에큰차이가나타났다. 각 OD 값에서의 log CFU 를비교해볼때는, OD 값이커질수록세균의수가점차적으로증가함을알수있었다. (Figure 3, group C) 3. 2% CHX 의 E. faecalis 에대한살균효과 2% CHX 을 5 분, 15 분, 30 분, 40 분동안처리한결과 Ct value 가점차증가함을알수있었고 (Figure 4A), 살아있는세균의양은감소하는것을알수있었다 (Figure 4B). 대조군과비교하여살아있는 E. faecalis 의 relative difference 를볼때, CHX 을 5 분동안처리하였을때에도상당한양의세균이죽는다는것을알수있었다. 그러나완전한세균의사멸은 2% CHX 을 40 분동안처리한경우에나타났고, 이는추가적으로 plate counting 을통해 CFU 를측정한결과에서확인할수있었다 (data not shown). IV. 고 E. faecalis 는광범위한항균, 항생제에저항성을가지는동시에재발하는만성치근단치주염의원인이되는세균이기때문에이번연구에서사용하였다. 또한근관내에서세균은 biofilm 을형성하여약제에대한저항성을가지기때문에, 근관치료의실패가능성을인지하고전략적접근을하여야한다. 따라서 E. faecalis 에대한 CHX 의살균효과를알아보기위해살아있는세균의검출이필요했고, 기존의 plate counting 방법의대체방법으로써 PMA 처리와 real-time PCR 방법을적용하는것을알아보았다. 먼저 E. faecalis 에대한 real-time PCR 의효과검증을시행하였다. OD 값이 1.0 으로조정된 E. faecalis 를단계적으로희석하여 real-time PCR 을시행하였다. Figure 1 에나타난결과를보면세균이약 10 배정도로단계적인양이증가할수록 Ct value 도단계적인차이를나타냈다. MiniOpticon 에나타난증폭곡선그래프에서도 DNA 양이 찰 540

A I II III IV V Viable E. faecalis (μl) 0 0.5 5 50 500 Dead E. faecalis (μl) 500 499.5 495 450 0 Viable bacteria (%) 0 0.1 1 10 100 B A C B Figure 2.

Ct value of amplified genomic DNA shown as a function of the percentage of viable E. faecalis, C. Relative difference of viable E. faecalis measured by real-time PCR) Figure 3.

Relative difference of PMA treated E. faecalis at each optical density, group C. Log CFU by plate counting at each optical density) Figure 4. Monitoring exposure of E.

Decrease of relative difference of viable cells as increasing exposure time of 2% CHX) 많은순서에서적은순서로같은간격으로늘어선증폭곡선이얻어졌고, DNA 양이많아질수록같은간격으로감소하는 Ct value 를보였다. 이결과로보아서 E.

5 A I II III IV V Viable E. faecalis (μl) Dead E. faecalis (μl) Viable bacteria (%) B A C B Figure 2. Effect of PMA on the amplification of different ratios of viable and dead E. faecalis (A. Table showing mixing ratios of viable and dead E. faecalis, B. Ct value of amplified genomic DNA shown as a function of the percentage of viable E. faecalis, C. Relative difference of viable E. faecalis measured by real-time PCR) Figure 3. Correlation between relative difference measured by real-time PCR and log CFU by plate counting (group A. Relative difference of non-pma treated E. faecalis at each optical density, group B. Relative difference of PMA treated E. faecalis at each optical density, group C. Log CFU by plate counting at each optical density) Figure 4. Monitoring exposure of E. faecalis to increasing time periods of 2% chlorhexidine (A. Increase of Ct values as increasing exposure time of 2% CHX, B. Decrease of relative difference of viable cells as increasing exposure time of 2% CHX) 많은순서에서적은순서로같은간격으로늘어선증폭곡선이얻어졌고, DNA 양이많아질수록같은간격으로감소하는 Ct value 를보였다. 이결과로보아서 E. faecalis 에대한 primer 도잘만들어졌고 real-time PCR 의시행조건도적절하다는것을확인하였다. 따라서다음단계로 PMA 의효과검증을시행하였다. Nocker 등 4),5),18),19) 의연구에따르면 PMA 와 quantitative PCR 을같이사용하였을때, 살아있는세균만선택적으로검출되는데성공적인결과를보였다. 하지만그의연구에서는 Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, E. coli 0157:H7, Mycobacterium avium 등의세균이사용되었고, 어떤연구에서도 E. faecalis 를이용하여실험한적은없었다. 따라서 E. faecalis 에서도 PMA 와죽은세균이반응하여, 살아있는세균만선택적으로검출되는지를확인하는과정이필요했다. 살아있는세균의비율이단계적으로 10 배의차이가나도록 Figure 2A 와같이살아있는세균과죽은세균을섞어서 541

6 대한치과보존학회지 : Vol. 33, No. 6, 2008 실험하였다. 살아있는세균의비율을 10 배차이가나도록한이유는작은양의차이에서는 Ct value 의큰차이가없었기때문이다. 살아있는세균이양이 10 배정도의차이가나도록하였을때 Ct value 는약 3 정도의차이를보였다 (Figure 1). 위의결과에서도살아있는세균의양이증가할수록 Ct value 는감소하는것을확인할수있었다 (Figure 2B). 물론 Ct value 의차이가 Figure 1 에서나타난차이만큼크게나타나지는않았지만, 유의할만한차이를보이는것을알수있었다. 이를통해 PMA 가빛노출하에서죽은세균의 DNA 와 crosslinking 이일어난것이라고추정할수있었고, PMA 를처리한후 real-time PCR 을시행하는것이살아있는 E. faecalis 만선택적으로검출할수있는효과적인방법이라는것을알수있었다. 다음으로 plate counting 으로얻어진 CFU 가 real-time PCR 을통해측정된살아있는세균의 relative difference 와연관되어비교되었다. 각 OD 값은세균의양에있어서어느정도의차이를만들기위하여약 0.2, 0.5, 1.0, 1.5 의값으로정하였다. E. faecalis suspension 100 μl 를 20 ml BHI broth 에넣은후약 3 시간 30 분경과시에 OD 값이 0.23 에도달했고, 이후급속히증가하면서 5 시간경과시에 OD 값이 1.0 에도달했다. OD 값이 1.0 에서 1.5 로도달할때는세균의성장속도가늦어서많은시간이소요되었다. 약 7 시간경과시에 OD 값이 1.5 에도달하였다. PMA 를처리한표본과처리하지않은표본에서세균의 relative difference 의차이를비교해보면 OD 값이 1.0 에도달할때까지는어느정도비슷한것을알수있다. 따라서 OD 값이증가하여 1.0 에도달할때는표본에살아있는세균이대부분인것으로해석된다. 또한 OD 값이 1.0 에서 1.5 로올라갈때는 PMA 를처리하지않은표본은계속살아있는세균의 relative difference 가증가하는데비해, PMA 를처리한표본에서는살아있는세균의 relative difference 가확연히감소하는것이관찰되었다. 이를통해서 OD 값이 1.5 일때는살아있는세균과죽은세균이함께존재하며, 죽은세균의 DNA 가 PMA 와 crosslinking 이일어나서검출되지않았다고생각할수있다. 실험결과에서의문이생긴점은 CFU (Figure 3C) 는 OD 값이 1.5 일때계속증가하였음에비해서 PMA 를처리한표본의 relative difference (Figure 3B) 는 OD 값이 1.5 일때많이감소하였다는점이다. PMA 를처리한표본에서살아있는세균만검출된다는점을생각해보면, CFU 와 PMA 를처리한표본의 relative difference 사이에는상관관계가있어야한다. 하지만실제로둘사이에 OD 값이 1.5 일때큰차이를보였다. CFU 는 OD 값이 1.0 일때보다 1.5 일때계속증가하였다. 하지만 PMA 를처리한표본의 real-time PCR 에서측정된 relative difference 는 OD 값이 1.0 일때보다 1.5 일때훨씬많이감소하였다. 즉, PMA 처리시에는죽은세균으로판단되었던것이실제배양을해보면배양이된다는결론을내릴수있다. 이는세균세포막에미세한손상만받아도 PMA 가세포막을통과하여 real-time PCR 시행시에증폭되지않는데반해, 배양시에는세포막이일부손상을받았더라도 BHI agar plate 를통해영양분이공급되면세포막이회복되어세균이성장할수있기때문으로추측된다. 하지만투과성이있던세포막이성공적으로재생되는경우는보고된적이없으므로이에대한연구가추후더필요하리라고생각된다. 아직까지살아있는세균만을정확하게검출할수있는방법은없다. Cultivation-based approach 에서도살아있는세균이배양이안되는현상 (viable but non-culturable) 이나타난다고한다 20). 따라서살아있는세균과죽은세균을구분하는것이 100% 정확할수는없고, 세균이살아있다는것의정의도생식증식 (reproductive growth), 대사활성도 (metabolic activity), 세포막의완전함 (membrane integrity) 에따라달라질수있다. PMA 처리방법역시세포막의완전함에따라세균이살아있는지유무를평가하게되므로, 완전히살아있는세균만 100% 확실이검출된다고말하기에는무리가있을것같다. E. faecalis 에대하여 CHX 이가지는항균성은 Heling 등 21) 에의하여이미밝혀진바있으며, Lima 등 13) 은 1 일과 3 일동안배양된 E. faecalis biofilm 에 2% CHX 을처리하였을때만완전한세균의사멸을관찰할수있었다고하였다. 이번연구에서도 3 일동안 membrane filters 에서배양한 E. faecalis biofilm 에 2% CHX 을처리하였을때에살아있는세균이시간에따라점차적으로감소함을알수있었다. 3 일동안세균을배양한것은세균의성장곡선을통해 starvation phase 때의세균을만들기위해서였고, 이시기의세균이가장저항성이높아서 disinfectant 에의해쉽게제거되지않기때문이다 16). 이번실험의결과 2% CHX 을 5 분동안처리하였을때에도많은양의세균이사멸했지만, 배양후 CFU 로확인해본결과 CHX 을 40 분동안처리하였을때완전히세균이사멸하는것을알수있었다 (data not shown). 따라서 PMA 처리후 real-time PCR 을시행할때도 CHX 을 40 분까지처리하였고, 처리시간이길수록 Ct value 가커지고살아있는 E. faecalis 의 relative difference 가감소하는것을확인하였다 (Figure 4). 이는 CHX 의처리시간이증가할수록죽은세균이많아져서상대적으로살아있는세균의양이감소하는것을나타내는것이다. 이를통해서 disinfectant 로 2% CHX 을사용하여 E. faecalis 에대한살균효과를평가하는데있어서도, PMA 처리와 real-time PCR 방법을적용하는것이가능하다고하겠다. 이번연구의결과첫째로살아있는 E. faecalis 의비율이감소할수록 Ct value 는증가하였다. 둘째로 PMA 처리후 542

7 real-time PCR 방법을이용하여세균의양을측정한것과 plate counting 으로얻은 CFU 사이에는 OD 값이 1.0 일때까지는상관관계가있었다. 하지만 OD 값이 1.5 이상일때는한계가있었다. 셋째로 2% CHX 을오래적용할수록살아있는 E. faecalis 의상대적인양이감소하는것을 PMA 처리와 real-time PCR 방법을사용하여확인하였다. PMA 처리와 real-time PCR 방법은빠르고간단한방법으로앞으로 DNA-based assay 를더욱활발하게할것이다. 특히기존의 PCR 방법이살아있는세균과죽은세균을구분하지못하고함께증폭시키는반면, 이번 PMA 를이용한연구방법은완전한세포막을가진세균만선택적으로검출하여증폭시킨다는점에서더욱의미가있다. 또한 PMA 처리와 real-time PCR 방법이이전의연구 4),5),18),19) 와달리, E. faecalis 를표본으로사용하고 disinfectant 로 CHX 을사용한경우에도성공적으로적용됨을확인할수있었다. 물론 PMA 처리시에살아있는세균의상대적인양과배양에의해얻어진 CFU 가 OD 값이 1.5 일때여러원인에의해직선적인상관관계를보이지는않았다. 하지만 disinfectant 에노출된후세포막의완전함을평가하는데에있어서 PMA 처리방법이빠르고재현가능한방법임을알수있었고, 그러므로이는 plate counting 의대체방법으로써가치가있을것이다. V. 결론 1.PMA 처리와 real-time PCR 방법을이용하여죽은세균을제외하고살아있는 E. faecalis 만선택적으로검출할수있다. 2. 기존의 plate counting 방법의대체방법으로써 PMA 처리와 real-time PCR 방법을적용하는것이가능하지만, OD 값이 1.5 이상일때는한계가있다. 3.Starvation phase 의 E. faecalis 를제거하기위해서 2% chlorhexidine 의장시간적용이필요하다. 참고문헌 1. Williams JM, Trope M, Caplan DJ, Shugars DC. Detection and quantitation of E. faecalis by real-time PCR (qpcr), reverse transcription-pcr (RT-PCR), and cultivation during endodontic treatment. J Endod 32:715-21, Young G, Turner S, Davies JK, Sundqvist G, Figdor D. Bacterial DNA persists for extended periods after cell death. J Endod 33: , Josephson KL, Gerba CP, and Pepper IL. Polymerase chain reaction detection of nonviable bacterial pathogens. Appl Environ Microbiol 59:3513-5, Nocker A, Sossa-Fernandez P, Burr MD, Camper AK. Use of propidium monoazide for live/dead distinction in microbial ecology. Appl Environ Microbiol 73:5111-7, Nocker A, Sossa KE, Camper AK. Molecular monitoring of disinfection efficacy using propidium monoazide in combination with quantitative PCR. J Microbiol Methods 70:252-60, Molander A, Reit C, Dahlen G, Kvist T. Microbiological status of root-filled teeth with apical periodontitis. Int Endod J 31:1-7, Möller AJ. Microbiological examination of root canals and periapical tissues of human teeth. Methodological studies. Odontol Tidskr 74:1-380, Sundqvist G, Figdor D, Persson S, Sjö gren U. Microbiologic analysis of teeth with failed endodontic treatment and the outcome of conservative re-treatment. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 85:86-93, Ro ças IN, Jung IY, Lee CY, Siqueira JF Jr. Polymerase chain reaction identification of microorganisms in previously root-filled teeth in a South Korean population. J Endod 30:504-8, Haapasalo M, Orstavik D. In vitro infection and disinfection of dentinal tubules. J Dent Res 66:1375-9, Wilson M. Susceptibility of oral bacterial biofilms to antimicrobial agent. J Med Microbiol 44:79-87, Mah TF, O Toole GA. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends Microbiol 9:34-9, Lima KC, Fava LR, Siqueira JF Jr. Susceptibilities of Enterococcus faecalis biofilms to some antimicrobial medications. J Endod 27:616-9, Fouad AF, Kum KY, Clawson ML, Barry J, Abenoja C, Zhu Q, Caimano M, Radolf JD. Molecular characterization of the presence of Eubacterium spp. and Streptococcus spp. in endodontic infections. Oral Microbiol Immunol 18:249-55, Abdullah M, Ng YL, Gulabivala K, Moles DR, Spratt DA. Susceptibilities of two Enterococcus faecalis phenotypes to root canal medications. J Endod 31:30-6, Portenier I, Waltimo T, Φrstavik D, Haapasalo M. The susceptibility of starved, stationary phase, and growing cells of Enterococcus faecalis to endodontic medicaments. J Endod 31:380-6, Zamany A, Spa ngberg LS. An effective method of inactivating chlorhexidine. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 93:617-20, Nocker A, Cheung CY, Camper AK. Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells. J Microbiol Methods 67:310-20, Nocker A, Camper AK. Selective removal of DNA from dead cells of mixed bacterial communities by use of ethidium monoazide. Appl Environ Microbiol 72: , De Vos MM, Nelis HJ. An improved method for the selective detection of fungi in hospital waters by solid phase cytometry. J Microbiol Methods 67: , Heling I, Sommer M, Steinberg D, Friedman M, Sela MN. Microbiological evaluation of the efficacy of chlorhexidine in a sustained-release device for dentine sterilization. Int Endod J 25:15-9,

8 대한치과보존학회지 : Vol. 33, No. 6, 2008 국문초록 김신영 이승종 김의성 서덕규 송윤정 정일영 * 연세대학교치과대학치과보존학교실 세균의검출에있어서 polymerase chain reaction (PCR) 방법은기존의 plate counting 과달리빠르게세균을검출할수있다. 하지만세균이죽은후에도 DNA 는장기간존재할수있기때문에, DNA 에기초한분석은살아있는세균과죽은세균을구분할수없다. 최근에 DNA extraction 전에 propidium monoazide (PMA) 를처리하여살아있는세균만선택적으로검출하는방법이제시되었다. PMA 는손상된세포막만통과하여죽은세포의 DNA 와빛노출하에서결합하여 PCR 이증폭되는것을막는다. Enterococcus faecalis 는근관치료의실패에있어서중요한원인이되는세균으로제시되어왔다. 그리고 chlorhexidine (CHX) 은 E. faecalis 의제거에있어서효과적인약제임이밝혀졌다. 이번실험의목적은세균수의측정에있어서, PMA 처리와 real-time PCR 방법의적용가능성을기존의 plate counting 과비교하여알아보는것이다. 또한 E. faecalis 에대한 2% CHX 의살균효과를 PMA 처리후 real-time PCR 방법을사용하여알아보는것이다. 실험방법으로먼저살아있는세균과죽은세균을다른비율로섞어서 PMA 를처리한후 real-time PCR 을시행하여 PMA 가빛노출하에서죽은세균의 DNA 와결합하는효과를나타내는지알아보았다. 다음으로 PMA 처리후 realtime PCR 방법을이용하여살아있는세균의양을측정한것을 plate counting 으로얻은 CFU 와비교하였다. 마지막으로 2% CHX 의처리시간을다르게하였을때 E. faecalis 에대한살균효과를 PMA 처리후 real-time PCR 방법을사용하여알아보았다. 실험결과로살아있는 E. faecalis 의비율이감소할수록 Ct value 는증가하였다. 그리고 PMA 처리후 real-time PCR 방법을이용하여세균의양을측정한것과 plate counting 으로얻은 CFU 사이에는 Optical density (OD) 값이 1.0 일때까지는상관관계가있었다. 하지만 OD 값이 1.5 일때는, PMA 를처리한후 real-time PCR 을시행했을때측정된살아있는세균의양이감소하였음에반해서 plate counting 에의한 CFU 는계속증가하였다. 마지막으로 2% CHX 을오래적용할수록살아있는 E. faecalis 의상대적인양이감소하는것을 PMA 처리와 real-time PCR 방법을이용해확인하였다. 주요단어 : E. faecalis, real-time PCR, propidium monoazide, chlorhexidine 544

012임수진

012임수진 Received : 2012. 11. 27 Reviewed : 2012. 12. 10 Accepted : 2012. 12. 12 A Clinical Study on Effect of Electro-acupuncture Treatment for Low Back Pain and Radicular Pain in Patients Diagnosed with Lumbar