ph 7.0 완충용액에서합성수산화인회석의 결정침착과구성에대한불소농도의영향 연세대학교대학원 치의학과 김건태
ph 7.0 완충용액에서합성수산화인회석의 결정침착과구성에대한불소농도의영향 지도교수이찬영 이논문을석사학위논문으로제출함 2014 년 6 월 연세대학교대학원 치의학과 김건태
감사의글 실험을진행하면서미숙함으로실패를하기도했고쉬운길을돌아서가기도했지만그모든과정들이있어야한편의논문이완성된다는것을알았습니다. 하나의결과를얻기위해얼마나객관적이고정확하게실험을진행해야하는지, 얼마나많은시간을정성들여야하는지또한알수있었고과학을하는사람으로서의기본적인자세를다시배울수있었습니다. 그리고부족한저에게이러한깨우침을얻을수있는기회를주신이찬영선생님께깊은감사를드립니다. 좀더치열하게, 열정적인자세로임하지못했던점에송구스럽기도합니다. 부족한논문이지만더열심히할수있게많은격려를주신김의성선생님, 서툴게작성된원고를꼼꼼히수정해주시고많은관심가져주신정일영선생님께도정말감사드립니다. 그리고세계어느곳에서도연세대학교치과대학보존과에서배웠다는것을자랑스럽게해주실뿐아니라의사로서의바른마음가짐을가르쳐주신이승종선생님, 노병덕선생님, 박성호선생님, 박정원선생님, 신수정선생님, 신유석선생님께도이글을빌어진심으로감사의말씀을드리고싶습니다. 또한, 힘든 3년동안옆에서기쁜일, 슬픈일모두함께기뻐하고슬퍼하며힘이되어주는우리동기민지, 선미, 건석, 용욱모두자랑스럽고고맙다는말을전합니다. 마지막으로항상따뜻한응원과분에넘치는사랑을주시지만자식멀리보내고옆에서챙겨주지못한다고늘미안해하시는사랑하는부모님과못난형이지만항상따뜻하게챙겨주는제동생에게이논문을바칩니다. 2014 년 6 월 저자씀
차례 그림차례 iii 표차례 iv 국문요약 v Ⅰ. 서론 1 Ⅱ. 재료및방법 4 1. Seed 재료의준비 4 2. 실험용액의조제 4 가. Stock 용액의조제 4 나. 실험용액의조제 5 3. Seeded crystal growth 실험모형 7 가. Crystal growth 후이온농도 7 나. Crystal growth 가일어난질량분석 8 4. 통계분석 9 i
Ⅲ. 결과 10 1. 실험전후용액의이온농도측정 10 가. 실험용액의칼슘이온농도의변화 11 나. 실험용액의인산이온농도의변화 12 다. 실험용액의불소이온농도의변화 14 2. seed 의질량증가량측정 16 3. 결정침전표본의성분분석 18 가. 결정침전표본의불소성분비 19 나. 결정침전표본의 Ca/P 성분비 19 다. 결정내불소침전물의비율 20 Ⅳ. 고찰 22 Ⅴ. 결론 28 참고문헌 29 Abstract 32 ii
그림차례 Fig.1. Schematic illustration of experimental set-up 7 Fig.2. Schematic illustrations of calculating the amounts of crystal growth 9 Fig.3. The amount of consumed calcium ion in experimental solution after crystal growth 11 Fig.4. The amount of consumed calcium ion according to the group 12 Fig.5. The amount of consumed phosphate ion in experimental solution after crystal growth 13 Fig.6. The amount of consumed phosphate ion according to the group 13 Fig.7. The amount of consumed fluoride ion in experimental solution after crystal growth 14 Fig.8. The amount of consumed fluoride ion according to the group 15 Fig.9. Weight increments of the HA seed after crystal growth 17 Fig.10. Weight increments of the HA seed according to the group 17 Fig.11. Fluoride molecular ratio to HA seeds in crystallized samples 19 Fig.12. Ca/P molecular ratio to HA seeds in crystallized samples 20 Fig.13. Fluoride ion ratio in crystallized samples 21 iii
표차례 Table 1. Initial composition of experimental solutions 6 Table 2. Decrease amount in compositions of the experimental solution after experiments 10 Table 3. Weight increment of the HA seed after crystal growth 16 Table 4. Molecular ratio in crystallized samples 18 iv
국문요약 ph 7.0 완충용액에서합성수산화인회석의 결정침착과구성에대한불소농도의영향 불소는광화를촉진하고결정을안정화시키는주요인자로알려져있다. 하지만불소가치아법랑질의광화작용에미치는영향에대한많은연구에도불구하고아직그기전에대한정확한이해나일치된의견의정립이이루어지지못하고있는상태이다. 따라서이번연구의목적은 ph 7.0 의완충용액에서불소농도의변화가합성수산화인회석 (hydroxyapatite, HA) 을이용한 seeded crystal growth 에미치는영향을분석하고그과정에서불소가결정성장에구조적으로어떠한역할을하는지알아보는것이다. ph 7.0 의인산칼슘과포화용액의불소농도를 0, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 ppm 으로달리하여총 8 군의실험용액을제조하였다. 각실험용액은 HA seed 가들어있는반응주를일정유속으로통과하도록하여인산칼슘염이 HA seed 표면에결정성장이일어나도록하였다. 이러한결정화과정을평가하기위하여실험용액이결정성장반응을일으키기전후의칼슘, 인산, 불소이온농도의차이를평가하였고, 결정성장후질량증가량을측정하였다. 또한결정성장반응이후의표본의분자성분비를분석하여다음과같은결론을얻을수있었다. v
1. 실험용액의불소농도가증가함에따라더많은결정이침착되었다. 2. ph 7.0 의완충용액에서불소농도가 0 에서 64ppm 까지증가함에따라 결정이침착되는양은지속적으로증가하나 8ppm 이상의불소농도에서 질량의증가비율이감소하였다. 3. 불소는합성수산화인회석의결정침전과정에서전구체인육인산 칼슘 (Octacalcium phosphate, OCP) 을가수분해하며, 불소농도가증가할수록 합성수산화인회석의결정내에불화인회석의비율이높아졌다. 결론적으로, ph 7.0 의재광화용액에서불소농도가증가함에따라 HA 를 seed 로 한결정성장이촉진되었으나 8ppm 이상의불소농도에서그증가비율이 감소하였다. 또한불소는 OCP 의가수분해와직접적인불화인회석의형성을통해 결정성장을촉진한다. 핵심되는말 : seeded crystal growth, 수산화인회석 (hydroxyapatite), 불소농도 vi
ph 7.0 완충용액에서합성수산화인회석의 결정침착과구성에대한불소농도의영향 < 지도교수 : 이찬영 > 연세대학교대학원치의학과 김건태 Ⅰ. 서론 치아우식은치태내의세균이만들어낸산에의해법랑질표면이탈회되면서시작된다. 하지만탈회된법랑질표면은타액등에의해재광화될수있는데, 이러한탈회와광화가균형을이룬다면우식은더진행되지않고멈출수있다. Head 등 (HEAD, 1912) 이이러한광화현상을처음보고한이후, Backer-Dirks (Dirks, 1966) 와 Anderson(Anderson과 Oastler, 1938) 등은광화현상이 in vivo에서도일어남을보여주었다. 이들은광화의기전을인산칼슘염의용해도곡선을통해동력학적으로설명하였다. 여기서용해도곡선은각각의인산칼슘염의용해도를 ph 변화에따라나타낸곡선으로, 같은 ph이더라도이온의농도가높아서 - 1 -
용해도곡선위쪽의조건하에있는용액에서는광물이침착되고, 이온의농도가낮아서용해도곡선아래조건의용액에서는광물이소실됨을의미한다. 따라서법랑질을광화시키는환경을만드는것이중요한데, 이런광화작용에영향을미치는요소로 1) 칼슘, 인산, 불소등유체의이온조성, 2) 단백질, 유기산등의유기질성분 (Matsumoto 등, 2006) 이있으며, 포화도및시간, 그리고 ph 도영향을준다. 이중불소는광화를촉진하고안정화시키는주요인자인데, 이인산칼슘이수화물 ( dicalcium phosphate dehydrate, DCPD) 이나육인산칼슘 (octacalcium phosphate, OCP) 의가수분해를촉진하여 apatite의침전을유도한다 (Aoba, 1997; Iijima 등, 1992). 불소가직접 apatite 결정의수산화기를치환하면불화인회석 (fluoroapatite, FAp) 이만들어져, 구조와크기변화가일어나고 (Yanagisawa 등, 1989), 더높은정전기적결합으로인해화학적으로더안정해진다 (Elliott, 1994; Robinson 등, 2004). 하지만광화에가장효과적인불소의농도에대해서는이견이있다. Ten Cate(Ten Cate과 Arends, 2009) 등은치아시편을이용한실험에서 1ppm의불소농도에서는불소가포함되지않았을때보다 2배의광화가일어났다고보고하였으나, 한 (Han 등, 1996) 등은불소농도가 1 ppm이나 4 ppm일때보다 2 ppm일때광화가더잘일어났다고하였다. 하지만 Amjad(Amjad과 Nancollas, 2009) 와이 (Lee과 Aoba, 1995), 권 (Kwun 등, 1999) 등은 6 ppm 이하의농도에서는불소의농도가증가할수록결정침착량이많아짐을보고하였다. 또한최근에신 (Shin 등, 2012) 또한 seeded crystal growth model을이용한실험에서 4 ppm 이하의농도에서불소의농도가증가할수록결정침착량이증가한다고하였다. - 2 -
위와같이불소가치아법랑질의광화작용에미치는영향에대한많은연구에도 불구하고아직그기전에대한정확한이해나일치된의견의정립이이루어지지 못하고있는상태이다. 또한대부분의광화에대한실험이 10ppm 이하의불소 농도에서진행되었으나 Yamazaki(Yamazaki et al, 2007) 등은인공우식병소의탈회를완전히막기위해서는 25ppm 이상의불소가필요함을보고한바있다. 따라서기존의실험보다고농도의불소농도하에서합성수산화인회석의광화에미치는영향에대한연구가필요하리라생각되며, seeded crystal growth 실험에서완충용액의불소농도를 0 에서 64 ppm 으로변화를주어불소농도가합성수산화인회석의결정성장에미치는영향과결정내불화인회석을분석하여다소지견을얻었기에이에보고하고자한다. - 3 -
II. 재료및방법 1. Seed 재료의준비 수산화인회석현탁액 (Sigma-Aldrich Co., St Louis., MO, U.S.A., 분자량 502.31) 에 3차증류수를넣고원심분리기 (Micro 12, Hanil, Korea) 를이용하여 3회반복세척한것을사용한다. 그후이를 24시간동안동결건조기 (freeze dryer, Ilshin lab co., Korea) 에동결건조시킨후이분말을 seed material 로이용하였다. 2. 실험용액의조제 가. Stock 용액의조제 (1) 염화칼슘 2수화물 (CaCl 2 2H 2 O) 분말 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis., MO, U.S.A., 분자량 147.01) 로부터 0.1M 용액을제조하여실험군의 stock 용액으로사용하였다. (2) 인산칼륨 (KH 2 PO 4 ) 분말 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis., MO, U.S.A., 분자량 136.09) 로부터 0.1M 용액을제조하여실험군의 stock 용액으로사용하였다. (3) 불화나트륨 (NaF) 분말 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis., MO, U.S.A., 분자량 41.99) 로부터 100ppm(5.26mM) 용액을조제하여이를 stock 용액으로사용하였다. - 4 -
염화칼슘및인산칼륨 stock 용액은 ion chromatography(790 Personal IC, Metrohm, Herisau, Switzerland) 를이용하여분석하였다. 불화나트륨용액은 fluoride combination electrode(model. 9609, Thermo scientific, Waltham, MA, U.S.A.) 를이용하여불소농도를측정하였다. 나. 실험용액의조제 인산칼슘완충용액을제조하기위해준비한각 stock 용액으로부터 1mM 칼슘및 3mM 인산의조성이되도록계산된양만큼취하여사용하였고, 각용액에는방부제로써아지드화나트륨 (NaN 3 ) 분말 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis., MO, U.S.A.) 을 3.08mM이되도록계산하여첨가하였다. 불소는각실험군의불소농도에맞도록 100ppm stock 용액에서희석해사용하였다. ph는 ph meter(model 920A, Orion Research Inc., Beverly, U.S.A.) 계측하에수산화칼륨용액을첨가하여 1~8군모두 ph 7.0이되도록조절하였다. 이렇게조제한실험용액은위의 stock 용액과같은방법으로각이온의농도를다시정량분석하여 Table 1과같은농도를얻었고이를 seeded crystal growth를위한실험용액으로사용하였다. - 5 -
Table 1. Initial composition of experimental solutions Composition Concentration Fluoride Calcium Phosphate Sodium ph (ppm) (mm) (mm) Azide(mM) Group 1 0 1.02 3.03 3.08 7.00 Group 2 1.01 1.00 3.00 3.08 7.03 Group 3 2.00 1.02 3.02 3.08 7.00 Group 4 4.02 1.01 3.00 3.08 7.02 Group 5 8.01 1.02 3.02 3.08 7.00 Group 6 16.01 1.02 3.02 3.08 7.01 Group 7 32.02 1.03 3.04 3.08 7.00 Group 8 64.04 1.00 3.00 3.08 7.02-6 -
3. Seeded crystal growth 실험모형 가. Crystal growth 후이온농도 실험모형은 Mura-Galelli 가개발한것과동일하며 (Mura-Galelli, 1992), Fig. 1 에도식화하였다 (Shin 등, 2012). Vessel A 에는제조된실험용액을담고, 이를 연동펌프 (peristaltic pump, Masterflex 7524, Cole-Parmer, IL, U.S.A.) 를 이용하여일정한유속 ( 평균 2.5 ± 0.3 ml/hr) 으로흐르게하였다. 이용액은수산화인회석 seed가담긴반응주 (reaction column) 를통과하게되고, 반응을마친실험용액은 vessel B에포집되게된다. 각구성요소는 Tygon tube(r-3603, Saint-Gobain, OH, U.S.A) 를이용하여연결하였으며, 이음새부분에는테프론테이프와파라핀필름으로감싸중간에실험용액이새지않도록구성하였다. Fig. 1. Schematic illustration of experimental set-up HA : hydroxyapatite - 7 -
반응주는 1cc 일회용주사기의실린더를절단하여사용하였으며반응중에는실린더헤드가바닥에수직하게아래로향하게고정하였다. 각실험군은대기압하의실온에서 48시간지속하였으며, 각실험의유속은 2.5 ± 0.3 ml/hr 의값을갖도록설계하였고, 이를각실험군마다 10차례반복하여시행하였다. 실험을마친후에는반응주를통과하고포집된용액 (vessel B) 의칼슘, 인산및불소이온의농도를측정하여투입전의실험용액의값과비교하였다. 여기서측정된이온소모량만큼각이온이결정성장에참여하였다고짐작할수있고이를통해간접적으로결정의성분을정량적으로확인할수있다. 나. Crystal growth 가일어난질량분석 반응주내부에서실험용액이반응을하기전과후의질량을측정함으로써실제반응으로생긴 crystal 의양을측정하였다. 우선반응주는 1cc 일회용주사기의실린더를절단하여사용하였고, 그내부에는거름종이 (Advantec, Toyo, Japan) 를위치시켰으며, 이를고정하기위해크기가맞는고무링을제작해사용하였다. 그후 seed 로준비한동결건조된수산화인회석분말을미량저울 (microbalance, MC-5, Sartorius, Germany) 을이용해반응주내부에 3.00mg이되도록거름종이위에올려놓았다. 반응이끝난후에는반응주를다시 24시간동안동결건조하고, 그질량을측정함으로써실제결정침착이일어난질량을정량적으로측정하였다 (Fig. 2 참조 ). - 8 -
Fig. 2. Schematic illustrations of calculating the amounts of crystal growth A : Amounts of seed crystals originally placed in the reaction column B : Weighed amounts of solid sample recovered at the end of experiment B-A : Difference between B and A, amounts of crystal growth (This illustration is cited from Shin(Shin 등, 2012).) 4. 통계분석 실험을통해측정된결과자료를 SPSS Statistics 18.0 (PASW Statistics) 프로그램을이용하여분석하였다. 각군간의차이를검정하기위해일원변량분석 (One-way ANOVA) 을사용하였다. 유의차발생시사후검정으로 Tukey test를실시하였으며가설검증을위한유의수준은 0.05로하였다. - 9 -
III. 결과 1. 실험전후용액의이온농도측정 결정침전반응후, 실험용액의각이온의감소량을측정하였다 (Table 2). Table 2. Decrease amount in compositions of the experimental solution after experiments (Mean ± S.D.) (n=10) group ph F (ppm) Changes in experimental solution, (inlet-outlet) ΔCa (mg) ΔP (mg) ΔF (mg) 1 0 0.50 ±.16 1.35 ±.22 NM 2 1 0.76 ±.09 1.72 ±.22 0.02 ±.005 3 2 1.21 ±.17 1.94 ±.16 0.04 ±.010 4 4 1.60 ±.12 2.30 ±.27 0.12 ±.033 7.0 5 8 2.11 ±.30 2.69 ±.25 0.30 ±.070 6 16 2.40 ±.44 2.91 ±.26 0.39 ±.058 7 32 2.72 ±.47 3.42 ±.22 0.48 ±.082 8 64 2.91 ±.47 3.81 ±.52 0.70 ±.150 NM : Not measurable, no fluoride was added to the experimental solutions. - 10 -
The amount of consumed Ca ion (mg) 가. 실험용액의칼슘이온농도의변화 One-way ANOVA 를이용하여각군간의차이를검정하였다 (Fig. 3). 결정침전반응후각군내에서불소농도가증가함에따라, 칼슘이온의 결정으로의침착량도증가하는결과를보였으며 1,3,5,8 군간의침착량간에유의한 차이를보였다 (p<0.05). 불소농도에따른칼슘이온침착량을 Fig. 4 에첨부하였으며, 실험용액의불소 농도가증가할수록칼슘이온침착량의증가비율은감소하는양상을보였다. 4.00 3.50 3.00 2.50 2.00 1.50 1.00 0.50 0.00 e e de d c bc a ab 1 2 3 4 5 6 7 8 Group Fig. 3. The amount of consumed calcium ion in experimental solution after crystal growth Different letters denote statistically different (p<0.05). - 11 -
The amount of consumed Ca ion (mg) 3.50 3.00 2.50 2.00 1.50 1.00 0.50 0.00 0 20 40 60 80 불소 (ppm) Fig. 4. The amount of consumed calcium ion according to the group 나. 실험용액의인산이온농도의변화 One-way ANOVA 를이용하여각군간의차이를비교하였다 (Fig. 5). 결정침전반응후각군내에서불소농도가증가함에따라, 인산이온의침착량도증가하는결과를보였으며 1.3.5.8 군간의침착량간유의차있는결과를보였다 (p<0.05). 불소농도에따른인산이온침착량을 Fig. 6 첨부하였으며, 실험용액의불소농도가증가할수록인산이온침착량의증가비율은감소하는양상을보였다. - 12 -
The amount of consumed P ion(mg) The amount of consumed P ion(mg) 5.00 4.50 4.00 3.50 3.00 2.50 2.00 1.50 1.00 0.50 0.00 e e d d c ab bc a 1 2 3 4 5 6 7 8 Group Fig. 5. The amount of consumed phosphate ion in experimental solution after crystal growth Different letters denote statistically different (p<0.05). 4.00 3.50 3.00 2.50 2.00 1.50 1.00 0.50 0.00 0 20 40 60 80 불소 (ppm) Fig. 6. The amount of consumed phosphate ion according to the group - 13 -
The amout of consumed F ion (mg) 다. 실험용액의불소이온농도의변화 One-way ANOVA 를이용하여각군간의차이를비교하였다 (Fig. 7). 불소가포함되지않은 1 군을제외한다른 7 개실험군의불소이온소모량을비교 하였다. 기존실험용액에포함된불소의농도가높을수록반응후용액의불소이온 소모량도 2-3 군, 5-6 군간을제외하고는유의차있게증가하는결과를보였다. (p<0.05). 실험용액의불소농도에따른불소이온침착량을 Fig. 8 에첨부하였으며, 침착량의증가비율감소량은칼슘과인산이온소모량보다는작았다. 0.90 0.80 0.70 0.60 0.50 0.40 0.30 0.20 0.10 0.00 e d cd c b NM a ab 1 2 3 4 5 6 7 8 Group Fig. 7. The amount of consumed fluoride ion in experimental solution after crystal growth Different letters denote statistically different (p<0.05). NM : Not measurable, no fluoride was added to the experimental solutions. - 14 -
The amount of consumed F ion(mg) 0.80 0.70 0.60 0.50 0.40 0.30 0.20 0.10 0.00 0 20 40 60 80 불소 (ppm) Fig. 8. The amount of consumed fluoride ion according to the group - 15 -
2. Seed 의질량증가량측정 결정침전반응후, 반응주내표본의결정성장량을측정하기위해시편을동결건조시킨후미량저울을이용하여다시질량을측정하였다. 이값에서실험전의 seed 질량을빼서 seed의질량증가량을측정하였다. 증가량을분석한결과를 Table 3 및 Fig. 9에첨부하였다. One-way ANOVA 를이용하여각군간의차이를비교하였다. 실험용액의불소농도가증가할수록 seed 의질량이증가하였으며 1,3,5,8 군사이에유의차있는질량증가량을보였다 (p<0.05). 실험용액의불소농도에따른질량증가량을나타낸그래프에서불소농도가증가할수록증가비율이줄어드는양상을보였다 (Fig. 10). Table 3. Weight increments of the hydroxyapatite(ha) seed after crystal growth (Mean ± S.D.) (n=10) group ph F (ppm) Δweight (mg) Increase rate (%) 1 0 0.94 ±.20 31.36 2 1 1.47 ±.28 48.20 3 2 2.14 ±.50 71.24 4 7.0 4 2.68 ±.72 89.44 5 8 3.44 ±.79 114.62 6 16 3.82 ±.70 127.37 7 32 4.07 ±.61 135.55-16 -
Weight increase(mg) Weight increase(mg) 8 64 4.50 ±.42 149.82 5.00 4.50 4.00 3.50 3.00 2.50 2.00 1.50 1.00 0.50 0.00 f ef ef de cd bc ab a 1 2 3 4 5 6 7 8 Group Fig. 9. Weight increments of the HA seed after crystal growth Different letters denote statistically different (p<0.05). 5 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 0 20 40 60 80 불소 (ppm) Fig. 10. Weight increments of the HA seed according to the group - 17 -
3. 결정침전표본의성분분석 결정침전반응후표본의불소성분비와 Ca/P 분자비를분석하였다. 성분비는앞의실험방법에기술된것과같이결정침전반응후의표본을과염소산에용해시켜각분자의몰농도를측정함으로써이루어졌다. 표본과같은질량의합성 HA를과염소산에용해시켜여기에서측정된인의몰농도를기준값 1로하여표본의성분의양을나타내었다. 또한, 생성된결정에대한불소이온침착량의비율을분석하였다. Table 4. Molecular ratio in crystallized samples (Mean ± S.D.) (n=10) group ph F (ppm) Molecular ratio in crystallized samples F Ca/P 1 0 0.00 ±.00 1.35 ±.05 2 1 0.12 ±.02 1.47 ±.05 3 2 0.15 ±.02 1.57 ±.11 4 7.0 4 0.19 ±.02 1.59 ±.10 5 8 0.23 ±.03 1.63 ±.08 6 16 0.33 ±.04 1.67 ±.05 7 32 0.38 ±.02 1.64 ±.06-18 -
F molecular ratio 8 64 0.40 ±.02 1.66 ±.05 가. 결정침전표본의불소성분비 결정표본의상대적불소의양을 One-way ANOVA 를이용하여분석하였다 (Fig. 11). 그결과, 2 군과 3 군, 7 군과 8 군간을제외하고는실험용액의불소농도가 증가할수록결정에포함된불소의성분비는유의차있게증가하였다 (p<0.05). 0.50 0.40 e f f 0.30 0.20 a ab c d 0.10 0.00 NM 1 2 3 4 5 6 7 8 Group Fig. 11 Fluoride molecular ratio to HA seeds in crystallized samples Different letters denote statistically different (p<0.05). 나. 결정침전표본의 Ca/P 성분비 결정표본의 Ca/P 비율을 One-way ANOVA 를이용하여분석하였다 (Fig. 12). 불소농도가 0 인 1 군과 1ppm 인 2 군, 4ppm 인 4 군사이에유의차가있는결과를 보였으며, 4ppm 이상의불소를포함하는실험군은모두유의차없는 Ca/P 값을보였다 - 19 -
Ca/P molecular ratio (p<0.05). 1.80 1.70 bc c c c c c 1.60 b 1.50 1.40 a 1.30 1.20 1 2 3 4 5 6 7 8 Group Fig.12. Ca/P molecular ratio to HA seeds in crystallized samples Different letters denote statistically different (p<0.05). 다. 결정내불소침전물의비율 반응후생성된결정의질량에대한실험용액의불소이온소모량의비율을 One-way ANOVA를이용하여분석하였다 (Fig. 13). 생성된결정의총질량에대한실험용액의불소이온소모량을백분율로나타내었으며, 실험용액의불소농도가증가할수록전체결정에대한불소이온소모량의비율은유의차있게증가하였다 (p<0.05). - 20 -
Fluoride ion in crystal (%) 20.00% 18.00% 16.00% 14.00% 12.00% 10.00% 8.00% 6.00% 4.00% 2.00% 0.00% f e de d c ab b a 1 2 3 4 5 6 7 8 Group Fig.13. Fluoride ion ratio in crystallized samples Different letters denote statistically different (p<0.05). - 21 -
Ⅳ. 고찰 광화기전을연구하는여러방법중 Seeded crystal growth 실험모형은수산화인회석결정침착에영향을미치는인자를파악할수있는방법으로, 이를이용한많은선행연구들이있었다 (Aoba 과 Moreno, 1984; Barone 과 Nancollas, 1976; Eanes, 1980; Nancollas 과 Mohan, 1970). 이후 Mura-Galleli(Mura-Galelli 등, 1992) 는반응주 (reaction column), 연동펌프 (peristaltic pump) 를이용한간단한실험모형을소개하였는데, 이 (Lee 과 Aoba, 1995), 권 (Kwun 등, 1999), 신 (Shin 등, 2012) 등은이방법이결정침착반응과정의평가에유용하다고하였다. 또한이, 권등은 seed 로사용하는재료가인간의법랑질인지또는합성수산화인회석인지에관계없이광화의정도는사용된재료의표면적에만영향을받는다고하였다. 따라서, 치아시편을대신하여합성수산화인회석을이용하는방법은광화역학을이해하는데유용하다고생각되기때문에본연구에서는합성수산화인회석을사용한 seeded crystal growth 실험모형을이용해결정성장이일어나는양상을평가하고자하였다. 이실험모형은이미형성된법랑질결정의인접한좁은부위에서발생하는광화과정을재현한것으로, 특정농도의유액이일정한속도로흐르게하여법랑질결정을둘러싸는유체의생리적환경과유사하도록하였다 (Mura-Galelli, 1992). 비록반응주의국소부위에따라침전을위한용액조성이나이온의동력이달라결정침전역학을정확히규명하기어려울수도있으나기존의같은모형을사용한연구와본연구에서실험의유효성및일관성을보여, 이러한제한적요소는무시할 - 22 -
수있다고생각된다. 이모형은 acid buffer system에서치아절편을이용한광화연구와는달리치아법랑질의구조를재현하지못하여법랑질의표층과표면하층의광화양상의차이, 광화깊이등에대한고찰은불가능하다. 그러나본모형을이용한연구방법은유체의이온조성에따른결정성장의기전과그역학을더심도있게이해할수있다는장점이있다. Seed 실험모형을이용한기존의연구에서완충용액의조성은대부분 porcine의 amelogenesis 과정의 enamel fluid 를기준으로제작된칼슘 1.0mM, 인산 3.0mM, ph 7.2~7.4 정도로맞추어졌다 (Kwon, 1999; Lee, 1995; Mura-Galleli, 1992; Oh, 1997). 본실험에서도이에준하여칼슘 1.0mM, 인산 3.0mM, ph 7.0의실험용액을제조하고불소농도를 0에서 64ppm으로변화를주어사용하였다. 본연구에서광화의양상에대한정량및정성분석은세가지방법으로이루어졌다. 첫번째는실험후포집된용액의각이온농도를분석하여이온의침착량을측정하고이를통해결정성장반응에참여한이온의양을간접적으로알아보는방법이다. 두번째는결정성장반응전후의 seed의무게차이를통해결정성장량을측정하는방법이고, 세번째는반응후얻어진결정표본의불소성분을분석하여결정침전반응에서불소가어떠한방식으로작용하는지분석하였다. 이온침착량및 seed의질량증가량분석결과, 칼슘과인의이온침착량및표본의질량증가량은비슷한양상을보였다. 실험용액의불소농도가증가할수록이온침착량및질량증가량이증가하였으며 1,3,5,8 군간에유의한차이가있었다. 권 (Kwun et al., 1999) 의연구에따르면 ph 7.2인실험용액의불소농도를 0-10ppm으로달리하여실험한결과 6ppm 이상에서는결정성장량이증가하지않았 - 23 -
다고하였다. 본실험에서도이와비슷하게 8, 16ppm인군간에결정성장량및칼슘과인산이온침착량에유의한차이가없었으나 8ppm인군과 32ppm, 64ppm인군간에서는칼슘과인의이온소모량에서유의한차이를보였고 8ppm과 64ppm인군에서만질량증가량에서유의한차이를보였다. 또한실험용액의불소농도에따른이온침착량및질량증가량을분산형그래프로변환했을때, 불소농도 8ppm인 5 군을기점으로그래프의기울기가작아지며이는불소농도증가량에대한이온침착량및질량증가량의비율이감소함을의미한다 (Fig. 4,6,10). 불소농도의증가에따른이온의침착량증가에대해 Ten Cate (Ten Cate and Featherstone, 1991) 등은불소농도에따라불화인회석 (FAp) 과불화칼슘 (CaF2) 의용해도등온선이달라지기때문이라고설명하였다. 용액의불소농도가 1ppm일때보다 10ppm일때칼슘이온이더잘침전될수있으며, 이로인해불화인회석과불화칼슘이보다안정적인형태로더많이생성된다고보고하였다. Saxegaard & Rolla (Saxegaard and Rolla, 1988) 또한용액의불소이온농도가높아질수록불화칼슘의생성이증가하는것을실험적으로보고하였으며, 이들불화칼슘및불화칼슘유사물질은산성환경에서불소이온의 reservoir로광화에기여하며중성 ph에서는법랑질표면에안정적으로유지된다고하였다. 생물학적으로 apatite의형성과정에서전구체로써몇가지상의인산칼슘염이존재하게되는데, amorphous tricalcium phosphate(acp), DCPD, OCP 등이그것이다. 이들중 DCPD, OCP 등은 Hydroxyapatite(HA) 만큼안정하지못하며, 생리적환경에서 HA로가수분해될수있으나이전환과정에있어서의역학은여러조절인자의영향을받는다 (Wu과 Nancollas, 1999). 불소는이러한전구체들의가수분해를촉진하여 HA로변환시키는역할을하는것으로알려져있다 (Aoba, 1997; Barone과 - 24 -
Nancollas, 1978; Robinson 등, 2004). 이를종합해볼때, 본실험에서실험용액의불소이온농도가높아질수록결정의성장량이증가하는것은불화인회석과불화칼슘이침착되는방향으로 driving force 가작용하며불소가 HA의전구체인 OCP의가수분해를촉진함으로써결정의성장을증가시키기때문으로생각된다. 다만실험용액의 ph가중성인 7.0이기때문에불화칼슘이불소의 reservoir로서불소이온을유리하지는않는것으로보이며이는신 (Shin 등, 2012) 의연구에서보인 ph 4.3 용액에서 ph 7.0 용액보다결정성장량이더많은결과에대한설명이될수있을것이다. 8ppm이상의불소농도에서각이온침착량및질량변화량의증가율이감소하는것은 HA seed의표면적및인산칼슘의전구체인 OCP의포화정도의한계때문으로생각된다. Aoba(Aoba and Moreno, 1984) 등은실험에서 seed crystal calcium apatite 의침전률에입자의크기와 crystal 의양보다성장에유용한표면적이더영향을미치는것을보였다. 따라서불소및인산칼슘전구체가반응할수있는합성 HA의표면적의한계가결정성장량의증가비율감소에대한원인이될수있을것이다. 또한중성 ph 7.0에서 OCP의포화도에한계가있기때문에불화인회석의침착은지속적으로이루어지더라도 OCP의가수분해에의한인산칼슘염의침착은제한되며, 이로인해결정성장량의증가비율이감소하는것으로추측된다. 권 (Kwun 등, 1999) 등의연구에서도불소농도가 6ppm이상일때이온소모량이증가하지않는결과에대한원인으로전구체인 OCP의양에대한포화정도의한계를지적한바있다. 불소이온농도의소모량은칼슘이나인산이온의침착양상과달리실험용액의불소농도가증가함에증가비율이감소했지만그감소폭이적었다. 이는불화인회석의직접적인침착외에불화칼슘의용액내형성 (Ten Cate et al, 1991) 및인산칼슘의 - 25 -
전구체인 OCP의가수분해 (Robinson et al., 2004) 에불소가지속적으로소모되기때문으로추정된다. 결정표본의성분을분석한결과, 결정에포함된불소이온의성분비는기존실험용액의불소이온농도가증가함에따라 1ppm과 2ppm, 32ppm과 64ppm인군간을제외하고는유의차있게증가함을확인하였다. 이는저농도의불소용액에서는부족한불소가불화인회석의형성및침착외에불안정한상태의 OCP를 HA로가수분해하는데사용되기때문으로추정되며 (Eanes, 1980), 고농도의불소용액에서는반응할수있는 HA의표면적이한정되불화인회석의침착이지연되기때문으로추정된다 (Aoba and Moreno, 1984). 하지만생성된결정에대한불소침착량의비율을봤을때, 불소는지속적인불화인회석의침착을통해결정성장에직접관여함을알수있었다. 결정표본의 Ca/P 분자비의분석을통해서는실험을통해얻어진결정이실험용액의불소농도변화에따라서로다른구성으로되어있음을확인할수있었다. 불소농도가 0, 1, 4ppm인군간에서서로유의차있는 Ca/P 분자비를나타냈으며 4ppm 이상의불소농도에서는각군간에유의차없는결과값을보였다. 이는불소농도가낮은상태에서는낮은 Ca/P 비율을가진화합물의인산칼슘결정이침착되다가, 불소농도가증가하면서높은 Ca/P비율을가진인산칼슘으로결정침착이이루어짐을의미한다. HA의전구체로알려진 OCP(Ca8H2(PO4)6ㆍ5H2O) 의 Ca/P 분자비는 1.33이며, 성숙한 HA(Ca5(PO4)3OH) 의 Ca/P 분자비는 1.67이다. 본실험의결정분석결과와비교했을때, 0과 1ppm의저농도불소에서 Ca/P 분자비는 OCP와유사하며 4ppm 이상의불소농도에서는성숙한 HA와유사하다. 이를통해불소농도가높아질수록 - 26 -
불소가 OCP등의 HA 전구체를 HA로전환시키는데더기여함을알수있다. Aoba(Aoba, 1997) 와 Robinson(Robinson et al., 2004) 등은불소가가수분해를통해 OCP의수명을줄여결국결정으로성장하게한다고주장하였고, Eanes(Eanes, 1980) 또한불소용액내 OCP의축적량이줄어드는것을가수분해때문이라고설명하였다. 이러한점들을참고했을때불소는 OCP의가수분해를통해 Ca/P 분자비가높은안정된결정형태의인산칼슘염을형성하는데기여해결정성장량을증가시킬뿐아니라불화인회석의형성을통해직접적으로결정형성에관여한다고할수있다. - 27 -
Ⅴ. 결론 본연구에서는 ph 7.0 완충용액의불소농도를 0, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64ppm 으로달리하여제조한후합성수산화인회석 (hydroxyapatite, HA) 을 seed로사용해실험하여불소가 HA의광화에미치는영향에대해정량및정성적으로분석하고자하였고, 다음과같은결과를얻었다. 1. 실험용액의불소농도가증가함에따라더많은결정이침착되었다. 2. ph 7.0 의완충용액에서불소농도가 0 에서 64ppm 까지증가함에따라 결정이침착되는양은지속적으로증가하나 8ppm 이상의불소농도에서 질량의증가비율이감소하였다. 3. 불소는합성수산화인회석의결정침전과정에서전구체인육인산 칼슘 (Octacalcium phosphate, OCP) 을가수분해하며, 불소농도가증가할수록 합성수산화인회석의결정내에불화인회석의비율이높아졌다. - 28 -
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Abstract Effect of Fluoride concentration on the crystal growth and composition of hydroxyapatite in ph 7.0 buffer Solutions Guntae Kim Department of Dentistry The Graduate School, Yonsei University (Directed by Chan-Young Lee, D.D.S., M.S.D., D.D.Sc.) The present study was undertaken to investigate the crystal growth onto synthetic hydroxyapatite (HA) seeds in ph 7.0 supersaturated solutions with different fluoride concentrations. 8 groups of ph 7.0 calcium phosphate supersaturated solutions were prepared with different fluoride concentration (0, 1, 2, 4, 8, 16, 32 and 64ppm) and the all of solutions were set to have same degree of saturation. Each solution was introduced into the reactive column containing seeded HA by the use of a peristaltic pump. Calcium phosphate precipitate yield crystal growth onto the seeded HA surface while solutions flow the reactive column. For evaluating of crystallizing process, the changes of calcium, phosphate and fluoride ion concentrations of the inlet and outlet solutions were determined. The recovered solid samples were weighed to assess the amount of minerals precipitated during the experimental period, and finally determined their composition to - 32 -
deduce characteristics of crystals. Results of the study are as follows. 1. As fluoride concentration increased in experimental solution, more ions precipitate as a crystal. 2. As fluoride concentration increased in experimental solution from 0ppm to 64ppm, crystal of seeded HA was increased. But At concentrations above 8ppm, increase rate was decreased. 3. Fluoride facilitates crystal growth of seeded HA with hydrolyzing octacaclium phosphate to stable calcium phosphate and as fluoride concentration increased, ratio of fluoroapatite in hydroxyapatite was increased. In conclusion, as fluoride concentration increased in ph 7.0 remineralizing solution, more ion consumption and seeded crystal growth were observed. Also, fluoride ion facilitates crystal growth of HA with hydrolyzing octacaclium phosphate to stable calcium phosphate and being precipitated as a fluoroapatite. Key words: seeded crystal growth, hydroxyapatite, fluoride concentration - 33 -