<31345F28C0CFB9DD29C0CCC1DFB7CE2E687770>

J Plant Biotechnol (2017) 44:97 106 DOI:https://doi.org/10.5010/JPB.2017.44.1.097 ISSN 1229-2818 (Print) ISSN 2384-1397 (Online) Research Article 신규수입승인 6 개유전자변형작물의검출기법개발 설민아 조범호 최원균 신수영 엄순재 김일룡 송해룡 이중로 Development of detection methods for six approved LM crops in Korea Min-A Seol Beom-Ho Jo Wonkyun Choi Su Young Shin Soon-Jae Eum Il Ryong Kim Hae-Ryong Song Jung Ro Lee Received: 5 January 2017 / Revised: 8 February 2017 / Accepted: 8 February 2017 c Korean Society for Plant Biotechnology Abstract Living modified crops are genetically modified living organisms and are widely used in biotechnical research and desired goods. As the reliance on LM products, concerns about safety of LMOs have been continuously increased in South Korea. We established the detection methods for unintentional released LMOs in environmental conditions. To detect six LM event genes of 1 canola, 1 maize and 4 soybeans, PCR conditions were based upon consideration of the Joint Research Centre information. Genomic DNAs were isolated from LM samples and PCR analysis were performed using each event-specific primer pair. Event-specific genes of all events were efficiently recognized by our methods. To investigate the insertion site of LM genes in each genome, we verified PCR product sequence by DNA sequencing. These results suggest that the LM event-specific gene amplification can be efficiently developed. In addition, our detection method is fit for monitoring and post-management of LM crops in the environment. Keywords Living modified organism (LMO), Monitoring, Detection method, Polymerase chain reaction (PCR) M. A. Seol W. K. Choi S. Y. Shin S. J. Eum I. R. Kim H. R. Song J. R. Lee ( ) 국립생태원생태연구본부생태보전연구실 (Division of Ecological Conservation, National Institute of Ecology (NIE), Seocheon 33657, Korea) e-mail: leejr73@nie.re.kr B.-H. Jo 충남테크노파크바이오센터생물산업팀 (Bio-industrial Team, Bio Center, Chungnam Techno Park, Yesan, 32415, Korea) 서론 유전자변형생물체 (LMO) 란인위적으로유전자를재조합하거나유전자를구성하는핵산을세포또는세포내소기관으로직접주입하는기술, 또는분류학에의한과 ( 科 ) 의범위를넘는세포융합기술을이용하여새롭게조합된유전물질을포함하고있는생물체를말한다 ( 유전자변형생물체의국가간이동등에관한법률제 2 조 ). 현대생명공학기술은유전자변형농작물이나유전자변형식품뿐만아니라, 동물과미생물분야에서도널리활용되고있다. 일반적으로유전자재조합기술이이용되고있는것은 LMO 작물분야이다. 2015 년기준으로전세계 28 개국에서유전자변형작물이재배되었고, 그면적은대한민국면적의약 18 배정도인 1 억 7,970 만 ha 에이른다. 1990 년대에는해충저항성, 제초제내성, 바이러스내성등형질작물의생산성을높이기위한유전자변형작물 ( 콩, 옥수수, 면화, 캐놀라 ) 이재배되었으며, 점차무름방지, 갈변방지 ( 사과 ), 발암물질제거 ( 감자 ), 영양성분강화 ( 비타민 A 강화쌀 ), 천연물질 ( 약품 ) 생산등의여러가지특성을가진작물이개발되고있으며, 육류품질향상및의료용장기생산등에활용할수있도록 GM (Genetically modified) 동물의개발에도큰진척을보이고있다. GM 염소에서생성된의약품이상용화돼있고, 빠르게자라는 GM 연어와 GM 닭에서생산되는난치병치료를위한의약품이 FDA 의승인을받았으며, 그밖에도장기이식을위한 GM 동물연구가진행되고있다. 또한, 대량생산이용이한미생물에서는산업용효소, 식품첨가물, 농약, 오염정화용미생물, 의약용단백질등을생산하여각종산업분야에활용하고있다. 초기 GM 작물 ( 콩, 옥수수, 면화, 캐놀라 ) 은미국과같이대규모농업을하고있는산업국에서잡초제어와해충방제효과를목적으로개발되었고, 향상된생산성으로농업경제성장및식량확보효과를거두었다. 그러나, 아메리카대륙에비해아시아와아프리카지역은소규모경작이이 This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

98 J Plant Biotechnol (2017) 44:97 106 루어지고있으며기후변화에따라농업환경이열악하다. 따라서개발도상국들은안정적인식량확보와농업발전을위해산업국과다국적기업으로부터 GM 품종을도입하였고, 생산성향상과경제적인혜택을경험하게되었다. 2006 년부터필리핀은 GM 옥수수를재배하였고황금쌀에대한시험재배가이루어지고있으며, 인도는전세계에서가장많은면적에서 GM 면화를재배하여수출하고있다. 일부아프리카국가들은 GMO 가혼합된식량원조를거부하고있지만, 남아프리카공화국은 GM 작물을도입하여옥수수, 면화, 콩등을재배하여부족한식량난을해결하고있다. GM 작물을도입후식량확보에긍정적인효과를경험한개발도상국들은점차자국내농업환경에맞는, 가뭄과염분등환경스트레스내성, 영양성분강화, 농업환경개선 ( 물이용효율, 질소효율등 ) 에이용할수있는맞춤형 GM 작물을개발하고있다. 또한, 바나나, 완두, 카사바, 가지, 파파야, 사탕수수, 토마토등실생활에유용한식품으로이용될수있는작물을개발하고있다 (ISAAA 2015). 현재우리나라는상업적으로 LMO 를재배하고있지는않지만, 곡물자급률이낮아식품과사료용으로유전자변형옥수수, 콩, 면화를수입하고있다 (MAFRA 2015). 그리고전세계적으로다양한 GM 작물개발이이루어지고있는상황에서우리나라또한 2000 년대초반부터활발하게 GM 작물을연구하고있다. 개발중인 GM 작물은해충저항성벼 ( 혹명나방방제 ), 황금쌀 ( 비타민 A 보강 ), 시력개선및노화방지용컬러쌀, 가뭄저항성벼를포함하여총 13 작물 58 종이다. 주요대상작물은벼, 콩, 배추, 고추, 감자, 고구마, 화훼류등이며, 해충저항성, 불량환경내성등생산성보존과농약및노동력절감형, 품질고급화특성을갖도록연구하고있다. 2008 년부터국내식품용및농업용으로수입된 LMO 는해마다증가하여 2015 년약 23.6 억달러규모의총 1,024 만톤이수입되었다. 전체수입작물중식용으로는 215 만톤 (21%) 이수입되었으며, 그외농업용으로 809 만톤 (79%) 이수입되었다. 가장많이수입된작물은옥수수로전체수입량의 88% 를차지하는 905 만톤이수입되었으며, 다음으로는 10% 를차지하는콩 103 만톤, 면실 16 만톤 (1.6%), 그리고소량의캐놀라가수입되었다. 또한, LMO 법시행 (2008 년 1 월 1 일 ) 이후 2016 년 7 월현재국내에는 147 개의 LMO 가식용 (food), 사료용 (feed), 가공용 (processing) 으로승인되어수입되고있다 (KBCH 2015). 하지만, 부족한식량문제의해결, 바이오연료를이용한대체에너지마련및불치병치료방법으로서의 LMO 의개발과이용에대한호의적인견해와달리, 한편으로는위험성에대한논의가계속되고있다. LMO 가자연생태계나인체및동물에게미치는잠재적인위해성은비의도적인환경방출에의한 GM 식물의자생, Bt 유전자이용시비표적곤충류피해, 유전자이동으로인한잡초화, 잡초및해충의내성증가등에관한것이다 (Agbios 2001). 예로는 2004 년일본의이바라키현카시마항하역장 주변에서자생하는 GM 유채발견, 2005 년몬산토에서개발한 LMO 옥수수 (MON863) 를먹인쥐에서나타난혈액이상및장기크기논란과, 제초제내성옥수수 NK603 의만성독성에대한논쟁이대표적이다 (Seralini et al. 2012). 따라서 LMO 를안전하고효과적으로이용하기위해서는잠재적인위험성에대한평가가뒷받침되어야한다. 우리나라는비의도적위해성에대한안전성심사를통해 LMO 를수입하지만여전히불안함이존재하며, 인천항구에서부터운송로를따라운송회사, 사료제조공장주변에서 GM 콩과옥수수가발견된사례등국내에서자연환경에 LMO 가발견된사례가보고되고있다 (Lee et al. 2009; Park et al. 2010; Han et al. 2014; Han et al. 2015). 국내수입 유통중인 LMO 의비의도적환경유출현황및사후관리를위해환경부는 2009 년부터매년전국 6 개권역에서 LMO 가수입되는항만에서부터운송로를따라사료공장이나축산농가, 또는지역축제지까지자연생태계로의유출가능성을모니터링하고있다. 운송로를따라유출된낙곡이나, 도로주변에서자생하고있는콩, 옥수수, 면화, 캐놀라등을 LMO 의심작물로채집하여 LMO 여부를분석하고있다. 2009 년 (159 지역 ) 부터 2015 년 (787 지역 ) 까지해마다모니터링지역수가증가하고있으며, 결과적으로 LMO 로판별되는의심시료수도증가하고있다 (Lee et al. 2015c). 따라서, 확산된 LMO 가유발할수있는생태계교란, 파괴로부터자연환경을보호하고 LMO 를안전하게이용하기위해자연생태계위해성평가및안전관리가필요하다. 먼저, 매년증가하고있는자연환경에비의도적으로유출된 LM 의심시료를분석하기위해서 LMO 여부를판별할수있는빠르고명확한검출법개발이선행되어야한다. 환경부와국립생태원에서는효율적인모니터링조사및사후관리를위해 2011 ~ 2014 년까지총 5 작물 40 개 LM 이벤트 ( 콩 10 개, 옥수수 16 개, 면화 8 개, 캐놀라 5 개, 사탕무 1 개 ) 의단일검출기법을확립하였고 (Lee et al. 2015a), 2013 년옥수수 15 개, 2014 년 17 개 LM 이벤트 ( 콩 6, 면화 6, 캐놀라 5) 의동시검출기법을개발하였다 (Lee et al. 2015b). 지속적으로신규로승인및유통되는 LMO 가늘어나고있어수입된신규 LMO 의명료한판별을위한유전자변형작물의특이적인검출기법을구축해야할필요성이있다. 2015 년국립생태원에서국내수입이승인되어유통되고있는 LM 작물중 6 개이벤트를선정하고 LMO 를판별할수있는검출기법개발을수행한결과를참고하여본연구논문을작성하였다 (Choi et al. 2015). 본연구결과확립된 LMO 검출기법은국내수입 승인된 LMO 의 90% 를검출가능하게할수있으며, 보다많은의심시료를빠른시간내효과적으로판별가능한동시검출기법개발연구의기초가될것이다. 따라서, 본연구결과확립된검출기법은비의도적으로혼입된 LMO 에의한자연생태계위해성평가및안전관리를위한과학적인판별기법을제공할것이다.

J Plant Biotechnol (2017) 44:97 106 99 재료및방법 표준시료로부터 genomic DNA 정제 유전자변형작물의특이적인검출기법개발에필요한 LM 콩 (MON87708, MON87769, DAS-68416-4, DAS-44406-6) 과 LM 옥수수 (DAS-40278-9), LM 캐놀라 (MON88302) 및비변형표준시료를표준물질및측정연구소 (Institute for Reference Materials and Measurements, IRMM) 와미국유지화학협회 (American Oil Chemists Society (AOCS, Urbana, IL, USA)) 로부터구입하였으며본연구에사용한표준시료는분말상태 (MON87708, MON87769, DAS-68416-4, DAS-44406-6, DAS-40278-9) 와종자상태 (MON88302) 로만판매한다 (Table 1). 구입후종자상태 (MON88302) 표준시료는막자사발을이용하여분말상태로만든후 DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) 를사용하여 genomic DNA 를추출하였다. Genomic DNA 는전기영동과 Nano-drop (Thermo fisher scientific, Waltham, USA) 을이용하여순도가높은것을사용하였다. 각작물의내재유전자및이벤트특이적 Primer 제작 각콩, 옥수수, 캐놀라의내재유전자 primer 는 NCBI GenBank 유전체염기서열을바탕으로 Lectin 1 (Le1, GenBank accession no. K00821), Alcohol Dehydrogenase1 (Adh1, GenBank accession no. AF123535) 및 Cruciferin A (CruA, GenBank accession no. X14555) 의 primer 를제작하였다 (Seol et al. 2015). 6 개 LM 작물에도입된목적유전자를검출하기위한특이적 primer 는유럽위원회공동연구센터 (Joint Research Centre-European Commission, JRC-EC) 와 LM 환경위해성센터 (Center for Environmental Risk Assessment, CERA) 에서 LMO 이벤트의도입유전자특성과 primer 서열정보등을참고하여제작하였다 (Table 2) (JRC 2015). 이벤트특이적 PCR 반응및민감도분석 Non-LM 은비변형표준시료로써, LM 표준시료인 LM 의대조구로사용하였으며, 매회 50 ng/µl 의 genomic DNA 를 2X Table 1 List of six LM events Crop Event name Provider Type MON87708 AOCS Powder (10 g) Soybean DAS-68416-4 IRMM Powder (1 g) DAS-44406-6 IRMM Powder (1 g) MON87769 AOCS Powder (10 g) Maize DAS-40278-9 IRMM Powder (1 g) Canola MON88302 AOCS Seed (100 g) Table 2 Oligonucleotide primersused to detect six LM events Primer name Sequence(5-3 ) Target Amplicon size (bp) Letin 1-F CACCTTTCTCGCACCAATTGACA Le1 Letin 1-R TCAAACTCAACAGCGACGAC (Soybean endogenous) 105 Alcohol CGTCGTTTCCCATCTCTTCCTCC Adh1 Dehydrogenase1-F (Maize Alcohol CCACTCCGAGACCCTCAGTC endogenous) Dehydrogenase1-R 135 CruciferinA-F GGCCAGGGTTTCCGTGAT CruA CruciferinA-R CCGTCGTTGTAGAACCATTGG (Canola endogenous) 101 MON87708-F TCATACTCATTGCTGATCCATGTAG MON87708-R AGAACAAATTAACGAAAAGACAGAACG MON87708 91 DAS-68416-4-F GTACATTAAAAACGTCCGCAATGTGT DAS-68416-4-R GTTTAAGAATTAGTTCTTACAGTTTATTGTTAG DAS-68416-4 130 DAS-44406-6-F TTATTGTTCTTGTTGTTTCCTCTTTAGG DAS-44406-6-R CCTCAATTGCGAGCTTTCTAATTT DAS-44406-6 99 MON87769-F CATACTCATTGCTGATCCATGTAGATT MON87769-R GCAAGTTGCTCGTGAAGTTTTG MON87769 87 DAS-40278-9-F CACGAACCATTGAGTTACAATC DAS-40278-9-R TGGTTCATTGTATTCTGGCTTTG DAS-40278-9 98 MON88302-F TCCTTGAACCTTATTTTATAGTGCACA MON88302-R TCAGATTGTCGTTTCCCGCCTTCA MON88302 101

100 J Plant Biotechnol (2017) 44:97 106 Fig. 1 Genomic DNA isolation from NON-LM and LM. (A) Genomic DNAs of NON-LM crops were displayed by 1% agarose gel electrophoresis (Lane M; 1Kb DNA Ladder, Lane 1; Soybean, Lane 2; Maize, Lane 3; Canola). (B) Genomic DNAs of six LM events were displayed by 1% agarose gel electrophoresis (Lane M; 1Kb DNA Ladder, Lane 1; LM soybean MON87708, Lane 2; LM soybean MON87769, Lane 3; LM soybean DAS-68416-4, Lane 4; LM soybean DAS-44406-6, Lane 5; LM Maize DAS-40278-9, Lane 6; LM Canola MON88302). 다. 먼저, 6 개 LM 작물의 PCR 생산물을 PCR Purification system 으로정제 (Biofact, Daejeon, Korea) 한후, T-blunt PCR Cloning system (Solgent, Daejeon, Korea) 을이용하여 cloning 하였고, 도입유전자와주변염기서열을비교분석하였다. 자체적인최적검출기법확립 Fig. 2 Amplification for endogenous and event-specific genes in six LM crops. (A) Endogenous genes (soybean Le1, maize Adh1 and canola CruA) of six LM events were detected by 2.5% agarose gel electrophoresis. (B) Event-specific PCR products of six LM events were detected by 2.5% agarose gel electrophoresis. (Lane M; 100 bp DNA Ladder, Lane 1; LM soybean MON87708, Lane 2; LM soybean MON87769, Lane 3; LM soybean DAS-68416-4, Lane 4; LM soybean DAS-44406-6, Lane 5; LM Maize DAS- 40278-9, Lane 6; LM Canola MON88302). EF-Taq PCR Pre-Mix (Solgent, Daejeon, Korea) 를사용하여이벤트검출 PCR 반응을수행하였다 (Proplex PCR system, Applied Biosystems, Waltham, USA). 확립된각 6개작물에대한검출기법을통해 LM 이벤트가검출될수있는최저농도를확인하기위하여민감도분석실험을수행하였다. 유전자변형작물의검출최고농도는 50 ng/µl를기준으로하였고순차적희석을통해검출최저농도를확인하였다. PCR 은 95 C에서 5분, 95 C 15초, 60 C 20초간 40 cycle 수행한뒤, PCR 생성물과 Biofact사의 100 bp Plus DNA Ladder 4 µl (150 ng/µl) 를 agarose gel에전기영동으로결과를확인하였다. LMO 검출반응후생성물의염기서열정보분석 검출기법 PCR 반응후, 이벤트특이적인 primer 에의해증폭된산물인지증명하기위하여염기서열분석을수행하였 각 6 개이벤트의특이적인 primer 염기서열을 blast 하여식물유전체염기서열을검색하였고, 정확한도입유전자의삽입위치와증폭효율이높은검출기법확립을위하여여러조합의 primer 를제작하였다. JRC 로부터수집한기존의 primer 와새로제작한 primer 를이용하여이벤트검출 PCR 을수행하였고, 자체적인최적의검출기법을확립하였다. 결과및고찰 LMO 도입유전자검출기법확립및민감도분석 6 개유전자변형 (LM) 표준시료와비변형 (NON-LM) 콩, 옥수수및캐놀라표준시료로부터 genomic DNA 를정제하여 (Fig. 1), 도입유전자검출 PCR 을수행하였다. 먼저, 각작물고유의내재유전자검출 PCR 및이벤트특이적도입유전자를검출가능한지 PCR 을통해확인하였다. PCR 실험을통해 6 개 LM 이벤트에서각작물의내재유전자 (Le1, Adh1, CruA) 와이벤트특이적도입유전자가검출되는것을확인하였다 (Fig. 2). 이어, 6 개 LM 과 NON-LM 의표준시료에서내재유전자와이벤트특이적 primer 를이용하여검출반응실험을진행하였다 (Savini et al. 2013b; Mazzara et al. 2012; Savini et al. 2014; Savini et al. 2015; Savini et al. 2012; Savini et al. 2013a). 제초제저항성 LM 콩 MON87708(CS-dmo 유전자삽입 ), DAS-68416-4 (pat, aad-12 유전자삽입 ) 와 DAS-44406-6 (mepsps, pat, aad-12 유전자삽입 ) 및기능성강화 LM 콩 MON87769 (CS-PjD6D, CS-NcFad3 삽입 ) 4 개 LM 이벤트를대상으로검

J Plant Biotechnol (2017) 44:97 106 101 Fig. 3 Establishment of PCR amplification for LMO events. PCR analysis were performed by using the endogenous Lectin 1 (Le1) and event-specific gene primers. PCR products of MON87708 (A), MON87769 (B), DAS-68416-4 (C) and DAS-44406-6 (D) were displayed. (E) PCR analysis were performed by using the endogenous Alcohol Dehydrogenase1 (Adh1) and DAS-40278-9 event-specific gene primers. (F) PCR analysis were performed by using the endogenous Cruciferin A (CruA) and MON88302 event-specific gene primers. PCR products were electrophoresed on a 2.5% agarose gel. 출기법을확립하고자하였다. 그결과, 모든 NON-LM 및 LM 이벤트표준시료에서콩고유의내재유전자가검출되었으며, 각이벤트특이적 primer 는 LM 표준시료에서만증폭되어 4 개의 LM 콩에대한검출기법을확립하였다 (Fig. 3A-D). 또한, 제초제저항성 LM 옥수수 DAS-40278-9 (aad-1 유전자삽입 ) 와 LM 캐놀라 MON88302 (cp4 epsps 유전자삽입 ) PCR 반응결과, 유전자변형옥수수와캐놀라에대해서만특이적으로도입유전자가검출되는것을확인하였다 (Fig. 3E and F). LMO 검출기법은자연환경에혼입된 LMO 의심시료를과학적인방법을이용하여 LMO 여부를분명하게판단하여제거하기위해구축하였다. 그러나, 자연생태계에비의도적으로유출된콩, 옥수수의낙곡이나자생하고있는식물체의모양, 크기및시든정도에따라, 검출반응 PCR 에필요한양만큼의 genomic DNA 분리가불가능하거나순도가낮아 LM 여부를판단하기위한 PCR 을수행하기힘든경우가있다. 따라서다수의문헌자료를참고하여 6 개 LM 표준시료에서정제한 genomic DNA 농도조건을달리하여검출가능한가장낮은농도를확인하기위한검출한계 PCR 을수행하였다 (Kim and Kim 2009a; Kim et al. 2008; Kim et al. 2015; Kim et al. 2009b; Lee et al. 2007; Min et al. 2004; Moon et al. 2012; Wu et al. 2009; Yoo et al. 2013). 각 LM 콩, 옥수수, 캐놀라의 genomic DNA 는 50 ng/µl 을최고농도로사용하였으며, 이어서차례대로 D.W 로희석한낮은농도의 genomic DNA 로검출반응시사용한 PCR 실험방법과동일한방법 으로검출한계농도를확인하였다. 본검출법은자연환경모니터링을통해채집된 LM 의심시료를판별하기위해개발된분석법이다. 본데이터는표준시료를이용하여수행하였으나, 환경에비의도적으로유출된의심개체의명확한 LMO 여부를판단할수있는최저검출농도를확인하고자민감도분석실험을수행하였고, 실제의심시료의 LM 유전자의 PCR 생성물을정확하게확인할수있는농도를검출최저농도로결정하였다. 검출최저농도분석결과, LM 콩 MON87708, MON87769 이벤트는 0.05 ng/µl, DAS-68416-4 이벤트는 6.25 ng/µl, DAS-44406-6 이벤트는 0.19 ng/µl 농도까지검출되었다. 또한, LM 옥수수 DAS-40278-9 이벤트는 3.12 ng/µl, LM 캐놀라 MON88302 이벤트는 0.025 ng/µl 농도까지검출되었다. 판매되는각각의표준시료중 LM 시료가가장많이혼합된표준시료를선정하여검출법을개발하기위해사용하였다. MON87708, MON87769 및 MON88302 는 LM 작물이 100% 혼합된표준시료이고, DAS-68416-4, DAS-44406-6, DAS-40278-9 는 LM 작물이 10% 가혼합된표준시료이다. 그결과, 검출이가능한최저농도확인실험에서도각 LM 작물검출반응결과와유사하게 LM 작물이 10% 혼합된 DAS-68416-4( 검출한계최저농도 : 6.25 ng/µl), DAS-44406-6( 검출한계최저농도 : 0.19 ng/µl), DAS-40278-9 ( 검출한계최저농도 : 3.12 ng/µl) 이벤트에비해, LM 작물이 100% 혼합된 MON87708( 검출한계최저농도 : 0.05 ng/µl), MON87769( 검출한계최저농도 : 0.05 ng/µl) 및 MON88302( 검출한계최저농도 : 0.025 ng/µl) 이벤트에서는낮은농도에서

102 J Plant Biotechnol (2017) 44:97 106 Fig. 4 Concentration-dependent DNA amplification of event-specific genes. PCR products of MON87708 (A), MON87769 (B), DAS-68416-4 (C), DAS-44406-6 (D), DAS-40278-9 (E) and MON88302 (F) were electrophoresed on a 2.5% agarose gel. (Lane M; 100bp DNA Ladder, Lane 1-14; 50, 25, 12.5, 6.25, 3.12, 1.56, 0.78, 0.39, 0.19, 0.09, 0.05, 0.025, 0.012, 0.006 ng/µl LM crops).

J Plant Biotechnol (2017) 44:97 106 103 Table 3 Sequencing results of six LM events Crop Event name Sequence(5-3 ) Soybean Maize MON87708 DAS-68416-4 DAS-44406-6 MON87769 DAS-40278-9 TCATACTCATTGCTGATCCATGTAGATTTCCCGGACTTTAGCTCAAAATGCATGTATTTA TTAGCGTTCTGTCTTTTCGTTAATTTGTTCT GTACATTAAAAACGTCCGCAATGTGTTATTAAGTTGTCTAAGCGTCAATATTTTAATTCT TAACAATCAATATTTTAATTCTTAAACTTTATTAAATCTAACAATAAACTGTAAGAACTA ATTCTTAAAC TTATTGTTCTTGTTGTTTCCTCTTTAGGAACTTACATGTAAACGGTAAGGTCATCATGGA GGTCCGAATAGTTTGAAATTAGAAAGCTCGCAATTGAGG CATACTCATTGCTGATCCATGTAGATTTCCCGGACATGAAGCCATTTACAATTGACCATC ATACTCAAAACTTCACGAGCAACTTGC CACGAACCATTGAGTTACAATCAACAGCACCGTACCTTGAAGCGGAATACAATGAAGGT TAGCTACGATTTACAGCAAAGCCAGAATACAATGAACCA TCCTTGAACCTTATTTTATAGTGCACAAAACCTTTTAGTCATCATGTTGTACCACTTCAA Canola MON88302 ACACTGATAGTTTAAACTGAAGGCGGGAAACGACAATCTGA *Under bars denote event-specific primer sequences for detection of six LMOs. Fig. 5 Schematic representations of event-specific genetic elements of six LM crops. Location and direction of primers are indicated by F and R. All primer pairs were designed with nucleotide sequences of the DNA flanking region and the inserted DNA cassette. (LB; left border, RB; right border, ; promoter, ; encoding gene, 3 terminator). 도 LM 특이적인도입유전자가검출되었다. 이러한결과는표준시료에포함된 LMO 혼합비율이검출최저농도에영향을준다는것을나타내며, 모니터링시발견된 LM 의심시료를분석할때기초데이터로활용될것이다. 각 6 개작물에대한검출한계최저농도를각각정리하였다 (Fig. 4). 각이벤트별도입유전자구조및주변염기서열분석 각이벤트별도입유전자가삽입된위치와검출기법의정확성을확인하기위하여 PCR 산물을이용한염기서열을분석하고 alignment 를수행하였다. Bioedit program 을이용하여검출반응후 PCR 생성물이 LM 특이적 primer 에의해증폭된산물인지확인하였다. 또한, GMO Detection Method Database (GMDD) 와 BIOSAFETY SCANNER Website 로부터수집한 정보를토대로각이벤트별프로모터, 도입유전자, 종결인자의구조를파악할수있었다. Table 3 에서보듯이, 6 개이벤트모두 LMO 를검출할수있도록, 각작물의고유유전자와 LM 특이적도입유전자의염기서열에서 LM 특이적인이벤트검출 primer 가설계되었음을확인할수있었고, 기존에수집된 LMO 유전정보와일치하였다 (Table 3, Fig. 5). 신규최적검출기법확립 PCR 증폭의효율성은여러가지실험조건에따라변하는데, 본연구에서자체적으로확립한각이벤트별특이적증폭실험에서도표준시료의함량, primer 결합부위와반응산물의크기등에따라 PCR 증폭효율의차이를확인하였다. 기존에수집된정보를바탕으로확립한검출조건에서

104 J Plant Biotechnol (2017) 44:97 106 Table 4 New oligonucleotide primers for detection of LM events Target event name Sequence (5-3 ) Amplicon size (bp) R1 CCTAGCTATAGTTTTGTCAC 123 MON87708 R2 CCGTCCGCAAGTGAATAATATACAG 200 R3 GGTAATAGATGCACCGTAGG 246 R4 AGAAGACGTGCACTACGTGA 325 F1 TAACGCTGCGGACATCTACATTTTTGA 163 MON87769 F2 GGACGTGAATGTAGACACGTCGAA 287 F3 CATGCATCAATCGACCGTACCGCGGCCG 366 R1 GAACTTGCTAACATATTTCAATGG 242 DAS-68416-4 R2 CCCTCACATAAAGTAAATG 300 R3 GAGTATCAGTGGCAGAAAGAG 375 R4 CACACTTATGTGTCGAGGCCA 429 F1 GAAGGGTGGGGCCTGACATAGTAGC 229 DAS-44406-6 F2 GATATGTGGGTCATTGGCCCACATGA 272 F3 GTCTTATAAAAAACACATCTGAATAC 371 F1 TCTCTAAGCGGCCCAAACTTG 153 DAS-40278-9 F2 CAGGAGACCTCGCTTGTAACC 215 F3 GTCCAGAGGGTACCCCATCATT 277 F4 TAGGAGACATATGATCCTCATG 333 F1 GATCCTCCTCAAGTTGTACAGTCTTGAAGAG 196 MON88302 F2 GTCTTTGCTTTTGGCTCTTACTTTTGCG 304 F3 CGCGTCTAGAAGTTGTGGATAAGATTGAATC 407 는이벤트특이적 PCR 생성물의크기가 100 bp 이하로검출되는이벤트들이존재하는데, 이것은향후다수의모니터링의심시료를분석할때생성물크기가비슷한내재유전자와구별하기에혼란을줄수있다. 따라서내재유전자의생성물크기와명확하게구분되며 PCR 증폭효율이높은새로운 primer 를구축하는실험을수행하였다. 먼저, 6 개이벤트검출시사용된 primer sequence 를바탕으로 blast 하여식물유전체염기서열을검색하였다. MON87769( 콩 ), DAS-44406-6 ( 콩 ), DAS-40278-9( 옥수수 ) 및 MON88302( 캐놀라 ) 이벤트의검출에사용된정방향 primer 와 MON87708( 콩 ), DAS-68416-4 ( 콩 ) 이벤트검출에사용된역방향 primer 는각식물유전체염기서열의일부분에일치하였고, 최적의검출기법확립을위하여다수의새로운 primer 를 마크로젠에의뢰하여제작하였다 (Table 4). 새롭게제작한 primer 의작동여부를확인하기위하여, 본연구의검출기법확립에사용한 JRC primer 와짝을이루어이벤트검출 PCR 을수행하였다. 그결과, MON87708 이벤트는새롭게제작한 R1/R3 primer, MON 87769 이벤트는 F1/F2/F3 primer, DAS-68416-4 이벤트는 R1/R3/F4 primer 를사용할경우 JRC primer 조합보다증폭효율이많이향상되는결과를확인하였다. DAS-44406-6 이벤트는 F1/F3 primer, DAS-40278-9 이벤트는 F1/F2/F4 primer, MON88302 이벤트는 F1/F2/F3 primer 가결합및중합하여검출되는것을확인하였고, 새롭게제작한 primer 를사용할경우증폭효율이많이향상되는효과를보였다. 특히, LM 작물 이 10% 가혼합된 DAS-68416-4, DAS-44406-6, DAS-40278-9 이벤트에서는새로운 primer 를이용하여 PCR 반응을수행하였을때기존 JRC primer 조합보다높은농도의 PCR 산물을확인할수있었다 (Fig. 6). 이러한결과들로부터검출반응시높은효율의 primer 결합을선택하는것이중요하며, 확립된 6 개이벤트의새로운검출기법은국립생태원자체적인검출기법으로예상치못하게자연생태계에발견된 LM 의심시료분석및모니터링조사연구등에적극활용할것이다. 적요 일반적으로유전자를재조합하는생명공학기술이널리이용되고있는것은유전자변형작물분야이다. LM 제품에대한의존도가높아짐에따라한국에서는 LMO 의안전성에대한우려가지속적으로증가하고있다. 따라서, 우리는자연환경내비의도적으로방출된 LMO 를판별할수있는검출기법을확립하였다. JRC 정보를토대로 6 개 LM 이벤트 ( 캐놀라 1, 옥수수 1, 콩 4 개 ) 의유전자를검출할수있는 PCR 조건을확립하였다. 각 LM 시료에서 genomic DNA 를분리하였고, 이벤트특이적인프라이머를사용하여 PCR 실험을수행하였다. 또한자체적으로확립된검출법에의해모든 LMO 의이벤트특이적유전자가검출되었다. LM 유전자

J Plant Biotechnol (2017) 44:97 106 105 Fig. 6 Amplification of event-specific genes using newly designed primers of six LM events. PCR products of MON87708 (A), MON87769 (B), DAS-68416-4 (C), DAS-44406-6 (D), DAS-40278-9 (E) and MON88302 (C) were electrophoresed on a 2.5% agarose gel (Lane M; 100bp DNA Ladder, Lane 1; JRC primer, Lane 2 ~ 5; new primer). 의삽입위치를분석하기위해 PCR 생성물을이용하여염기서열을분석하였다. 이결과는 LM 이벤트의특이적인유전자를효율적으로검출할수있음을나타낸다. 게다가본연구결과확립된검출기법은자연환경내 LM 작물의모니터링및사후관리에활용될것이다. 사사 본연구는 2015 년국립생태원생태보전연구실의연구과제 (NIE-2015-06) 로수행되었다. References Agbios (2001) Esential Biosafety. Vol. 1 No. 1 Merkvile, Canada Choi WK, Seol MA, Lee JR, Jo BH,Moon JC, Shin SY, Eum SJ, Kim IR, Kim JM, Song HR (NIE) (2015) Establishment of detection methods for LMO Han SM, Kim DY, Md RU, Hwang KS, Lee BK, Kim CG, Park KW (2014) Appearance/Instance of genetically modified maize at grain receiving harbors and along transportation routes in Korea. Weed Turf. Sci 3:221-224 Han SM, Oh TK, Md RU, Shinogi Y, Lee BK, Kim CG, Park KW (2015) Monitoring the occurrence of genetically modified maize in Korea: A 3-year observations. J Fac Agriculture, 60(2):285-290 European Commission, Joint Research Centre (JRC). Available from: http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications (ISAAA). GM Approval Database. Available from: http://www. isaaa.org. Accessed 2015 Korea Biosafety Clearing House(KBCH). Status of risk assessment of GMO in Korea. Available from: http://www.biosafety.or.kr. Accessed 2015 Kim JH, Kim HY (2009a) Event-specific detection methods for genetically modified maize MIR604 using real-time PCR. Food Sci. Biotechnol. 18(5):1118-1123 Kim JH, Kim SA, Seo YJ, Lee WY, Park SH, Kim HY (2008) Multiplex PCR detection of the MON1445, MON15985, MON88913, and LLcotton25 Varieties of GM cotton. Food Sci. Biotechnol. 17(4):829-832 Kim JH, Park SB, Roh HJ, Park SH, Shin MK, Moon GI, Hong JH, Kim HY (2015) A simplified and accurate detection of the genetically modified wheat MON71800 with one calibrator plasmid. Food Chem. 176:1-6 Kim JH, Seo YJ, Sun SH, Kim HY. Multiplex PCR detection of 4 events of genetically modified soybeans(rrs, A2704-12, DP356043-5, and MON89788) (2009b) Food Sci. Biotechnol. 18(3):694-699 Lee BK, Kim CG, Park JY, Park KW, Kim HJ, Yi H, Jeong SC, Yoon WK, Kim HM (2009) Monitoring the occurrence of genetically modified soybean and maize in cultivated fields and along the transportation routes of Incheon Port in South Korea. Food con. 250-254 Lee JR, Shin SY, Choi WK, Moon JC, Jo BH, Seol MA, Eum SJ, Kim IR, Kim JM, Song HR (NIE) (2015c) Study on environmental monitoring and post-management of LMO (VII) Lee JR, Choi WK, Moon JC, Jo BH, Shin SY, Seol MA, Eum SJ, Kim IR, Song HR, Kim JM (NIE) (2015a) LMO detection methods. ISBN 979-11-86197-24-0

106 J Plant Biotechnol (2017) 44:97 106 Lee JR, Jo BH, Choi WK, Moon JC, Shin SY, Eum SJ, Seol MA, Kim IR, Kim JM, Song HR (NIE) (2015b) Development of multiplex-pcr for simultaneous detection of LMOs (III) Lee SH, Kim JK, Yi BY. Detection methods for biotech cotton mon15985 and mon88913 by PCR (2007) J. Agric Food Chem. 55:3351-3357 Ministry of agriculture food and rural affairs. Self-sufficiency rate of grain in Korea. Available from: http://www.mafra.go.kr. Accessed 2015 Mazzara M, Charles Delobel C, Pinski G, Savini C, Van den Eede G (2012) Event-specific Method for the Quantification of Soybean MON87769 Using Real-time PCR. Validation Report and Validated Method. EUR 25487 EN.2012. JRC74371 Min DM, Kim MY, Jung SI, Heo MS, Kim JK, Kim HY (2004) Quantitative analysis of genetically modified soybean in processed foods using real-time PCR. Korean J. Food Sci. Technol. 36(5): 723-727 Moon GS, Shin WS. Establishment of quantitative analysis method for genetically modified maize using a reference plasmid and novel primers (2012) Prev Nutr Food Sci. 17:274-279 Park KW, Lee BK, Kim CG, Kim DY, Park JY, Ko EM, Jeong SC, Yoon WK, Kim HM (2010) Monitoring of occurrence of genetically modified maize at a grain receiving port and along transportation routes in the Republic Korea. Food Con. 456-461 Savini, C. Event-specific Method for the Quantification of Oilseed Rape MON88302 Using Real-time PCR -Validation Report and Validated Method (2013a) JRC86264 Savini C, Bogni A, Foti N, Mazzara M, Kreysa J. Event-specific Method for the Quantification of Maize DAS-40278-9 Real-time PCR - Validation Report and Validated Method (2012) EUR 25585 EN Savini C, Mazzara M, Munaro B, Kreysa J. Event-specific Method for the Quantification of Soybean MON87708 Using Real-time PCR - Validation Report and Validated Method (2013b) EUR 25982 EN. JRC81896 Savini C, Sacco MG, Mazzara M, Kreysa J. Event-specific Method for the Quantification of Soybean DAS-68416-4 Using Realtime PCR - Validation Report and Validated Method (2014) EUR 26706 EN. JRC 89867 Savini C, Sacco MG, Mazzara M, Kreysa J. Event-specific Method for the Quantification of Soybean DAS-44406-6 Using Real-time PCR - Validation Report and Validated Method (2015) JRC 95249 Seralini GE, Clair E, Mesnage R, Gress S, Defarge N, Malatesta M, Hennezuin D, Joel Spiroux de Vendomois (2012) Long term toxicity of a Roundup herbicide and a Roundup-tolerant genetically modified maize. Food and Chemical Toxicology 50:4221-4231 Seol MA, Lee JR, Choi WK, Jo BH, Moon JC, Shin SY, Eum SJ, Kim IR, Song HR (2015) Establishment of detection methods for approved LMO in Korea. J Plant Biotechnol. 42:196-203 Wu G, Wu YH, Xiao L, Lu CM. Event-specific qualitative and quantitative PCR detection of genetically modified rapeseed topas 19/2 (2009) Food Chem. 112:232-238 Yoo MR, Kim JH, Yea MC, Kim HY (2013) Development of detection method of unapproved genetically modified potato (EH92-527-1) in Korea using duplex polymerase chain reaction. Korean J. Food Sci. 45(2):156-160