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1 일반연구자지원사업최종보고서 ( 제출용 ) 양식 A101 1 부처사업명 ( 대 ) 기초연구사업보안등급 ( 보안, 일반 ) 일반 2 사업명 ( 중 ) 일반연구자지원사업공개가능여부 ( 공개, 비공개 ) 공개 3 세부사업명 ( 소 ) 신진연구 ( 특정기초 - 우수신진 ) 4 과제성격 ( 기초, 응용, 개발 ) 기초 4-1 실용화대상여부 ( 실용화, 비실용화 ) 5 과제명 6 주관연구기관 7 협동연구기관 8 주관연구책임자 년도 정부출연금 (A) 국문 영문 새로운 NF-κB 억제인자 LC8 의파골세포분화억제기능 Inhibitory roles of LC8, a novel NF-κB inhibitor in osteoclast differentiation 이화여자대학교산학협력단 성명정우진직급 ( 직위 ) 부교수 소속부서분자생명과학부생명과학전공전공생화학 현금 (C) 9 연구개발비및참여연구원수 ( 단위 : 천원, M Y) 기업체부담금 현물 (D) 소계 E=(C+D) 정부외출연금 (B) 상대국부담금 (F) 합계 G=(A+B+E) 참여연구원수 1 차년도 , 차년도 , 차년도 , 차년도 차년도 0 0 합계 140, , 총연구기간 (34 개월 ) 11 다년도협약연구기간 (34 개월 ) 12 당해연도연구기간 (12 개월 ) 13 참여기업 14 국제공동연구 중소기업수대기업수기타계 상대국연구기관수상대국연구개발비상대국연구책임자수 관계규정과모든지시사항을준수하면서국가연구개발사업에따라수행중인연구개발과제의최종보고서를붙임과같이제출합니다 년 2 월 25 일 주관연구책임자 : 정우진 ( 인 ) 주관연구기관장 : 최경희 ( 직인 ) 교육과학기술부장관귀하 - 1 -

2 목차 Ⅰ. 연구계획요약문 1. 국문요약문 3 Ⅱ. 연구결과요약문 1. 국문요약문 4 2. 영문요약문 5 Ⅲ. 연구내용 1. 연구개발과제의개요 6 2. 국내 외기술개발현황 9 3. 연구수행내용및결과 목표달성도및관련분야에의기여도 연구결과의활용계획 연구과정에서수집한해외과학기술정보 주관연구책임자대표적연구실적 참고문헌 연구성과 기타사항

3 연구계획요약문 연구의 목적및내용 양식A 201 본연구의최종목표는새로운 NF-κB 억제인자 LC8의파골세포분화억제기능을 LC8 형질전환마우스를이용하여분자및동물수준에서규명하는것이다. 이연구를통해골다공증이나류마티스성관절염치료를위한새로운신약개발전략을제공하고자한다. NF-κB는파골세포분화에서중요한역할을하므로, 새로운 NF-κB 억제인자 LC8은파골세포분화를억제할것으로예상된다. LC8의파골세포분화억제기능을연구하기위해 1 차년도에는 LC8 형질전환마우스를제작할것이다. 왜냐하면기능이상실된초파리는배아단계에서죽기때문이다. 2차년도에는 LC8 형질전환마우스의골수에서유래한대식세포 (BMM) 를이용하여파골세포분화에대한 LC8의억제효과를분자수준에서연구할것이다. 3차년도에는난소절제동물이나 calvariae에 LPS를주입한동물모델을이용하여골밀도감소나골손상에대한 LC8의보호기능에대한연구가진행될것이다. 연구결과 1차년도 1. LC8의발현을위한발현벡터의제작및발현검증 2. LC8 형질전환마우스의제작및확인 3. LC8의 Raw264.7 세포의파골세포분화에미치는영향조사 2차년도 LC8 형질전환마우스에서유래한 BMM의파골세포분화과정에서, 1. LC8의파골세포분화억제기능 2. LC8에의한 NF-κB 활성억제효과 3. LC8의 MAP kinase 활성화에미치는영향조사 3 차년도 1. LC8 형질전환마우스골수세포로부터유래한파골세포의골흡수억제효과 2. LPS 주입에의한 calvariae 의골손상에대한 LC8 의보호기능 연구결과의활용계획 이연구는새로운 NF-κB의억제인자로밝혀진 LC8의파골세포분화에대한억제기능을분자수준에서이해할수있는정보를제공할것이다. 이러한연구결과는골다공증이나류마티스성관절염을위한신약개발에새로운이론적기반을제공할수있을것으로기대된다. 또한 NF-κB의활성에영향을받는것으로알려진염증성장질환과대장염, 패혈성쇼크, 천식등의염증성질병에대한 LC8의보호기능도가까운미래에밝혀질수있을것으로기대되며, 이를통해염증성질병을위한새로운치료약물의개발에도움을줄수있을것이다. 엘씨 8 엔에프카파비파골세포분화 중심어 형질전환마우스골다공증류마티스성관절염 - 3 -

4 연구결과요약문 한글요약문 연구의 목적및내용 연구결과 연구결과의활용계획 양식A 202 < 연구목적 > 새로운 NF-κB 억제인자 LC8의파골세포분화억제기능을규명하여, 골다공증이나류마티스성관절염치료를위한새로운신약개발전략을제공하고자함. < 연구내용 > 새로운 NF-κB 억제인자 LC8의파골세포분화억제기능을연구하기위해 LC8이과발현된 Raw264.7 세포주와형질전환마우스를제작하였고, RAW264.7 세포주와 LC8 형질전환마우스의골수에서유래한대식세포 (BMM) 를이용하여파골세포분화에대한 LC8의억제효과를분자수준에서규명하였으며, 마우스두개골에 RANKL나 LPS를주입한동물모델을이용하여 LC8의파골세포형성감소와골손상에대한보호기능을규명함. LC8의발현을위한발현벡터의제작및발현검증 LC8 형질전환마우스의제작및확인 LC8이과발현된 Raw264.7 세포주의제작 RAW264.7 세포주에서파골세포분화에대한 LC8의억제효과규명 마우스골수세포의파골세포분화에서 LC8의억제효과규명 마우스골수세포의파골세포분화에서 LC8의 NF-κB 활성억제규명 마우스골수세포의파골세포분화에서 LC8의 MAPKs 활성억제규명 마우스골수세포의파골세포분화에서 LC8의 c-fos와 NFATc1 발현억제규명 마우스골수세포의파골세포분화에서 LC8의 actin ring 형성및골흡수억제규명 RANKL 나 LPS이주입된마우스두개골에서골손상에대한 LC8의보호기능규명 새로운 NF-κB의억제인자인 LC8의파골세포분화에대한저해기능을분자수준에서이해할수있는정보를제공함. 골다공증이나류마티스성관절염을위한신약개발에새로운이론적기반을제공할수있을것으로기대됨. LC8 과발현세포주와마우스는 NF-κB의활성에영향을받는것으로알려진염증성장질환과대장염, 패혈성쇼크, 천식등의염증성질병에대한 LC8의보호기능연구에활용할계획임. 이를통해염증성질환의새로운치료약물의개발에기여할수있으리라기대됨. 엘씨 8 엔에프카파비파골세포분화 중심어 형질전환마우스골다공증류마티스성관절염 - 4 -

5 SUMMARY Purpose& contents Result Expected Contribution <Research purpose> 양식 A 203 The purpose is to provide new strategy for design of novel drugs that target osteoporosis and rheumatoid arthritis by identifying inhibitory roles of LC8, a novel NF-κB inhibitor, in osteoclast differentiation in molecular and animal levels. <Research content> To study inhibitory roles of LC8, a novel NF-κB inhibitor, in osteoclast differentiation, we generated RAW264.7 cells and transgenic (Tg) mice overexpressing LC8, investigated inhibitory roles of LC8 in osteoclastogenesis in molecular level using LC8-overexpressing RAW cells and finally examined protective roles of LC8 against on loss or damage of bone in mouse calvaria injected with LPS and RANKL. Preparation and expression test of construct for LC8 expression. Generation and identification of LC8-overexpressing Tg mice Generation and identification of LC8-overexpressing RAW264.7 cells Inhibition of osteoclast differentiation of Raw264.7 cells by LC8 Inhibition of osteoclast differentiation of mouse BMMs by LC8 Inhibition of NF-κB activation in osteoclastogenesis of mouse BMMs by LC8 Inhibition of MAPKs activation in osteoclastogenesis of mouse BMMs by LC8 Inhibition of induction of c-fos and NFATc1 in osteoclastogenesis of mouse BMMs by LC8 Inhibition of actin ring formation and bone resorption in osteoclastogenesis of mouse BMMs by LC8 Protective roles of LC8 against bone damage in mouse calvaria injected with LPS and RANKL This study will provide a detailed molecular understanding of inhibitory roles of LC8, a novel NF-κB inhibitor, in osteoclast differentiation. Thus, it is expected to provide a molecular basis for design of novel drugs that target osteoporosis and rheumatoid arthritis. LC8-overexpressing RAW cells and Tg mouse could be used to study protective roles of LC8 against other inflammatory diseases including inflammatory bowel disease, colitis, septic shock and asthma, in which NF-κB has been implicated. Collectively this research could provide insight into the development of new therapeutic drugs against inflammatory diseases. LC8 NF-κB Osteoclast differentiation Keywords Transgenic mice Osteoporosis Rheumatoid arthritis - 5 -

6 연구내용및결과 1. 연구개발과제의개요 ~ 10. 중요연구변경사항을항목에따라작성함 제목 14point, 소제목 12point, 본문내용은 10point 로작성하며, 줄간간격은조정가능함 연구내용및결과는 50 페이지이내로작성함 내용작성과관련한설명내용 ( 청색박스로표시된부분 ) 은내용작성시제거하고기술함 양식 A 연구개발과제의개요 가. 연구개발의목적 우리몸의뼈 (bone) 는일생동안흡수 (resorption) 되고다시형성되는역동적인조직으로, 1년에 10% 정도가 remodeling 되는것으로알려져있다 (1). 이러한연속적인 bone remodeling 과정에서뼈를형성하는역할은조골세포 (osteoblast) 가뼈를흡수하여파괴하는역할은파골세포 (osteoclast) 가담당하여뼈의항상성 (bone homeostasis) 을유지하고있다. 그러나이두세포의활성이조화롭게조절되지못하면, 골화석증 (osteopetrosis), 골다공증 (osteoporosis), 류마티스관절염 (reumatoid arthritis) 등과같은뼈관련질환들이생기게된다. 조골세포는중간엽간세포 (mesenchymal stem cell) 로부터분화되어, 활성화된파골세포에의해낡은뼈가제거된자리에새로운뼈를형성한다. 조골세포가만든골기질이점차무기질화되면서골형성이마무리된다. 이후조골세포의대부분은사멸되고일부는골세포 (osteocyte) 나골표면세포 (bone lining cell) 로분화되어생존한다. 파골세포는조혈모세포 (hematopoietic stem cell) 에서유래하는 monocyte lineage progenitor cells로부터분화된다. 단핵의파골세포도이미 TRAP, CTR, MMP9, integrin αvβ3 등의활성을갖고있어뼈흡수활성이있는데, 이들이서로융합되어다핵의파골세포로분화되면서 sealing zone, ruffled boarder, transcytosis 등의파골세포특이적인구조가만들어진다 ( 그림 1) (2). 최근에 RANK(receptor activator of NF-κB) 와 RANKL(RANK ligand) 가파골세포분화에중요한역할을하는것으로알려졌고, RANK signaling pathway가빠르게밝혀지고있다. RANKL는 TNF family의일원으로 ODF(osteoclast differentiation factor), OPGL(osteoprotegrin ligand), TRANCE(TNF-related activation-induced cytokine) 등으로도불리고있다. RANK는 intrinsic enzymatic activity는갖고있지않고, TRAF(TNF-receptor-associated factor) family proteins과같은 adaptor molecule을 recruit하여신호전달을한다. 파골세포분화에서 RANK signaling은주로 TRAF6를통해매개되어, NF-κB와 JNK(JUN N-terminal kinase) 나 p38같은 MAPKs(mitogen-activated kinases) 가활성화된다 (3). 파골세포분화에서 NF-κB의중요한역할은유전학적으로잘알려져있지만 (4, 5), MAPK의 in vivo 기능은아직밝혀져있지않다. RANK는 AP-1(activating protein-1) 도활성화시키는데, CaMKIV(calcium/calmodulin-dependent protein kinase type IV) 와 CREB(cAMP-responsive-element-binding protein) 에의한 c-fos의 induction을통해이루어진다. NF-κB와 AP-1은파골세포분화의결정적인조절인자인 NFATc1(nuclear factor of activated T cell, cytoplasmic 1) 의초기발현을조절한다 ( 그림2)

7 M-CSF (macrophage/monocyte-cology stimulating factor) 와 RANKL는조골세포에서분비되고파골세포전구세포의 c-fms와 RANK에각각결합하여파골세포분화를일으킨다. 조골세포에서는 RANKL에결합하는 RANKL의 soluble decoy receptor인 OPG를분비하여 RANK signaling을억제함으로써파골세포의분화를저해하기도한다 ( 그림2). 최근엔 soluble recombinant RANKL와 M-CSF (macrophage/monocyte-cology stimulating factor) 를처리하여골수세포나 macrophage cell line으로부터손쉽게파골세포의일차배양이가능하게되어 (6), 파골세포분화연구에일대전기가마련되었다. 그림 1. Development of osteoclasts from hematopoietic stem cells. RANK(receptor activator of NF-κB) 라는이름에서알수있듯이 NF-κB는 RANK signaling 초기에활성화되며, 파골세포의분화에서중요한역할을한다는것이알려져있다 (7). NF-κB는포유류에서다섯종류 [Rel(cRel), RelA(p65), RelB, NF-κB1(p50), NF-κB2(p52, 전구체인 p100에서만들어짐 )] 가알려져있으며이들은 dimer로작용한다. NF-κB는활성화되기전에는억제인자인 IκB 단백질과결합되어세포질에존재하다가 RANKL와같은자극을받으면핵으로이동하여 target 유전자들을발현시킨다 (8). NF-κB는두가지기전에의해활성화된다 ( 그림3). classical NF-κB pathway에서는 IκB 단백질이 IKK(I κb kinase) complex에의해인산화되고유비퀴틴의존적으로분해되어 NF-κB(p50/RelA) 가핵으로이동된다. alternative pathway에서는 NIK(NF-κB-inducing kinase) 에의한 IKKα활성화로 p100이 p52로 process되어 p52/relb가핵으로이동된다. 파골세포형성과염증에의한골감소실험에서 IKKβ는 in vitro와 in vivo에서모두필요하지만 IKKα는 in vitro에서만효과가있어 classical NF-κB pathway가파 - 5 -

8 골세포분화에중요한기전일것이라는해석이있지만 (9), p50 결핍마우스는파골세포분화에별지장이없는반면, p50과 p52가함께결핍된마우스는파골세포분화에이상이생긴다는연구결과도있으므로 (5), 정확한조절기전을이해하기위해서는좀더연구가필요하다. NFATc1은파골세포의운명을결정하는매우중요한인자로, 파골세포분화초기에 NF-κB의중요한 target 유전자중하나이다 (10, 11). RANKL에의해활성화된 NF-κB는이미존재하고있던 NFATc2와함께 NFATc1 promoter에결합하여 NFATc1의초기발현을주도한다. 이후 NFATc1은자신의 promoter 에작용하여 auto-amplification 되며, AP1, PU.1, MIFT와같은다른전사인자와함께 cathepsin K, TRAP(tartarate-resistant acid phosphatase), calcitonin receptor, OSCAR(osteoclast-associated receptor), β3-integrin 등의파골세포특이적인유전자의발현을조절한다 ( 그림2) (12). 본연구의목적은새로운 NF-B 억제인자인 LC8 의파골세포분화에대한억제효과를분자수준에서상세 히밝히고, 동물실험을통해 LC8 의골다공증과류마치스관절염의억제기능을 in vivo 에서규명함으로써 골다공증이나류마티스성관절염치료를위한새로운신약개발전략을제공하는것이다. 그림 2. Osteoimmunological interactions in osteoclasts and osteoblasts - 6 -

9 그림 3. Classical and alternative pathways of NF-κB activation 나. 연구개발의필요성및범위 골다공증을포함한많은골관련질환들에대한연구는조골세포보다는파골세포의분화조절에집중되어왔다. 앞에서기술한바와같이 NF-κB는파골세포분화에서매우중요한역할을한다. 우리는최근에 NF-κ B의새로운억제인자를발견하고그억제기전을연구해왔다. LC8(dynein light chain 8 kda) 은 dynein motor complex의구성성분일뿐만아니라다양한기능을갖고있는여러단백질들과도결합한다 (13). 그중 NF-κB inhibitor인 IκBα와도결합하는것이보고된바있으나 (14), 이의생리적인의미는연구되어있지않았다. 새로운산화환원조절단백질인 TRP14 (thioredoxin-related protein 14 kda) 이어떻게 TNF에의한 NF-κB 활성을저해하는지그기전을설명하기위해 TRP14의기질을탐색하는과정에서 TRP14의기질로서 LC8이발견되었다 (15). 이후본연구실에서 IκBα와결합하는 LC8이 IKK에의한 IκBα 의인산화를방해함으로써 NF-κB 활성을저해하고, LC8과 IκBα의결합은 LC8의산화상태에따라조절되며, TRP14은 LC8을환원된상태로유지함으로써 NF-κB 활성을억제한다는연구결과를발표하였다 ( 그림4 참조 )(16). LC8은 TNF 뿐만아니라 LPS(lipopolysaccharide), IL-1β, IR(ionizing radiation), UV, PMA, pervanadate등과같은다양한 NF-κB inducers에의한 NF-κB 활성화를저해하였다. 이는 LC8이 RANKL 에의한 NF-κB 활성화도억제할가능성이매우높다는것을시사한다. LC8에의한 NF-κB의억제는본연구진에의해새로이밝혀진기전으로, 동물실험을통한 LC8의파골세포분화억제기능연구는 NF-κB의 - 7 -

10 새로운억제인자로서 LC8 의생리적인기능의규명뿐만아니라, 골다공증과같은많은골질환치료제개 발에새로운전략을제공하기위해매우필요한일이다. 현재 Eli Lilly, Amgen, Smith Klein Beecham, 노바티스, 머크등선진국의다국적제약회사는파골세포분화와관련된신호전달기전을밝히고, 이경로를조절하는제제를개발하는데총력을기울이고있어, 연구가완료되어제품화되면골질환의예방과치료부분에서독점화할가능성이매우높다. 현재우리나라의여성들에있어서 40대이후가장경계대상의질병이골다공증인점을고려하면, 새로운 NF-κB 억제인자 LC8의파골세포분화억제기전에관한본연구는학문적으로나경제적으로매우중요하다고사료된다. 그림 4. Proposed mechanism for inhibition of NF-κB by LC8-8 -

11 2. 국내외기술개발현황 골다공증은대표적인골소실질환으로써파골세포제어를타겟으로하는 anti-resorptive drug 의개발, 그 리고조골세포를타겟으로하는 osteogenic drug 의개발을목표로연구개발이진행중에있다. 기존의골다공증치료제는대부분골흡수를억제하는치료제가주종을이루고있으나다음표와같이다양 한부작용을지니고있어장기사용시큰문제점으로지적되고있으며새로운약물이개발이절실히요구 되고있다. 대표적골다공증치료의종류, 작용방식및부작용 골다공증치료제개발과관련하여국내외대학을중심으로하는연구기관에서는약물의효능과특이성을향 상시킬수있는신규타겟의발굴을중심으로연구를진행중이며, 국내외다양한제약사에서는치료제개발 에적극적으로나서고있는실정이다. 본기술과관련된국내외연구기관으로는대학을중심으로하는연구기관의경우, 파골 / 조골세포의기능제어를목표로신규타겟단백질의확보와그 validation에초점을두고연구를진행중이다. 대표적기관으로일본도쿄치과대의 Takayanagi 그룹, 도쿄대 Tanaka 그룹, 미국워싱턴대 Tietelbaum 그룹, 영국성죠지병원의 Chambers 그룹, 미국펜실바니아대 Roodman 그룹, 미국 Columbia대 Karsenty 그룹등이있다. 이들연구그룹은파골 / 조골세포의분화활성화기전, 이들세포분화와활성화의신규타겟규명등에초점을두고연구를진행중이다. 국내의경우, 의과대 ( 전남대, 영남대, 가톨릭대, 연세대등 ), 치과대 ( 서울대, 경북대등 ), 자연대 ( 이화여대, 부산대등 ) 소속의연구실에서파골 / 조골세포의기능제어타겟발굴연구를진행중에있다

12 3. 연구수행내용및결과 [1 차년도 ] 가. LC8 과발현형질전환마우스제작을위한 LC8 발현벡터의제조 LC8, Flag-tagged LC8, HA-tagged LC8이 chicken beta-actin promoter 조절하에서발현될수있도록이미제작되어있던 LC8 clones (pcr-lc8, pflag-lc8, pcgn-lc8) 을주형으로표1-3과같이 PCR을수행하고, 각 PCR product를제한효소 EcoRI과 KpnI으로절단하여 pcba-m 벡터 ( 그림 5) 의 EcoRI/KpnI site에클로닝하였다. 표 1. PCR condition Constructs pcba-lc8 pcba-flag-lc8 pcba-ha-lc8 Template (0.1 μg/μl) pcr-lc8 0.5 μl pflag-lc8 0.5 μl pcgn-lc8 0.5 μl Primer 1 (10 μm) LC8-EF 5 μl Flag-EF 5 μl HA-EF 5 μl Primer 2 (10 μm) LC8-KR 5 μl LC8-KR 5 μl LC8-KR 5 μl 10x buffer 5 μl 5 μl 5 μl 10X dntp mix 5 μl 5 μl 5 μl Ex Taq Pol 0.25 μl 0.25 μl 0.25 μl D.W μl μl μl Total 50 μl 50 μl 50 μl 표 2. PCR Cycling parameters Cycles (35) Denaturation (94 ) Annealing (56 ) Extension (72 ) First 2 min + 30 sec 30 sec 1 min sec 30 sec 1 min last 30 sec 30 sec 1min + 2 min 표 3. The sequence of primer used in PCR Primer name LC8-EF LC8-KR Flag-EF HA-EF CBA-F CBA-R TG-beta-F Sequence 5 -CGGAATTCAATGTGCGACCGAAAGGCCGTG-3 5 -GGGGTACCTTAACCAGATTTGAACAGAAGAATG-3 5 -CGGAATTCATGGACTACAAAGACGATGACG-3 5 -CGGAATTCATGGCTTCTAGCTATCCTTATGAC-3' 5'-CCTACAGCTCCTGGGCAACG-3' 5'-GAGCCAGGGCATTGGCCACA-3' 5'-CTGCTAACCATGTTCATGCC-3' Restriction enzyme sites (EcoRI and KpnI) were indicated by italic, and start or stop codon was indicated by bold character

13 그림 5. Map of pcba-m vector 제작된 LC8 발현벡터를각각 pcba-lc8, pcba-flag-lc8, pcba-ha-lc8 이라명명하고, colony PCR (primer set: CBA-F & CBA-R, 표 3 참조 ) 를통해 LC8 유전자의클론닝여부를확인하였다 ( 그림 6). 그림 6. Colony PCR of LC8 expression clones colony PCR 에의해확인된 clone 의 plasmid DNA 를제한효소 EcoRI 과 KpnI 으로절단하여 insert 의존재 를확인하고 ( 그림 7), DNA sequencing 을통해 LC8 유전자가제대로클론닝되었음을최종검증하였다. pcba-lc8, #4; pcba-flag-lc8, #3; pcba-ha-lc8, #4 클론을선택하였다

14 그림 7. Digestion of LC8 expression vectors by EcoRI and KpnI 나. LC8 발현벡터의 LC8 발현여부확인 제작된 LC8 발현벡터 (pcba-lc8, #4; pcba-flag-lc8, #3; pcba-ha-lc8, #4) 를 Fugene 6를이용하여 Hela cells에 48시간 transfection하고, LC8 항체를사용한 western blot으로 LC8의발현정도를확인하였다 ( 그림 8). 발현 level이가장높은 pcba-ha-lc8 발현벡터를 LC8 형질전환마우스제작에사용하였다. 그림 8. Expression of LC8, Flag-LC8 and HA-LC8 in HeLa cells 다. LC8 과발현형질전환마우스의제작및확인 pcba-ha-lc8 발현벡터를제한효소 SalI, PstI, PvuI 로절단하고 ( 그림 9), chicken beta-actin promoter 와 LC8 유전자를포함하는 DNA 절편 ( 약 2.6 kb) 을 agarose gel 에서분리정제하여이화실험동 물센터에 LC8 형질전환마우스의제작을의뢰하였다

15 A B 그림 9. Digestion of pcba-ha-lc8 by SalI, PstI and PvuI (A), and diagram of the 2.6-kb DNA fragment digested with SalI and PstI 대리모에서태어난자손 (offspring) 의꼬리 DNA 를정제하고, 이를주형으로아래조건 ( 표 4 & 5) 으로 PCR 를수행하여 founders 6 마리 (#18, 32, 36, 37, 79, 83) 를확보하였다 ( 그림 10). 표 4. PCR condition using tail DNA as a template Tail DNA (0.5 μg/μl) 1 μl Primer 1 (10 μm) TG-betaF 1 μl Primer 2 (10 μm) CBA-R 1 μl 10x buffer 1 μl 10X dntp mix 1 μl Ex Taq Pol 0.05 μl D.W μl Total 10 μl 표 5. PCR Cycling parameters Cycles (35) Denaturation (94 ) Annealing (62 ) Extension (72 ) First 5 min 30 sec 30 sec sec 30 sec 30 sec last 30 sec 30 sec 2 min

16 그림 10. Identification of LC8 Tg mice by PCR using tail DNA as a template founder #18 와 #83 의여러조직을적출하고 LC8 항체를이용한 western blot 을통해 LC8 Tg mouse 의 여러조직에서 HA-LC8 이발현됨을확인하였다 ( 그림 11) A B 그림 11. Expression of HA-LC8 in various tissues of LC8 Tg mice (A, #18; B, #83)

17 라. RAW264.7 cells 의파골세포분화에서 LC8 의억제효과 LC8 이 knock-down 된 Raw264.7 세포주를만들기위해먼저 Oligoengine program 으로 mouse LC8 sirna sequence 2 종류를디자인하였다 (#1: CATCGAGAAGGATATTGCG, #2: GTGGCACATGAAACCAAAC). ( 그림 12) 1 agatgcgcca cggcttcggt agcgaccggc tgtcttctgc tgcttgagcg gcgcccgcac 61 cttccctagg agctcgcagc agccggctgg cctctgctcc acggtaacca tgtgcgaccg 121 gaaggcggtg atcaaaaatg cagacatgtc ggaagagatg caacaggact cggtggagtg 181 cgctacccag gcgttggaga agtacaacat cgagaaggat attgcggccc atatcaagaa 241 ggagtttgac aagaagtaca accctacctg gcactgcatt gtgggccgaa acttcggtag 301 ttatgtggca catgaaacca aacacttcat ctacttctac ctgggtcagg tggccattct 361 tctgttcaaa tctggttaaa agcatggact gtgccaaaca cccagtgatc catccaaaaa 421 caaggactgc atccaaattc caaataccag agactgaatc ttcagccttg ctaagggaac 481 acctcgtttg aatctgttgt gttgtgtaca gggcttcatt ctctgtacaa gtctgtggtt 541 ataaaattag taaaacagct tacatttgta tttattttct agtccatact tctgtacccc 601 catttttttc tcccttaggt cattccttta aaaataaatc tgttggagat gt 그림 12. mrna sequence of mouse LC8 (accession number, NM_019682). The possible target sequences for silencing was underlined, and start and stop codons were indicated by bold character. 세포내에서 Dicer 에의해 LC8 sirna 로전환되는 small hairpin RNA (shrna) 를발현하는벡터를제작하 기위하여그림 13 과같이 2 종류의 64-mer duplex DNA 를만들어 psuperiorpuro( 그림 14) 의 BglII/HindIII site 에클로닝하였다. 1) mlc8 shrna#1 5 -GATCCCCCATCGAGAAGGATATTGCGttcaagagaCGCAATATCCTTCTCGATGTTTTTGGAAA-3 3 -GGGGTAGCTCTTCCTATAACGCaagttctctGCGTTATAGGAAGAGCTACAAAAACCTTTTCGA-5 2) mlc8 shrna#2 5 -GATCCCCGTGGCACATGAAACCAAACttcaagagaGTTTGGTTTCATGTGCCACTTTTTGGAAA-3 3 -GGGCACCGTGTACTTTGGTTTGaagttctctCAAACCAAAGTACACGGTGAAAAACCTTTTCGA-5 그림 13. Sequence of 64-mer duplex DNA for construction of expression vector that directs intracellular synthesis of mouse LC8 sirna. The 5'-cohesive ends containing BglII or HindIII were indicated by bold character, and the target sequences to interfere LC8 expression were underlined

18 그림 14. Map of psuperiorpuro vector 다음 ( 표 6) 조건으로 colony PCR (H1P-F 와 T3 primer 을사용 ) 을수행하여 positive clone 을고르고, DNA sequencing 을통해 LC8 sirna 발현벡터가정확히제조되었음을확인하여 psuperior-mlc8 이라명 명하였다. 표 6. PCR condition Cycles Denaturation (94 C) Annealing (56 C) Extension (72 C) First 2 min + 30 sec 30 sec 30 sec sec 30 sec 30 sec Last 30 sec 30 sec 2 min + 30 sec H1P-F: 5 -CCA TGG AAT TCG AAC GCT GAC GTC-3 T3: 5 -AATTAACCCTCACTAAAGGG-3 mouse LC8 sirna 를발현하는 2 종류의 psuperior-mlc8 constructs (#1 과 #2) 가 LC8 의세포내발현 을억제하는지확인하기위하여 Fugene 6 를사용하여 psuperior-mlc8 으로 NIH3T3 세포를 60 시간동안

19 transfection 한후, LC8 항체로 western blot 을수행하였다. psuperior-mlc8-2 가효과적으로 LC8 을 knock-down 시킴을확인하였다 ( 그림 15). 그림 15. Depletion of LC8 in NIH3T3 cells transfected with psuperior-mlc8 Lipofectamine 2000 을사용하여 psuperior-mlc8-2 로 RAW264.7 세포를 48, 72 시간동안 transfection 한후, LC8 항체로 western blot 을수행하여 psuperior-mlc8-2 가 RAW264.7 세포에서도효과적으로 LC8 을 knock-down 시킴을확인하였다 ( 그림 16). 그림 16. Depletion of LC8 in RAW264.7 cells transfected with psuperior-mlc8-2 Amaxa 을사용하여 psuperior-mlc8-2 로 RAW264.7 세포를 60 시간동안 transfection 한후, puromycin (1.5 μg/ml) 이들어있는배지에서 subculture 하면서 LC8 이감소된 (LC8 sirna 가 stably expression 되는 ) clone 을 LC8 western blot 을통해확보하였다 ( 그림 17)

20 그림 17. Isolation of RAW264.7 cell lines expressing stably LC8 sirna [2 차년도 ] 가. LC8 이과발현된 RAW264.7 세포주제작 LC8 이과발현된 RAW264.7 세포주를제작하기위한 HA-LC8 발현벡터를제조하기위해 pcgn-lc8 벡 터 ( 그림 18) 를 template 로하여다음 ( 표 7&8) 과같이 PCR 을수행하고, PCR product (343 bp) 를 pcdna3.1 벡터의 EcoRI 과 XhoI sites 에클로닝하였다. ATGGCTTCTAGCTATCCTTATGACGTGCCTGACTATGCCAGCCTGGGAGGACCTTCTAGA 60 TGCGACCGAAAGGCCGTGATCAAAAATGCGGACATGTCGGAAGAGATGCAACAGGACTCG 120 GTGGAGTGCGCTACTCAGGCGCTGGAGAAATACAACATAGAGAAGGACATTGCGGCTCAT 180 ATCAAGAAGGAATTTGACAAGAAGTACAATCCCACCTGGCATTGCATCGTGGGGAGGAAC 240 TTCGGTAGTTATGTGACACATGAAACCAAACACTTCATCTACTTCTACCTGGGCCAAGTG 300 GCCATTCTTCTGTTCAAATCTGGTTAA 327 그림 18. Nucleotide sequence encoding HA-tagged human LC8 in pcgn-lc8. The XbaI recognition sequence is indicated by italic and the sequence coding for HA is underlined. 표 7. PCR condition Template (0.1 μg/μl) pcgn-lc8 0.5 μl Primer 1 (10 μm) HA-EF 5 μl Primer 2 (10 μm) LC8-XR1 5 μl 10x buffer 5 μl 10X dntp mix 5 μl Ex Taq Pol 0.25 μl D.W μl Total 50 μl HA-EF: 5 -CGGAATTCATGGCTTCTAGCTATCCTTATGAC-3' LC8-XR1: 5 -GCCTCGAGTTAACCAGATTTGAACAGAAGAATGG

21 표 8. PCR Cycling parameters Cycles (32) Denaturation (94 C) Annealing (58 C) Extension (72 C) First 2 min + 30 sec 30 sec 30 sec sec 30 sec 30 sec last 30 sec 30 sec 30 sec + 2 min colony PCR (primer set: HA-EF & LC8-XR1) 에서 343 bp 의 PCR product 를보여주는클론을골라 그 plasmid 를 EcoRI 과 XhoI 으로절단하여 337 bp DNA fragment 를확인하고, DNA sequencing 을통해 LC8 의클로닝를최종검증하였다 (pcdna-ha-lc8, 그림 19). 그림 19. pcdna-ha-lc8. Lipofectamine 2000 을사용하여 pcdna-ha-lc8 로 Raw 세포를 transfection 하고 HA-LC8 의발 현정도를 LC8 과 HA 항체를이용하여확인하였다 ( 그림 20) 그림 20. Expression of HA-tagged LC8 in Raw264.7 cells transfected with pcdna-ha-lc8. Amaxa 을사용하여 pcdna-ha-lc8 로 RAW264.7 세포를 24 시간동안 transfection 한후, G418 (1 mg/ml) 이들어있는배지에서 subculture 하면서 HA-LC8 이발현된 (HA-LC8 이 stably expression 되는 ) clone 을 LC8 western blot 을통해확보하였다 ( 그림 21)

22 그림 21. Isolation of RAW264.7 cell lines expressing stably HA-tagged LC8 나. RAW264.7 세포주에서파골세포분화에대한 LC8 의억제효과 HA-LC8이과발현되는 RAW264.7 세포주와정상세포에 RANKL (100 ng/ml) 를넣고날짜별로세포를고정하여 tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) 염색을한후, 파골세포분화정도를 TRAP-positive multinucleated (>3 nuclei) 세포수를비교분석한결과, LC8이과발현된 RAW264.7 세포주에서 RANKL에의한파골세포분화가억제됨을확인하였다 ( 그림 22). 그림 22. Inhibition of RANKL-induced osteoclast differentiation of RAW cells by LC8 overexpression. RAW264.7 cells were cultured in the presence of RANKL (100 ng/ml) for the indicated time. The cells were fixed, subjected to TRAP staining and were observed under a light microscope: scale bar, 200 mm (left). The number of TRAP-positive multinucleated cells (TRAP+ MNCs) was counted (right). All values represent means ± SD. * P < ** P < *** P < 다. LC8 형질전환마우스로부터분리된골수세포의파골세포분화에서 LC8 의억제효과 LC8 형질전환마우스로부터골수세포를다음과같은방법으로분리하였다 : 마우스를경추탈골시킨후

23 근육을 제거하고 대퇴골(femer)과 경골(tibia)의 관절강(joint cavity) 부분을 절단한다. syringe로 10% FBS(fetal bovine serum)와 1% penicillin/streptomycin이 포함된 α-mem(minimal essential medium) 배지를 여러 번 반복하여 밀어내어 골수세포를 얻고, Cell Strainer (40 μm)로 여과한 후 원심분리로 세 포들을 회수한다. 얻어진 세포들을 Gey s Solution (RBC lysis solution)에 풀어 적혈구를 파괴하고 원심 분리한다. 회수된 세포들은 α-mem 배지에서 1일간 배양한 후 떠있는 세포들만 모아 M-CSF (20 ng/ml)가 추가된 배지에서 3일간 배양한다. lymphocytes를 포함하는 nonadherent 세포들은 제외하고 adherent 세포들을 bone marrow macrophages (BMM)으로 사용한다. LC8 형질전환 마우스(#18)와 정상 마우스에서 얻은 BMM에 M-CSF (20 ng/ml)와 RANKL (100 ng/ml)를 처리하고 날짜별로 세포를 고정하여 tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) 염색을 한 후, 파골세포 분화정도를 TRAP-positive multinucleated (>3 nuclei) 세포수를 비교 분석하였다. LC8 형질전환 마우스의 BMM에서 LC8은 과발현 되었고 (그림 23A), RANKL에 의한 파골세포 분화가 억제 됨을 확인하였다(그림 23, B and C). 또한 다른 LC8 형질전환 마우스(#83)의 BMM에서도 동일한 결과 를 확인할 수 있었다 (그림 23, D-F). 그림 23. Inhibition of RANKL-induced osteoclast differentiation of BMM by LC8 overexpression. (A and D) Cell lysates (20 mg) of BMMs obtained from wild-type (WT) or Tg mice, were subjected to the immunoblot analysis using antibodies specific to LC8 and b-actin. (B and E) BMMs were cultured with M-CSF (20 ng/ml) and RANKL (100 ng/ml) for the indicated time. The cells were fixed, subjected to TRAP staining and were observed under a light microscope. Scale bar, 200 mm. (C and E)ThenumberofTRAP-positivemultinucleatedcells(TRAP+MNCs)generatedinBandEwascounted. Two lines of Tg mice were used: A-C, line 18; D-F, line 83. All values represent means ± SD. *P < 0.05 P < 0.01 ** P < ***

24 라. LC8 형질전환마우스로부터분리된골수세포의파골세포분화시 LC8 의 NF-κB 활성억제 NF-κB는파골세포분화에서중요한역할을하며, LC8은새로이밝혀진 NF-κB 억제인자이므로 LC8의파골세포분화억제는 NF-κB 활성억제를통해이루어졌을가능성이크다. 이러한가능성을조사하기위하여 HA-LC8이과발현된형질전환마우스의 BMM 세포의 RANKL에의한 IκBα 인산화와분해를정상세포와비교분석한결과, LC8이과발현된골수세포에서 RNAKL에의한 IκBα 인산화와분해가현저히저해됨을확인하였다 ( 그림 24, A & B). 또한 NF-κB의 target 유전자인 COX-2의발현도 LC8이과발현된형질전환마우스의 BMM 세포에서상당히감소됨이확인되었다 ( 그림 24C). 그림 24. Inhibition of RANKL-induced NF-kB activation by LC8 overexpression. BMMs were exposed to RANKL (100 ng/ml) in the presence of M-CSF (20 ng/ml) for the indicated times. A and B, cell lysates were subjected to immunoblot analysis with antibodies to p-ikba, to IkBa, to LC8, or to β-actin (A). The chemiluminescence signals for p-ikba and IkBa were quantified and normalized by those of β-actin (B). The abundance of COX-2, LC8, and b-actin in cell lysates was determined by immunoblot analysis using their specific antibodies (C)

25 [3 차년도 ] 가. LC8 inhibits activation of JNK and ERK in BM M s stimulated by RA NKL RANKL은파골세포분화와관련된유전자의발현에중요한기능을하는것으로알려진 JNK, p38, ERK 등 mitogen activating protein kinases (MAPKs) 를활성화시킨다. LC8 과발현이 RANKL에의한 MAPKs의활성화를저해하는지조사하였다. MAPKs는 TXY motif내의 threonine과 tyrosine 잔기 (Thr 183 and Tyr 185 for JNK; Thr 180 and Tyr 182 for p38; Thr 202 and Tyr 204 for ERK) 의 dual phosphorylation에의해활성화된다. dual phosphorylation된단백질에특이적인항체를이용한이뮤노블랏분석에서 RANKL에의한 JNK와 ERK의인산화는정상골수세포에비해서 LC8 과발현골수세포에서현저히감소됨을알수있었다 ( 그림 25). 그러나 p38의인산화는 LC8 과발현에의해영향을받지않았다. 그림 25. Inhibition of RANKL-induced MAPK activation by LC8 overexpression. BMMs were incubated with M-CSF (20 ng/ml) and RANKL (100 ng/ml) for the indicated times, after which cell lysates were subjected to immunoblot analysis with antibodies to phospho-jnk and JNK1, to phospho-p38 and p38 or to phospho-erk and ERK2 (upper and lower of each pair of images, respectively) (A). The chemiluminescence signals for phospho-jnk, phospho-p38 and phospho-erk were quantified and normalized by those of JNK1, p38 and ERK2, respectively (B)

26 나. LC8 suppresses RANKL-induced expression of c-fos and NFATc1 in BMMs RANKL은 activator protein-1 (AP-1) 전사인자를활성화시키는데, 이는부분적으로는파골세포분화에필요한 AP-1의중요한성분인 c-fos의발현을통해이루어진다. 그래서 RANKL에의해활성화된골수유래대식세포에서 c-fos 발현에대한 LC8의효과를조사하였다. RANKL에의한 c-fos의발현이정상골수유래대식세포에서는 8시간쯤에최대가되었고 12시간까지유지되었으나, LC8 과발현세포에서는현저히감소되었다 ( 그림 26A). RANKL은또한파골세포분의주요한조절인자인 NFATc1의강한발현을유도하는데, 이발현은 NF-κB와 c-fos pathways에의존적이다. RANKL에의해유도되는파골세포분화에서 LC8이 NF-κB 활성화와 c-fos 발현을저해하므로 LC8은 RANKL에의한 NFATc1 발현도억제하리라고여겨진다. 예상대로정상골수세포유래대식세포는 RANKL에의해많은양의 NFATc1이발현되었으나, LC8 과발현세포에서는 NFATc1의발현이거의사라졌다 ( 그림 26B). NFATc1은 tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP), cathepsin K, calcitonin receptor, osteiclast-associated receptor (OSCAR), β-integrin 같은많은파골세포특이적인유전자의발현을 AP1, PU.1, MITF, CREB 등의다른전사인자와함께조절한다. NFATc1 타겟유전자중하나인 TRAP의양은 TRAP activity assay에서볼수있듯이정상골수세포유래대식세포와비교해서 LC8 과발현세포에서현저히감소되었다 ( 그림 26C). 다. LC8 inhibits actin ring formation of and bone resorption by osteoclast 성숙된파골세포는 actin ring으로구성된 sealing zone을가지고있는데골흡수에필요하고선명한경계를보인다. 다음으로 LC8이 actin ring 형성과골흡수를저해하는지조사하였다. 정상골수세포에서분화된파골세포는선명한경계를보이는 actin ring을형성하였으나 LC8 과발현세포는 actin ring 형성이현저히감소되었다 ( 그림 27A). LC8에의한 actin ring 형성의억제가파골세포의골흡수능력을저해하는지조사하기위해골수세포유래대식세포를 dentine discs에서 RANKL에의해파골세포로분화시켰다. sealing zone 형성에서의억제효과와마찬가지로 LC8 과발현은 dentine disc에서 resorption pits 형성을현저히감소시켰다 ( 그림 27B). 이들결과는 LC8이파골세포의 actin ring 형성과골흡수를저해한다는것을시사한다. 라. LC8 inhibits osteoclast formation and bone destruction induced by LPS or RANKL in mouse calvaria LC8 과발현골수유래대식세포를이용한연구결과들은 LC8이 NF-κB의억제뿐만아니라 c-fos와 NFATc1의발현억제를통해파골세포분화와골흡수를저해한다는것을보여준다. 과다한파골세포활성으로기인된골질환에서 LC8의치료효과가능성을알아보기위해 LC8이과발현된마우스의두개골에 LPS나 RANKL를주입하고파골세포의형성과골감소를분석하였다. 정상마우스와비교하여 LC8 과발현마우스에서골파괘의정도와 TRAP 염색된파골세포의수가유의적으로감소되었다 ( 그림 28). 이는 LC8이염증에의해유도되는골변형을억제할수있다는것을시사한다

27 그림 26. Suppression of RANKL-induced expression of c-fos and NFATc-1 by LC8 overexpression. BMMs were incubated with M-CSF (20 ng/ml) and RANKL (100 ng/ml) for the indicated times. The abundance of c-fos (A), and the expression of NFATc-1 (B) in cell lysates were determined by immunoblot analysis using their specific antibodies. The specific activity of TRAP was determined as described in Materials and methods (C). All values represent means ± SD. * P < 0.05; ** P <

28 그림 27. Inhibition of RANKL-induced actin ring formation and bone resorption by LC8 overexpression. (A) After incubation of BMMs with RANKL (100 ng/ml) for 5 days in the presence of M-CSF (20 ng/ml), the cells were fixed with 3.7% formaldehyde solution in PBS, permeabilized with 0.1% Triton X-100 and incubated with Alexa Fluor 488-phalloidin for 20 min. After washing with PBS, the cells were incubated with 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) for 2 min. Images were photographed under a confocal microscope. Scale bar, 50 μm. (B) BMM cells on dentine discs were incubated with M-CSF (20 ng/ml) and RANKL (100 ng/ml) for 7 days, after which cells were removed from dentine discs and resorbed pit were visualized by staining with hematoxylin. Scale bar, 200 μm (left). The area of resorption pits was measured with Image-Pro Plus 4.5 (Media Cybernetics). Data represent means ± SD and * P < 0.05 (right)

29 그림 28. Inhibition of LPS- or RANKL-induced osteoclast formation and bone destruction by LC8 overexpression. LPS (15 mg/kg body weight), RANKL (2 mg/kg) or PBS was injected in the space between the subcutaneous tissue and the periosteum of the skull, each in a 50-μl volume. Seven days after the injection, calvaria bone was fixed, decalcified, embedded in paraffin, and stained with TRAP, subsequently with hematoxylin and eosin. Scale bar, 190 μm

30 4. 목표달성도및관련분야에의기여도 가. 목표달성도 목표달성도 (%) 내용 LC8 의발현을위한발현벡터의제작 100 LC8 형질전환마우스의제작 100 LC8 과발현 RAW264.7 세포주제작을위한 LC8 발현벡터의제작및발현검증 LC8 과발현형질전환마우스제작을위한 LC8 발현벡터의제작및발현검증 LC8이과발현된형질전환마우스제작완료 LC8 과발현형질전환마우스 2종이상확보 LC8 의 Raw264.7 세포의파골세포분화에 미치는영향조사 100 LC8 이과발현된 RAW264.7 세포주제작 LC8 과발현 RAW264.7 세포를이용하여파골 세포분화에대한 LC8 의억제효과규명 마우스골수유래대식세포의파골세포 분화과정에서 LC8 의파골세포분화 억제효과 100 마우스골수세포분리및대식세포분화기술확보 LC8 과발현마우스의골수유래대식세포를이용하여 LC8의파골세포분화억제효과규명 마우스골수유래대식세포의파골세포 분화과정에서 LC8 의 NF-κB 활성 억제효과 100 마우스골수유래대식세포의 RANKL에의한파골세포분화에서 LC8의 NF-κB 활성억제효과규명 마우스골수유래대식세포의파골세포분화에서 LC8의 c-fos와 NFATc1 발현억제규명 마우스골수유래대식세포의파골세포 분화과정에서 LC8 의 MAP kinase 활성화에미치는영향조사 100 마우스골수유래대식세포의 RANKL 에의한파 골세포분화에서 LC8 의 JNK 및 ERK 활성억제 규명 LC8 의골흡수억제효과확인 100 마우스골수유래대식세포의파골세포분화에서 LC8 의 actin ring 형성및골흡수억제규명 LPS 주입에의한마우스두개골의골 손상에대한 LC8 의보호기능 100 마우스두개골골흡수모델확립 RANKL 나 LPS가주입된 LC8 과발현마우스의두개골에서골손상에대한 LC8의보호기능규명

31 나. 관련분야에의기여도 LC8이새로운 NF-κB 억제인자임이동물모델에서입증되어 LC8의생리적인기능이규명되고, LC8에의한 NF-κB 활성조절이실질적으로파골세포분화에중요함이검증되리라기대된다. 파골세포는골다공증치료제개발의주요 target으로 NF-κB 활성억제를통한 LC8의파골세포분화억제기능규명은골다공증이나류마치스관절염치료제개발에새로운전략을제시할수있다. 골다공증을비롯한골관련질환치료비용은고령화가가속되면서가파르게증가될것으로전망된다. 2003년한해동안골다공증에의해연간의료비용이 4,390억원, 생산성손실비용이 6,100억원으로총 1조 495억원의사회경제적손실이발생한것으로추정된다. LC8이파골세포의분화를억제하는본연구결과를토대로새로운골다공증치료제가개발되면, 국내제약산업의발전과수입대체효과를가져올수있어국가경제에크게이바지하리라기대된다. 본연구를통해 2 명의석사를양성하여배출할계획으로, 이들은본연구결과를국제적인논문에게제함 으로써연구에대한흥미와자신감을가지고학문연구를계속하거나졸업후연구기관에서자신의연구역 량을인정받아과학발전에기여하는인제가되리라기대한다. 5. 연구결과의활용계획 LC8 을골다공증이나류마티스성관절염을위한신약개발에활용하기위한추가적인동물모델연구가공 동으로진행될필요가있음. LC8 은 redox sensitive target 으로 TRP14 에의해산화상태가조절되고, 파골세포분화도활성산소에의해 조절됨이알려져있으므로 TRP14 에의한파골세포분화조절에대한연구도추가로필요함. LC8 과발현세포주와마우스는 NF-κB 와밀접한관련이있는것으로알려진염증성장질환과대장염, 패혈성쇼크, 천식등의염증성질병에대한 LC8 의보호기능연구에활용할계획임. 본연구를통해얻어진연구결과는관련기업에기술이전을검토하여산업체와공동으로골다공증이나관절 염의새로운치료제개발에활용할계획임

32 6. 연구과정에서수집한해외과학기술정보 활성산소 (reactive oxygen species) 는조골세포에서의 RANKL의발현및파골전구세포에서의 RANKL 신호전달을활성화시켜파골세포로의분화를촉진함. 또한활성산소는파골세포에의한골흡수와난소제거에의한골감소에도관련이있음이알려져있음. 그리고본연구팀은레독스조절을받는 NF-κB의새로운조절인자인 LC8이활성산소에민감한타겟단백질이며 TRP14에의해산화상태가조절됨으로써 NFκB의레독스조절에기여한다는것을밝힌바있음. 따라서 TRP14에의한파골세포분화조절여부및기전연구가추가로필요함. NF-κB는염증반응을조절하는주요한전사인자이며, 염증성장질환과대장염, 패혈성쇼크, 천식등의염증성질병이 NF-κB와밀접한관련이있는것으로알려져있음. 따라서이들염증성질환들에대해서도 LC8이억제효과가있을것으로기대되므로 LC8 과발현세포주와마우스를 LC8의염증성질환치료효과규명연구에활용할계획임. 7. 주관연구책임자 ( 공동연구원 ) 대표적연구실적 번호논문명 / 특허명 / 기타소속기관명역할 1 2 Thioredoxin-related protein 14, a new member of the thioredoxin family with disulfide reductase activity: Implication in the redox regulation of TNF-alpha signaling Redox regulation of lipopolysaccharide-mediated sulfiredoxin induction which depends on both AP-1 and Nrf2 이화여자대학교 교신저자 이화여자대학교교신저자 논문게재지 / 특허등록국가 FREE RADICAL BIOLOGY AND MEDICINE J. Biol. Chem. 논문게재일 / 특허등록일 특기사항 (SCI 여부 ) SCI (IF: 6.081) SCI (IF: 5.328)

33 8. 참고문헌 1. Alliston T, Derynck R. (2002) Interfering with bone remodelling Nature 416, Miyamoto T, Suda T. (2003) Differentiation and function of osteoclasts Keio J Med. 52, Takayanagi H. (2007) Osteoimmunology: shared mechanisms and crosstalk between the immune and bone systems Nat Rev Immunol. 7, Franzoso, G. et al. (1997) Requirement for NF-κB in osteoclast and B-cell development. Genes Dev. 11, Iotsova, V. et al. (1997) Osteopetrosis in mice lacking NF-κB1 and NF-κB2 Nature Med. 3, Boyle, W. J., Simonet, W. S., and Lacey, D. L. (2003) Osteoclast differentiation and activation. Nature 423, Jimi E. et al. (2004) Selective inhibition of NF-κB blocks osteoclastogenesis and prevents inflammatory bone destruction in vivo, Nat. Med. 10, Hayden, M. S., and S. Ghosh (2004) Signaling to NF-κB Genes Dev. 18, Ruocco M.G. et al. (2005) IKB kinase (IKK)β, but not IKKα, is a critical mediator of osteoclast survival and is required for inflammation-induced bone loss J. Exp. Med. 201, Asagiri M. et al. (2005) Autoamplification of NFATc1 expression determines its essential role in bone homeostasis J. Exp. Med. 202, Takayanagi H. et al. (2002) Induction and activation of the transcription factor NFATc1 (NFAT2) integrate RANKL signaling for terminal differentiation of osteoclasts, Dev. Cell 3, Asagiria M. and Takayanagi H. (2007) The molecular understanding of osteoclast differentiation Bone 40, Fan, J., Q. Zhang, H. Tochio, M. Li, and M. Zhang (2001) Structural basis of diverse sequence-dependent target recognition by the 8 kda dynein light chain J. Mol. Biol. 306, Crepieux, P., H. Kwon, N. Leclerc, W. Spencer, S. Richard, R. Lin, and J. Hiscott. (1997) I kappab alpha physically interacts with a cytoskeleton-associated protein through its signal response domain. Mol. Cell. Biol. 17, Jeong, W., T. S. Chang, E.S. Boja, H. M. Fales, and S. G. Rhee (2004) Roles of TRP14, a thioredoxin-related protein in tumor necrosis factor-alpha signaling pathways. J Biol Chem 279, Yuyeon Jung, Hojin Kim, Sun Hee Min, Sue Goo Rhee and Woojin Jeong (2008) Dynein Light Chain LC8 Negatively Regulates NF-kB through the Redox-dependent Interaction with IκBα J. Biol. Chem. 283,

34 9. 연구성과 사업명신진연구지원사업연구책임자정우진주관기관이화여자대학교산학협력단 과제번호 과제명새로운 NF-κB 억제인자 LC8 의파골세포분화억제기능 전문학술지논문게재 과학기술 / 학술적연구성과 ( 단위 : 건 ) 초청강연실적 학술대회논문발표 지식재산권 국내논문국외논문출원등록국내국제 SCI 비SCI SCI 비SCI 국내국외국내국외 수상실적 저역서 출판실적 보고서 인력양성및연구시설 ( 단위 : 명, 건 ) 학위배출국내외연수지원장기단기산학강좌연구기자재박사석사국내국외국내국외 국내과학자해외파견 국제협력 ( 단위 : 명, 건 ) 과학자교류국제협력기반학술회의개최 외국과학자국내유치 MOU 체결국제공동연구국제사업참여국내국제 산업지원및연구성과활용 ( 단위 : 건 ) 기술확산 연구성과활용 ( 사업화및후속연구과제등 ) 기술이전 기술지도 기술평가 후속연구추진 사업화추진중 사업화완료

35 전문학술지논문게재성과정보 과제번호게재연월논문제목총저자명출처학술지명권 ( 호 ) 학술지구분 SCI여부 IF 국제공동연구논문여부 기여도 Thioredoxin-related protein 14, a new member of the thioredoxin family with disulfide reductase activity: Implication in the redox regulation of TNF-alpha signaling Jeong,Wooji njung,yuye onkim,hojin Park,SunJo orhee,sueg oo SCI FREE RADICAL BIOLOGY AND MEDICINE 47(9) 국외 SCI 등재 ( jcr2008 ) 아니오 20% Redox Regulation of Lipopolysaccharidemediated Sulfiredoxin Induction, Which Depends on Both AP-1 and Nrf2 Kim,HojinJu ng,yuyeons hin,bongso okim,hyery eonsong,hy unsookbae, SooHanRhe e,suegooje ong,woojin SCI JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 285(45) 국외 SCI 등재 5.328(j cr2009) 아니오 30% 국제학술대회초청강연실적성과정보 과제번호발표연월학술대회명발표자강연주제개최국 the Annual Meeting of the Korean Society for Biochemistry and Molecular Biology 정우진 Redox regulation of LPS-mediated sulfiredoxin induction 대한민국

36 학술대회논문발표성과정보 과제번호발표년월학술대회명저자논문제목학술대회구분개최국 the American Society for Cell Biology the Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology the Annual Meeting of the Korean Society for Biochemistry and Molecular Biology the 2010 Fall Conference of The Korean Association of Immunologists 한국분자세포생물학회 the 12th Annual symposium of the Center for Cell Signaling and Drug Discovery Research Yuyeon Jung, Bong Soo Shin, Hojin Kim, Hyaeryeon Kim, Hyunsook Song and Woojin Jeong Sohyun Hong, Hojin Kim and Woojin Jeong Hojin Kim, Yuyeon Jung, Bong Soo Shin, Hyunsook Song, Soo Han Bae, Sue Goo Rhee and Woojin Jeong Hyeryeon Kim, Yoohee Yang, Woojin Jeong Yuyeon Jung, Bong Soo Shin, Hojin Kim, Hyaeryeon Kim, Hyunsook Song and Woojin Jeong Sohyun Hong, Hojin Kim and Woojin Jeong Redox regulation of activator protein-1-dependent sulfiredoxin gene expression by lipopolysaccharide in macrophages TRP14 attenuates osteoclast differentiation by inhibiting NF-κB and MAPK signaling Redox regulation of LPS-mediated sulfiredoxin induction which depends on both AP-1 and Nrf2 LC8 inhibits RANKL-induced osteoclast differentiation by suppressing NF-kappaB and MAP kinases Redox regulation of activator protein-1-dependent induction of sulfiredoxin gene by lipopolysaccharide in macrophages TRP14 attenuates osteoclast differentiation of RAW macrophage cells 국제학술대회 국제학술대회 국제학술대회 국제학술대회 국제학술대회 국내학술대회 미국 미국 대한민국 대한민국 대한민국 대한민국 10. 기타사항 ( 중요연구변경사항등 ) 해당사항없음

37 [ 별첨 1] 대표연구성과 대표연구업적요약문 연구업적제목 Thioredoxin-related protein 14, a new member of the thioredoxin family with disulfide reductase activity: Implication in the redoxregulation of TNF-α signaling 연구업적유형학술지게재논문 ( ) 특허 ( ) 저서 ( ) 역서 ( ) 주관연구책임자또는공동연구원성명 Woojin Jeong, Yuyeon Jung, Hojin Kim, Sun Joo Park and Sue Goo Rhee 참여자수 5 본과제수행결과로인한대표연구성과작성시기술내용 - 참여자의역할 : 교신저자 - 관련된연구과제 : 사업명 : 미래기반기술개발사업 과제명 : 산화환원반응의작용표적탐색및작용기전규명 과제번호 : M N 사업명 : 국가핵심연구센터 과제명 : 활성산소매개신호전달 Target 발굴 과제번호 : R

38 [ 별첨 1] 대표연구성과 대표연구업적요약문 연구업적제목 Redox regulation of lipopolysaccharide-mediated sulfiredoxin induction which depends on both AP-1 and Nrf2 연구업적유형학술지게재논문 ( ) 특허 ( ) 저서 ( ) 역서 ( ) 주관연구책임자또는공동연구원성명 Hojin Kim, Yuyeon Jung, Bong Soo Shin, Hyeryeon Kim, Hyunsook Song, Soo Han Bae, Sue Goo Rhee and Woojin Jeong 참여자수 8 본과제수행결과로인한대표연구성과작성시기술내용 - 참여자의역할 : 교신저자 - 관련된연구과제 : 사업명 : 미래기반기술개발사업 과제명 : 산화환원반응의작용표적탐색및작용기전규명 과제번호 : M N 사업명 : 국가핵심연구센터 과제명 : 활성산소매개신호전달 Target 발굴 과제번호 : R

39 양식 1. 과제현황 자체평가의견서 ` 사업구분 과제번호 기초연구사업 기재하지않음 연구분야기재하지않음기재하지않음단위 ( ) 과제구분사업명일반연구자지원사업 ( 신진 ) 주관 총괄과제기재하지않음총괄책임자기재하지않음 과제명새로운 NF-κB 억제인자 LC8 의파골세포분화억제기능과제유형 ( 기초, 응용, 개발 ) 연구기관이화여자대학교산학협력단연구책임자정우진 연구기간연구비 ( 천원 ) 참여기업 상대국 연차 기간 (yyyy.mm ~ yyyy.mm) 정부민간계 1 차년도 ~ ,000 40,000 2 차년도 ~ ,000 50,000 3 차년도 ~ ,000 50,000 4 차년도 5 차년도 계 ( 총연구기간 ) 140, ,000 상대국연구기관 2. 평가일 : 2011 년 2월 25일 3. 평가자 ( 연구책임자 ) 소속 직위 성명 이화여자대학교부교수정우진 4. 평가자 ( 연구책임자 ) 확인 본인은평가대상과제에대한연구결과에대하여객관적으로기술하였으며, 공정하게평가하였음을 확약하며, 본자료가전문가및전문기관평가시에기초자료로활용되기를바랍니다. 확약 정우진

40 Ⅰ. 연구개발실적 다음각평가항목에따라자체평가한등급및실적을간략하게기술 (200 자이내 ) 1. 연구개발결과의우수성및창의성 등급 : ( 아주우수, 우수, 보통, 미흡, 불량 ) 본연구는새로운 NF-κB 저해인자인 LC8이파골세포의분화에서 NF-κB 활성을억제하여파골세포분화에서매우중요한조절인자인 c-fos와 NFATc1의발현도현저감소시켜파골세포분화를억제하고, 결과적으로 actin ring 형성과골흡수를저해함으로서염증성골손상에대한보호기능을할수있음을규명한것으로, 골다공증이나류마티스성관절염치료를위한새로운신약개발전략을제공함. 2. 연구개발결과의파급효과 등급 : ( 아주우수, 우수, 보통, 미흡, 불량 ) 마우스모델에서규명된새로운 NF-κB 억제인자 LC8의염증성골손상에대한보호기능은 NF-κB 활성을조절함으로써골질환을치료하려는연구그룹에가능성을제시하여이분야의연구와신약개발을활성화시킬수있으리라기대됨. 3. 연구개발결과에대한활용가능성 등급 : ( 아주우수, 우수, 보통, 미흡, 불량 ) 골다공증이나류마티스성관절염을위한신약개발에활용될가능성이높음. LC8 과발 현세포주와마우스는 NF-κB 의활성에영향을받는것으로알려진염증성장질환과 대장염, 패혈성쇼크등의염증성질병에대한 LC8 의보호기능연구에활용할계획임. 4. 연구개발수행노력의성실도 등급 : ( 아주우수, 우수, 보통, 미흡, 불량 ) 제시한연구내용을체계적으로성실히수행하였고, 계획된연구목표를성공적으로달성함. 5. 공개발표된연구개발성과 ( 논문, 지식재산권, 발표회개최등 ) 등급 : ( 아주우수, 우수, 보통, 미흡, 불량 ) 과제수행중 SCI 논문 (FRBM 과 JBC) 2 편을교신저자로발표함

41 Ⅱ. 연구목표달성도 세부연구목표 LC8 과발현 RAW264.7 세포주및형질전환마우스제작 비중 (%) 달성도 (%) 자체평가 LC8 발현벡터의제작및발현검증함. LC8이과발현된 RAW264.7 세포주및형질전환마우스라인 2종이상제작함. RAW264.7 세포및마우스골수유래대식세포의파골세포분화과정에서 LC8의파골세포분화억제효과규명 LC8 과발현 RAW264.7 세포를이용하여파골세포분화에대한 LC8 의억제효과규명함. 마우스골수세포분리및대식세포분화기술확보함. LC8 과발현마우스의골수유래대식세포를이용하여 LC8의파골세포분화억제효과규명함. 마우스골수유래대식세포의파골세포분화과정에서 LC8의 NF-κB 및 MAPKs 활성억제효과규명 마우스골수유래대식세포의 RANKL 에의한파골세포분화에서 LC8의 NF-κB 활성억제효과규명함. 마우스골수유래대식세포의파골세포분화에서 LC8의 c-fos와 NFATc1 발현억제규명함. 마우스골수유래대식세포의 RANKL 에의한파골세포분화에서 LC8의 JNK 및 ERK 활성억제규명함. LC8 의골흡수억제및마우스 두개골의골손상에대한보호 기능규명 마우스골수유래대식세포의파골세포분화에서 LC8의 actin ring 형성및골흡수억제규명함. RANKL나 LPS가주입된 LC8 과발현마우스의두개골에서골손상에대한 LC8의보호기능규명함. 합계

42 Ⅲ. 종합의견 1. 연구개발결과에대한종합의견 본연구는새로운 NF-κB 억제인자 LC8 의파골세포분화억제기능을 LC8 과발현형질전 환마우스를이용하여분자수준및동물수준에서규명한것으로, 골다공증이나류마티스 성관절염치료를위한새로운신약개발전략을제공하게될것으로기대됨. 2. 평가시고려할사항또는요구사항 연구수행중에확보된기술과실험재료들이타연구과제에도활용되어이미 2편의 SCI 논문게제에기여하였고, 본과제의주된연구결과는현재특허출원과논문투고를준비하고있음. 실험동물의제작및동물실험이포함된연구로, 연구비와연구기간이빠듯하였음을고려해주시기바람. 3. 연구결과의활용방안및향후조치에대한의견 LC8 과발현세포주와마우스는 NF-κB의활성에영향을받는것으로알려진염증성장질환과대장염, 패혈성쇼크등의염증성질병에대한 LC8의보호기능연구에활용할계획이고, LC8의파골세포분화및골손상억제기능규명결과는특허와 SCI 논문에투고예정이며, 골다공증이나류마티스성관절염을위한신약개발에활용할계획임

43 Ⅳ. 보안성검토 1. 연구책임자의의견 특허출원을준비하고있으므로보안이필요하다고사료됨. 2. 연구기관자체의검토결과 협약당사자 ( 산학협력단장등 ) 의의견을기재함