제출문 농림부장관귀하 본보고서를 고항균활성키티나아제활성균주를이용한토마토잎곰팡이병제어용환경친화 적미생물제제개발 과제의최종보고서로제출합니다. 2007 년 05 월 21 일 주관연구기관명 : 동아대학교 총괄연구책임자 : 문병주 세부연구책임자 : 정순재 세부연구책임자 : 이영병 연 구 원 : 김현주 연 구 원 : 이광열 연 구 원 : 백정우 연 구 원 : 전옥주 연 구 원 : 최기혁 연 구 원 : 공현기
요약문 Ⅰ. 제목 고항균활성키티나아제활성균주를이용한토마토잎곰팡이병제어용환경친화적 미생물제제개발 Ⅱ. 연구개발의목적및필요성 1992년 UN 환경개발회의리우선언이후지구환경보호를위한노력과 WTO가창립되면서환경과무역을연계시킨그린라운드가진행되면서농업도환경친화적농업으로의전환이시급해졌다. 특히, 화학농약사용량의제한및잔류허용량강화로저독성, 저약량제품또는생물농약의개발이필요하게되었는데, 국내에서도최근친환경농업육성 5개년계획의수립으로화학농약사용량을 2005년도까지원제기준으로 30% 를감소시키고저농약재배로친환경농업재배면적을확대시키는친환경농업구현을계획하여실행하고있다 ( 농림부, 2001). 따라서, 현재국내에서는미생물농약에대한관심이크게일어나많은연구자와벤처기업등에서연구가진행되고있으며, 생물농약의개발과보급은필수가되어이는앞으로도계속가속화될전망이다. 현재전세계미생물농약시장은앞으로도고속성장할것으로예상되나, 국내에서개발되어등록, 시판되고있는미생물농약은극히미흡한상태이고이에이용되는균주의특허문제등많은문제가산적해있지만우리나라실정에맞는균주의선발과유전학적인육종그리고이를이용한미생물농약개발및이를정확한적용하는방제방법확립으로친환경농업을일반화하는데본연구의목적이있다. 이에, 본연구에서는항균물질활성세균인 Bacillus amyloliquefaciens A-2, 항균물질활성과 chitinase 활성을동시에지니는 Burkolderia capacia CH-67 균주및 chitinase 유전자가삽입된 B. amyloliquefaciens A-2 형질전환체를이용하여토마토잎곰팡이병방제용엽면살포제를개발하여환경친화적인병방제용미생물농약을개발하고이를실용화하고자한다. - 2 -
Ⅲ. 연구개발내용및범위 제 1 세부과제 : 고항균활성키티나아제활성균주의유전학적육종 다양한미생물로부터의키티나아제유전자정보확보 키티나아제유전자의분리및 cloning 키티나아제유전자의항균물질활성미생물로의도입및발현 고항균활성키티나아제활성재조합미생물최종선발 키티나아제의분리, 정제및특성조사 선발재조합균주의키티나아제분비능, 활성능부가에의한길항력증강조사 작물생육도 ( 작물생육촉진 ) 조사 타작물의잎곰팡이병에대한방제력검정 제 2 세부과제 ; 고항균활성키티나아제활성균주를이용한미생물제제제조기술확립 키티나아제활성균주및항균활성미생물의지속적인분리 선발미생물의배양적생화학적특성검정과동정 키티나아제활성미생물의키티나아제활성검정 항균물질활성미생물의항균활성검정 고항균활성키티나아제활성모균주와재조합균주의대량활성을위한최적조건확립 고항균활성키티나아제활성모균주와재조합균주의대량배양기술개발 미생물제제개발을위한 Additives 선발 미생물제제의제조기술확립및제형화 미생물제제의최적화실험및우수제형선발 미생물제제의경시적유효도및안정성조사 미생물제제의타작물에대한약해시험조사 제 3 세부과제 ; 개발미생물제제의방제효과검정및포장적용시험 선발고항균활성키티나아제활성모균주와재조합균주의생육실내폿트상에서의잎곰팡이병방제효과검정 선발고항균활성키티나아제활성모균주와재조합균주의온실내의폿트및토경재배에서의잎곰팡이병방제효과검정 미생물제제의생육실내폿트상에서의잎곰팡이병방제효과검정 미생물제제의온실내의폿트및토경재배에서의잎곰팡이병방제효과검정 미생물제제의포장에서의방제효과실증시험 미생물제제의실제자연병발생농가하우스에서의방제효과실증시험 - 3 -
Ⅳ. 연구개발결과및활용에대한건의 제 1 절연구개발결과 제 1 세부과제 : 고항균활성키티나아제활성균주의유전학적육종 연구책임자 : 이영병 1. 연구의목적토마토잎곰팡이병을생물학적방제법으로효과적으로제어하기위해, 기존의생물학적방제제로이용할수있는항균물질활성균을분자육종방법으로개량하는것을목적으로하였다. 길항미생물의항생물질을분비하는기존의능력에항균활성키티나아제유전자를도입하여재조합균주를육종하는목적으로연구가수행되었다. 2. 연구의방법및결과먼저대상으로하는항균물질활성균은 Bacillus amyloliquefaciens A-2를이용하였고이 A-2 균주는항균물질의활성은있으나 chitinase 활성은없었다. Bacillus속균에서 chitinase 형질전환을검정하기위한목적의대조균주는 B. subtilis 168 균주를이용하였다. A-2 균주에도입한 chitinase 유전자는 B. licheniformis N1 유래의 chitinase 유전자와 Cellulosimicrobium cellulans CH-10 유래의 chitinase 유전자를대상으로하였다. B. licheniformis N1 균주의 chitinase gene을분리하고염기서열을분석한결과, 다른 B. licheniformis 유래의 chitinase와아미노산서열에서 89-96% 의동일성을보였으며모든 conserved domain 이확인되었다. C. cellulans CH-10에서유래한 chitinase gene은방선균에서유래한 conserved 부위를 PCR로증폭하여염기서열을분석하고이단편을기초로 inverse PCR 하여 chitinase full sequences라고예측되는부위 (1.2kb) 를클로닝하였다. 그러나 C. cellulans CH-10 균주의배양여액의 chitinase 활성에비해클로닝한유전자는효소활성이결여되어재조합균주육종에이용을할수없었다. 반면, N1 유래 chitinase는 GST 융합단백질로발현되고효소활성이 colloidal chitin과형광성기질에대해우수하게나타나 A-2 균주의분자육종에직접이용하였다. 발현된 N1 chitinase 단백질을함유하는 E. coli의 lysate와형광기질을이용한 chitinase 활성을검정한결과, 이효소는 endo-type의 chitinase인것으로판단되었다. - 4 -
재조합 A-2 균주육종을위해 N-1 chitinase 유전자를 Bacillus 속균발현용인 pwh1520 벡터에 cloning하였다. 재조합된플라스미드 pbex WH 1-4 는 Bacillus amyloliquefaciens A-2 균주와 B. subtilis 168 에성공적으로형질전환되었고형질전환여부는 PCR과 Southern blot 방법으로검정되었다. 형질전환체에서의 chitinase 유전자발현은 RT-PCR 방법과형질전환체의배양상등액또는세포추출액그리고형광기질을이용한활성검정방법에의해확인되었다. 그결과재조합플라스미드를포함하는형질전환체와 A-2 균주와 B. subtilis 168 균주모두에서예상되는 chitinase 발현물인 RT-PCR 산물이검출되었다. 형광기질을이용한활성 검정결과, B. amyloliquefaciens A-2 형질전환체와 B. subtilis 168 형질전환체에서발현된 chitinase가 endo-type의 chitinase의활성을보였다. 마지막으로획득된 chitinase 활성유전자가삽입된 B. subtilis 168/pBex WH-14 형질전환체의 Fulvia fulva에서발현된 chitinase의항균력검정을위해 F. fulva 포자발아에대한억제능을조사하였다. B. subtilis 168/pBex WH-14 형질전환체에서분비되는 N1 유래의 chitinase가 F. fulva 포자발아율을억제하는활성이있음을확인하였다. 따라서항균력이인정된 N-1 chitinase 를발현하는 B. amyloliquefaciens A-2 균주를이용하여생물학적방제제형을제조하고방제활성을조사하였다. 제 2 세부과제 : 고항균활성키티나아제활성균주를이용한미생물제제제조기술확립 연구책임자 : 문병주 1. 연구의목적토마토잎곰팡이병을생물학적방제법으로효과적으로제어하기위해우수한항균물질활성균을선발하며선발된균주와그균주의 chitinase 활성재조합균주의제형을개발하여키티나아제를활성하는고항균활성미생물제제를제조하는기술을확립하는것을목적으로한다. 2. 연구의방법과결과 2005년 2월과 3월에조사된토마토잎곰팡이병의평균이병엽율은각각 28.8% 와 16.7% 로조사되었으며, 대상병원균으로 Fulvia fulva TF-13이최종분리동정되었으며이후의병원성및방제효과검정에이용되었다. 분리한 TF-13 균주는토마토에서병원성이일정하게유지되었으 - 5 -
며접종을위한분생포자부유액은여러배지를검정한결과 PDB 배지가최종선발되었다. 우수항균물질활성균은토마토근권과엽권에서다수의균주를분리하여병원균과대치배양을통해 1차선발하고병원균 F. fulva TF-13 균주가접종된토마토식물에서방제효과를검정하여 A-2 균주를최종선발하였다. 선발된길항균은전자현미경관찰, 16S rrna 유전자분석, gyra 유전자분석을통해최종 Bacillus amyloliquefaciens A-2로동정하였다. A-2 균주뿐아니라키티나아제활성이우수한균주로이연구에서 Paenibacillus pabuli 로동정된 CH-9 균주, Cellulosimicrobium cellulans로동정된 CH-10 균주, 그리고 Burkholderia cepacia로동정된 CH-67 균주도분리되어생물학적방제효과가함께검정되었다. 분리된균주들의생물학적방제효과는플라스크내항균효과검정, 현미경을통한균사생육억제능검정, 그리고생육실포트상에서길항균의생물학적방제력검정등을통해조사되었다. 그결과 A-2 균주와 CH-67 균주가우수한길항균임이증명되었다. 선발된두균주의우수한제형을개발하기위하여각균주의배양에적절한기초배지및탄소원, 질소원, 제형을위한전달매체 (carrier) 를포함한첨가제를선발하기위한실험과적정배양조건및제형화조건을탐색하기위한실험이플라스크배양과발효기배양을통해수행되었다. 그결과 A-2 균주를위해기초배지 (K 2 HPO 4 0.05%, MgSO 4 7H 2 O 0.05%, MnCl 2 4H 2 O, 0.0005%, CaCl 2 2H 2O 0.0005%, FeSO 4 0.0025%) 에현미유 (Rice oil) 3.0%, yeast extract 0.5% 를첨가한조성을 A-2 균주의대량배양용배지로최종선발하였으며, 이를현미유배지로명명하였다. 생육을위한적정산도와온도는 ph 6-7 그리고 35 이었다. B. cepacia CH-67 균주의대량배양을위해서는기초배지 (K 2HPO 4 0.125%, MgSO 4 7H 2O 0.001%, KH 2PO 4 0.038%) 에현미유 3.0% 와 (NH 4 ) 2 SO 4 0.5% 를첨가한배지를최종선발하였다. 두균주의수화제형과액상수화제형의제형을다양한전달매체를이용하여제조하였고이들각제형의효과를제3세부과제에서생육실포트와포장조건에서검정하였다. 특히 A-2 균주를위해방제효과검정을통해선발한제형은 A-2 균주의재조합균주인 A-2/pBex WH 1-4 의제형에도그대로적용하여이용하였다. 제 3 세부과제 : 개발미생물제제의방제효과검정및포장적용시험 연구책임자 : 정순재 1. 연구의목적 - 6 -
본과제의연구의목적은 2세부과제에서제조된각종길항미생물제형들의방제효과를생육실내포트와하우스내토경재배검정을통해분석하여우수제형을선발하고재조합균주의제형과기타선발된미생물제제를자연발병포장에서방제효과를검정하여우수한미생물제제를제공하기위한것이다. 2. 연구의방법과결과본연구에 A-2 균주의제제는수화제형 A-2A, A-2B, A-2E, A-2F, A-2G, A-2H, A-2I, A-2J, A-2K, A-2L, A-2M, A2-MP, A2-O 그리고액상수화제형 A-2C, A-2D 가방제효과검정에이용되었다. 수화제형제제 CH67-A, CH67-B, CH67-C, CH67-D, CH67-E, CH67-F 은 CH-67 균주를이용하여제조된것으로동일하게방제효과검정에이용되었다. 각제형의생물학적방제효과는포트재배한토마토에병원균의인공접종을통한생육실내포트검정이수행되었다. 대조약제로는화학농약인트리후미졸이이용되었다. 그결과선발된 A 2MP제제의방제가는 100배희석액처리시 89.0% 로화학농약의 88.8% 수준과유의차가없었고수화제형 CH 67C제제는 92.6% 방제가를보여화학농약의 89.5% 와도유의차가없었다. A 2MP제제와 CH 67C제제의혼합처리는각제제단독처리와큰차이가없어권장되지않았다. 또한, A2-MP와 CH67-C제제를플라스틱하우스내토경재배한토마토에서방제효과를검정한결과, A2-MP와 CH67-C제제의방제가는 100배희석액처리시각각 79.4%, 76.6% 로화학농약의 79.6% 와유의차가없었다. 한편, 항균물질활성과키티나아제활성을동시에가지도록재조합된 A 2.5균주 (A-2/pBex WH 1-4) 를이용하여 A2.5-MP 제제를제조하고잎곰팡이병방제를검정하였다. 그결과 A2-MP 제제와 A2.5-MP제제는각각, 78.4% 와 80.1% 로유의차가인정되지않았다. 비록, 재조합균주에의한제제 A2.5-MP는 A2-MP제제와유의차없이우수하였지만재조합균주에의한방제가의증진은크게없었다. 따라서도입된 chitinase의 in vivo 방제효과는인정되지않았다. 각선발된제형들, A-2MP, CH-67, A-2.5MP 들을토마토잎곰팡이병이자연발병하고있는경상남도김해시토마토재배포장에서 2007년 2월 2일부터 3주동안매1주마다 100 배희석후처리하고화학농약트리후미졸은 3000배희석하여처리하여방제효과를비교검정하였다. 그결과, CH67-C의경우 84.1% 의방제가를 A2-MP제제의경우는 60.0% 의방제가를보였는데, 재조합균주를이용한 A2.5-MP제제의경우 79.1% 의방제가를그리고화학농약트리후미졸처리구는 81.6% 의방제가를보여처리간유의차가없었다. 각제제와화학농약의교호처리의결과화학농약을교호하여살포하는것이제제만을살포하는경우보다방제가가다소우수하게나타났다. A-2 균주의토마토엽권정착력은 Rifampicin 저항성 B. amyloliquefaciens A-2R 균주를이용하여제조한수화제형 A-2RMP 제제를토마토잎에처리한후 7일동안생균수조사를통 - 7 -
해확인한결과 A-2균주의엽권정착력이 5일까지유지되는것으로확인되었다. 처리한 A-2 균주나 CH-67균주의토마토생육촉진효과를플라스탁하우스내포트재배에서성체식물과뿌리의생중량및건중량을측정하여비교하였다. CH-67 균주처리와달리 A-2 균주처리가잎곰팡이병에대한항균활성뿐만아니라, 토마토의생육촉진효과가있음이확인되었다. 일부토양병에대한이들 A-2MP제제와 CH67-C 제제의방제효과가인정되었다. 선발된제형 A-2MP에서방제원인 A-2 균주의생균수는 11개월동안 4 와실온에서보관시생균수가 5% 정도까지감소하였다. CH-67C제제는제조싯점부터균주는사멸되어천연물제형의형태로활성이유지되는것으로나타났다. 각장기간보관한 A2-MP와 CH67-C제제는 4 와실온에서보관시활성이일정기간유지되었음이확인되었다. 제 2 절활용에대한건의 1. 본연구로부터탐색분리된항균물질활성균인 B. amyloliquefaciens A-2 균주는토마토잎곰팡 이병방제용엽면살포제미생물농약의제제화에최초로이용되었으며, 균주및미생물농약제조에 관련된제형화기술은 2005 년 9 월에특허출원되었다. 2. Burkolderia cepacia 균주는그동안유전적으로면역력이약한호흡기질환환자에치명적인인체병원균으로보고되어있어본균주의사용에매우제한적이었다. 그러나본연구에서의 B. cepacia CH-67 균주는항균물질활성및키티나아제활성을동시에지녀국내의다양한작물병원균에광범위한스펙트럼을지닐뿐만아니라, 그활성이매우높아활용도가매우기대된다. 또한본연구실에서개발한제제제형화완성후존재하는생균수조사에서세균은사멸하고활성물질만이남아장기간의보관에도토마토잎곰팡이병에대한방제효과가여전히우수하여미생물제제보다는천연물제제로개발되는것이더경제적면에서더효율적일것이다. 또한, 어독성및동물독성검사를의뢰한결과에서도특별한독성문제가제기되지않아미생물제제로개발되어도무방할것으로판단되었다. 그러나독성에대한안전성문제는매우민감한사안이므로추후에여러차례의토의가이루어질것이다. 3. B. amyloliquefaciens A-2 균주및 B. cepacia CH-67 균주에의해생성되는물질연구는본세균에의한항균화합물의보고가지금까지알려진바가적어신규화합물일가능성이있고, 물질분리후물질특허출원과동시에유기합성및유도체합성을시도하여다양한약제개발및활성에활용될것이다. - 8 -
4. B. cepacia CH-67 가분비할것으로예상되는항균활성물질중고분자량폴리펩타이드는농약 용또는의약용항균제로의개발에이용될것이다. 5. 지금까지보고된연구또는국내외등록된특허와전혀다른 formulation 의구성성분으로미생 물제제가완성되어국내특허에출원되었다. 6. 미생물제제및천연물제제의제형화개발은기술이전에활용될수있다. - 9 -
SUMMARY Title: Development of an Environmentally-Friendly Biopestide with Antifungal Bacteria Producing Chitinase to Control Tomato Leaf Mold Disease Project I. Molecular Breeding of Chitinase Producing Biocontrol Bacteria. 1. Aim The specific aim of Project I was to producebiocontrol bacteria with improvedof biocontrol activity by introducing the chitinase gene. The resultantrecombinant biocontrol strain may effectively control the tomato leaf mold. This study was conducted to generate a chitinase producing recombinant biocontrol strain, which already expresses antifungal activity, but not chitinase activity. 2. Methodology and Results The target biocontrol strain Bacillus amyloliquefaciens A-2 produces antifungal compounds but not chitinase. The control strain to confirm the transformation and expression of chitinase gene in Bacillus sp was B. subtilis 168. The subject chitinase genes were originated from other biocontrol strains B. licheniformis N1 and Cellulosimicrobium cellulans CH-10. Deduced amino acids sequence analysis of clone chitinase gene from N1 strain revealed an 89-96% consistency with those from other B. licheniformis strains. All the conserved domains of chitinases were identified. The chitinase genes from the CH-10 strain were cloned by internal PCR and inverted PCR to isolate full length genes. However, compared to the chitinase activity from culture supernatantof the CH-10 strain, the isolated clone did not exhibited chitinase activity. Thus, the gene was not fit to be transformed into the A-2 strain. In contrast, the N1 chitinase gene was expressed in Escherichia colias a fusion protein and the enzyme - 10 -
showed the expected activity against colloidal chitin and fluorescent substrates. The N1 chitinase was subsequently used for generating chitinase producing recombinant biocontrol strain A-2. The expressed protein in E. coli showed that the enzyme was endo-type chitinase. A recombinant plasmid pbex WH 1-4 was generated by cloning the N1 chitinase gene into pwh1520. The recombinant plasmid was successfully transformed into B. amyloliquefaciens A-2 and B. subtilis 168. The transformation was confirmed by PCR and Southern blot. Expression of the chitinase gene in the transformants was confirmed by RT-PCR and analysis of chitinase activity using fluorescent substrates. The expressed enzyme in Bacillus spp. showed the same endo-type chitinase activity. Finally, the antifungal effect of N1 chitinase expressed in B. subitlis 168 was examined by investigating the spore germination inhibition of Fulvia fulva by the transformant B. subtilis 168/pBex WH 1-4. The chitinase proved to have the activity to inhibit the spore germination of F. fulva. Therefore, biocontrol activity of recombinant B. amyloliquefaciens A-2 strain was investigated by generating effective formulations. Project II. Formulation of Chitinase Producing Biocontrol Bacteria to Control Tomato Leaf Mold 1. Aim The specific aims of Project II wereto select effective biocontrol strains suppressing tomato leaf mold and to generate effective formulations of the selected biocontrol strains. The selected formulations would be applied to generate effective formulations of the recombinant biocontrol strain of B. amyloliquefaciens A-2, producing active chitinase. - 11 -
2. Methodology and Results. The frequency of tomato leaf mold occurrence in Busan between February and March of 2005 was between 28.8% and 16.7%. The causative fungi Fulvia fulva TF-13 was isolated from the diseased plants and identified to be used as the pathogen inoculum to investigate disease control value. The strain TF-13 maintained good virulence on tomato plants and produced the large amounts of conidia as inoculum. The PDB (Potato dextrose broth) was finally selected as the optimum media to prepare fungal inoculum. Antagonistic bacteria against F. fulva were isolated from tomato rhizosphere and phyllosphere and tested for biocontrol activity both in vitro and in vivo. Through electron microscopy, 16S rrna gene analysis and gyra comparison, the antagonistic bacteria A-2, CH-9, CH-10 and CH-67 were identified as Bacillus amyloliquefaciens, Paenibacillus pabuli, Cellulosimicrobium cellulans, and Burkholderia cepacia, respectively. Biocontrol activity of the four candidates wasinvestigated by the antifungal activity in vitro and in vivo again. Finally, A-2 and CH-67 were selected for further studies. In order to identify effective formulations of the two strains, basal medium, carbon source, nitrogen source and carriers for mass cultivation and formulations were selected through small scale flask cultivation and mass cultivation of antagonistic individual bacteria. The mass cultivation medium for A-2 was rice oil, containing 3% rice oil and 0.5% yeast extract in the basal medium (K 2 HPO 4 0.05%, MgSO 4 7H 2 O 0.05%, MnCl 2 4H 2 O, 0.0005%, CaCl 2 2H 2 O 0.0005%, FeSO 4 0.0025%). The mass cultivation medium for CH-67 contained 3% rice oil and 0.5% (NH 4 ) 2 SO 4 in the basal medium (K 2 HPO 4 0.125%, MgSO 4 7H 2 O 0.001%, KH 2 PO 4 0.038%). Various types of wettable powder type formulations and emulsified liquid formulations for both strains were generated by using various carriers. The respective formulations were selected to examine the disease control activity in project III along with the formulation of recombinant biocontrol strain A-2/pBex WH 1-4. - 12 -
Project III. Biocontrol Activity of Formulation Products against Tomato Leaf Mold and Its Field Test 1. Aim The specific aims of Project III include the investigation of biocontrol activity of various formulations against tomato leaf mold using antagonistic bacteria A-2, CH-67, and recombinant A-2 strain in growth chamber rooms, greenhouses and commercial production conditions of tomatoes. This study identifiedeffective formulations to control tomato leaf mold in the field. 2. Methodology and Results Formulations tested in this study include wettable powder type and emulsified liquid type. The A2-A, A2-B, A2-E, A2-F, A2-G, A2-H, A2-I, A2-J, A2-K, A2-L, A2-M, A2-MP, A2-O, CH67-A, CH67-B, CH67-C, CH67-D, CH67-E, CH67-F were wettable powder types and A2-C, A2-D were emulsified liquid type. Chemical fungicide Triflumizole was used as a control. The biocontrol activity of the formulations were investigated both in growth chamber rooms and in greenhouses on tomato plants inoculated with F. fulva. The most effective formulations from A-2 and CH-67 strain were A2-MP and CH67-C, respectively. Disease control value of A2-MP by 100-fold dilution treatment showed 89% which is not significantly different from that of chemical fungicide with 88.8%. Similarly, disease control value of CH67-C with100-fold dilution treatment exhibited 92.6% which is also not significantly different from that of chemical fungicide with 89.5%. The mixed application of A2-MP and CH67-C was not recommended. On the other hand, the recombinant biocontrol strain A-2.5 (A-2/pBex WH 1-4) was subjected to generate formulation A2.5-MP and investigated biocontrol activity. A2-MP and A2.5-MP showed a disease control value of 78.4% and 80.1% at 100-fold dilution, - 13 -
respectively, which are not significantly different from each other. The in vivo biocontrol activity of introduced chitinase in the recombinant strain was not recognized in a growth chamber experiment. In a similar manner to the greenhouse experiments, the biocontrol activity of the formulations A2-MP, CH67-C, A2.5-MP was compared in tomato production conditions in Kimhae from January through March, 2007. Disease control values of 100 fold diluted CH67-C, A2-MP, A2.5-MP and 3,000 fold diluted chemical fungicide exhibited 84.1%, 60%, 79.1%, and 81.6%, respectively. Treatments showed no significant differences in disease control values. Alternative treatment of chemical fungicide with different formulations showed enhanced disease control activity compared to the single treatment of biocontrol formulations. The viability of the A-2 strain, both on tomato leaf surfaces and during storage, maintained for 5 days,and 11 months, respectively. While the plant growth promotion activity was not recognized from CH-67 treatment, the activity was apparent from A-2 treatment by comparing both the fresh weight and dry weight of roots and adult plants. The biocontrol activity of some soil-borne disease was recognized from both formulations. The CH67-C formulations were prepared as natural product-based formulations since the bacteria Burkholderia cepaciach-67 were all lethal during formulation process. In all cases, both A2-MP and CH67-C retained biocontrol activity for a certain time period when they were stored at 4. - 14 -
CONTENTS Chapter 1. Introduction 27 Section 1. Purpose and significance of the research 27 1. Background of the research 27 2. Importance of the research 32 Section 2. Contents and scope of the research 37 1. Final goal of the research 37 2. Contents and scope of the research 38 Chapter 2. Research trend and problems in Korea and foreign country 39 1. Research trend in foreign country 39 2. Research trend in Korea 42 3. Patents of biopesticides in Korea 46 4. Problems of technology 48 5. Future prospect 49 6. Validity of technology transfer 50 Chapter 3. Research contents and results 51 <Project I> Molecular Breeding of Chitinase Producing Biocontrol Bacteria. Section 1. Introduction 51 Section 2. Isolation of chitinase gene from chitinase producing bacteria 1. Material and methods 53 2. Results 55 가. Zymogram of Cellulosimicrobium cellulans CH-10 55 나. Cloning of chitinase gene 56 1) Cloning of chitinase gene from Bacillus licheniformis N1 56 2) Cloning of chitinase gene from Bacillus licheniformis CH-1 58-15 -
3) Cloning of chitinase gene from C. celluans CH-10 60 Section 3. Cloning, expression and activity assay of chitinase genes 65 1. Material and methods 65 2. Results 66 가. Expression of chitinase gene from N1 and CH-1 in pet system 66 1) Expression chitinase gene from B. licheniformis N1 in pet system 2) Expression chitinase gene from C. cellulans CH-10 in pet system 나. Chitinase assay using Fluorogenic N-acetylglucosamine substrates 70 1) Enzyme activity of N1 chitinase 70 2) Enzyme activity of CH-10 chitinase 71 Section 4. Construction of expression vector system in Bacillus sp. 73 1. Material and methods 73 2. Results 74 가. Cloning to expression vector pwh1520 74 나. Transformation of recombinant plasmid into Bacillus sp. 75 다. Expression analysis of chitinase gene by RT-PCR 76 라. Chtinase activity from recombinant Bacillus strains 168 and A-2 77 Section 5. Inhibition of spore germination by chitinase from transformants 79 1. Material and methods 79 2. Results 79 <Project II> Formulation of Chitinase Producing Biocontrol Bacteria to Control Tomato Leaf Mold Section 1. Introduction 81 Section 2. Isolation and identification of microorganism 82 1. Material and methods 82 2. Results 89 가. Isolation, identification of tomato leaf mold pathogen 89-16 -
1) Symptoms of tomato leaf mold and its occurrence 89 2) Fungal pathogen and conidia production 91 3) Pathogenicity analysis 93 나. Isolation and characterization of antagonistic bacteria 95 1) Isolation of antagonistic bacteria 95 ( 가 ) Primary selection 95 ( 나 ) Disease control effect by antagonistic bacteria 96 ( 다 ) Antifungal activity by antagonist A-2 strain 97 2) Identification of antagonist A-2 strain 98 다. Isolation and identification of chitinase active strains 102 1) Isolation of chitinase active strain CH-9 and CH-10 102 2) Isolation of CH-67 103 3) Identification of chitinase active strain 104 ( 가 ) Strain CH-9 104 ( 나 ) Strain CH-10 105 ( 다 ) Strain CH-67 108 라. Growth inhibition effects of pathogen by antifungal and chitinase active strain 110 1) flask cultivation 110 2) Suppression of pathgen mycelia 110 3) Growth inhibition effects by A-2 and CH-10 strain 112 마. Control effects of antifungal and chitinase active strain at pot assay 114 1) Single and/or mixture treatment of A-2, CH-9, CH-10 strain 114 2) Single treatment of CH-67 strain 114 Section 3. Mass cultivation to develope biopesticides 117 1. Material and methods 117 2. Results 119 가. Optimal culture conditions of B. amyloliquefaciens A-2 strain 119 1) Cultural characteristics of A-2 strain 119-17 -
( 가 ) Flask cultivation 119 (1) Culture time, Temperature, Initial ph 120 (2) Carbon sources 122 (3) Nitrogen sources 123 ( 나 ) 7L Jar fermentation 124 나. Optimal culture conditions of C. celluans CH-10 strain 124 1) Culture time, Temperature, Initial ph 124 2) Carbon sources 126 다. Optimal culture conditions of B. cepacia CH 67 128 1) Flask cultivation 128 ( 가 ) Carbon sources 128 ( 나 ) Nitrogen sources 129 2) 7L Jar fermentation 130 Section 4. Development of biopesticide for tomato leaf mold 133 1. Material and methods 133 2. Results 135 가. Formulation of A-2 strain 135 1) Selection of carriers 135 2) Formulations 135 ( 가 ) wettable powder formulation A2-A~A2-L 135 ( 나 ) wettable powder formulation A2-M, A2-MP, A2-O 135 나. Formulation of CH-10 strain 136 다. Formulation of CH-67 strain 137 1) wettable powder formulation CH67-A, CH67-B, CH67-C 137 2) wettable powder formulation CH67-D, CH67-F 137 <Project III> : Control effects of developed biofungicides and Field applications Section 1. Introduction 139 Section 2. Control effects of biopesticides and selection of suitable formulation at pot assay 141-18 -
1. Material and methods 141 2. Results 145 가. Control effects of biopesticides of A-2 strain 145 1) Wettable powder formulations A2-A, A2-B, A2-E, A2-F and soluable concentrate A2-C, A2-D 145 2) Wettable powder formulations A2-G~A2-L 146 3) Wettable powder formulations A2-H, A2-M 150 4) Wettable powder formulations A2-MP, A2-O 152 5) Control effects of Selected formulation A2-MP 154 나. Control effects of biopesticides of CH-10 strain 156 1) Wettable powder formulations CH-10G 156 다. Control effects of biopesticide of CH-67 strain 158 1) Control effects of flask culture of CH-67 strain 158 2) Control effects of fermenter culture of CH-67 strain 158 3) Pot assay 158 ( 가 ) Wettable powder formulations CH67-A, CH67-B, CH67-C 159 ( 나 ) Wettable powder formulations CH67-D, CH67-F 161 4) Control effects of CH-67C formulations according to different spraying concentration 164 라. Synergy effects of antifungal active formulation (A2-MP) and chitinase active formualtion CH67-C 165 마. Control effects of formulation of recombinant A 2.5 strain 167 Section 3. Application of selected biofungicides in plastic house 170 1. Material and methods 170 2. Results 170 가. Tomato leaf mold 170 Section 4. Application of selected biofungicides in a field experiment 173 1. Material and methods 173 2. Results 174-19 -
가. Control effects of biopescides by spraying times 174 나. Control effects of biopescides by crossed or mixed treatments 177 Section 5. Survival ability and stability of developed biofungisides 180 1. Material and methods 180 2. Results 182 가. Assessment of survival cells of A-2 formulation 182 나. Plant growth promoting effects by biofungicides 182 다. Application to the soil disease 184 라. Storage stability 187 마. Control effects of biopescides after long-term storage 187 Chapter 4. Accomplishment and contribution to the related field 189 Section 1. Achievement of research goal 189 Section 2. Contribution to the related field and expected impacts 191 Chapter 5. Future Application of the research 193 Chapter 6. Overseas scientific information 196 Chapter 7. References 204-20 -
목 차 제 1 장연구개발과제의개요 27 제 1 절연구개발의목적과필요성 27 1. 연구의배경 27 2. 연구개발의필요성 32 제 2 절연구개발내용및범위 37 1. 최종연구목표 37 2. 연구개발의내용및범위 38 제 2 장국내외기술개발현황 39 제 1 절국내외관련기술의현황과문제점 39 1. 외국에서의개발현황 39 2. 국내에서의개발현황 42 3. 국내의특허관련동향 46 4. 관련기술문제점 48 5. 앞으로의전망 49 6. 기술도입의타당성 50 제 3 장연구개발수행내용및결과 51 < 제 1 연구목표 > 고항균활성키티나아제활성균주의유전학적육종 제 1 절서론 51 제 2 절다양한 Chitinase 활성균주에서 chitinase 유전자분리 1. 연구수행방법 53 2. 연구결과 55 가. Cellulosimicrobium cellulans CH-10 chitinase의활성 zymogram 55 나. Chitinase 유전자 cloning 56 1) Bacillus licheniformis N1으로부터의 chitinase gene의 cloning 56 2) Bacillus licheniformis CH-1으로부터 chitinase gene의 cloning - 21 -
3) Cellulosimicrobium celluans CH-10 으로부터 chitinase gene 의 cloning 제 3 절 Chitinase 유전자의 cloning, expression 및활성검정 1. 연구수행방법 65 2. 연구결과 66 가. N1 및 CH-10 chitinase의 pet system에서의발현 66 1) B. licheniformis N1 chitinase의 pet system에서의발현 66 2) C. cellulans CH-10 유래의 chitinase 유전자의 pet-42a(+) system에서의발현 68 나. Fluorogenic N-acetylglucosamine을이용한 chitinase 기질특이성조사 70 1) N1 chitinase의기질특이성조사 70 2) CH-10 chitinase의기질특이성조사 71 제 4 절 Bacillus sp. 에서의발현용 Vector system 구축 73 1. 연구수행방법 73 2. 연구결과 74 가. Bacillus sp. 에서발현용 vector cloning 74 나. Bacillus sp. 의형질전환 75 다. RT-PCR 을이용한발현확인 76 라. Bacillus strain (168, A-2) 에서의 N1 chitinase assay 77 제 5 절형질전환균주 (Bacillus subtilis 168) 의길항능조사 79 1. 연구수행방법 79 2. 연구결과 79 < 제 2 연구목표 > 고항균활성키티나아제활성균주를이용한미생물제제제조기술확립 제 1 절서론 81 제 2 절유용미생물의탐색및동정 82 1. 연구수행방법 82 2. 연구결과 89-22 -
가. 토마토잎곰팡이병발생과분리, 동정및병원성검정 89 1) 토마토잎곰팡이병의발병율및병징조사 89 2) 공시병원균및포자부유액선발 91 3) 병원성검정 93 나. 항균물질활성균주선발및동정 95 1) 우수항균물질활성균분리 95 가 ) 항균물질활성균의 1차선발 95 나 ) 생육실내방제효과검정및최종선발 96 다 ) 항균물질활성균 A-2 균주의항균물질에의한포자발아억제 97 2) 우수항균물질활성균 A-2균주의동정 98 다. 키티나아제활성균주의분리및동정 102 1) 키티나아제활성균주 CH-9 와 CH-10의분리 102 2) 키티나아제활성균주 CH-67의분리 103 3) 키티나아제활성균주의동정 104 가 ) CH-9 균주 104 나 ) CH-10 균주 105 다 ) CH-67 균주 108 라. 선발항균물질활성및키티나아제활성균주에의한병원균생육억제효과검정 1) 플라스크내검정 110 2) 현미경내균사억제능관찰 110 3) A-2 균주와 CH-10균주의동시배양에의한병원균의생육억제효과 112 마. 생육실내포트상에서의방제효과 114 1) A-2 CH-9, CH-10 균주의단독및혼합처리에의한방제효과 114 2) CH-67 균주단독처리에의한방제효과 114 제 3 절항균물질활성세균의대량배양기술확립 117 1. 연구수행방법 117 2. 연구결과 119 가. B. amyloliquefaciens A-2 균주의최적배양조건확립 119 1) 항균물질활성균 A-2 균주배양적특성조사 119 가 ) 삼각플라스크배양 119-23 -
(1) 배양시간, 생육온도및초기 ph의영향 120 (2) 탄소원 122 (3) 질소원 123 나 ) 발효기 (Jar fermenter) 에서의배양 124 나. 키티나아제활성균주 CH-10의대량배양용배지선발 124 1) 생육온도, 초기 ph 조건 124 2) 탄소원 126 다. B. cepacia CH 67 균주의최적배양조건확립 128 1) 삼각플라스크배양 128 가 ) 탄소원 128 나 ) 질소원 129 2) 발효기배양 130 제 4 절잎곰팡이병방제용엽면살포제미생물농약제조기술확립 133 1. 연구수행방법 133 2. 연구결과 135 가. A-2 균주를이용한수화제형및액상수화제형의제형화 135 1) 전달매체선발 135 2) 제형화 135 가 ) A2-A~A2-L 수화제형 135 나 ) A2-M, A2-MP, A2-O 수화제형 136 나. CH-10 균주를이용한수화제형미생물농약의제형화 136 다. CH-67 균주를이용한수화제형미생물농약의제형화 137 1) CH67-A, CH67-B, CH67-C 수화제형 137 2) CH67-D, CH67-F 수화제형 137 < 제 3 연구목표 > : 개발미생물제제의방제효과검정및포장적용시험 제 1 절서론 139 제 2 절개발미생물제제의방제효과검정및우수제형선발 141 1. 연구수행방법 141-24 -
2. 연구결과 145 가. 항균물질활성균 B. amyloliquefaciens A-2균주를이용한미생물제제의생육실포트에서의방제효과 145 1) 1차제제 ( 수화제형 A2-A, A2-B, A2-E, A2-F / 액상수화제형 A2-C, A2-D) 145 2) 2차제제 ( 수화제형 A2-G~A2-L) 146 3) 3차제제 ( 수화제형 A2-H, A2-M) 150 4) 4차제제 ( 수화제형 A2-MP, A2-O) 152 5) 최종선발된미생물제제 A2-MP제제의희석배수별방제효과검정 154 나. 키티나아제활성균주 CH-10를이용한방제효과검정 156 1) CH-10균주를이용한미생물제제 158 다. 키티나아제활성균주 CH-67의최종선발과방제효과검정 158 1) CH-67 균주배양액의방제효과검정 158 2) CH-67 균주의발효기배양액의방제효과검정 159 3) CH-67 균주를이용한엽면살포제의생육실내포트검정 159 가 ) 1차제제 (CH67-A, CH67-B, CH67-C) 161 나 ) 2차제제 (CH67-D, CH67-F) 161 4) 최종선발된 CH67-C제제의희석배수별방제효과 164 라. 항균물질활성제제 (A2-MP) 와키티나아제활성제제 (CH67-C) 의혼합방제효과검정 165 마. 재조합 A 2.5 균주를이용한미생물제제의방제효과 167 제 3 절플라스틱하우스내토경재배에서의방제효과검정 170 1. 연구수행방법 170 2. 연구결과 170 가. 개발미생물농약의포장에서의방제효과검정 170 제 4 절미생물농약의자연발생농가실증시험 173 1. 연구수행방법 173 2. 연구결과 174 가. 개발미생물제제의처리횟수별방제효과 174-25 -
나. 개발미생물제제의혼합및교호처리에의한방제효과 177 제 5 절선발미생물농약의작물에서의엽권정착력및저장안정성검정 180 1. 연구수행방법 180 2. 연구결과 182 가. 플라스틱하우스내포트재배한토마토에서의 A-2제제의엽권정착력검정 182 나. 개발미생물제제의작물에서생육촉진효과검정 182 다. 타작물의토양병에대한방제력검정 184 라. 개발미생물제제의저장안정성검정 187 마. 개발미생물제제의장기간보관후방제효과검정 187 제 4 장목표달성도및관련분야에의기여도 189 제 1 절연구개발목표의달성도 189 제 2 절관련분야의기술발전에의기여도및기대효과 191 제 5 장연구개발결과의활용계획 193 제 6 장해외과학기술정보 196 제 7 장참고문헌 204-26 -
제 1 장 연구개발과제의개요 제 1 절연구개발의목적과필요성 1. 연구의배경 가. 토마토잎곰팡이병연구 토마토잎곰팡이병 (Leaf mold) 을일으키는병원균은 Fulvia fulva이며, 균사덩이의형태로종자의표면에부착또는기생하여월동하며온실내에서는병든잎에서포자덩이, 균사및분생포자의형태로생존하며수시로기공을통해서침입한다. 이외에도가지에발생하는잎곰팡이병균 Mycovellosiella nattrassii Deight가알려져있다. 병징은잎의표면에담황색의윤곽이희미한무늬가생기며잎맥에싸이고그뒷면에는회갈색곰 팡이의분생포자가생긴다. 열매에는꼭지를둘러싸는검은무늬가생기며단단해지고약간움푹해진 다. 발생환경은노지에서도발생하나시설재배에서상대습도 80% 이상다습시환기가나쁘고온도가 22 정도일때심하게발병하며, 10~15 에서는현저히발병이억제된다. 조밀하게심어통풍이나쁘면포기내의습도가높아져발생이심화된다. 생육후기에비료기가떨어져식물이쇠약할때발생이많다. 주로공기전염을하며병원균은온실, 하우스의각종자재, 피해를받은잎및종자에붙어있는균사로겨울을지낸다. 병반이형성된후에는병반위에많은분생포자가생기고이것이비, 바람에의해서날려퍼지게된다. 분생포자는저녁부터이튿날아침에걸쳐엽면에생긴이슬에의하여쉽게발아하여기공으로침입하므로잎뒷면이감염되기쉽다. 잎곰팡이병의발생은온도와습도에크게영향받는다. 즉기온은 20~25 에서발병되거나퍼지기쉽고 10~15 에서는거의퍼지지않는다. 습도는 90% 이상의다습조건에서발생되기쉽다. 노지재배에서는비가많은 6~7월에발생하고밤낮의온도교차가크고비오는날이많은지역에서발생하기쉽다. - 27 -
하우스재배에서는봄에비가많이오고환기가곤란할때많이발생한다. 또관수량이많다든지 흙이지나치게습한하우스에서많이발생하고비료가부족하여초세가약한것이나밀식해서지나치 게무성한경우에도많이발생한다. 경종적방제방법은우선종자소독과온실의환기및배수에유의하고, 저항성품종을재배하며, 충 분한시비로서영양부족현상이나타나지않도록하며병든식물체는발견즉시제거하고수확후병 든식물체가남지않도록해야한다. 화학적방제방법으로는토마토잎곰팡이병등록약제인가벤다 가스신수화제 ( 고추탄 ), 리프졸훈연제 ( 트리후민 ), 사프롤유제지오판수화제 ( 톱신엠 ), 지오판 유황액상수화제 ( 아싸 ), 이프로 치람수화제 ( 로브티 ), 지오판 리프졸수화제 ( 굳타임 ) 등이있다. 하지만최근화학농약에의한방제효과가매우낮아져새로운약제개발이시급한실정이다. 나. 키티나아제의병방제기작연구 Chitin 은 N-acetyl-D-glucosamine 이 β-1,4 결합으로중합된고분자물질로서게, 새우등 의갑각류및연체류의껍질과근육, 곤충류, 버섯류의표피성분으로알려져있으며특히, 식물병 원성진균의세포벽을이루는주성분이다. 생물학적방제기작중의하나인키티나아제 (EC 3.2.1.14) 는 chitin 의 β-1,4-glucosidic 결합을가수분해하는효소이며, 작용기작에따라 β-1,4-glucosidic 결합을무작위로절단하는 endo 형과 chitin 사슬의비환원성말단으로부터절단하는 exo 형키티나아제등이있으며, 키티나 아제분리및정제그리고특성에대한연구는많이보고되어있다. 최근곰팡이, 세균, 식물체에서의역할이규명되어지면서이들사이의생태적상호관계에키티나아제가중요하게관여하고있는데관심을가지게되었고, 키티나아제에의한식물병원성진균이함유한 chitin성분의효소적분해는작물의병해를막는생물학적방제에효과적인방법으로알려져있다 (Chet, I 등, 1990; Harman, G 등, 1989; Ordentlich, A 등, 1987, 1988; Sitrit, Y 등, 1995; Sneh, B 등, 1981, Tweddell, R 등, 1994). 키티나아제 gene 을이용한생물학적방제연구 - 28 -
- Kobayashi, D. Y. 등 (2001) Stenotrophomonas maltophilia strain 34S1의키티나아제 gene의특성과생물학적방제. - Lutz, Matthias P. 등 (2001) 생물학적방제제로이용된 Trichoderma atroviride P1내에서의키티나아제 gene의발현 다. 키티나아제 gene 연구의해외도입기술정보 1999 년의연구에따르면, 키티나아제 gene 의 cloning 은 gene regulation 과 catalytic activity 와직접적인관련이있으며, 키티나아제 gene 은 inducer 로서의 chitin 과 repressor/inducer system 에의해통제되어진다고보고되고있다. 2000 년이후의연구경향에따르면, 농업적, 미생물산업적, 환경적인면에서의키티나아제연 구의중요성은 gene expression 의발전을이루게하며, 효소의대량활성을위해서키티나아제 gene 의 regulation 과 cloning 을이해하는데많은업적들이기대된다. - 29 -
미생물로부터의키티나아제 gene 의 Cloning 과 sequence 에관한연구 균주명키티나아제유전자저자 Serratia liquefaciens. chib Woytowich, A. 등 Bacillus circulans WL-12 키티나아제 A1 Tanaka, H Aeromonas hydrophila JP101 Chi92 Mei Li Wu Pseudomonas sp. YHS-A2. 키티나아제 Lee, H. S.; Bacillus cereus exo 키티나아제 Chi36 Shu-Yi Wang Bacillus sp. BG-11 thermostable 키티나아제 Bhushan, B. Vibrio alginolyticus H-8. 키티나아제 genes Ohishi, K. Streptomyces thermoviolaceus OPC-520 thermostable 키티나아제 Tsujibo, H. Chlorella virus PBCV-1 2 키티나아제 genes 1 chitosanase gene Liangwu Sun proteobacteria 키티나아제 genes Cottrell, M. T Serratia marcescens 2170 chic Suzuki, K marine microorganism 키티나아제s Cottrell, M. T Aeromonas sp. No. 10S-24. pca8 ORF Ueda, M. Xanthomonas sp. AK ChiA Sakka, K Bacillus licheniformis TP-1 키티나아제 gene Srisurang, T. Candida albicans CHT1 McCreath, K. J Bacillus circulans WL-12 chic Mustafa Alam Aeromonas caviae chia gene Sitrit, Y. Rhizopus oligosporus two 키티나아제 s Yanai, K. Streptomyces lividans 66 키티나아제 genes Miyashita, K. Vibrio alginolyticus H-8 키티나아제 gene Ohishi, Kazuo 라. 키티나아제유전자의발현시스템기술개발생물공학분야에서유용유전자를클로닝하는이유중의하나는특정미생물에서유용유전자를과잉발현하여유용단백질및효소를대량활성하는데있다. 이를위해선다양한유전자조작을통해전사, 번역, 분비, 단백질의안정성등을증진시키고자발현벡터의개발은매우중요하다. 선진각국에서는다양한미생물을이용하여재조합단백질을저렴한비용으로대량활성하기위한연구가경쟁적으로진행되고있으며, 유용효소의산업화를위한다양한숙주및발현계의개발을특허화하고많은기술을독점보고하고있는실정이다. 국내에서도유전자발현기술역시진행되고는있으나외국의기슬을모방하거나전수받고있는실정이므로유전자재조합발현기술은날로그중요성이증대되고있다. - 30 -
( 국외의연구동향 ) Harris 등 (1993) 은 Serratia marcescens 의키티나아제유전자를 35S constitutive promoter 에구축하여 T. harzianum 에도입발현하였다. Zeilinger 등 (In submit) 은 T. harzianum 의키티나아제유전자로부터외래유전자를발현할수 있는 promoter 를개발하였다. Sitrit 등 (1995) 은알팔파뿌리혹세균인 Rhizobium melioti 에도입발현시켜 Rhizoctonia solani 를억제하는형질전환균주를얻었다. 키티나아제유전자의미생물내에서의발현연구 균주명숙주명키티나아제유전자저자 Aeromonas sp. No. 10S-24 E. coli pca 8 ORF Sutrisno, A. Saccharomyces cerevisiae Aspergillus awamori. endo 키티나아제 Murphy, R. A. Streptomyces olivaceoviridis ATCC 11238 Heterologous expression chi92 Haiming Li - Bacillus thuringiensis. 키티나아제 gene Lertcana. M. Xanthomonas sp. E. coli 키티나아제 gene Hwang C. W. Janthinobacterium lividum Saccharomyces cerevisiae 키티나아제 gene Molloy, C Enterobacter agglomerans E. coli Chernin, L. S Aeromonas sp. No. 10S-24 E. coli 키티나아제 III gene Ueda, M Trichoderma harzianum Trichoderma reesei endo키티나아제 Margolles-Clark Streptomyces thermoviolaceus OPC-520 E. coli 키티나아제 gene Tsujibo, H Alteromonas sp. strain 0-7. E. coli 키티나아제 gene Tsujibo, H Streptomyces plicatus E. coli 키티나아제 gene Robbins, P. W. Aeromonas hydrophila E. coli 키티나아제 gene Chen, J. P Bacillus thuringiensis E. coli chia74 Barboza-Corona, J. Eleazar - 31 -
( 국내의연구동향 ) 김상달 (1997, 1998, 연구보고서 ) 은 Xanthomonas malthophilia 의키티나아제유전자를 siderophore 활성성균주인 P. fluorescens GL20 에 broad-host range plasmid 를대상으로도입 발현하여식물근부균 Fusarium oxysporium 을억제하였다. 강선철등 (1998, 연구보고서 ) 등은곤충기생성병원균인 Metarhizium anisopliae 와 Beauveria brassiana 로부터살충성활성을나타내는키티나아제와 protease 를분리하여살충성곰팡이내에 서도입발현하였다. 정영륜 (2002, 연구보고서 ) 은 T. harzianum 과 Pseudomonas putida 에키티나아제유전자를도 입발현하였다. 그러나, 유전적으로안정하지못하여실용화연구는고려되지않았다. 국내의키티나아제유전자를이용한대부분의국내연구보고서에의하면분리한키티나아제유전자를유용세균이나사상균에성공적으로형질전환하여고효율로발현되는발현효과만을확인하였을뿐, 이들의상업화를위한대량배양기술및제형화기술개발에관한연구결과는국내에서는전무하다. 2. 연구개발의필요성 가. 기술적측면 토마토는현재가공용에서생식용에이르기까지다양한종류가개발되어세계에서가장많 이재배되고있는채소류로성장하였고우리나라에서는주로생식용으로재배되고있으나최근에 는당도가높고먹기에편한방울토마토의수요증가와채소류수출의급격한증대로재배면적이 크게늘어나고있는추세이다. 토마토는주요과채류와비교했을때단가는약간낮은편이지만 단경기나홍수출하기에관계없이연중가격이안정되어있으며, 농가표준소득또한노지재배에서는고추, 오이에비해높고, 시설재배에서는고추보다는낮지만오이와는비슷한것으로나타났다. 이를미루어보아토마토는단수증대와품질향상기술만갖출수있다면안정소득작목으로손꼽힐수있을것같다. - 32 -
미국등선진국에서최근에발표한연구결과에의하면토마토의리코핀색소가세포의산화를방지하여항암효과를나타낸다고하였는데, 이결과에의하면금후토마토소비가늘어날것으로기대된다. 토마토의품종은숙기와과형에따라최근에각광을받고있는완숙형을비롯하여미숙형, 송이토마토, 방울토마토, 등 4가지로대별할수있는데판매처와소비자의기호를고려하여선택하면된다. 토마토는생육기간동안착과의안전성측면에서두가지유형의품종군으로분류되는데, 하나는유한생장군으로 4~6단이상에서착과가불안정하여재배기간도 6개월이하인단기재배성품종들로기존에국내에서재배되고있는토마토품종은대부분유한생장군에속한다. 또다른하나는무한생장군으로 6개월이상재배가가능하며연간 35~40단수확할수있는장기재배형품종군이고유럽이나중동, 미주지역에서재배되는토마토품종은대부분이품종군에속한다. 토마토에발생하는병해는수십여종이알려져있으나, 우리나라의시설, 노지재배에서중요한병해는잿빛곰팡이병, 잎곰팡이병, 겹둥근무늬병, 점무늬병, 시들음병, 역병, 풋마름병, 배꼽썩음병, 모자이크병등이며이외에흰가루병, 균핵병, 궤양병, 반점세균병은지역이나해에따라국부적으로발생하여간혹피해를가져온다. 이중 Botrytis cinerea에의한잿빛곰팡이병과 Fulvia fulva에의한잎곰팡이병이가장중요하고다음으로는앞서언급한역병과 Alternaria spp. 균에의한겹무늬병, Stemphilium spp. 균에의한점무늬병이흔히발생한다. Leveillula spp. 에의한흰가루병과 Sclerotinia spp. 에의한균핵병은지역적으로간혹발생하여피해를주고있다. 잎곰팡이병의방제는주로화학농약에의존하여왔지만이는환경오염에의한생태계파괴및인축에대한독성그리고약제저항성균주의출현으로전세계적으로심각한문제점들이대두되고있다. 이를위해최근에는길항미생물에의한생물학적방제에관한연구결과들이보고되어지면서실용화연구에의해제품들이시판되고있으나그들의방제효과의변이와토양내의길항균밀도불유지등으로인해실용화측면에서는다소부정적이다. 이를극복하고자여러가지병발생기작중식물병원균의세포벽구성성분인 chitin을분해하는식물병억제효소, 즉키티나아제를이용한생물학적방제연구가진행되면서최근에는유전공학적으로키티나아제를분비하는미생물의병억제능력을증가시키고자노력하고있다. 특히, 항생물질을활성하는균주들보다병원균에대한억제능력이낮은 chitin 분해미생물의병억제능력 - 33 -
을증가시키기위해항생물질활성능력이높은균주를선발하고여기에키티나아제유전자를도입, 발현시켜키티나아제분비와항생물질에의한병억제력을동시에지닌다기능성균주로형질전환하여지금까지알려진균주들보다병방제능력이뛰어난균주로개발하는것이미생물제제개발에있어서가장필요한기술분야로대두되고있다. 그러나, 국외뿐만아니라국내의실험실내실험에서는키티나아제분해능이증가되었음을확인하였으나, 이를이용하여미생물농약으로개발한예는외국의사례 ( 살충제개발 ) 를제외하고는전무하며, 국내역시실제로미생물농약을개발하여실제포장에서그방제능력을확인하여실용화한예는현재까지보고된바가없다. 나. 경제산업적측면 세계적으로더욱높아지는자국의환경생태계보호열기에따라기존화학농약의피해사례가주목받고있고, 이로인한토양, 수질오염, 인축에대한독성및환경호르몬피해, 저항성해충출현, 유용천적감소등이보고되고있다. 지구환경생태계와인류건강에대한심각한수준의위협을주는이러한문제점을최소화하기위해선진국을중심으로환경친화적생물농약의필요성을중요하게인식하고관련기술및제품개발에많은노력을기울이고있다. 현재전세계적으로 2백여종의생물농약이연구되고있는것으로알려져있으며약 60여종 ( 병해충방제용 17종. 해충방제용 37종. 선충방제용 2종, 잡초방제용 8종 ) 의생물농약관련상품이실용화되어있다 ( 농약정보 99년 7.8호 ). UNCED는 99년까지화학농약사용량의 25% 를줄이거나대체하도록각국에권고하고있으며, 우리나라도 2004년까지현재사용되고있는화학농약의 50% 를대체하거나줄이겠다는추진계획을수립, 발표하였다 (97. 농림부 ). 최근 ( 주 ) 경농등기존대기업들이생물농약개발에참여하였고, 생물농약전문벤처기업의창업움직임도활발히진행되고있는등관련연구개발의움직임이활발하며그필요성이해를거듭할수록절실히요구되고있는실정이다. 현재전세계생물농약의시장규모는약 8,000억원정도이며, 미생물농약은약 2,000 억원정도이다. 약 20조원의전체농약시장에서생물농약이차지하는비중은아직미약하지만, 전체농약시장성장률에비해생물농약은중요성이급속히증대되어연 20% 이상의성장을하고있으며, 2000년대초까지약 5,000억원의시장형성이예측된다. 미국시장조사에의하면 2000 년현재생물농약의판매는 5 억불에서 11 억불로농약전체의 - 34 -
11% 를차지하고있으며전세계적으로는 70억불정도로예상하고있다. 국내시장역시매년증가추세에있으므로본연구의다기능성균주는새로운미생물농약으로개발될수있고, chitin 유전자들은병저항성품종육종에이용될수도있으며, 시설재배작물의토양전염성병방제를위한토양첨가제로도활용될수있을것이다. 현재우리나라에서는 ( 주 ) 케아이비씨에서활성하고있는약제중항곰팡이미생물제제인 프라미쓰, 바이오콘트롤, 마이코싸이드는모두잿빛곰팡이병과흰가루병을방제하는미생물농약이 며현재개발된잎곰팡이용미생물농약은등록된바가없다. 다. 사회문화적측면 선진국에서는생물농약의보급확대를위하여미생물농약의저독성인정등록기간단축및비용감면, 등록우선권부여등의국가차원의지원정책을시행하고있다. 미국은생물농약의개발및관리면에서는선진화가이루어졌으며미국의생물농약의관리체계는 OECD국가및타국가의모델이되고있다. 세계적인화학및농약회사인미국몬산토사의화학분야포기및생물분야집중선언, 듀폰사의미생물살충제시장진출전략강화등의움직임과함께우리나라기업및정부도환경생태계보호를위한관련부처의국가행동계획수립에이와같은상황에대처하기위한적극적인노력을시도하고있다. 일본은미국의생물농약의관리체계를근간으로하여 1997년에 미생물농약가이드라인 을제정하여화학농약과는별도로관리하고있으며그범주에는바이러스, 세균, 진균원생동물및선충이포함이되며천적항생물질유전자조작미생물은제외하고있다. 국내의경우, 관련연구자들을중심으로일부 BT. 등일부곤충병원미생물을이용한미생물살충제개발시도노력이수년전부터계속되어오고있으나, 우수균주의확보부족, 미생물농약시장규모의협소, 관련전문가의부족, 관련업계의개발의지부족, 정부및민간의인식부족등의이유로말미암아효과적인방제기술및관련제품개발에성공하지못한실정이다. 그러나, 미생물농약의등록시험방법및등록신청서류검토기준 이고시됨에따라미생물농약개발연구가한층활성화되고가속화될것으로전망하고있다. 현재까지몇몇길항미생물에의해개발된생물농약이시판되고있지만화학농약보다방제효 과가낮고, 대상병원균의범위가좁으며, 방제효과에대한확신과농민들에의한불신으로많이이 용되지못하고있는실정이다. 이를극복하기위해서병원균의억제효과가더우수하고대상병원 - 35 -
균의범위가넓은유용미생물의확보와첨단유전공학기술에의한활성물질또는효소활성증대 및대량활성기술개발과최종적으로포장응용기술개발에주력하여야한다. 이는국내토양과우리고유의작물보호에적합한무공해생물방제법을확립할수있으며, 유기화학농약의사용을최소화할수있고, 국내농산물의질적수준과안전성을높여환경보존과농 산물시장개방압력에도움이될것이다. - 36 -
제 2 절연구개발내용및범위 1. 최종연구목표 항균활성이뛰어난길항세균인 Bacillus amyloliquefaciens A-2 균주및항균활성과키티나아제활성을동시에지녀탁월한방제균으로확인된 Burkholderia cepacia CH-67균주를이용하여잎곰팡이병방제용 (Fulvia fulva) 엽면살포제를개발하고자하였다. 또한 B. licheniformis N1 균주및다양한균주로부터식물병원성진균의세포벽가수분해에관여하는키티나아제유전자의유전정보를획득하여그람양성균인 Bacillus amyloliquefaciens A-2 균주에도입함으로서유전학적육종을통해고효율키티나아제및고항균물질활성균주로개발하고이를새로운미생물농약개발에이용하므로서환경친화적인생물학적방제법을개발하고자하였다. - 37 -
2. 연구개발의내용및범위 제 1 세부과제 : 고항균활성키티나아제활성균주의유전학적육종 다양한미생물로부터의키티나아제유전자정보확보 키티나아제유전자의분리및 cloning 키티나아제유전자의항균물질생산미생물로의도입및발현 고항균활성키티나아제활성재조합미생물최종선발 키티나아제의분리, 정제및특성조사 선발재조합균주의키티나아제분비능, 활성능부가에의한길항력증강조사 작물생육도 ( 작물생육촉진 ) 조사 타작물의잎곰팡이병에대한방제력검정 제 2 세부과제 ; 고항균활성키티나아제활성균주를이용한미생물제제제조기술확립 키티나아제활성균주및항균활성미생물의지속적인분리 선발미생물의배양적생화학적특성검정과동정 키티나아제생산미생물의키티나아제활성검정 항균물질생산미생물의항균활성검정 고항균활성키티나아제활성모균주와재조합균주의대량활성을위한최적조건확립 고항균활성키티나아제활성모균주와재조합균주의대량배양기술개발 미생물제제개발을위한 Additives 선발 미생물제제의제조기술확립및제형화 미생물제제의최적화실험및우수제형선발 미생물제제의경시적유효도및안정성조사 미생물제제의타작물에대한약해시험조사 제 3 세부과제 ; 개발미생물제제의방제효과검정및포장적용시험 선발고항균활성키티나아제활성모균주와재조합균주의생육실내폿트상에서의잎곰팡이병방제효과검정 선발고항균활성키티나아제활성모균주와재조합균주의온실내의폿트및토경재배에서의잎곰팡이병방제효과검정 미생물제제의생육실내폿트상에서의잎곰팡이병방제효과검정 미생물제제의온실내의폿트및토경재배에서의잎곰팡이병방제효과검정 미생물제제의포장에서의방제효과실증시험 미생물제제의실제자연병발생농가하우스에서의방제효과실증시험 - 38 -
제 2 장 국내외기술개발현황 제 1 절국내외관련기술의현황과문제점 1. 외국에서의개발현황 가. 미생물자체를이용한생물농약 각종식물병원균에대해그들의증식을억제시키거나, 기생하거나, 항생작용및포식작용을나타내는미생물을이용하여병방제에활용하는생물학적방제법이나이들미생물을농약화시킨미생물농약은현재실용화된것이 16종, 실용화로추진중인것이 29종이알려져있으며실제로는그이상의건들이추진되고있다. 2005년현재미생물농약으로등록된유용미생물로서살균성세균은 10종, 곰팡이 11종, 살충성세균은 9종, 곰팡이 6종, 선충 7종, 원생동물 1종, 바이러스 11종등이다. 살선충곰팡이는 1종, 선충 1종, 제초성세균 1종, 곰팡이는 2종으로총 80여종의미생물이등록된상태다. 미생물을이용한병해방제시도연구는 1927년미국에서감자더뎅이병방제용으로방선균을이용한것이최초이며, 1960년이후부터농약의형태로실용화되기시작하였고, 일본에서는 1962년에담배허리마름병에 Trichoderma 생균제제를시초로이후에많은제품이미국에서개발되었으며대부분의실용화제품이육묘중발생되는묘잘록병방제용으로개발되었음이주목되었다 ( 표 1). 2000년현재까지미국에서는약 44 종이상의미생물농약이등록되었고지속적으로발표되고있다 ( 표 2). 병해방제용생물농약중가장획기적인성공제품으로는각종작물중에서도특히다년생목본류의뿌리에발생되고있는뿌리혹세균병 (Crown gall) 에길항미생물인 Agrobacterium radiacter strain 84 및 K1026균주를이용한 Galltrol, Dygall, Nogall, Bakuterozu 제품이있다. 현재의유기합성농약이모든세균병에효과가저조하나특히뿌리혹세균병은유기합성농약효과를전혀볼수없는데비해, 이생물농약은확실한효과를나타내어우수한방제제로이용되고있다. 이생물농약의방제기작으로는 A. radiobacter세균이활성하는아그로신 (Agrocin) 이라는항균성물질이병원균의세포벽합성을저해하는것이기작이다. - 39 -
표 1. 병해방제용미생물살균제실용화생물농약 ( 농과원최용철 ) 미생물이용균주대상병해상품명등록국 ( 년 ) Agrobacterium radiobacter strain 84 Crown gall Galltrol Bakuterozu Dygall USA('79) Japan('89) Canada 세균 A. radiobacter K1026 Bacillus subtilis Pseudomonas cepacia Crown gall Nogall Australia Seedling root diseases Infection seed-born Quantum 4000 GUS 2000 USA USA Seedling root Blue circle USA 곰팡이 Pseudomonas fluorescens EG-1053 Streptomyces griseovirides Gliocladium virens GL-21 Pythium ligandam T.harzianum Rifaistrain KRL-AG 2 T. harzianum /polysporum T. lignorum T. viridae Damping-off Dagger G USA('88) Damping-off(Fusar ium, Alternaria etc.) Dampint-off (Rhizoctonia, Pythium) Sugar beet disease Damping-off (Pythium) Wood-decaying fungus Southern blight Sore shin(tobacco) Verticillium in mushroom Plum silver leaf disease Mycostop WRC-GL-21-W RC-AP-1 Polygandron F-Stop BinabTM T Trichoderma (spore) BINAB T SEPPIC BINAB USA USA('90) Czechoslovaki a USA USA Japan('62) France UK - 40 -
표 2. 미국에서상업적으로이용되고있는주요미생물농약 (USDA,2000) 방제미생물상품명대상병원균 세균 Agrobacterium radiobacter Bacillus subtilis Burkholderia cepacia Pseudomonas flurescens Pseudomonas flurescens Pseudomonas syringae Streptomyces griseoviridis Galltrol-A외 3종 Kodiak외 4종 Intercept BlightBAN A506외 3종 Conquer외 2종 Bio-save 100외 1종 Mycostop 뿌리혹병뿌리썩음병, 시들음병각종토양병사과 배나무화상병양송이세균성갈색무늬병잿빛곰팡이병, 푸른곰팡이병각종토양병 곰팡이 Ampelomyces quisqualis Candida oleophilia Coniothyrium minitans Fusarium oxysporum Gliocladium virens Gliocladium catenulatum Pythium oligandrum Talaromyces flavus Trichoderma harzianum AQ10 Aspire Contans 외1종 Biofox C외 1종 SoilGard PreStop외 1종 Polygandron Protus Binab T외 12종 각종흰가루병잿빛곰팡이병, 푸른곰팡이병균핵병시들음병모잘록병, 뿌리썩음병, 팻취병모잘록병, 뿌리썩음병, 팻취병모잘록병, 뿌리썩음병뿌리썩음병, 시들음병균핵병, 역병, 뿌리썩음병, 시들음병 나. 항생물질을이용한생물농약 미생물을인공적으로배양할때배양액에미생물이활성하는대사물질을배출하게되는데이러한대사활성물질을분리정제하여의약용및농업용항생물질로활용하고있다. 이러한항생물질은약 8,000종이상이알려져있으며이중실용화추진중인것은약 600여종이며농업용으로활용되는것은 20여종, 그중병해방제용으로많이사용되고있는것은 6종이실용화되고있다 ( 표 3). 농업용항생물질활성균은토양내에많이분포하고있는방선균 (Actinomycetes) 중 Streptomyces속균주로부터많은물질이알려져있다. 세계최초의농업용항생물질은 1958년도열병방제용항생물질로알려져있는 Blasticidin S를선두로 Kasugamycin, Polyoxin, - 41 -
Validamycin 등이사용되고있다. 이들농업용항생물질은미생물자체가아닌활성물인물질을 이용하게되므로농약으로서의안전성평가는유기합성물인화학농약과동일한수준에서평가되고 있으며화학농약에비해매우저독성인것으로알려져있다. 표 3. 병해방제용농업용항생물질 ( 농과원최용철 ) 항생물질생산균주대상병 ( 작물 ) Blasticidin-S Streptomyces griseochsomogenes Blast(Rice) 등록년도 ( 한국 ) '58('66) Kasugamycin St. kasugaensis St. kasugapinus Blast(Rice) '64('69) Validamycin St. hygroscopicus var.limoneus Sheath blight(rice) '70('76) Polyoxin Streptomycin St. cacaoi var. asoensis St. griseus Sheath blight(rice) Alternaria leaf spot(apple) Powdery mildew (Apple, Pear, Cucumber) Black rot(pear) Brown spot(tobacco) Gray mold(red pepper) Scab(Pump) Canker(Apple) Canker(Citrus) Bacteria shot hole(peach) Late blight(potato) '64('71) '44('81) 2. 국내에서의개발현황 미생물자체를이용하거나, 미생물이활성하는생리활성물질에대한국내의연구및개발은외국에비해 30~50년뒤늦은 1980년대에기초적연구가수행되어왔으며, 전문가가부족한실정과체계가갖춰져있지않은상황에의해실용화되고있는제품은개발되어있지않다. 그러나, 최근에체계적인연구실과전문가들에의해꾸준한노력에따라연구역사에비해연구수준은많이향상되어좋은결과가이루어지고있다. 미생물자체를이용하여병해방제용으로연구된것으로는 1985년부터국가연구기관및대학의병리학자를주축으로담배의모자이크병 (TMV), 세균성마름병 (Bacterial wilt), 오이시들음병 (Fusarium wilt), 고추역병 (Phytophthora blight), 딸기시들음병, 눈마름병 (Rhizoctonia bud rot), 사탕무우잘록병 (Damping-off), 벼도열병, 잎집무늬마름병방 - 42 -
제등에관한연구가보고되어있다 ( 표 3). 특히, 보고된연구결과중현재활용가능성이높아일부균주에특허를취득또는특허중인것은고추역병방제를위한길항미생물균주인 AC-1, 오이덩굴쪼김병방제용인비병원성균주와각종작물에발생하고있는흰가루병균에기생하는기생균에의한방제방법은곧실용화가가능한것으로생각된다. 표 4. 국내에서의미생물에의한각종작물병해방제연구 작물 대상병 미생물종류 보고년도 TMV Virulence virus '85 Tobacco Non pathogenic Bacterial wilt P. solanacearum '85 Fusarium wilt Rhixosphere antagonists '87 P. gladioli '92 Non pathogenic strain of Cucumber Fusarium oxysporum f. sp. '93 cucumerinum Gliocladium virens P. putida '95 Phytophthora blight Bacillus sp.(ac-1) '86 P. cepacia '88 Red pepper Trichoderma harzianum Enterobacter agglomerans '89 Non pathogenic strain of Phytophthora capsici '92 Fusarium wilt Trichoderma sp. '88 Strawberry T. harzianum '95 P. gladioli '90 Rhizoctonia bud rot Antagonistic microorganisms '94 Sugar beet Damping-off Pseudomonas sp. '88 Rice Blast, sheath blight Pseudomonas sp. '90 한편, 미생물활성활성물질인농업용항생물질연구역시외국에비해 20~30 년후에 추진되었으며현재도신물질탐색에힘쓰고있다. 지금까지결과로는벼흰잎마름병방제용으로 cychloheximide를분리동정한바있으며, 방선균 streptomyces균에의한 Maculocin을분리한바있으나, 신물질분리나유망한물질의활용까지는이르지못하고있다. 이제까지국내에서미생물자체를이용한병해방제용생물적방제중가장많은연구가이루어진고추역병균방제용 AC-1 균주를생물농약으로등록하기위한제반시험을완료한단계이며, 실용화를추진중이다. Botrytis cinerea 의생물학적방제중수확후발생하는각종저장성병해도보고되고있는 - 43 -
데, 예를들면장미 (pyrrolnitrin), avocado(bacillus subtilis), 포도 (Trichoderma spp.), 사과 (Pseudomonas cepacia, 배 (P. cepacia, Bacillus pumilus, B. amyloliquefaciens), citrus(candida olephila), cyclamen(ulocladium atrum) 가보고되고있다. 전세계적으로약 40종의생물농약제품이식물병의방제용으로시판되고있는데, Trichoderma속균을이용한제제인 Trichodex (Deborah 등, 년도불명 ) 와 Pseudomonas syringae를이용한 Bio-save 110 등이국외에서시판되고있으나작물살포용뿐만아니라길항세균을이용한미생물농약은전혀개발되지않고있다. 국내에서복성해등 ( 생명공학연구소, 1992) 에의해 B. subtilis를길항균으로한딸기잿빛곰팡이병방제용미생물농약의개발을성공적으로수행하였으나수년이지난현재까지그실용화여부가불분명한데최근미생물농약등록기준이마련되어품목고시가될것으로기대하고있다. 최근 BT계미생물농약의약효를 10배이상오래지속시키고싼제조공정에성공했다고밝혔다. 최근경상대학교정영륜교수연구팀에의해 2000 년도에개발된토리 ( 상품명 ) 는 T. harzianum 을이용한미생물농약으로잿빛곰팡이병에매우탁월한효과가있는것으로보고 ( 정영륜 등, 1993) 되고있으며현재시판중에있다 ( 표 5). 2002 년 3 월국내처음으로그린바이오텍이고추역병살충제와잿빛곰팡이용살균제등 3 종을등록을하였으며 2003 년도에완제품을출시하였다. 2003년전남대지연태와정순주교수팀이 NIN( 대표김희경 ) 와공동연구한결과천연무독성농약개발에성공하였다. 이는미국등의학자들이 2010년개발을목표를앞지른것으로서이무독성농약은천연물을이용해만든생물전환제제로단백질원과식물성지방산을원료로한물질을추출해이를나노입자롤제조하였다. 이는벼문고병, 벼도열병, 잔디패치병, 고추탄저병, 장미역병, 오이흰가루병과잿빛곰팡이병등을완전구제한다고발표하였다. 2005년동부한농화학은비티제인 B. thurringiensis 살충제 등 10 여종이상의미생물농약을개발중에있으며현재 5개종이등록절차를진행중에있다. 또한, 환경친화적제초제인 DBH-129, 원예용살충제 DBI-3204, 미생물살균재 AC-1, 나방류방제에주로활용되는 바이오박 을상품화하였다. 배재대바이오의약센터소장이기성교수는동부한농화학과산학협력으로 KL1114MBF 세 - 44 -
균을이용한무공해무독성농약을개발하고곧상품으로출시된다. 이농약은입제, 수화제, 종자코팅제등의다양한상품으로개발되었는데, 특히배추무사마귀병방제용종자코팅제는작물의뿌리에미생물이정착, 각종병해를일으키는병원균의침입을억제하는것으로환경에전혀영향이없다고밝혔다. 본연구실에서는 1999년 B. licheniformis N1 균주로제조한 Soy제제의들깨잿빛곰팡이병예방효과와치료효과를입증하였고, 이를이용하여 1999년에서 2002년까지는수화제형 N1E제제를딸기, 토마토, 결구상추의잿빛곰팡이병을약 90% 이상방제하였음을증명하였다. 게다가수화제형 N1K제제역시상기의작물에서잿빛곰팡이병에대한높은방제효과를보여새로운미생물농약의방제가능성을보였다. 2004년에서 2005년도에는결구상추밑둥썩음병방제용으로수화제형 BW-13A제제의방제효과를실제포장에서검증하였고, 결구상추균핵병방제용으로액상수화제 A7-2제제와수화제 A7-I 제제역시방제효과가자연병발생포장에서방제효과가뛰어나특허출원되었다. - 45 -
표 5. 국내에서살균제로개발중인미생물균주와개발된미생물제품 대상식물병균주연구팀제품명 인삼뿌리썩음병 Bacillus, Arthrobacter, 한국인삼연초연구소 Pseudomonas 등복합균주투엠바이아연구소 고추역병 Bacillus AC-1 농업과학기술원 모잘록병등 Paenibbaciluus polymyxa Pseudomonas fluorecens 경상대 채소시들음병 Paenibbaciluus koreensis 경상대 바이코나 1, 2 (1987) 흰나라등 (1994) 3년차포장실험 (1995) 3년차포장실험 (1998) 배추무사마귀병 Bacillus sp. 배재대, 동부한농 (2000) 잿빛곰팡이병잎곰팡이병겹둥근무늬병흰가루병, 고추역병잿빛곰팡이병, 모잘록병흰가루병 Trichoderma harzianum Paenibbaciluus polymyxa AC-1 Bacillus subtilis GB413 Ampelomyces quisqualis AQ94013 경상대제일그린그린바이오텍그린바이오텍그린바이오텍 토리 (2000) 탑씨드 (2003) 씰러스 (2004) 큐펙트 (2004) 3. 국내의특허관련동향 1) 국내생물농약에관한기술개발은외국에비해 3-4년도의기술격차가있으나생물농약에관한특허는 87년 BT 균의대량제조방법으로첫출원이이루어졌다가 94년에항바이러스단백질을함유하는바이러스방제제의특허가출원되었다. 2002년 5월까지는총 19건으로매년점점늘어나고있는추세이다. 2) 국내미생물농약은총 8개품목이등록되었는데, 이중국내선두업체인그린바이오텍이 2002년 3월국내처음으로고추역병살충제와잿빛곰팡이용살균제등 3종의원제등록과더불어 2004 년도에 2종의미생물농약 ( 씰러스, 큐펙트 ) 를추가하여총 5개품목을등록하였다. 이어 2005년에는잔디용미생물농약을 1건추가하여총 6개품목을등록한것으로밝혔다. - 46 -
3) 2003 년전남대지연태와정순주교수팀이 NIN( 대표김희경 ) 와공동개발한천연무독성농약개 발로세계 29 개국에특허출원하였다. 현재이연구팀은작물안전성검사를마친것으로알려졌다. 4) 동부한농화학은 BT 제인 B. thurringiensis 살충제 등 10 여종이상의미생물농약을개발중에 있으며현재 5 개종이등록절차를진행중에있다. 환경친화적제초제인 DBH-129, 원예용살충 제 DBI-3204, 미생물살균제 AC-1, 나방류방제에주로활용되는 바이오박 을상품화하였다. 5) 복성해 ( 생명공학연구소 ) 박사팀은최근 BT 계미생물농약의약효를 10 배이상오래지속시키는 싼제조공정의개발로 26 개국에특허출원하였고, 삼성물산과캐나다의 2 개회사와산업화를추진 중에있다. 6) 고려바이오연구소, 엔바이오시스, 한국바이오세라믹, 한국녹생환경, 비아이지등의바이오벤쳐기 업과경농, 한국화학연구원, 한국과학기술원등도연구개발을활발히진행하고있다. 7) 본연구실의경우, 2005년현재파리목해충에대해방제효과를가지는바실러스슈린지에스균주를이용한미생물살충제 ( 제 0458765 호 ) 와바실러스리케니포미스 N1 및이를포함하는식물병원성진균방제용미생물제제 ( 제 0506721 호 ) 등의 2건이미생물농약의제형화로특허등록되었다. - 47 -
4. 관련기술문제점 가. 국내개발의문제점 1) 국내개발기술은연구역사가짧고기술수준이낮고연구인원이수적으로부족하며연구가산발적이며중심체제가없어활성화가지연되고있다. 2) 방제대상의선택성이좁고, 제한적이다. 3) 농약제조판매측면에서수익보장이어렵고, 개발여력이없다. 4) 사용자측면으로는속효성인화학농약을선호한다. 5) 농약등록시국내여건상제출서류작성해결부족및시일이많이걸린다. 6) 국내미생물농약등록을위한 GLP 인정독성시험기관이미흡하며이를뒷받침할국가차원의적극적지원이필요하다. 7) 산학협력체제의미성숙으로기술을습득한연구원들의취업난때문에기술연계가이루어지지않는다. 나. 생물농약의등록요건 미국, 캐나다, 영국, 유럽등의외국에서는화학농약과생물농약의등록평가기준이상세히정해져있으며, 안전성평가부분에서도요건별로차이를두고있으나, 국내의경우에는농약관리법에생물농약등록규정이있기는하나그내용이현재로서는명확하지않아그기준이매우모호한실정이다. 일본의경우에도최근생물농약의실용화품목이증가됨에따라새로운규정에의해생물농약이등록되고있으며등록규정이정립되어실용화를간단히추진되도록하고있다. 따라서, 국내에서도새로운생물농약등록기준이세부적으로나뉘어명료하게설정되어저독성이면서안전한생물농약이활용될수있는방법이제시되어야할것으로생각된다. 금후, 생물농약으로실용화하기위한검토기준중연구자가생각하여야할참고사항으로는 1) 화학농약의규격, 성상과같은수준으로이용생물의분류상의위치와특성을명확히파악한다. 2) 인간이나가축에대한감염성의유무, 병원성의유무를밝혀야하며 3) 농약으로서의실용적인효과를확인한다. 4) 표적작물에대한약해및이상증상등에영향이없어야하며 - 48 -
5) 환경이나표적외생물 ( 누에, 꿀벌, 지렁이등유용곤충 ) 에영향이없고 6) 농약으로서의제품관리 ( 수송, 보관, 유효기간등 ) 가되어야한다. 다. 이용상의문제점 1) 화학농약과는달리, 그효과가서서히나타나는경우가많다. 2) 주위환경에의해효과가영향을받는경우가많다. 3) 재연성이떨어지는경향이있다. 4) 화학농약보다낮은방제가를목표로한다. 5) 화학농약에비해고가인경우가많다. 6) 사용상의주의점이나효과를발휘하기위한조건이있다. 7) 화학농약과의동시사용영향평가가어렵다. 8) 화학농약에비해가격이비싸나활성물의가격반영이어렵다. 5. 앞으로의전망 환경친화적미생물농약은농약의잔류독성및축적과환경오염등문제를야기하는화학농약의대체품목으로시장이확대될것이다. 미생물농약제조는다른분야에비해서비교적외국과의기술격차가적고, 미래산업으로서전망이밝다. 하지만개발소요기간, 기술, 자금등많은문제로민간기업이이를전부해결해나가기어려운실정이다. 이에정부차원에서의지원이시급하다. 생물농약이세계적으로차지하는매출액은전체농약 300억불중 1% 에해당하는 3억불에지나지않으며, 개발실용화된 70여종중각국에서많이사용되고있는미생물살충제인 Bt제를제외하면대부분의생물농약사용량은많지않다. 이외에사용중인생물농약은화학농약보다효과가우수하거나, 화학농약에의한문제점으로도출된약제저항성문제해결또는방제가어려운뿌리혹세균병의방제제로이용되고있다. 그러나, 이제까지사용되고있는화학농약이과학기술의발달에의해밝혀지지않았던독성의문제점이점차밝혀짐에따라저독안전한생물농약의개발및실용화는더욱촉진될것으로생각된다. 특히, 생물농약은환경생태계에안전하며, 약제저항성출현이없고, 농산물의안전성및부존자원을이용한저렴한개발비등으로볼때개발은꼭필요하다. 국내의입장으로볼때농약을필수적으로사용하지않으면안될상황에서는자체개발생물농약은필요한자재이다. 현재, 개발하고있는국내의연구결과를확대발전시킨다면단기간내에 - 49 -
실용화가가능할것이며, 외국에서개발된것보다는국내자원을이용한생물농약이국내환경에잘 적응할뿐만아니라기술축적측면에서육성시켜야할분야로보며, 21 세기에화학농약대체로생 물농약사용이바람직할것으로볼때실용화촉진은필수적인과제라생각된다. 6. 기술도입의타당성 가. 외국에서상품화된것은특정작물의특정병을대상으로하는미생물농약이주종을이루고있으나, 국내에서많이발생하는병과는양상이다름으로이에대한방제효과가의문시된다. 설령기술을도입하더라도기술의종속, 기술료등아직까지작은우리나라미생물농약시장에서경제성을맞추기가쉽지않을것이다. 나. 미생물농약의개발은장기간에걸친기술, 정보, 경험의축적으로이루어지며, 한번의기술도입으로그러한능력을갖출수없으므로기술도입에의한기술의정립은불가능하다. 국제적인기술보호여건이나이를극복해야하는국내여건으로볼때국내의우수연구진과국내기업이효과적인연구공조체계를이루어연구를진행해야한다. 다. 미생물을이용한미생물제제는그환경에적응하는능력이중요하므로국내에서분리한 균주를이용하는것이가장바람직하다고보여진다. - 50 -
제 3 장연구개발수행내용및결과 제 1 세부과제 : 고항균활성키티나아제활성균주의유전학적육종 연구책임자 : 이영병 제 1 절 서론 Chitin은각종식물병원성진균특히사상균의세포벽주성분으로알려져있으며연간 100 억톤정도로지구상에서셀룰로오스다음으로많이생산되고있는자원이다. 최근 chitin 및 chitin 유도체는식품산업, 제약산업, 농업및환경분야등의다양한산업분야에서이용되고있다. 생물방제균의주요기작중의하나인 chitinase는 chitin의 β-1,4-glucosidic 결합을가수분해하는효소이며, 작용기작에따라 chitin의 β-1,4-glucosidic을무작위로절단하는 endo-형과 chitin 사슬의비환원성말단으로부터절단하는 exo-형등이있다. 오래전부터곰팡이, 세균, 식물체에서의 chitinase 역할에관한연구들이규명되면서이들사이의생태적작용상호작용에 chitinse가중요하게관여하고있다는데에큰관심을가지게되었고식물병원성진균이함유한 chitin 성분의효소적분해는작물의병해를방제하는적극적인방제기작중의하나이다. 병발생기작중식물병원균의세포벽구성성분인 chitin을분해하는식물병억제효소, 즉키티나아제를이용한생물학적방제연구가진행되면서최근에는유전공학적으로키티나아제를분비하는미생물의병억제능력을증강시키고자노력하고있다. 특히, 항생물질을활성하는균주들보다병원균에대한억제능력이낮은 chitin 분해미생물의병억제능력을증강시키기위해서항생물질활성능력이높은균주를선발하고여기에키티나아제유전자를도입, 발현시켜키티나아제분비와항생물질에의한병억제력을동시에지닌다기능성균주로형질전환하여지금까지알려진균주들보다병방제능력이뛰어난균주로개발하는것이미생물제제개발에있어서필요한기술분야로대두되었다. 그러나, 국외뿐만아니라국내의실험실내실험에서는키티나아제분해능이증가되었음을확인하였으나, 이를이용하여미생물농약으로개발한예는외국의사례 ( 살충제개발 ) 를제외하고는전무하며, 국내역시실제로미생물농약을개발하여실제포장에서그방제능력을확인하여실용 - 51 -
화한예는현재까지보고된바가없다. 따라서, 본연구에서는다기능성방제균의육종에필요한 chitinase이유전자원을마련하고항균활성은있으나, chitinase 활성은없었던 Bacillus amyloliquefacines A-2 균주에 chitinase 유전자를삽입하여이들의증가된방제력을검정하고자하였다. - 52 -
제 2 절다양한 Chitinase 활성균주에서 chitinase 유전자분리 1. 연구수행방법 가. Colloidal chitin 제조 Chitin은비수용성이며분자내수소결합으로인하여매우단단한구조를가지고있기때문에산이나효소에의해서쉽게분해되지않으므로, chitin의미립자를물에분산시켜 chitinase가작용할수있는 colloidal chitin을제조하여사용하였다. 먼저 Crude chitin (Practical grade from Crab shells, Sigma) 100 g에강염산 (HCl) 2,000 ml를가하여 4 에서 24시간동안교반시키고 glass wool로여과하였다. 여액은 4 의에탄올로가하여교반시키면서흰색의 colloidal chitin이생성되면상온에서 colloidal chitin이가라앉을때까지방치하고상등액은버린다. 이를 7,000 rpm 에서 15분간원심분리한후침전물은다시증류수에분산시킨후 10 N NaOH로중화시키고, 앞선과정에서생성된 NaCl의제거를위해 3 4회증류수로세척한후원심분리하고침전물을회수, colloidal chitin을제조하였다. 나. 유전자조작에사용된균주및 plasmids 본연구에 plasmid 구축및증폭을위한숙주세포로는 E. coli DH5α (supe44 hsdr17 reca1 gyra96 thi-1 rela1) 와 Top10'(F -, mcra, D(mrr-hsdRMS-mcrBC), f80laczdm15 DlacX74, deor, reca1, arad139 D(ara-leu)7697, galk, rpsl(strr), enda1, nupg를사용하였으며, 발현숙주세포로는 BL21(DE3) (F -, dcm, ompt, hsds(r - B m - B ), ga l(de3) 를사용하였다. PCR product의 cloning을위한 vector로는 pgem-t vector (promega) 를, 발현용 plasmid vector는 pet22b (Novagen) 를사용하였다. Bacillus 발현용 vector로는 E. coli-bacillus shuttle vector인 pwh1520 (MoBiTec) 을사용하였으며, 발현용 Bacillus 숙주로는 Bacillus subtilis 168 를사용하였다. 항진균활성세균인 B. licheniformis N1과 chitinase 활성균주인 B. licheniformis CH-1의 Chromosomal DNA를분리하여 template로사용하였다. B. licheniformis에서 chitinase gene의염기서열이밝혀진 B. licheniformis TP-1유래의 TP-chitinase 염기서열을기초로 primer를디자인하여 Chi-F,R이라고명명하였다 (Table 1). 중합효소는 Taq DNA polymerase로 Ex taq (Takara, Korea) 을구입하여사용하였다. 한편, PCR 증폭반응은 Mygenie 32 thermal block (Bioneer, Korea) 을사용하고, 증폭조건은 94 (5분 ), 94 (1분 ), 51 (1분 ), 72 (1분 30초 ) 로 30회반복하고, 마지막단계로 72 에서 5분간실시하였다. 이조건으로증폭된산물을 QIA - 53 -
quick PCR purification kit (Qiagen Inc., Germany) 를이용하여정제한후, pgem-t vector 에 ligation 한후 E. coli top 10 에 transformation 한후 LB X-gal 배지에서 white colony 를선별하였다. 선별된형질전환체가포함된 5 ml의 LB broth (ampicilline 50ug/ml) 접종하여밤새배양후 plasmid 추출후 CH-1과 N1 균주의 chitinase gene 을포함할것으로예상되는적절한재조합plasmid를확보하였다. 재조합플라스미드의제한효소절단양상에기초하여올바른재조합 clone을선별하여시료의염기서열분석을 Genotech corp. (Daejeon, Korea) 에의뢰하였다. 삽입된DNA의양가닥의염기서열을완전히분석한이후, 이 DNA 염기서열을 National Center for Biotechnology Information (NCBI) 에서 BLASTN을통하여분석하였다. 다. 재조합 plasmid 제작및형질전환 E. coli에있는 plasmid DNA는 plasmid purification kit (Nucleogen) 을사용하여추출하였으며, 유전자및제한효소단편 DNA의 cloning과 E. coli 형질전환은 Maniatis 등의방법으로수행하였다. 라. Chitinase 활성측정 1) Plate agar assay 0.5% colloidal chitin이포함된 LB agar plate배지에서분리균및형질전환체를배양하여 colloidal chitin의분해에의한투명환을관찰하여활성을결정하였다. 투명환이나타난 plate는증류수로 bacteria colony를씻어낸다음 0.5% congo red solution으로 37 에서 30분간염색한후 1M NaCl 로씻어내어반응을정지시켰다. 2) SDS-PAGE와 Zymogram SDS-PAGE는 Laemmli(1970) 의방법으로행하였으며, 1 mm 두께의 12%(w/v) polyacrylamide gel 에 0.7 mg CM-chitin-RBV/ml를첨가하여사용하였다. 120V의일정한전압으로상온에서행하였으며, 단백질 band는 0.25% Coomassie blue R-250으로염색하여확인하였다. In situ zymogram technique을이용하여 chitinase 활성을분석하기위하여 polyacrylamide gel 제조시. 단백질 sample은 sample buffer (2% (w/v) SDS, 10% (v/v) glycerol, 1.25% (w/v) β-mercaptoethanol, 62.5 mm Tris-HCl, ph 6.8) 를첨가한후 5분간끓여상온에서식혔다. 전기영동이끝난후 gel을증류수에서 15분정도방치하였으며, 0.1% Triton X-100이포함된 50 mm sodium acetate buffer에서 24시간방치하였다. Chitinase 활성을가지는 band에서투명환을 - 54 -
관찰하였다. 2. 연구수행결과 가. Cellulosimicrobium cellulans CH-10의 chitinase 활성 zymogram C. cellulans CH-10 균주로부터활성되어지는 chitinase의분자량및효소활성검정을위해 SDS-PAGE상에서 pn-nag 2 를기질로하여 colloidal chitin이포함된배지에서 chitinase 활성을조사하였다. 그결과, 배양상층액뿐만아니라잔존의 chitin에서도활성이나타나 chitinase는 chitin에 binding되어있을것으로판단되었으며, 이후 chitin에 binding되어있는 chitinase를쉽게분리정제하기위하여배양액에서 colloidal chitin을분리한다음 guanidine chloride를사용하여상온에서약 2시간동안단백질을용출시켰는데, 그결과, C. cellulans CH-10의배양상층액, 농축액, 그리고기질첨가시에모두총 3개의 chitinase band가관찰되었다 (Fig. 1). A B C D M kda 113 92 52.3 35.3 28.7 Fig. 1. Chitinase activity determination on SDS-PAGE of Cellulosimicrobium cellulans CH-10 and Paenibacillus pabuli CH-9 culture supernatant. A 12% acrylamide gel was supplemented with 0.25 mg/ml CM-chitin-RBV for the in-gel chitinase assay: Lane A, the culture supernatant (CH-10 strain); lane B, 70% ammonium sulfate precipitate of the supernatant (CH-10); lane C, protein eluted from colloidal chitin remained in the CH-10 culture (elution by 2M guanidine chloride); lane D, 10-fold concentrate of the Paenibacillus pabuli CH-9 supernatant. Lane M indicates molecular weight standards. - 55 -
나. Chitinase 유전자 cloning 1) Bacillus licheniformis N1으로부터의 chitinase gene의 cloning 본연구과제의선행연구에서 B. licheniformis N1 균주의 chitinase의유전자를모균주인 N1 균주또는항균물질활성이높은유용미생물에효율적으로 chitinase 활성을증강시켜방제기작이향상된다기능적균주의확보와함께이들을이용한새로운미생물농약개발에이용하고자하였다. N1 균주의 chitinase gene 염기서열분석결과, 지금까지그특성이알려져있지않은 B. licheniformis DSM13 chitinase와 96% 의 protein sequence identity를가지고있었으며, 곤충의세포벽성분인 chitin에효율적으로작용하여 insecticidal activity를가지는것으로알려진 B. licheniformis TP-1 chitinase와도 89% 의 protein sequence identity을나타내었다. 또한, DNA 염기서열에서도 98% 의아주높은 sequence identity를나타내었다 (Fig.6). 이는 DNA 염기서열상에서 3개의 domain중에서 catalytic domain(44-435 amino acid) 에서부분적으로하나의염기가 deletion과 insertion에의한단백질서열의변화가유도되었으며 chitin binding domain에서도 deletion이생김으로서전체단백질서열에서 DNA 염기서열과는달리낮은 homology를보인것으로사료되었다 (Fig. 2). - 56 -
Fig. 2. The nucleotide and deduced amino acid sequences of the chitinase from the N1 The start codon of ATG is boxed, the termination codon is asterisked, the chitin-biding domain is highlighted and SD sequences is underlined. - 57 -
2) Bacillus licheniformis CH-1으로부터 chitinase gene의 cloning B. licheniformis N1 이외에 chitin 분해능이뛰어난 B. licheniformis CH-1 균주로부터도 chitinase gene을확보하기위해 B. licheniformis TP-1 chitinase gene과 N1 chitinase gene의 DNA 염기서열을토대로 primer를제작한후, PCR을실시하였다. 그결과약 1.8 Kb의 PCR product를확보하였고, CH-1 chitinase gene의 DNA 염기서열분석은 pgem-t vector에 ligation하고, E. coli Top10F' 에 transformation 한후 plasmid 를추출하여 DNA sequecing 을행하였다. 그결과, CH-1 chitinase 의염기서열은 N1 chitinase와같이 TP-1과높은유사성을보였으며, 단백질서열은 N1 chitinase와 96% 의매우높은 identity 을나타내었다. 또한, TP-1 chitinase와의비교에서는 86% 의 identity 을보였다 (Fig. 3, 4). 이와같이본연구실에서확보한 2종류의 B. licheniformis에서 cloning된 chitinase gene은단백질서열상서로높은상동성을보였으며, TP-1 strain는 catalytic domain과 chitin binding domain에서 homology가낮은것으로나타나효소의활성특성에있어서차이점이있을것으로판단되었다 (Fig. 4). - 58 -
Fig. 3. The nucleotide and deduced amino acid sequences of the chitinase from the CH-1. The start codon of ATG is boxed, the termination codon is asterisked and the chitin-biding domain is highlighted. - 59 -
Fig. 4. Amino acid alignments for chitinases from Bacillus licheniformis N1, CH-1, TP-1 and structure of functional domains 3) Cellulosimicrobium celluans CH-10으로부터 chitinase gene의 cloning C. cellulans 에서유래한 chitinase gene sequences를기초로 primer를 design 하여 conserved 한부위를 PCR로증폭하여염기서열결과를분석한결과 342bp 단편을얻었다 (Table. 1). 이단편을기초로 inverse PCR 하여 C. cellulans CH-10에서 chitinase full sequences라고예측되는부위 1.2kb 클로닝하였다 (Fig. 5-7) - 60 -
Table 1. Primers used in this study Primer Name sequences 비고 Chi F 5'-TCAATCTCATTTATGTAAGCGTTT-3' Chi R 5'-AAATCTCTCTTTATCGTTTTCTA-3' Hind chi F 5'-AAAGCTTTGGATGAAAAGGAG-3' Chi F2 5'-CGGAGTGATCGACGCGCCAAATG-3' Chi F3 5'-GCGCCCATAATGCGCTGTT-3' RTR1 5'-TGTATGCGTTCGTCTCTTTCCATTCG-3' RTR2 5'-TATGGAGTTCTCCATCGGCGATCCTT-3' Bex F1 5'-GGACTAGTTCCCTTGTTGACTTCTGTGC- 3' Bex F2 5'-AAAGACTAGTAACATCGTGTTGG-3' Bex F3 5'-GGACTAGTATGAACATCGTGTTGG-3' Bex R1 5'-CCGGATCCCTATTCGCAGCCTCCGACCAG- 3' CH10-F2 5 -GCAGGTGAGCCACGAGAC-3 CH10-R2 5 -GGACCGGATGGTCTCGGCGAAGCC-3 if-1 5 -GCGGGCCGCGGCCGTAGTAGGCGTCCTG-3 ir-1 5 -AGCAGGACCCGACCGTCGCGTGGCAGACCG-3 if-2 5 -GTTCACCTCGACCACGTGCACCAGCCCGTG-3 ir-2 5 -CCGGTACCGCGTCGATGACGTGCCACGACG-3 if-3 5 -GACCACGTGCACCAGCCCGTGCGTCTCGTG-3 ir-3 5 -GTCGGCGAGCACGGCTTCGCCGAGACCATC-3 RAGE-R 5 -GGTCCTCCATGGGGACAAGGATTCCCCAGG-3 RAGE-F2 5 -CTACGTCGCCGGGTACACGAGCGGCGCCGT-3 N1 chi partial chi inverse PCR UF-1 5 -CGGCAACGCCTCGTTCGACCAGT-3 full length UR-1 5 -GGAAGCTTGCAGGTGAGGTGGTCGCCCGT-3 chi - 61 -
Fig. 5. Pairwise alignment of partial chitinase gene from C. cellulans CH-10 with chitinase gene from C. uda. if-1,2,3 primer is underlined and ir-1,2,3 primer is uplined - 62 -
Fig. 6. Schematic diagram of genomic DNA library construction of C. cellulans CH-10-63 -
Fig. 7. The strategy to obtain full-length chitinase gene by inverse PCR The UF-1 and UR-1 primers were used to amplify the full-length chitinase gene from C. cellulans CH-10 chromosome. - 64 -
제 3 절 Chitinase 유전자의 cloning, expression 및활성검정 1. 연구수행방법 가. pet-42a vector 를이용한 Cloning 앞서제 2 절의 N1 과 CH-10 균주로부터분리된 chitinase 유전자를 pet-42a vector 에 cloning 하였는데, 이를위해 start codon 앞 -25 ~ -15 부위사이에 PCR 증폭으로 point mutation을일으켜제한효소부위를형성시켰다. 이때 PCR 증폭을위해 Taq DNA polymerase 는 Ex taq (Takara, Korea) 를구입하여사용하였고, PCR 증폭반응은 Mygenie 32 thermal block (Bioneer, Korea) 에서 94 pre-denature 5분, 94 denaturation 1분, 52 annealing 1분, 72 elongation 1분 30초로하여이를 30회반복하고, 마지막으로 72 에서 5분간증폭하였다. 이조건으로증폭된 PCR 산물은 QIA quick PCR purification kit (Qiagen Inc., Germany) 를이용하여정제한후, pgem-t vector에 ligation하고 E.coli top 10 에 transformation 한후 LB X-gal 배지에서 white colony를선별하였다. 선별된형질전환체들은 5 ml의 LB broth (ampicilline 50ug/ml) 에접종하여밤새배양한후재조합 plasmid를확보하였다. 재조합플라스미드의제한효소절단양상에기초하여올바른재조합 clone을선별하여염기서열분석을 Genotech corp. (Daejeon, Korea) 에의뢰하였다. 이후, 확인된 insert를 pet-42a vector에 ligation 한후, E. coli top 10 에 transformation하고 LB X-gal 배지에서 white colony를선별하였다. 선별된형질전환체는 5 ml의 LB broth(kannamycin 50ug/ml) 에접종하여밤새배양후 plasmid 추출하였다. 재조합플라스미드의제한효소절단양상에기초하여올바른재조합 clone을선별하여재조합 DNA 를 pet-42-chi 로명명하고, E. coli BL21(DE3) 에 transformation 하였다. 나. Expression of chitinase gene in pet system 앞서형질전환된 E. coli BL21 (DE3) 을 5 ml LB broth(kannamycin 50ug/ul) 에배양한 뒤여기서 3 ml 의배양액을 500-ml flask 의 100 ml LB broth(kannamycin 50ug/ul) 에접종하고, 세균밀도 (O.D 600 ) 가 0.4-0.5 될때까지배양 (37 C, 200 rpm) 하였다. 그 후 isopropyl thiogalactoside (IPTG) 를 1 mm 되도록첨가하여 pet-42-chi에들어있는 N1 유래의 chitinase gene이 over-expression 되도록유도하였다. 이를 4시간동안 30 C에서배양시킨다음 4 C 에서 10,000g 로 10분간원심분리하고, 집균한뒤배양상층과집균을따로분리하여 4 C에보관하였다. 집균시료는 protein sample buffer와혼합하여 5분간끓이고, 총단백질은 12% SDS-PAGE에 - 65 -
전기영동하고 0.1% Coomassie brilliant blue R-250 에염색하였다 다. Fluorogenic 4-methylumbelliferone 을이용한 chitinase assay chitinase 활성검정을위하여기질로서, 4-Methylumbelliferyl N-acetyl- β -D-glucosaminide, 4-methylumbelliferyl-β-D-N,N-diacetylchitobioside, 4-methylumbellife ryl-β-d-n,n,n -triacetylchitotrioside을각각 DMSO에녹여서최종농도를 1 mm로준비하였다. Chitinase 활성은 96 well micro plate에 200 mm sodium phosphate buffer (ph 7.0) 을 150 ul로채운뒤, 20 ul의기질을넣고혼합한뒤 37 C 에서 15분간전반응시키고 chitinase 시료를 30 ul 넣어 37 C 에서 15분간효소반응을하였다. 이후, 3 M sodium carbonate를 50 ul 첨가하여효소반응을중지시키고, 390 nm에서 485 nm사이의파장에서 4-methylumbelliferone의증가로생성된형광물질을측정하였다. 2. 연구결과 가. N1 및 CH-10 chitinase 의 pet system 에서의발현 1) B. licheniformis N1 chitinase의 pet system에서의발현 B. licheniformis N1 균주의 chitinase의단백질특성및항균물질활성검정을위해 pet42a expression vector system을도입하여 chitinase의효소단백질을발현시켰다 (Fig. 8). 그결과, 98kDa 정도되는 band에서 over-expression되는것을관찰하였는데, 이는약 36 kda되는 GST fusion protein이 N1 chitinase와결합하여발현되었다.(fig. 9). - 66 -
Fig. 8. Schematic diagram of the constructed recombinant plasmids, pet-42a-chi, for overexpression of chitinase from B. licheniformis N1-67 -
Fig. 9. SDS-PAGE analysis of the over-expressed chitinase gene from B. licheniformis N1 in E. coli cells. Lane M, Molecular weight marker; lane 1, 4 hrs induction of BL21(DE3)/ pet-42a lysate; lane 2, 1 hr induction of BL21(DE3)/ pet-42-chi lysate; lane 3, 1 hr 30 min induction of BL21(DE3)/ pet-42-chi lysate; lane 4, 2 hr induction of BL21(DE3)/ pet-42-chi lysate; lane 5, 2 hrs 30 min induction of BL21(DE3)/ pet-42-chi lysate; lane 6, 3 hr induction of BL21(DE3)/ pet-42-chi lysate; lane 7, 4 hr induction of BL21(DE3)/ pet-42-chi lysate. 2) C. cellulans CH-10 유래의 chitinase 유전자의 pet-42a(+) system에서의발현 UF-1/UR-1으로 PCR하여얻은 product를 pgem-t easy vector에 cloning하고이의 recombinant DNA를 pufr라고명명하였다. 이재조합 DNA를 Nco Ⅰ과 Hind Ⅲ로처리된 pet-42a(+) vector에 cloning하였다. 발현 vector에 cloning된 CH-10 유래의 chitinase 유전자의과발현은다양한 induction 조건별로 12% SDS-PAGE에서조사되었는데, 그결과 37 의조건에서 57.5kDa 수준의과발현되는밴드를관찰할수있었다 (Fig. 10). - 68 -
Fig. 10. SDS-PAGE analysis of the expressed CH-10 chitinase in E. coli. Lane M, broad range marker; lane 1,2,3, represents 1 hr, 2 hr, 3 hr induction of BL21(DE3)/ pet-42a(control), respectively. lane 4,5,6 represents 1 hr, 2 hr, 3 hr induction of pet-42-4-1, respectively. lane 7,8,9 represents 1 hr, 2 hr, 3 hr induction of pet-42-4-4, respectively. - 69 -
나. Fluorogenic N-acetylglucosamine 을이용한 chitinase 기질특이성조사 1) N1 chitinase의기질특이성조사과발현된 N1 chitinase-gst fusion 단백질을포함하는 E. coli의 lysate와형광기질을이용한 chitinase 활성을검정하였다. 그결과, 4MDG(4-methylumbelliferyl N-acetyl- β -D-glucosaminide) 기질에서는 chitinase 활성이나타나지않았는데, 이는 exo-chitinase (β -1,4-hexosaminidase) 활성결여인것으로판단되었다. 반면나머지 4MDD (4-methylumbelliferyl- β -D-N,N -diacetylchitobioside) 와 4MDT(4-methylumbelliferyl-β-D N,N,N -triacetylchitotrioside) 에서는활성이관찰되었는데, 이는 N1 chitinase가이들기질에존재하는두개또는그이상의과당을 Endo-splitting하여활성을나타내는것으로판단되었다. 가장높은활성은 4MDD에서나타났는데, 이는 N1 유래의 chitinase 에서가장주요한기능인 chitin에서 diacetylchitobiose을인식하고분해하는것이기때문이라고사료된다. 한편대조구로 chitinase를발현하지않는 E. coli 의 lysate의형광기질에대한활성결과, 형광활성이전혀없었다. 따라서, 앞서의 3가지의기질을이용하여기질특이성을조사한결과, N1 유래 chitinase는 endo-type의 chitinase 인것으로조사되었다 (Fig. 11). Fig. 11. Chitinase activity and substrate specificity of E coli cells carrying the chitinase gene from B. licheniformis N1 using fluorogenic -methlumbelliferine linked N-acetylglucosamine and its oligomers. Cont 1 is E. coli BL21(DE3)/pET-42a lysate, Sample is E. coli BL21(DE3)/pET-42-Chi lysate and Cont 2 is reaction with H 2O. - 70 -
2) CH-10 chitinase의기질특이성조사 CH-10 chitinase의기질특이성은앞서의 N1 chitinase의기질특이성조사와동일한방법으로실시한결과, 효소활성이전혀관찰되지않았기에시료를 soluble과 insoluble type으로분리한다음, soluble type인경우는 Fluorogenic N-acetylglucosamine 기질과반응시켜효소활성을검정하였으나전혀반응이없었다. CH-10 chitinase sequence의결과가 family 19에속하여이들이항균물질활성을지니는 chitinase와관련이있다는보고에따라 Streptomyces sp. 유래의 chitinase amino acid sequences의 clustal과비교해보았다. 이때, start codon에서약 100 개의 amino acid sequences가 family 19에관련된 chitinase sequence에대하여아미노산서열이다른것으로확인되어발현이되지않았던원인을예측할수있었다 (Fig. 12). - 71 -
Fig. 12. Alignment of chitinase amino acid sequences of C. cellulans and other Streptomyces sp. BAC5793:chitinase IS [Streptomyces sp. AJ9463], AAT2743chitinase IS :[Streptomyces sp. MG3], BAC9907:chitinase [Streptomyces sp. J-13-3], AAQ2463:chitinase [Streptomyces griseobrunneus], BAA23739: chitinase C [Streptomyces griseus], BAC4525:family19 chitinase [Nocardiopsis prasina],baa88834:chi25 [Streptomyces thermoviolaceus], BAA88833:chi35 [Streptomyces thermoviolaceus], CAD5544:secreted chitinase [Streptomyces coelicolor A3(2)], BAA7564:ChiG [Streptomyces coelicolor], BAA7564:ChiF [Streptomyces coelicolor], CAB4295:chitinase [Streptomyces coelicolor A3(2)], CAB3732:30 kda chitinase [Streptomyces olivaceoviridis], AAD3275:MmcY [Streptomyces lavendulae], BAA9225:chitinase B [Burkholderia gladioli] BAD9201:chitinase I [Bacillus circulans] - 72 -
제 4 절 Bacillus sp. 에서의발현용 Vector system 구축 1. 연구수행방법 가. pwh1520 vector 를이용한 cloning Bacillus sp. 에서발현유도를위해서 Bacillus-E.coli shuttle vector 인 pwh1520(mobi tec, USA) 을구입하여사용하였다. 이때, N1 chitinase gene 을 pwh1520 vector 에 cloning 하기 위해 start codon 앞 -25 ~ -15 부위사이에 PCR 증폭으로 point mutation 을일으켜서제한 효소 Spe Ⅰ과 Bam HⅠ부위를형성시키고 (Table 1), PCR 증폭은 Taq DNA polymerase로 Ex taq (Takara, Korea) 을사용하였다. PCR 증폭반응은 Mygenie 32 thermal block (Bioneer, Korea) 을이용하여 94 pre-denature 5분, 94 denaturation 1분, 52 annealing 1분, 72 elongation 1분 30초로 30회반복하고마지막단계에서 72 5분간증폭하였다이조건으로증폭된산물을 QIA quick PCR purification kit (Qiagen Inc., Germany) 를이용하여정제한후, pgem-t vector 에 ligation하고 E.coli DH 5α 에 transformation 한후 LB X-gal배지에서 white colony를선별하였다. 선별형질전환체들은 5 ml의 LB broth (ampicilline 50ug/ml) 에접종하여밤새배양하고재조합 plasmid를확보하였다. 재조합플라스미드의제한효소절단양상에기초하여올바른재조합 clone을선별한후시료의염기서열분석은 Genotech corp. (Daejeon, Korea) 에의뢰하였다. 이후확인된 insert를준비한 pwh1520 vector에 ligation한후, 또다시 E. coli top 5α 에 transformation 하고 LB (ampicilline 50ug/ml) 배지에서 colony 를 선별하였다. 선별형질전환체는앞서와동일한방법으로배양후 plasmid 를추출하고올바른 재조합 plasmid 를선발하였다. 나. Transformation to Bacillus sp. Bacillus 형질전환은 Gang 등 (1999) 에의한방법에의해 Bacillus electro-competent cell을먼저제작하였는데, 이때 Bacillus cell 배양액을 0.5 M sorbitol 이함유된 LB 배지에 1/20 volume으로접종하고 37 에서세균농도가 600 nm에서 OD 0.85-0.95가될때까지배양되면이를얼음에서 10분간냉각한뒤, 원심분리 (4, 5000 X g, 5분 ) 하여 cell을획득하였다. 획득된 cell은 EP buffer (LB containing 0.5 M sorbitol, 0.5 M mannitol and 10% glycerol) 로 4회 washing 한후다시 EP buffer 로현탁하여세균농도가 1X 10 10 cfu/ ml (1/40 로희석 ) 되도록 competent cell 을제작한뒤, -80 에보관하면서실험에사용하였다. 한편, Electroporation 을위해, 60 μl의 competent cell 과 1 μl (50 ng/ μl ) 의 recombinant - 73 -
plasmid DNA를잘혼합하고, 1.6kV 의전압을가하여전기충격을준뒤, 1 ml의 recovery medium (LB containing 0.5 M sorbitol and 0.38 M mannitol) 을첨가하고 3시간동안배양하였다. 형질전환체 (transformants) 는 selection medium (containing 20 ppm tetracycline) 에서선발되었다. 다. RT-PCR Bacillus amyloliquefaciens A-2, A-2 transformants, B, licheniformis N1, B, licheniformis CH-1, B. subtilis 168 및 B. subtilis 168 transformants 에서 total RNA 를분 리하고 1.0 μg RNA와유전자특이 primer(chi-f3, RTR1) 를사용하여역전사를실시하였다. 역전사는역전사효소 M-MLV Reverse-transcriptase 를이용하여 42 에서 1시간반응하였다. 역전사산물을 template 로 PCR 을수행하였는데, PCR 조건은 Mygenie 32 thermal block (Bioneer, Korea) 을이용하여 94 pre-denature 3분, 94 denaturation 30초, 53 annealing 30초, 72 elongation 30초로 30회반복하여 RT-PCR을수행하였다. 결과는 1.5% agarose gel에전기영동하여확인하였다. 라. B. subtilis 168, B. amyloliquefaciens A-2에 chitinase 유전자발현 Bacillus sp. 에서 N1 chitinase의발현은 Fluorogenic 4-methylumbelliferone을기질로이용한 chitinase assay 방법을사용하였다. B. subtilis 168, B. amyloliquefaciens A-2를대조구로하고 chitinase 처리구는 B. subtilis 168, B. amyloliquefaciens A-2에 pbex WH1-4가형질 전환된변이체에서발현을유도하였다. 반응후 30 분과 24 시간후의 UV illuminator 에서효소활 성을확인하였다. 2. 연구결과 가. Bacillus sp. 에서발현용 vector cloning N1 유래의 chitinase gene을 Bacillus 에서발현하기위해 N1 chitinase의 promoter 부위까지포함한유전자를 pwh1520 벡터에 cloning하였다 (Fig. 12). 이때, N1의 chitinase는 CH-1 chitinase와 holomolgy가유사하여본발현용 vector system 구축에서 N1 chitinase 만을사용하였다. - 74 -
Fig. 12. Schematic diagram of the constructed recombinant plasmids, pbex WH1-4, expression of N1 chitinase gene in B. amyloliquefaciens A-2 and B. subtilis 168 나. Bacillus sp. 의형질전환표준균주인 B. subtilis 168 는 Bacillus strain 에서 N1 chitinase 에서발현양상을관찰할수있는발현 host 로써 B. amyloliquefaciens A-2 에형질전환에앞서실시하였다. B. subtilis 에 pbex WH 1-4 와 pwh1520 을형질전환하여서 Tetracycline 배지에서 selection 하 였다. 변이체확인은 PCR 기법을이용해서변이체를확인하였다. B. amyloliquefaciens A-2 에 는 pbex WH 1-4 만형질전환한후똑같이 PCR 기법으로확인하였다 (Fig 13). lane 1에서약 1.3kb, lane 3 에선 0.8kb lane 6에서는 450 bp 가나왔다. lane 7 은 control 로 E. coli DH5α /pbex WH 1-4 을 template 로증폭하여확인한결과약 830bp에서 band 가형성이되었다. 이로써 B. amyloliquefaciens A-2 에 pbex WH 1-4의형질전환이최종으로이루어졌다. - 75 -
Fig. 13. PCR detection of N1 chitinase gene from recombinant B. amyloliquefaciens A-2 Lane 1~6 using A-2 wild type and the recombinant as template, lane 7, using E. coli DH5 α/pbex WH 1-4 as a control; lane 1, PCR result wiyh the primer Chi-F2 and RTR2; lane 2, PCR result with the primer Chi-,F2 and RTR1; lane 3, PCR result with the primer Chi-F3 and RTR1; lane 4, PCR result with the primer Chi-F3 and Chi-R2; lane 5, PCR result with the primer RTF1 and Chi-R1; lane 6, PCR result with the primer RTF1 and Chi-R2; lane 7, PCR result with the primer RTF1 and Chi-R1. Note the 834 bp PCR product amplified from control PCR (lane 7) and the same band from lane 3. 다. RT-PCR 을이용한발현확인 B. subtilis 168과 B. amyloliquefaciens A-2에서 total RNA 를분리하여이를 template 와 specific primer(table 1) 를혼합하여 RT-PCR를실시하였다. B. subtilis 168과 B. amyloliquefaciens A-2에서는 band가생성되지않았고, pbex WH 1-4 를포함하는형질전환체에서만유전자가발현되어 RT-PCR 산물이생성되었다. 또한 A-2에서 xylose 를첨가하지않은시료에서도 band가생성되는것으로보아 N1 chitinase는 xylose inducer와독립적으로발현됨을알수있었다 (Fig. 14). - 76 -
Fig. 14. Expression analysis of N1 chitinase by RT-PCR in Bacillus subtilis 168/pBex WH 1-4, B. subtilis 168, B. amyloliquefaciens A-2, B. amyloliquefaciens A-2/pBex WH 1-4 1, B. subtilis 168; 2, B. subtilis 168/pBex WH 1-4; 3, B. amyloliquefaciens A-2; 4, B. amyloliquefaciens A-2/pBex WH 1-4 (supplement of xylose); 5, B. amyloliquefaciens A-2/pBex WH 1-4(no supplement of xylose) 라. Bacillus strain (168, A-2) 에서의 N1 chitinase assay Fluorogenic 4-methylumbelliferone을기질로이용하여발현실험을해본결과, RT-PCR 결과와마찬가지로 inducer 인 xylose 를첨가하지않아도발현이되지만상당히느리게발현이일어나며, 그양도매우작아서 24시간이지나야지 B. amyloliquefaciens A-2 transformant 에서 N1 chitinase 가검출되었다. 또한 B. subtilis 168 transformant에서 xylose 기질첨가시 30분후 4MDD(4-methylumbelliferyl-β-D-N,N -diacetylchitobioside) 와 4MDT(4-methylumbelliferyl -β-d-n,n,n - triacetylchitotrioside) 에서동시에반응이일어났지만 xylose 기질을첨가하지 않았을때에는 4MDT(4-methylumbelliferyl-β-D N,N,N -triacetylchitotrioside) 에서만반응이 일어났다. 이는 N1 chitinase prompter가작용하지만 pwh1520의 xylose promoter 보다상대적으로적게발현이유도되는것으로짐작이된다. 그리하여 24 시간이지난후에야그활성이조금씩나타나는것이다. 그러나 B. amyloliquefaciens A-2 transformant 에서는기질첨가와는관계없이 24 시간이지난후에야 4-methylumbelliferyl-β-D N,N,N -triacetylchitotrioside 에서만반응이보였다. 또한 host 의종류에따라 chitinase 발현양상이약간틀려지는것이관찰되었다. - 77 -
Fig. 15. Chitinase activity using Fluorogenic 4-methlumbelliferine substrates 1, 2 : Supernatant of B. amyloliquefaciens A-2 transformant 3, 4 : Supernatant of B. subtilis 168 transformant 5, B. amyloliquefaciens A-2; 6, B. subtilis 168; 7, D.W 2, 4, 6 : 0.5% xylose induction - 78 -
제 5 절형질전환균주 (Bacillus subtilis 168) 의길항능조사 1. 연구수행방법 가. 형질전환체에의한잎곰팡이병포자발아억제능조사 Chitinase에의한항균물질활성 (antifungal activity) 을조사하기위해 chitinase 처리구는 Bacillus subtilis 168균주에 pbexwh1-4가형질전환된세균의배양상등액을이용하였고, 대조구로서 168균주에 pwh1520만삽입된형질전환체의배양상등액을이용하였다. 이때잎곰팡이병원균인 Fulvia fulva의 conidia suspension (1x10 5 conidia/ ml ) 을제조하고이에, 세균배양액의상등액 200 μl와병원균포자부유액 10 μl (1 x 10 3 conidia) 를혼합하여, 37 에서배양하였는데각처리구당 10개씩 3 반복으로시행하였다. 그후시간대별로 sampling하여포자발아율을관찰하였다. 대조구는세균을배양하지않은배지에 tetracycline (20 ul/ml) 을첨가한것을동량사용하였다. 1. 연구결과 B. subtilis 168/pBex WH-14 처리구는 chitinase 를분비하지않은대조구에비해 6 시간 이후부터포자발아율이확연히차이나기시작하였으며, 12 시간지난후부터는대조구와 2 배 가까운발아율의차이를나타내었다. 이는 Bacillus subtilis 168/pBex WH-14 형질전환체에서 분비되는 N1 유래의 chitinase 가포자발아율에영향을주는것으로사료되며, 이는 family 18 유래의 chitinase 는주로항균활성효과가없고, family 19 유래에서만항균활성이있다라는보고 에따라, 연구가더진행되어야할것으로사료된다 (Fig. 16). - 79 -
Fig. 16. Inhibition of spore germiation by N1 chitinase expressed in B. subtilis 168-80 -
제 2 세부과제 : 고항균활성키티나아제활성균주를이용한미생물제제제조기술확립 연구책임자 : 문병주 제 1 절서론 국제화시대인 21 세기에는고품질의고기능성채소활성을위해국제간의경쟁이치열해질것으로예상되며, 우리나라역시작물의수출가치를높이기위해모든작물의고품질화를목표로국산채소의소비를촉진시키고국가경쟁력을강화하여야한다. 이러한추세에미루어고품질활성을위한집중적인기술이필요하며, 특히최근에일고있는채소의이용증대효과를지속적으로뒷받침하기위해채소의재배법개발및병방제의연구개발이지속적으로이루어져야한다 ( 농림부, 2002). 최근, 생물학적인방법에의해농작물을보호하려는연구가활기를띠고있어, 생물학적제제의실용화가능성이부각되어외국에서는진균과세균을이용한주요미생물농약이상업적으로판매되고있다. 현재세계생물농약시장은전체농약시장규모약 300억달러 (97년기준 ) 의 3% 정도로소규모이지만, 2010년에는 500% 증가되어 430억달러의 10% 를차지할것이라고예측되고있으며, 미생물농약분야는년간 15~20% 의고속성장을지속하여 2013년에는생물농약의시장규모가세계적으로 50억불이될전망이다. 국내역시 2010년에는전체시장의약 10% 로증가하여약 1,220 억원의시장이예상되고있다. 미생물농약의제형화는저장, 배송및대상작물과토양에서적용방법이기존의화학적산물과는다른접근이필요한데, 미생물농약의안정성은적어도 1년이상은지속되어야한다. 길항세균에게안정적인영양공급을해야하며, 저장산물에서의독소의대사과정을제거해야하고, 세균을치사시키지않는범위에서대사활성을낮추어야한다 (David K Rodham, 1999). 또한, 길항세균의치사량을최소화하려면복합적인배지를사용하여세균을생장시켜야하고건조방지를위하여보호제를첨가하여안정성에있어유리하게조정해주어야한다. 국내외의토마토잎곰팡이병방제에관련된연구가미흡하고, 또한생물학적방제를위한미생물제제의개발또한전무하여, 토마토에발생하는잎곰팡이병을방제하고, 농가의수익을극대화하기위하여지속적인연구가이루어져야할것으로사료된다. 본연구에서개발한미생물농약이제품으로개발될경우, 국내공급은물론세계적으로토마토의주요활성국가로의수출이가능하며, 국내의토마토활성효율을증대시켜농가소득향상은물론전반적인농업경쟁력재고에기여 - 81 -
할수있을것이다. 제 2 절유용미생물의탐색및동정 1. 연구수행방법 가. 토마토잎곰팡이병발생과병원균분리및동정 1) 토마토잎곰팡이병발병율및병징조사 부산광역시강서구대저 2동소재토마토재배농가에서발생한토마토잎곰팡이병의발병율을 2005년 2월부터 3월까지조사하고이들의병징을수시로관찰하였다. 발병율은토마토재배플라스틱하우스 4동을 6구역 ( 구역당 200 60 cm ) 으로임의선정하여, 총토마토주수 (4동 100 주 6구역 ) 에대한이병주수를조사하여이병엽율로환산하였다. 이병엽율 (%) 은병반면적율을조사하여다음과같이환산하였다. 이병엽율 (%) = 계수 : 0- 발병무, ( 발병수 계수 ) 4 엽수 100 1- 병반면적율 1 5%, 2- 병반면적율 5.1 20%, 3- 병반면적율 20.1 40% 4- 병반면적율 40% 이상 2) 이병잎에서의병원균분리및공시병원균의포자부유액선발 가 ) 병원균분리 부산광역시강서구대저 2 동의토마토재배플라스틱하우스에서잎표면에소형의흰 - 82 -
색점무늬가나타나고, 뒷면에융단모양의균총이형성되어잎곰팡이병증상을보이는병든잎을 채집하여발병부위에서병원균총 45 균주를분리하였다. 병든토마토의잎을 면적이 1 cm 2 가되 도록잘라자른조각을 5.25% sodium hypochlorite에약 1분간표면살균한후살균수로 2 3번세척하고, 흡수지로물기를제거하여감자한천배지 (PDA, Potato Dextrose Agar) 와 streptomycin 50 ppm이첨가된물한천배지 (WA, Water agar) 에올려 22, 암조건의항온기에서 7일간배양하고, PDA 배지에 3회정도계대배양하여순수분리하였다. 분리된균주들은 PDA 사면배지에계대하여 22 에서 7일간배양한후, 4 저온냉장고에보관하면서실험에사용하였다. 나 ) 병원균의포자부유액선발병원균접종시분생포자의효과적인포자부유액선발을위한예비실험으로 24well culture plate를이용한방법과포트에분무접종하여이병엽율을조사하였다. 먼저 24 well plate에서는 PDB, 멸균수 (D.W) 와 30% tomato juice ( 상품명 : 가야 ) 처리구외에토마토전즙을이 용하여조사하였다.(Fig. 2). 각 well 당처리구 2 ml에공시균주를 20 μl (1x10 4 conidia/ ml ) 을접종 하여포자형성량을측정하였다. 또한, 분리된 45 균주를각각 PDA, OMA, V-8A 배지를공시하여 22 에서 16 일간배양한후생성된포자수를측정하여포자형성수가많은 PDA 배지를병원균배 양배지로선발하였다. 3) 병원성검정 가 ) 공시품종 토마토는현재농가에서통상적으로사용하고있는서광 ( 상품명 : 주이코 102) 품종을공 시하여생육상내와온실내포트검정및온실내토경검정에사용하였다. 나 ) 병원성검정병원성검정시접종원으로서분생포자의효과적인포자부유액선발을위하여 30% tomato juice( 상품명 : 가야 ) 외 PDB배지와 D.W. 등 3종류의분생포자부유액을공시하였고, 24 well culture plate를이용하여분생포자부유액선발실험에임하였다. 45균주중병원성이강한것으로확인된토마토잎곰팡이병균 Fulvia fulva TF 13균주를배양한 PDA 평판배지에멸균수를부어살균된면봉으로긁어내고 4겹의살균된거즈로균사를걸러내어포자부유액을만들었다. 부유액에첨가한분생포자의농도는 Hemocytometer를이용하여 1.0 10 5 conidia/ml로조정하였다. - 83 -
토마토는종자를플러그포트에파종한후 3~4엽이되었을때, 포트에이식하여본엽이 5~6엽정도되어 1화방이형성되기직전무렵의식물체를사용하였고, 20±2, 상대습도 90% 조건인생육상에서 24시간보관한후에잎의뒷면에공시한분생포자부유액이잎에맺힐정도로분무접종한후같은조건의생육상에서보관하였다. 토마토는각처리당 5주씩 3반복으로하였고, 접종 48시간후에플라스틱하우스로옮겨이병엽율 (%) 을조사하여병원성이가장강한균주를선발하여공시하였다. 나. 항균물질활성균및키티나아제활성균의분리및선발 1) 항균물질활성균의분리부산시강서구대저 2동의토마토재배포장에서병원균에길항능력을지니는유용미생물의분리를위해근권토양 1g에멸균수 10ml로현탁한후 warning blender로수초간혼합하고다시멸균된살균수를이용하여일정배율로희석한뒤, NA(Nutrient agar, Difco) 배지에 0.1ml씩도말하여 30 에서 1주간배양한평판배지에나타난균총을수회에걸쳐순수분리하였다. 균주들은장기간보존을위해 20% glycerol 용액에현탁시켜 deep freezer(-70 ) 에보관하면서실험에이용하였다. 가 ) 항균물질활성균의 1차선발 In vitro에서항균활성검정은 PDA배지상에서병원균인 Fulvia fulva TF13의균사절편과대치배양하여공시세균과병원균사이에형성되는저지대크기를조사하여항균활성이높은 9 균주를 1차로선발하였으며, 이를제차검정하여 2 균주를 2차항균물질활성균으로최종선발하였다. 나 ) 생육실내방제효과검정및최종선발분리한세균 600여균주들중에서 1차선발된길항세균 2균주를생육실내방제효과검정을실시하여우수한항균물질활성균을최종선발하였다. 토마토잎곰팡이병의방제효과검정방법은, NB배지에 24시간배양한 1차길항세균의부유액 (1 10 10 CFU/ml) 을각각포트당 50ml씩토마토잎의앞, 뒷면에분무접종하고 24시간후병원균 Fulvia fulva TF13 균주의분생포자부유액 (1 10 6 conidia/ml) 을처리하여 22, 상대습도 90% 이상생육실에 5일간보관후, 플라스틱하우스로옮겨 2일간격으로이병엽율 (%) 을조사하여방제가를환산하였다. - 84 -
다 ) 항균물질활성균 A-2 균주의항균물질에의한포자발아억제 선발된 A-2 균주에서활성되어지는항균물질활성균성물질의온도에대한영향및활 성조사방법을검토하기위하여병원균 TF13 균주의포자액 (1 10 5 conidia/ml PDA) 을 PDA 에 첨가하여배지를조제하였다. 항균물질활성균성물질시료는 A-2 균주를 NB 배지에서 2일간배양 (35, 180 rpm) 한다음상등액을냉동건조시킨시료를 100배희석하고, 각각 10, 20, 40, 80 μl으로양을달리하여병원균의포자가포함된배지에떨어뜨려 25 에서 4일간배양한후배지위에서형성되는 Inhibition zone을측정하였다. 2) 우수항균물질활성균 A-2균주의동정잎곰팡이병방제용우수항균물질활성균으로최종선발된 A-2균주를 API test, TEM을이용한형태관찰및 16S rdna gene sequence analysis 와 gyra sequwnce analysis를이용하여동정을실시하였다. 가 ) TEM(Transmission electronic microscopy) 을이용한형태관찰 A-2균주를 1일간 NA 배지에서배양한후세균현탁액을 3차증류수에 1/2, 1/4, 1/16, 1/32의순으로희석하고, grid를각각현탁액에뭍힌후, 1% aqueous uranyl acetate를떨어뜨려 1~2분방치한후에세균의형태와편모를관찰하였다. 이때, negative staining으로 grid 위에 1% aqueous uranyl acetate를처리한것을사용하였다. 나 ) 16S rdna gene sequence analysis A-2 균주의정확한동정을위하여, LB배지에서 1일간배양한각세균의 chromosomal DNA promega genomic DNA purification kit (Promega., U.S.A.) 를사용하여 genomic DNA를준비하고 (Chun, 1995), 이를 universal primer set를사용해 16S rdna를 PCR amplication하였다. PCR product를 QIAquick PCR purification Kit (QIAGEN Inc,. German) 를사용하여정제한후, pgem-t vector (Promega., U.S.A.) 에 cloning 하여, ABI 100 automated DNA sequence(takara Korea, Korea) 로분석하고, 이염기서열을기초로 NCBI 에 Blast 하여동정하였다. 다 ) grya sequence analysis Bacillus 속균에포함하는 A-2 균주의정확한속동정을위해 gyrase subunit A sequence 분석을실시하였다.Wizard genomic DNA extraction kit (Promega., U.S.A.) 를이요 - 85 -
하여각균주들의 genomic DNA를 Universal primer(p-gyra-f 5 CAG TCA GGA AAT GCG TAC GTC CTT3, p-gyra-r 5 CAA GGT AAT GCT CCA GGC ATT GCT3 ) 를이용하여 PCR amplication 하였으며, 이PCR product를 Qia Quick spin column (Qiagen Inc, German) 을이용하여다시정제한후 pgem-t vector (Promega Inc., U.S.A) 에 ligation후 E. coli로증폭하였다. plasmid extraction kit(atman bio, Korea) 를통해추출한 grya gene의 sequence를 NCBI의 blast을통해동정하였다. 다. 키티나아제활성균의분리및동정 1) 키티나아제활성균 CH-9와 CH-10의분리키티나아제활성이강한균주를분리하기위해서미리 chitin 분말을섞은토양을토마토재배하우스부근과산림에부엽토가많이쌓인토양에묻어두고 1~2 개월이지난후 colloidal chitin 이함유된배지에서키티나아제활성균주를분리하였다. 투명환이생긴균주를 50여종을분리하여가장활성이우수한균주를순수분리하였다. 이들을 0.5% colloidal chitin 배지에서다시계대하여그활성이재차검정하였다. 2) 키티나아제활성균 CH-67 분리예비실험에서선발된항균활성균 A-2 균주와키티나아제활성균 CH-10 균주의삼각플라스크배양에서의잎곰팡이병원균의균사억제가 100% 인데비해이들의미생물제제인 A2-H와 CH-10G제제를처리할경우방제가가다소저조해짐을관찰하고항균활성과키티나아제분비능을동시에가지는우수한미생물을지속적으로분리하였다. 이때, 침엽수림주변의 chitin이첨가된토양에서채취한토양 200 g을실험실로가져와토양산도를측정하고 10단계평판희석법으로 2% colloidal chitin이포함된 MG agar (Manitol 10 g, L-glutamic acid 2 g, KH2PO4 0.5 g, NaCl 0.2 g, MgSO4 0.2g, Agar 15 g, 1L D.W, ph 7.0) 배지에도말하여 25 incubator에배양하면서투명환을나타내는균주를선발하였다 3) 키티나아제활성균 (CH-9, CH-10 과 CH-67) 의동정잎곰팡이병방제용키티나아제분비능과우수항균물질활성균들인 CH-9, CH-10과 CH-67균주를 API test, TEM을이용한형태관찰및 16S rdna gene sequence analysis를이용하여동정을실시하였다. - 86 -
가 ) TEM(Transmission electronic microscopy) 을이용한형태관찰 CH-9, CH-10과 CH-67균주를 1일간 NA 배지에서배양한후세균현탁액을 3차증류수에 1/2, 1/4, 1/16, 1/32의순으로희석하고, grid를각각현탁액에뭍힌후, 1% aqueous uranyl acetate를떨어뜨려 1~2분방치한후에세균의형태와편모를관찰하였다. 이때, negative staining으로 grid 위에 1% aqueous uranyl acetate를처리한것을사용하였다. 나 ) 16S rdna gene sequence analysis CH-9, CH-10과 CH-67균주의정확한동정을위하여, LB배지에서 1일간배양한각세균의 chromosomal DNA promega genomic DNA purification kit (Promega., U.S.A.) 를사용하여 genomic DNA를준비하고 (Chun, 1995), 이를 universal primer set를사용해 16S rdna를 PCR amplication하였다. PCR product를 QIAquick PCR purification Kit (QIAGEN Inc,. German) 를사용하여정재한후, pgem-t vector (Promega., U.S.A.) 에 cloning 하여, ABI 100 automated DNA sequence(takara Korea, Korea) 로분석하고, 이염기서열을기초로 NCBI 에 Blast 하여동정하였다. 라. 선발항균및키티나아제활성균주에의한병원균생육억제효과검정 1) 플라스크내검정 2차실험에서는키티나아제활성균으로선발된 CH-9, CH-10 균주와 A-2 균주를단독또는혼합처리하고, 접종 3일후병원균의건중량을조사하여병원균생장억제효과를검정하였다. 병원균의균체량측정은 dry weight( 건중 ) 을사용하여측정하였다. Dry weight는배양액을 filter paper(whatman No.1) 를이용하여감압여과한후증류수로잔여배지성분을세척한다음 80 에서항량이될때까지건조하여질량을측정하였다. 포자의농도는 haemacytometer를이용하여측정하였다. 2) 현미경내균사억제능관찰 500 ml플라스크에 200 ml을넣고병원균을접종하고항균활성이높은 A-2 균주와 chitinase 활성균주를단독및혼합처리한후, 25, 150 rpm 조건에서 24시간배양하여항균물질활성균과키티나아제활성균, 두균주의단독또는혼합처리에의한병원균의생장억제효과를광학현미경상에서검경하였다. - 87 -
3) 항균물질활성균 A-2 균주와키티나아제활성균 CH-10 균주의동시배양에의한병원균의 생육억제 앞서우수한항균활성능력을나타낸 A-2 균주를키티나아제활성균과플라스크내단독 혹은혼합배양을통하여두균주의병원균생장억제능력의상승효과여부를검정하였다. 우선 500 ml플라스크에 PDB 200 ml을넣고병원균분생포자부유액 (1 10 4 conidia/ ml ) 을 5 ml씩접종하였 다. 25, 150rpm조건에서 24H 배양후, 길항세균인 A-2균주를 A 600=4.0 농도에서 10ml을접종하였으며, 키티나아제혼합처리구의경우키티나아제활성이높은것으로확인된 CH-10 균주의배양상층액 400ml을농축하여 0.2% 농도로첨가하였다. 3일간진탕배양후, 병원균의균체량을측정하여병원균생장억제효과를조사한결과 A-2 단독처리구에비하여 A-2와키티나아제혼합처리구에서다소높은억제효과를나타내었다. 마. 생육실내포트상에서의방제효과 1) A-2, CH-9, CH-10균주의단독및혼합처리에의한방제효과뛰어난항균물질활성을보이는 A-2균주와높은키티나아제활성을보이는 CH-9과 CH-10균주를각각, NB배지와 colloidal chitin이 3% 포함된 LB배지에 20시간배양 (30, 200 rpm) 한후 A 550 =1.0으로보정한세균부유액을각각 30일된성체식물에 A-2균주부유액은 30 ml과 50 ml씩골고루살포하고 CH-9과 CH-10균주부유액은 50 ml씩골고루살포한후생육실 (23.5, 상대습도 90% 이상 ) 에서하루동안보관하였다. 이때, Triflumizole는농약사용지침서에따라 3.00qofh 희석하여살포하였으며처리 24시간후 F. fulva TF13 균주의균사조각부유액을 A 550=0.4로보정하여포트당 10 ml씩토마토에접종하고생육실에 7일간보관하면서발병도를방제가로환산하였다. 2) CH-67 균주단독처리에의한방제효과 앞서의항균물질활성과 chitin 분해능이뛰어나선발된 CH-67 균주를먼저, NB 배지에 20 시간배양 (30, 200 rpm) 하고대량배양용배지로서 Pseudomonas 배양용기초배지에 3% 의현 미유 (Rice oil) 와 0.5% 의 (NH 4) 2SO 4 를첨가한배지에 3일간배양 (30, 350rpm, 1.5 atm) 한후배양액을세균과배양상등액으로나누어 30일된성체식물에 50 ml씩골고루살포하고생육실 (23.5, 상대습도 90% 이상 ) 에보관하였다. 이때, Triflumizole는농약사용지침서에따라 3.00qofh 희석하여살포하였으며처리 24시간후 F. fulva TF13 균주의균사조각부유액을 - 88 -
A 550=0.4 로보정하여포트당 10 ml씩토마토에접종하고생육실에 7 일간보관하면서발병도를방 제가로환산하였다. 2. 연구결과 가. 토마토잎곰팡이병발생과분리, 동정및병원성검정 1) 토마토잎곰팡이병의발병율및병징조사부산광역시강서구대저 2동의토마토재배농가에서발생한토마토잎곰팡이병의발병율을조사한결과, 2005년 2월과 3월의평균이병엽율은각각 28.8%, 16.7% 로조사되었으며 (Table 1), 초기의병징은잎표면에흰점무늬의소형점무늬가나타나다가병세가진전되면잎뒷면에융단모양의담황색균총이발생되면서병반이점차확대되었다. 이병은아래잎부터순차적으로발생하며병세가심해지면잎전체가황화되어말라죽었다 (Fig. 1). Table 1. Occurrence of leaf mold caused by Fulvia fulva on the tomato leaves at plastic house in Taejeo, Pusan. Plastic house Feb q Disease incidence (%) c March A b 32.0 21.1 B 29.7 14.1 C 24.4 19.4 D 29.2 12.3 Average(%) 28.8 16.7 a 2005 Year b Tested total of Tomato ; A, 2600 ; B, 2700 ; C, 2700 ; D, 2700 c Disease incidence (%) was made by estimating the number of tomato leaves infected by Fulvia fulva. - 89 -
Fig. 1. Symptoms of leaf mold of tomato caused by Fulvia fulva at Taejeo, Busan in 2005. - 90 -
2) 공시병원균및포자부유액선발성체토마토의이병엽에서 1차로분리한 45 분리균중예비실험을통해병원성이강한 TF13 등 6균주를선발하여배지의조성에따른분생포자형성량에미치는영향을조사하고이들중가장병원성이우수한병원균을최종선발하였다. 이때, 병원균포자부유액의영양배지로 PDB 배지, tomato juice 30% ( 상품명 : 가야 ), 토마토전즙, 살균수를선정하여각병원균의분생포자부유액을제조하고최종분생포자농도를 1 10 4 conidia/ ml으로조정하여 24-well culture의각 well 당 2 ml씩분주하여매일포자형성량을관찰하였다. 그결과, 총 6 균주모두 PDB 배지와 30% tomato juice 의분생포자부유액에서 1.1 10 6 conidia/ ml이상의분생포자형성량을보였는데, 이는전반적으로살균수의 1.1 10 4 conidia/ ml와토마토전즙의 6.0 10 5 conidia/ ml보다도우수하였다 (Table 2). 또한, PDB와 tomato juice 30% 의분생포자부유액에서각각 TF4와 TF13 균주가분생포자형성량이우수하여 1차로선발되었다 (Fig. 2). Table 2. Selection of suitable inoculum medium for the pathogenicity by various Fulvia fulva strains. 3days inoculum boiled tomato PDB leaf 30% tomato juice sterile water TF3 1.1 10 6 2.5 10 5 2.6 10 6 1.0 10 4 TF4 2.1 10 6 2.5 10 5 2.6 10 6 1.0 10 4 TF6 1.4 10 7 1.0 10 4 1.8 10 7 1.0 10 4 TF10 1.6 10 6 2.5 10 5 4.1 10 6 1.0 10 4 TF11 1.3 10 6 6.0 10 5 3.0 10 6 1.0 10 4 TF13 5.0 10 6 1.3 10 5 2.7 10 6 1.0 10 4-91 -
30% tomato juice boiled tomato leaf Potato destrose broth Distilled water Fig. 2. Experiment for selection of suitable inoculum medium for Fulvia fulva. 또한, 이후의모든생육상내포트검정을위해성체토마토에적용될효과적인분생포자부유액을최종선발하였는데, tomato juice 30%( 상품명 : 가야 ), PDB, 살균수등의분생포자부유액을 1 10 4 conidia/ ml농도로토마토에처리하고이병엽율을조사한결과, TF13 균주의경우 PDB 배지처리구에서 2일째이후부터병이발생하기시작하여접종 4일째에 81.5% 발병율을보였고, tomato juice 30% 처리구와살균수처리구에서는각각 100% 와 0% 로대부분의균주에서발병이너무심하거나전혀발병이일어나지않아분생포자부유액으로부적합한것으로조사되었다. 따라서, 최종적으로, 4일째에 82.6% 의가장적절한발병율을보인 TF13 균주를공시병원균으로선발하였고, PDB배지를가장효과적인분생포자부유액의영양배지로최종선발하였다 (Table 3). - 92 -
Table 3. The disease incidence of leaf mold caused by F. fulva strains isolated on tomato in growth chamber Disease incidence (%) a 4 days 6 days 8 days Isolates tomato tomato tomato PDB juice D.W. PDB juice D.W. PDB juice D.W. 30% 30% 30% TF3 34.2% 100% 0% 45.6% 100% 0% 46.0% 100% 0% TF4 80.4% 95.6% 0% 81.0% 97.0% 0% 81.5% 97.0% 0% TF6 80.5% 90.7% 0% 81.3% 92.5% 0% 82.0% 92.8% 0% TF10 70.8% 100% 0% 72.3% 100% 0% 72.3% 100% 0% TF11 55.6% 100% 0% 57.5% 100% 0% 58.2% 100% 0% TF13 81.5% 100% 0% 82.4% 100% 0% 82.6% 100% 0% 3) 병원성검정앞서 24-well culture에서선발된 TF4균주와 TF13균주를이용한 PDB 분생포자부유액를각포트당 30ml씩분무접종하여최종적으로병원성을검정한결과, 5일째에 TF4와 TF13 균주의발병도가각각 84.4%, 97.0% 로높은병원성을나타내었고, TF13균주가 TF4균주보다전반적으로병원성이높아공시병원균으로최종선발되었다 (Table 4, Fig. 3). Table 4. Disease incidence of leaf mold caused by Fulvia fulva strains on tomato in a growth chamber Isolates Disease incidence (%) a 1 days 3 days 5 days 7 days TF4 24.7% 77.9% 84.4% 90% TF13 24.5% 80.1% 97.0% 100% - 93 -
Fig. 3. Fulvia fulva TF13 isolated from diseased tomato at Taejeo, Busan in 2005-94 -
나. 항균물질활성균주선발및동정 1) 우수항균물질활성균분리 가 ) 항균물질활성균의 1차선발토마토재배하우스의근권토양및건전토마토잎으로부터분리된 600여균주를잎곰팡이병균과대치배양한결과 9 균주중 1차우수활성균으로선발하였는데그중에서도이들의균사생육저지효과를 PDA 평판배지상에서조사하였다. A-2와 A-7 균주가각각 8.4 mm, 6.7 mm로가장높은저지대를나타내었다 (Table 5, Fig. 4). Table 5. Inhibition of 9 bacterial isolates against the mycelial growth of Fulvia fulva TF13 on PDA medium Isolates Inhibition zone( mm ) * KT25 5.5c RH-1 6.2b LY11 5.9b N1 4.3c A-2 8.4a A-7 6.7b pro-eb-15 4.7c CT11 5.1c CT13 5.8b * Antibiotic production was determined by inhibition zone on PDA after 14 days incubaton - 95 -
Fig. 4. Growth inhibition of Fulvia fulva TF 13 by antagonistic bacterium A-2 on PDA medium 나 ) 생육실내방제효과검정및최종선발앞서 1차선발된 9균주의세균부유액을포트에정식한뒤 10일된토마토잎에처리하고생육상에 24시간보관한뒤, TF13 병원균의분생포자부유액을접종하여토마토잎곰팡이병에대한방제효과를검정하였다. 그결과, A-2 균주가 78.6% 로방제효과가가장높았고다음으로는 A-7 균주가 66.2% 이었다. 따라서, A-2 균주를토마토잎곰팡이병방제용우수항균물질활성균으로최종선발하였다 (Table 6). - 96 -
Table 6. Disease control effect of 9 isolates of antagonistic bacteria against Fulvia fulva TF13 Isolates 9 days after Disease incidence (%) Control value (%) a KT25 + Pa b 58.3 41.7d RH-1 + Pa 51.0 49.0d LY11 + Pa 56.6 43.4d N1 + Pa 49.3 50.7c A-2 + Pa 21.4 78.6a A-7 + Pa 33.8 66.2b pro-eb-15 + Pa 47.2 52.8c CT11 + Pa 63.3 36.4e CT13 + Pa 61.9 38.1e Pathogen only 100 0.0f Control 0.0 100a a Means followed by the same letter are not significantly different according to Duncan's multiple range (P=0.05%) b Pa = pathogen (F. fulva TF13) 다 ) 항균물질활성균 A-2 균주에의한포자발아억제 최종선발된 A-2 균주에서활성되어지는항균성물질의병원균포자발아억제능을조 사하기위해먼저, 병원균 TF13 균주의분생포자부유액을 1 10 5 conidia/ml 농도로보정하여 PDA배지상에도말하고, 여기에배양농축액시료를농도별 (10, 20, 40, 80 μl) 로달리하여살균된여과지에집적한후 25C에서 7일간배양하였다. 이때, 시료는열에대한안정성을위해 100 에서 10분간끓인후사용하였다. 그결과, 모든농도에서항균활성이관찰하였으며, 처리농도가높아질수록저지대 (inhibition zone) 의크기도증가되었다 (Fig. 5). - 97 -
Fig. 5. A plate assay showing fungal growth inhibition by culture supernatant concentrate of the A-2 isolate. the A-2 culture supernatant was 100-fold concentraed by freeze-dry method. (A) 10 μl; (B) 20 μl; (C) 40 μl; (D) 80 μl. 2) 우수항균물질활성균 A-2 균주의동정항균물질활성균 A-2 균주의동정을위하여먼저형태학적조사결과, 전형적인간균의형태를보였으며, 운동성을지닌편모가관찰되었다 (Fig. 6.). 또한, A-2 균주의정확한동정을위해 16s rrna 분석을통하여 Bacillus sp. 와 99%, Bacillus subtilis와 99% 그리고 B. amyloliquefaciens와는 98% 의유사성이있음을확인하였다 (Fig. 7). 하지만, Bacillus종의경우종래의생화학적특성에따른분류방법으로정확하게구분하기가어려운것으로알려져있고, 16S rrna 분석법의경우근접한종에서의염기서열의유사도 (99.2~99.6% 염기서열유사도 ) 가거의비슷하여확실한결론을내릴수가없었다. 그러나, 최근에는높은유전자변이율을가지는단백질유전자를분석하여세균의분류에응용하는방법들이개발 (Ash 등, 1991; Nakamura, 1999) 되어, 이들방법중 gyrase A 유전자의염기서열분석에의한 Bacillus종의동정분류법을이용하여동정하고자하였다 (Chun & Bae (2000). gyrase A 유전자증폭을위해 p-gyra-f(5'-cag TCA GGA AAT GCG TAC GTC CTT-3') 와 p-gyra-r(5'-caa GGT AAT GCT CCA GGC ATT GCT-3') 의프라이머를사용하여 gyrase A 유전자를 PCR로증폭한후 PCR fragment를 partial sequence 를 GeneBank에서 BLAST를이용하여검색한결과, B. amyloliquefaciens와 95% 의유사도를보 였다 (Fig. 8). 결론적으로 A-2 균주의동정을위해 최종적으로 B. amyloliquefaciens 로동정되었 - 98 -
으며, 본균주를 B. amyloliquefaciens A-2으로명명하였다. 현재까지 B. amyloliquefaciens의길항능에대한보고에의하면식물병원균의세포벽성분중의하나인 chitin을분해시킴으로서용균작용을유도하는키티나아제연구를중심으로많은보고가있다 ( 한등, 2001; Wang 등, 2002). 그러나본연구에서분리된 A-2 균주의경우는키티나아제활성능이없는것으로확인되어항균활성물질만으로도높은길항능을발휘하는것으로사료된다. Fig. 6. Transmission electron microscope (TEM) image of antagonistic bacteria A-2. - 99 -
Fig. 7. Phylogenetic analysis of 16S rdna sequence of the strain A-2 with other Bacillus species. The relative branch length of this dendrogram indicates the distance between the different strains. - 100 -
Fig. 8. Phylogenetic analysis of gyra gene sequence of the strain A-2 with other Bacillus species. The relative branch length of this dendrogram indicates the distance between the different strains. - 101 -
다. 키티나아제활성균의분리및동정 1) 키티나아제활성균 CH-9와 CH-10의분리토마토재배하우스의건전한근권토양으로부터채집한토양 sample을멸균수로희석하여 0.5% colloidal chitin이함유된 NB 배지에서키티나아제분비세균을분리하였다. 72시간동안배양된세균에서키티나아제활성을보이는투명환을형성하는균주들을 1차선발하였으며, 그결과 CH-9 와 CH-10 균주가가장높은활성을나타내어키티나아제분해능이우수한균주로 1차선발되었다 (Fig. 9). Fig. 9. Chitinase activity shown on colloidal chitin agar plate by the strain CH-9 and the strain CH-10. The photograph was taken after 72 hrs culture at 35. - 102 -
2) 키티나아제활성균 CH-67의분리 Chitin을정기적으로 enrichment한토양에서 2차로약 50여균주를분리한후키티나아제활성조사와잎곰팡이병원균 F. fulva TF13에대한포자발아억제효과를 PDA 평판배지에서조사한결과, 분리균중에서 CH-67 균주에서가장투명환이크고잎곰팡이병원균의포자부유액이도말된평판배지에서도항균활성을나타내어키티나아제분해와항균활성을동시에가지는우수균주로선발되었다 (Fig. 10) Fig. 10. Chtinase activity shown on 0.1% colloidal chitin agar plate and growth inhibition of F. fulva on PDA by the strain CH 67-103 -
3) 키티나아제활성균의동정 가 ) CH-9 균주키티나아제활성균주 CH-9 균주의동정을위하여먼저투과전자현미경 (TEM) 을이용한형태적특성을조사한결과, CH-9 균주는간상형의형태를보였으며 (Fig. 11), 정확한동정을위해 16s rrna 영역의염기서열을분석한결과, Paenibacillus pabuli (AB056094) 의 16s rdna 염기서열과 99% 의높은상동성을나타내었고, Paenibacillus amylolyticus (AY509233) 와 Paenibacillus xylanilyticus (AY427832) 와도높은유연관계를나타내었다 (Fig. 12). Fig. 11. Transmission electron microscope (TEM) image of the strain CH-9. - 104 -
Fig. 12. Phylogenetic tree by 16S rrna gene analysis of Paenibacillus pabuli CH-9. indicates soil clones. Bootstrap values are shown for each node that had 50% support in a bootstrap analysis of 1,000 replicates. The scale bar indicates 0.1 change per nucleotide. 나 ) CH-10 균주 CH-10 균주의동정을위한 TEM 사진촬영결과, 단간균의형태적특성을지녔으며, 세포직경크기는 0.34 0.65 μm였다 (Fig. 13). 한편, 생리생화학적특성조사는 Table 7과같으며아래와같다 (Table 7). 또한, 보다정확한동정을위하여 16s rdna 영역의염기서열을분석한결과, CH-10 균주는 Cellulosimicrobium cellulans DSM43879의 16s rdna 염기서열과 99% 의높은상동성을나타내었으며, Cellulosimicrobium funkei와비교적높은유연관계를나타내었다 (Fig. 25.). 그러나, 생화학적특성조사에서 Cellulosimicrobium cellulans와근접하여이를 Cellulosimicrobium cellulans CH-10으로최종동정명명하였다. - 105 -
Fig. 13. Transmission electron microscope (TEM) image of the strain CH-10. - 106 -
Table 7. Analysis of physiological and cellulans and the CH-10 strain biochemical characteristics of Cellulosimicrobium Chacteristic Cellulosimicrobium cellulans the CH-10 strain colony type circular, cinvex circular, cinvex color yellow-whitish yellow-whitish Utilization of: Glucose + + mannose + + maltose + + sucrose + + D-xylose + + L-arabinose + + D-ribose + + m-inositol + - glycerol + + cellobiose + + lactose + + gluconate + + mannitol + - pyruvate + + raffinose - - Starch hydrolysis + + Gelatin liquefy slowly slowly Catalase produced + + Nitrate reduction + + - 107 -
Fig. 14. Phylogenetic tree by 16S rrna gene analysis of Cellulosimicrobium cellulans CH-10. indicates soil clones. Bootstrap values are shown for each node that had 50% support in a bootstrap analysis of 1,000 replicates. The scale bar indicates 0.1 change per nucleotide. 다 ) CH-67의동정 CH-10 균주의동정을위한 16s rdna 영역의염기서열을분석한결과, CH-67 균주는 Burkholderia cepacia complex group 의염기서열과 99% 의높은상동성을나타내어이를 Burkholderia cepacia CH-67 으로최종동정명명하였다 (Fig. 15). - 108 -
Fig. 15. Phylogenetic tree by 16S rrna gene analysis of Burkholderia cepacia CH-67. indicates soil clones. Bootstrap values are shown for each node that had 50% support in a bootstrap analysis of 1,000 replicates. The scale bar indicates 0.1 change per nucleotide. - 109 -
라. 선발항균물질활성및키티나아제활성균에의한병원균생육억제효과검정 1) 플라스크내검정 500ml플라스크에 PDB 200ml을제조하여넣고잎곰팡이병원균 F. Fulva TF13 균주를접종하고여기에항균활성균주인 A-2 균주및키티나아제활성균주인 CH-9와 CH-10 균주를단독또는혼합접종하여 25, 150 rpm 조건에서배양한지 3일후건중량을조사하여병원균생장억제효과를조사하였다 (Table 8). 그결과, A-2 단독처리에서는병원균의건중량이 1.06 mg으로각각 CH-9와 CH-10 균주에의한 1.95 mg와 1.35 mg보다낮게조사되어항균물질활성균주 A-2가키티나아제활성균주인 CH-9 와 CH-10균주보다병원균단독처리구의 2.6 mg에비해약 50% 정도의병원균균사생장의감소율을보였다 (Table 8). 한편, 혼합처리구인 A-2+CH-9의경우 1.00 mg과 A-2+CH-10의경우에는 0.87 mg으로단독처리보다혼합처리가전반적으로효과적이었다. 따라서 B. amyloliquefaciens A-2균주와 C. cellulans CH-10균주의단독처리보다는혼합처리할경우가장병원균균사생육의억제효과가높은것으로확인되었다 (Table 8). Table 8. Inhibition effects of mycelial growth of Fulvia fulva TF13 by inoculating with antifungal strian A-2 isolate and/or with 키티나아제 producing strain CH-9. CH-10 in PDB media Isolates mycelial dry weight of Fulvia fulva TF13 ( mg, 10 days after) A-2 +Pa 1.06 d CH-9 +Pa 1.95 b CH-10 +Pa 1.35 c A-2+CH-9 +Pa 1.00 d A-2+CH-10 +Pa 0.87 e Pathogen (Pa) only 2.60 a Control 0.00 f 2) 현미경내균사억제능관찰 앞서각처리구에의한병원균생육억제에대한활성조사를광학현미경상에서검경한결 과, 항균물질활성균또는 chitinse 활성균을처리하지않은대조구에서는병원균의균사체가정상 - 110 -
적으로생육하였으나, A-2 처리구에서는빨간색색소와함께병원균의균사체가엉켜져더이상생장하지못하고사멸되어지는현상을관찰할수가있었다 (Fig. 15). 한편, CH-10균주단독처리구의경우에는 A-2 처리구와는달리균사의세포벽이분해되어세포내물질이용출되어지는것을관찰할수있었다. 따라서이러한현상은 CH-10 균주에서생산되는키티나아제에의한세포벽의분해에의한것으로판단되어진다 (Fig. 16). (A) (B) Fig. 15. Microscopy of the mycelium of Fulvia fulva TF13 co-cultured with B. amyloliquefaciens A-2 strain for 2 days at 25. A 200 ml PDB media was inoculated with 1 10 4 conidia/ml. After incubation for 1 day, the A-2 culture (OD550=2.0) 10 ml was inoculated in mycelim culture. This photograph was taken at 2 days after the A-2 inoculation. (A) pathogen only; (B) pathogen co-cultured with the A-2 isolate. - 111 -
(A) (B) Fig. 16. Microscopy of the mycelium of Fulvia fulva TF13 co-cultured with C. cellulans CH-10 strain for 2 days at 25. A 200 ml PDB media was inoculated with 1 10 4 conidia/ml. After incubation for 1 day, the CH-10 culture (OD550=2.0) 10 ml was inoculated in mycelium culture. This photograph was taken at 2 days after the CH-10 inoculation. (A) pathogen only; (B) pathogen co-cultured with the CH-10 isolate. 3) A-2 균주와 CH-10균주의동시배양에의한병원균의생육억제효과키티나아제활성을유도하는 colloidal chitin이함유된 LB배지 400 ml에 CH-10 균주의배양상등액을동결건조한시료를첨가하고여기에길항세균 A-2 균주를병원균에동시접종하여길항세균과키티나아제활성에의한균사생장억제의상승효과를조사하고자하였다. 이때, CH-10 균주를의배양상등액동결건조하여 A-2 균주와함께병원균배양액에접종해서균사체의생육억제효과를관찰하였다. 그결과, A-2 단독처리구에비해서 CH-10 균주의배양상등액시료가첨가된처리구에서더효과적인균사체억제현상이나타났다 (Fig. 17). - 112 -
Pathogen only A-2 A-2 + chitinase Fig. 17. Synergic effect of B. amyloliquefaciens A-2 and the crude 키티나아제 of C. cellulans CH-10 against the mycelium growth of Fulvia fulva TF13. The fungus Fulvia fulva was co-cultured with the A-2 strain and the CH-10 crude enzyme for 2 days at 2 5. A 200 ml PDB media was inoculated with 1 10 4 conidia/ml. After incubation for 1 day, the A-2 culture (OD550=2.0) 10 ml and the CH-10 crude enzyme were inoculated in mycelim culture. This photograph was taken at 2 days after the inoculation. The CH-10 crude enzyme was prepared by lyophilized 400 ml of the LB broth culture with colloidal chitin of CH-10. - 113 -
마. 생육실내포트상에서의방제효과 1) A-2 CH-9, CH-10 균주의단독및혼합처리에의한방제효과병원균생육억제효과가높았던항균물질활성균 B. amyloliquefaciens A-2 균주와키티나아제활성균주 P. pabuli CH-9, C. cellulans CH-10 균주를이용하여포트내방제효과를검정하였다. 그결과, A-2 균주의단독처리구의경우세균부유액 50 ml 처리구가 30 ml처리구보다유의성은없으나 83.7% 로방제가가높았으며, A-2 균주단독처리구보다 CH-9, CH-10 균주의혼합처리한처리구의방제가가각각 90.3, 86.6% 로나타내어유의성이없었다. 따라서, 항균활성균과키티나아제활성균의혼합처리에의한방제효과에대한상승효과가확인되지않았다 (Table 9). Table 9. Disease control of antifungal and 키티나아제 activity bacterial isolates against leaf mold caused by Fulvia fulva TF 13 on tomato at pots in a growth chamber Isolates 9 days after of antiagonistic bacteria Disease incidence (%) Control value (%) A-2 (30ml a ) 28.8 71.2b A-2 (50ml) 16.3 83.7ab CH-9 37.4 62.6c CH-10 35.9 64.1c A-2 (30ml)+CH-9 26.0 74.0b A-2 (30ml)+CH-10 26.9 73.1b A-2 (50ml)+CH-9 9.7 90.3a A-2 (50ml)+CH-10 13.4 86.6a Pathogen only 100 0.0de Control 0.0 100a a 50ml, 30ml ; quality of treated bacterial suspension 2) CH-67 균주단독처리에의한방제효과추가로선발된키티나아제활성세균 CH 67 균주를삼각플라스크및발효기에서배양하여정식한지 3~4주된토마토에처리하여토마토잎곰팡이병원균에대한방제효과를생육실내포트에서검정하였다. 그결과, 플라스크배양에서의세균배양액 (cell culture, 항생물질 + 세균 ), 배양상등액 (supernatant, 항생물질 ), 세균집균액 (cell suspension, 세균부유액 ) 처리구는각각 98.7%, 98.0%, 93.5% 의방제가가조사되었으며서로간의유의차는없었다. 또한, 발효기내배양에서는세균배양액 (cell culture, 항생물질 + 세균 ), 배양상등액 (supernatant, 항생물질 ), 세균집균액 (cell suspension, - 114 -
세균부유액 ) 처리구에서각각 91.3%, 96.7%, 95.0% 로플라스크배양과마찬가지로매우높은방제가를나타내었다 (Table 10, Fig. 18) 이상의실험결과. 토마토잎곰팡이병균에대하여항균물질활성균으로확인된 B. amyloliquefaciens A-2 균주는 in vitro 와 in vivo 실험에서우수길항균으로최종선발되었다. 또한, Chitinase 활성균으로확인된 CH-9, CH-10 와 CH-67 균주도 in vitro와 in vivo 실험결과우수길항균으로최종선발되었다. Table 10. Disease control effects of culture, cell, supernatant of B. cepacia CH-67 and chemical fungicide against leaf mold caused by F. fulva on treated tomato plants in a growth chamber Culture conditions flask culture Treatments 2 days Disease severity (%)a Control value (%)b cultures+pa 1.1 1.1 0.4 98.7 (±1.3) ab supernatant+pa 1.1 0.4 1.8 98.0 (±3.6) ab cell+pa 3.2 4.0 3.6 93.5 (±0.7) ab fermenter culture cultures+pa 7.9 4.0 2.5 91.3 (±5.1) b supernatant+pa 1.8 2.2 1.4 96.7 (±0.8) ab cell+pa 2.5 4.0 1.8 95.0 (±2.8) ab Triflumizole 3.6 6.5 2.5 92.4 (±3.8) ab Pathogen(Pa) only 61.5 58.3 45.7 0.0(±0.0) c Control 0.0 0.0 0.0 100 (±0.0) a a : Disease severity index (%) was made by estimating the percent (%) of infected leaf area on each plant by F. fulva TF13 b : Control value (%) = [(Disease severity index in control plants Disease severity index in treated plants) / Disease severity index in control plants] x 100-115 -
Fig. 18. Disease control effects of bacterial cultures from a flask culture, cell free culture supernatant from a fermentation and chemical fungicide against the leaf mold caused by F. fulva TF13 on tomato plants in a growth chamber. - 116 -
제 3 절항균물질활성균의대량배양기술확립 1. 연구수행방법 가. B. amyloliquefaciens A-2 균주의최적배양조건확립 1) 삼각플라스크배양 가 ) 최적배양시간, 생육온도 ph의영향잎곰팡이병균 (TF 13) 에대하여우수한길항력을보인 A-2 균주의최적배양시간, 생육온도및 ph를조사하였다. 최적배양시간의검정방법은 NB배지에서 24시간종균배양한 A-2균주의세균부유액 5 ml을 500 ml의삼각플라스크의 NB배지에접종하여 35 에서 160 rpm 으로 24시간진탕배양하여매 2시간마다증식정도를조사하였다. 각시료는 10배희석하고 spectrophotometer (550 nm ) 에서 OD값을측정였다. 앞서의생육조사에서와동일한방법으로생육온도및 ph의영향을조사하였다. 온도범위는 5 간격으로 20~45 사이에서실시하였고, ph의영향조사는 ph 4~8사이에서 ph 1 간격으로조사되었다. 24시간배양한각시료는 10배희석하여분광광도계 (spectrophotometer, Pharmacia, Biotech, UK) 에서 OD값을조사하였다. 나 ) 탄소원우수길항세균인 A-2 균주의생장과항균물질활성에효과적인배지를선발하기위하여, 질소원 yeast extract 0.5% 가포함된기초배지 (0.05% K 2 HPO 4, 0.05% MgSO 4 7H 2 O, 0.0005% MnCl 2 4H 2 O, 0.0005% CaCl 2 2H 2 O, 0.0025% FeSO 4 7H 2 O) 에저분자탄소원 4종류 (glucose, fructose, lactose, sucrose) 와고분자탄소원 4종류 (corn starch, rice oil, rice flour, molasse, ) 의탄소원 3.0% 를종류별로첨가하여공시길항세균을접종후 3일간진탕배양 (35, 180 rpm) 하였다. 이때, 균주의증식조사를위해 24, 36, 48시간째균체를회수하여 10단계희석평판도말법으로생균수를측정하였다. 대조구로는 NB배지를사용하였다. 다 ) 질소원 A-2 균주의생육에미치는질소원의영향을조사하기위해기초배지에앞서의실험에서 공시세균증식에효과적인탄소원으로확인된 3% rice oil ( 상품명 : 세림현미 ) 를첨가하고질소원 - 117 -
2 종류 (yeast extract, NH 4NO 3) 을각각 0.5% 로첨가하여세균부유액 (A 550=1.0) 1 ml을접종한 후진탕배양 (35, 180 rpm) 한뒤 30 시간째균체를회수하여 10 단계희석평판도말법으로생균 수를측정하였다. 2) 발효기배양발효기 (7 L jar fermenter) 에삼각플라스크실험에서우수하였던 rice oil ( 세림현미 ) 과 yeast extract를 4 L의기초배지에각각 3%, 0.5% 씩첨가하고 NB배지에종균배양된길항세균 A-2를 400 ml접종한후 35, 350 rpm, 1.5 atm에서 72 시간배양하였다. 발효가진행되는동안배양기내의생균수를 24시간간격으로 72시간까지측정하여발효기배양에서의생균밀도를검정하였다. 나. 키티나아제활성균주의최적배양조건 1) 최적배양온도와 ph 앞서의생육조사와동일한방법으로수행하며온도는 5 간격으로 25~40 사이에서조사하고, ph는 ph 1의간격으로 5~8사이에서조사되었다. 각시료는 10배희석하고 spectrophotometer를사용하여 chitinase activity (mu/ ml ) 를측정하였다. 각처리구당 5반복, 3회실시하였다. 2) 탄소원길항세균 A-2 균주의대량배양을위한탄소원선발실험에서와같은방법으로행하였으며, 대조구로서 LB배지와 0.5% colloidal chitin이포함된 LB배지를추가하여키티나아제활성량을조사하였다. 다. B. cepacia CH 67 균주의최적배양조건확립 1) 삼각플라스크배양 가 ) 탄소원 200 ml Pseudomonas 배양용기초배지 (K 2HPO 4 0.125%, MgSO 4 7H 2O 0.001%, KH 2 PO 4 0.038%) 에탄소원 (Glucose, Lactose, Fructose, Ethanol, Sucrose, Glycerol) 을각각 - 118 -
3% 되도록 500 ml용삼각플라스크에첨가하였다. 여기에 NB배지에서 24시간동안전배양한세균부유액 (A 550 =1.0) 1 ml을접종하고 65시간동안진탕배양 (30, 180 rpm) 하여배양액을회수하여분광광도계 (550 nm ) 로 O.D 값을측정하였다. 이때대조구로는기초배지를사용하였다. 또한고분자물질 (Rice oil, Rice bran, Wheat bran, Sun cremy, Corn starch, Yeast food) 을기초배지에 3% 되도록첨가하여 NB배지에서 24시간동안전배양한세균부유액 (A 550 =1.0) 1 ml을접종하고 78시간동안진탕배양 (30, 180 rpm) 하여 24시간간격으로균체를회수하여 10단계희석평판도말법으로생균수를측정하였다. 나 ) 질소원 CH-67균주의생육에미치는질소원의영향을조사하기위해기초배지에탄소원으로 Glucose (3%) 를첨가하고공시된저분자질소원 ((NH 4 ) 2 SO 4, NH 4 Cl, KNO 3 ) 을각각 0.5% 로첨가하여, 세균부유액 (A 550=1.0) 1 ml을접종한후 64시간동안진탕배양 (30, 180 rpm) 한뒤배양액을회수하여분광광도계 (550nm) 에서측정하였다. 이때대조구로서기초배지를사용하였다. 2) 발효기배양 Pseudomonas 배양용기초배지 4 L에삼각플라스크배양에서선발된질소원 (NH 4 ) 2 SO 4 0.5% 와고분자물질인 Rice oil, Wheat bran, Rice bran 을각각 3% 로첨가하여 7 L 발효기에넣은후, 전배양된 CH-67균주부유액 (A 550=1.0) 400 ml을접종하고 300 rpm, 1.5 atm, 30 의환경하에서배양하면서 12시간간격으로 96시간까지배양액내 ph와 D.O값의변화를측정하고균체를획득하여 10단계희석평판법을통하여생균수를검정하여최적배양조건을최종적으로확립하였다. 2. 연구결과 가. B. amyloliquefaciens A-2 균주의최적배양조건확립 1) 항균물질활성균 A-2 균주의배양적특성조사 가 ) 삼각플라스크배양 - 119 -
(1) 배양시간, 생육온도및초기 ph의영향우수길항균으로선발된 B. amyloliquefaciens A-2 균주의최적배양조건을조사한결과, A-2 균주는배양 14 시간째최대값에도달하였으며 24시간이후에는서서히감소하는양상을보였다 (Fig. 19). A-2균주의증식에적합한온도는 35 에서 A 550=0.8로세균밀도가가장높아적합하였으며, 그다음으로 30, 40 순이었고, 25 이하와 45 에서는세균밀도가낮았다 (Fig. 20). 한편, 배양액의초기 ph가 4.0일때는세균의생육이대부분저지되는것을확인하였고, ph 5와 ph 8에서는생육정도가양호하였으나, ph 6과 ph 7에서세균밀도가가장높았다 (Fig. 21). 1.2 Optical dencity(550 mm ) 1 0.8 0.6 0.4 0.2 A-2 0 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 In c u batio n pe rio ds Fig. 19. Growth curve of B. amyloliquefaciens A-2 strain in NB medium at 35 for 24 hours. - 120 -
Optical dencity(550 mm 1 0.8 0.6 0.4 0.2 e d b a * c 24 hr d 0 20 25 30 35 40 45 Temp.( ) Fig. 20. Effect of temperature ( ) for the growth of B. amyloliquefaciens A-2 strain in NB medium for 24 hours. * The same letter indicates the means are not significantly different (P< 0.05) based on Duncan's multiple range test. Optical dencity(550 mm ) 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 24 hr b c a * 4 5 6 7 8 ph a b Fig. 21. Effect of ph for the growth of B. amyloliquefaciens A-2 strain in NB medium for 24 hours. * The same letter indicates the means are not significantly different (P< 0.05) based on Duncan's multiple range test. - 121 -
(2) 탄소원플라스크배양에서탄소원이세균생장에미치는영향을조사하기위해질소원 (yeast extract) 이 0.5% 포함된기초배지에저분자와고분자탄소원을각각 3.0% 씩첨가한후, A-2균주의세균부유액 (1.0 10 8 cfu/ ml ) 를접종하고 3일간진탕배양하여균주의증식정도를조사하였다. 그결과, 저분자탄소원은 lactose와 sucrose가 24시간배양시각각 5.0 10 10 cfu/ ml, 1.0 10 10 cfu/ ml로높았으며 (Table 11), 고분자탄소원에서는현미유가 24시간배양시가장높은세균밀도인 5.1 10 12 cfu/ ml를나타내었다 (Table 12). 현미유는 72시간배양까지는시간이지남에따라밀도가다소낮아지는양상을보이나, 다른처리구보다는높은세균밀도를나타내어현미유를 A-2균주의생육에우수한탄소원으로선발되었다. Table 11. Effect of low molecular weight of carbon sources on the growth of Bacillus amyloliquefaciens A-2 at 35, 180 rpm in a flask culture Carbon sources Cell density (cfu/ ml ) a 24 hrs 36 hrs 48 hrs glucose 1.0 10 9 1.2 10 9 9.0 10 8 fructose 2.0 10 9 4.8 10 9 2.6 10 9 lactose 5.0 10 10 7.5 10 10 1.5 10 10 sucrose 1.0 10 10 1.0 10 10 1.1 10 10 control (NB) 7.5 10 7 1.4 10 8 3.4 10 7 a The number of cells was counted by a number of colony on a NA media with 10-fold dillution methods - 122 -
Table 12. Effect of high molecular weight of carbon sources on the growth of Bacillus amyloliquefaciens A-2 at 35, 180 rpm in a flask culture Carbon sources Cell density (cfu/ ml ) a 24 hrs 36 hrs 48 hrs corn starch 3.7 10 8 6.0 10 8 3.8 10 8 rice oil 5.1 10 12 7.5 10 11 2.9 10 11 rice flour 4.5 10 10 1.8 10 10 7.6 10 9 molasse 9.0 10 11 6.9 10 10 1.0 10 9 dough conditioner 1.6 10 9 3.0 10 9 6.7 10 8 control (NB) 7.5 10 7 1.4 10 8 3.4 10 7 a The number of cells was counted by a number of colony on a NA media with 10-fold dillution methods (3) 질소원 A-2균주의증식에우수한탄소원인현미유에질소원으로 yeast extract 또는 NH 4NO 3 를첨가하여세균증식의효과를조사하였다. 질소원인 yeast extract를현미유에첨가하여 30시간배양한경우생균수가 5.9 10 11 cfu/ ml로가장높았다 (Table 13). 따라서, 기초배지 (K 2 HPO 4 0.05%, MgSO 4 7H 2 O 0.05%, MnCl 2 4H 2 O, 0.0005%, CaCl 2 2H 2O 0.0005%, FeSO 4 0.0025%) 에현미유 3.0%, yeast extract 0.5% 를첨가한조성을 A-2 균주의대량배양용배지로최종선발하였으며, 이를현미유배지로명명하였다. Table 13. Effect of nitrogen sources on the growth of B. amyloliquefaciens A-2 at 35, 180 rpm in a flask culture Carbon source (3%)+Nitrogen sources (0.5%) 30 hrs (cfu/ ml ) a rice oil + yeast extract 5.9 10 11 rice oil + NH 4 NO 3 2.6 10 9 rice oil only 4.8 10 7 control (NB) 3.2 10 7 a The number of cells was counted by a number of colony on a NA media with 10-fold dillution methods - 123 -
나 ) 발효기 (Jar fermenter) 에서의배양삼각플라스크배양에서대량배양용배지로선발된현미유배지를발효기 (35, 350 rpm, 1.5 atm, ph 6~7) 에서 A-2균주를 72시간대량배양하여생균수를측정한결과, 초기세균수 1 10 8 cfu/ ml에서 7.0 10 11 cfu/ ml로증가되었다 (Table 14). Table 14. Population increase of B. amyloliquefaciens A-2 in rice oil medium using 7 L jar fermenter at 35 and 350 rpm and 1.5 atm Culture time Cell density (cfu/ ml ) a 0 hr 1.0 10 8 24 hrs 1.4 10 11 48 hrs 2.0 10 11 72 hrs 7.0 10 11 a The number of cells was counted by a number of colony on a nutrient agar plate with 10-fold dillution methods 나. 키티나아제활성균 CH-10 의대량배양용배지선발 1) 생육온도, 초기 ph 조건키티나아제활성균 CH-10의최적생육온도를조사한결과, 25 배양시에가장높은효소활성을나타내었으며, 전반적으로배양온도에따른효소에는큰변화를보이지않았다. 하지만, 접종 36시간이후에는활성이서서히감소되는양상을보였으며, 48시간이후에는효소활성은급격히감소하였다 (Fig. 22). 최적초기 ph 조사에서는 ph 6에서 36시간배양하면가장높은효소활성을보였으나 48시간후효소활성도가감소되었으며, 반면 ph 7에서는안정적인효소활성이관찰되었다. 이에반해 ph 5에서는활성이거의나타나지않았으며, ph 8에서는 36시간배양이후급격하게활성이낮아졌다 (Fig. 23). 따라서안정적인효소의활성을유도할수있는조건으로 ph 7의배양배지를최종결정하였다. - 124 -
25 25 C Chitinase activity(mu/ml) 20 15 10 5 0 36 48 72 30 C 35 C 40 C Time (hr) Fig. 22. Effect of temperature on the extracellular chitinase production of Cellulosimicrobium cellulans CH-10, using p-nitrophenyl-β-d-n,n'-diacetylchitobiose as the substrate. The CH-10 strain was grown in LB medium supplemented with 0.2% colloidal chitin.. Fig. 23. Effect of ph on the extracellular chitinase production of Cellulosimicrobium cellulans CH-10, using p-nitrophenyl-β-d-n,n'-diacetylchitobiose as the substrate. The CH-10 strain was grown in LB medium supplemented with 0.2% colloidal chitin. - 125 -
2) 탄소원 저분자탄소원 4 종과고분자탄소원 5 종을공시하여질소원인 yeast extract 0.5% 를첨 가한기초배지에 CH-10 균주를접종하고삼각플라스크에서 3 일간진탕배양후세균의증식정도를 조사한결과, 저분자탄소원 Fructose 에서 24 시간배양시 2.0 10 10 cfu/ ml, 48 시간배양시 7.9 10 10 cfu/ ml로지속적으로증가하는양상을보였으며, 고분자탄소원에서는개량제가 36시간배양까지 9.2 10 11 cfu/ ml로 LB배지에 chitin 0.5% 첨가한것보다높았다. CH-10균주의증식에우수한최적탄소원으로는개량제 (dough conditioner) 가선발되었다 (Table 15). 따라서, 기초배지 (0.05% K 2 HPO 4, 0.05% MgSO 4 7H 2 O, 0.0005% MnCl 2 4H 2 O, 0.0005% CaCl 2 2H 2 O, 0.0025% FeSO 4 ) 에개량제 3.0% 를첨가한개량제배지가 CH-10균주의대량배양용배지로선발되었다. - 126 -
Table 15. Effect of various carbon sources on cell growth of Cellulosimicrobium cellulans CH-10 at 35, 180 rpm in a flask culture Cell density (cfu/ ml ) a Carbon sources 20 hrs 30 hrs 45 hrs glucose 5.7 10 10 2.9 10 11 1.0 10 10 fructose 2.0 10 10 5.7 10 11 7.9 10 10 lactose 8.8 10 8 4.0 10 9 1.2 10 9 sucrose 6.3 10 8 4.0 10 9 9.0 10 8 corn starch 4.5 10 8 3.0 10 9 1.3 10 9 rice oil 8.1 10 9 6.0 10 10 2.2 10 9 rice flour 3.0 10 9 3.2 10 10 6.0 10 9 molasses 4.4 10 10 1.8 10 9 9.2 10 9 dough conditioner 6.3 10 11 9.2 10 11 3.4 10 10 LB+Chitin 1.5% 1.5 10 10 1.7 10 10 2.3 10 9 control (LB) 4.1 10 9 5.4 10 10 2.6 10 10 a The number of cells was counted by a number of colony on a LB agar plate with 10-fold dillution methods - 127 -
다. B. cepacia CH 67 균주의최적배양조건확립 1) 삼각플라스크배양 가 ) 탄소원 Pseudomonas 배양용기초배지에탄소원 3% 을종류별로첨가하고, CH-67균주의생육에미치는영향을조사한결과, 저분자탄소원의실험에서 Sucrose와 Glucose가 65 시간째에각각 A 550 =2.78, A 550 =2.76으로가장좋았다 (Fig 23). 그러나, 고분자탄소원선발에서는고분자물질인밀기울 (Wheat bran), 미강 (Rice bran) 에서 78 시간째에각각 1.7 10 9 cfu/ ml, 1.5 10 9 cfu/ ml로가장높은생균수가조사되었으며, 대조구인 Glucose의 7.4 10 8 cfu/ ml에비해현저히높았다 (Fig 24). 따라서, CH-67 균주의생육에가장효과적인고분자탄소원을 1차적으로밀기울과미강으로선발하고, 더불어사용이편리하고영양분이풍부한현미유 (Rice oil) 를첨가하여발효기내배양실험을통해최종적으로최적고분자탄소원을선발하고자하였다. Fig. 23. Population increase of Burkholderia cepacia CH-67 in the basal medium with 3% of various carbon sources at 30, 180 rpm in flask culture for 65 hr - 128 -
Fig. 24. Population increase of B. cepacia CH-67 in the basal medium with 3% of high molecular weight carbon sources and 0.5% of (NH 4 ) 2 SO 4 나 ) 질소원 CH-67 균주의생육에미치는질소원의영향을조사하기위해 Glucose (3%) 가첨가된 Pseudomonas 배양용기초배지에질소원으로 (NH 4) 2SO 4, NH 4Cl, KNO 3 을각각 0.5% 첨가하고전배양된 CH-67균주를접종하여 64시간동안 O.D값을측정한결과각각 A 550 =2.4, A 550 =2.3, A 550 =2.2로 (NH 4 ) 2 SO 4 가가장높게나타났다 (Fig 25). 이상의플라스크배양의실험결과로 CH-67 균주의대량배양용질소원으로 (NH 4) 2SO 4, 가선발되었다. - 129 -
Fig. 25. Effect of nitrogen sources on the cell growth of B. cepacia CH-67 in the basal medium 2) 발효기배양대량배양용배지를최종선발하기위해플라스크배양실험에서우수한질소원으로선발된 (NH 4) 2SO 4 0.5% 가첨가된기초배지 4 L에고분자물질인밀기울 (Wheat bran), 미강 (Rice bran), 현미유 (Rice oil) 3% 를각각첨가한후여기에종균배양된 CH-67 배양액 400 ml을접종하여 96시간동안시간별로세균밀도를조사하였다. 그결과, 최대세균증식시기에따라각각밀기울, 미강에서의생균수는 4.0 10 9 cfu/ ml, 1.3 10 9 cfu/ ml로조사되었고, 현미유에서는 1.7 10 10 cfu/ ml로앞서의플라스크배양시보다생균수가높게나타났다 (Fig 26-28). 이상의플라스크및발효기배양결과로기초배지에 3% 의현미유 (Rice oil) 와 0.5% 의 (NH 4) 2SO 4 를첨가한배지를 CH-67균주의대량배양용배지로최종선발하였다. - 130 -
10.5 11 11 Rice bran 10.0 10 10 9.5 9 9 log10 (cfu / ml) 9.0 8.5 ph 8 7 8 7 D.O 6 6 8.0 7.5 0 12 24 36 48 60 72 84 96 Time (hr) 5 ph D.O 4 4 0 12 24 36 48 60 72 84 96 Time (hr) 5 Fig. 26. Population growth of B. cepacia CH-67 in rice bran media using 7-L jar fermenter at 30 and 300 rpm and 1.5 atm. 10.5 11 11 Wheat bran 10.0 10 10 9.5 9 9 log10 (cfu / ml) 9.0 8.5 ph 8 7 8 7 D.O 6 6 8.0 7.5 0 12 24 36 48 60 72 84 96 Time (hr) 5 ph D.O 4 4 0 12 24 36 48 60 72 84 96 Time (hr) 5 Fig. 3. Fig. 27. Population growth of B. cepacia CH-67 in wheat bran media using 7-L jar fermenter at 30 and 300 rpm and 1.5 atm. - 131 -
10.5 11 11 Rice oil 10.0 10 10 log10 (cfu / ml) 9.5 9.0 8.5 ph 9 8 7 6 9 8 7 6 D.O 8.0 5 ph D.O 5 7.5 0 12 24 36 48 60 72 84 96 Time (hr) 4 4 0 12 24 36 48 60 72 84 96 Time (hr) Fig. 28. Population growth of B. cepacia CH-67 in rice oil media using 7-L jar fermenter at 30 and 300 rpm and 1.5 atm. - 132 -
제 4 절잎곰팡이병방제용엽면살포제미생물농약제조기술확립 1. 연구수행방법 가. A-2 균주를이용한수화제형및액상수화제형의제형화 1) 1차제형화 (A2-A~A2-L 수화제 ) 7 L 발효기에현미유배지 4 L넣고 B. amyloliquefaciens A-2 균주를 72시간배양후, 여기에옥수수전분, 타피오카전분, 변성전분, 썬크리미, 썬사이즈, 썬슈퍼젤, 썬프리젤등의전달매체를혼합하여수화제형 10종 (A2-A, A2-B, A2-E, A2-F, A2-G, A2-H, A2-I, A2-J, A2-K, A2-L), 액상수화제형 2종 (A2-C, A2-D) 의미생물농약을제조하였다 2) 2차제형화 (A2-M, A2-MP, A2-O 수화제 ) 7 L 발효기에현미유배지 4 L를넣고 B. amyloliquefaciens A 2 균주를접종하여 72시간배양 (30, 350 rpm, 1.5 atm, ph 6~7) 하고이배양액에기존의구슬형 (Bead type) 타피오카전분의단점으로인해이를끓이거나파우더형의타피오카전분등을사용하여이를전달매체로첨가하고혼합하여수화제형 3종 (A2-M, A2-MP, A2-O) 을추가제조하였다. 나. CH-10균주를이용한수화제형미생물농약의제형화 7 L 발효기에대량배지인개량제배지 4 L를넣고키티나아제활성이우수한것으로확인된 C. cellulans CH-10 균주를접종하여 72시간동안대량배양하였다. 이배양액에타피오카전분, 변성전분, 올리브유등의전달매체를첨가하고혼합하여수화제형미생물농약 5종 (CH10-G, CH10-H, CH10-I, CH10-J, CH10-K) 을제조하였다. 다. CH-67 균주를이용한수화제형미생물농약의제형화 1) 1차제형화 (CH67-A, CH67-B, CH67-C 수화제 ) 7 L 발효기에현미유배지 4 L를넣고 B. cepacia CH 67 균주를접종하여 72시간배양 (30, 350 rpm, 1.5 atm, ph 6~7) 하고이배양액에 Beads type의타피오카전분, Sun creamy, Dextrin, Sugar 등의전달매체를첨가하고혼합하여수화제형 CH67-A, CH67-B, CH67-C를제조하였다 (Table 20). - 133 -
2) 2차제형화 (CH67-D, CH67-F 수화제 ) 7 L 발효기에현미유배지 4 L를넣고 B. cepacia CH 67 균주를접종하여 72시간배양 (30, 350 rpm, 1.5 atm, ph 6~7) 하고이배양액에 Powder type Tapioca, Sun creamy, Sucrose등의전달매체를혼합하여수화제형 CH67-D, CH67-F를제조하였다. - 134 -
2. 연구결과 가. A-2 균주를이용한수화제형및액상수화제형의제형화 1) 전달매체선발제형화선발을위한전달매체로써 Beads type의타피오카전분, 옥수수전분, 변성전분, 썬크리미, 썬사이즈, 썬슈퍼젤, 썬프리젤등을사용하여수화제형으로제조하였다. 그러나 Beads type의타피오카전분이물에대한용해성이떨어지고살포기의입구를막는등여러가지단점이있어이를보완하기위해물에대한용해도도높고증량제의효과도있는 Powder type의타피오카와썬크리미, 슈크로오스 (Sucrose) 등을혼합하여제형화를재시도하였다. 본연구에서시도된제형화기술은변성전분과타피오카전분으로써가격면에서도저렴하여산업경쟁력이있으며, 자외선차단및부착정도와증량제로서의기능도있어이를전달매체로선발하였다. 2) 제형화 가 ) A2-A~A2-L 수화제 7 L 발효기에현미유배지 4 L넣고 B. amyloliquefaciens A-2 균주를 72시간배양후, 여기에옥수수전분, 타피오카전분, 변성전분, 썬크리미, 썬사이즈, 썬슈퍼젤, 썬프리젤등의전달매체를혼합하여수화제형 10종 (A2-A, A2-B, A2-E, A2-F, A2-G, A2-H, A2-I, A2-J, A2-K, A2-L), 액상수화제형 2종 (A2-C, A2-D) 의미생물농약을제조하였다 (Table 16, 17). Table 16. Composition of wettable powder-type and suspension concentrate wettable powder-type formulations using commercial additive, carrier and B. amyloliquefaciens A-2 Type Formulation Composition per liter of bacterial culture broth Wettable powder A2-A corn starch 400 g, modified starch 100 g A2-B corn starch 400 g, olive oil 50 g, sucrose 25 g Soluble concentrate A2-C sun creamy 80 g A2-D sun size 80 g Wettable powder A2-E sun supersel 80 g A2-F sun fregel 400 g - 135 -
Table 17. Composition of wettable powder-type formulations using commercial additive, carrier and B. amyloliquefaciens A-2 Type Formulation Composition per liter of bacterial culture broth A2-G bead typed tapioca starch 400 g, modified starch 100 g A2-H bead typed tapioca starch 400 g, olive oil 50 g, sucrose 25 g Wettable A2-I bead typed tapioca starch 400 g, sun fregel 400 g powder A2-J bead typed tapioca starch 400 g, sucrose 100 g A2-K bead typed tapioca starch 400 g A2-L corn starch 400 g 나 ) A2-M, A2-MP, A2-O 수화제 7 L 발효기에현미유배지 4 L를넣고 B. amyloliquefaciens A 2 균주를접종하여 72시간배양 (30, 350 rpm, 1.5 atm, ph 6~7) 하고이배양액에기존의구슬형 (Bead type) 타피오카전분의단점으로인해이를끓이거나파우더형의타피오카전분등을사용하여이를전달매체로첨가하고혼합하여수화제형 3종을추가제조하였다 (Table 18). Table 18. Composition of wettable power type formulations using commercial additives, carriers and B. amyloliquefaciens A 2 cultures Type Formulation Composition per liter of bacterial culture broth A2-M boiled tapioca starch 400 g, olive oil 50 g, sucrose 25 g Wettable powder A2-MP powder typed tapioca starch 400 g, olive oil 50 g, sucrose 25 g A2-O Sun creamy 80 g 나. CH-10균주를이용한수화제형미생물농약의제형화 7 L 발효기에대량배지인개량제배지 4 L를넣고키티나아제활성이우수한것으로확인된 C. cellulans CH-10 균주를접종하여 72시간동안대량배양하였다. 이배양액에타피오카전분, 변성전분, 올리브유등의전달매체를첨가하고혼합하여수화제형미생물농약 5종을제조하였다 (Table 19). - 136 -
Table 19. Composition of wettable powder-type formulations using commercial additive, carrier and C. cellulans CH-10 Type Formulation Composition per liter of bacterial culture broth CH10-G tapioca starch 400 g, modified starch 100 g Wettable powder CH10-H tapioca starch 400 g, olive oil 50 g, sucrose 25 g CH10-I tapioca starch 400 g, sun cap 100 g CH10-J tapioca starch 400 g CH10-K corn starch 400 g 다. CH-67 균주를이용한수화제형미생물농약의제형화 1) CH67-A, CH67-B, CH67-C 수화제형 7 L 발효기에현미유배지 4 L를넣고 B. cepacia CH 67 균주를접종하여 72시간배양 (30, 300 rpm, 1.5 atm, ph 6~7) 하고이배양액에 Beads type의타피오카전분, Sun reamy, Dextrin, Sugar 등의전달매체를첨가하고혼합하여수화제형 CH67-A, CH67-B, CH67-C를제조하였다 (Table 20) Table 20. Composition of wettable power type formulations using commercial additives, carriers and B. cepacia CH 67 cultures Type Formulation Composition per liter of bacterial culture broth Wettable powder CH67-A Sun creamy 70 g + Dextrin 10 g CH67-B Beads type Tapioca 400 g + Sugar 25 g CH67-C Sun creamy 80 g 2) CH67-D, CH67-F 수화제형 7 L 발효기에현미유배지 4 L를넣고 B. cepacia CH 67 균주를접종하여 72시간배양 (30, 300 rpm, 1.5 atm, ph 6~7) 하고이배양액에 Powder type Tapioca, Sun creamy, Sucrose등의전달매체를혼합하여수화제형 CH67-D, CH67-F를제조하였다 (Table 21). - 137 -
Table 21. Composition of wettable power type formulations using commercial additives, carriers and B. cepacia CH 67 cultures Type Formulation Composition per liter of bacterial culture broth Wettable powder CH67-D CH67-F Powder type of Tapioca 400 g Powder type of Tapioca 400 g + Sun creamy 80 g + Sucrose 100 g - 138 -
제 3 세부과제 : 개발미생물제제의방제효과검정및포장적용시험 연구책임자 : 정순재 제 1 절서론 토마토의원산지는남아메리카의서부고원지대인안데스산맥의고랭지대로페루, 에쿠아도르, 볼리비아지방에서수많은야생종이발견된다. 16세기초이탈리아로전파된이후유럽전체로퍼져나가 17세기에영국으로들어갔으나초기에는관상용으로재배되다가 18세기에이탈리아에서처음으로식용으로재배가시작되었다고하는데, 우리나라에처음들어온연대는확실히알수는없으나지봉유설에 " 남만시 " 로수록된것으로보아그책의저작연대인 1641년보다는앞선것으로생각되고토마토가중국에들어간연대가 17세기초라고추정되므로중국에들어간직후에우리나라사신에의해전래된것으로짐작된다. 이와같이전래된연대는 350여년전이라고하지만재배가일반화된것은그리오래지않다. 현재에는가공용에서생식용에이르기까지다양한종류가개발되어세계에서가장많이재배되고있는채소류로성장하였고우리나라에서는주로생식용으로재배되고있으나최근에는당도가높고먹기에편한방울토마토의수요증가와채소류수출의급격한증대로재배면적이크게늘어나고있는추세이다. 토마토에발생하는병해는수십여종이알려져있으나, 우리나라의시설, 노지재배에서중요한병해는잿빛곰팡이병, 잎곰팡이병, 겹둥근무늬병, 점무늬병, 시들음병, 역병, 풋마름병, 배꼽썩음병, 모자이크병등이며이외에흰가루병, 균핵병, 궤양병, 반점세균병은지역이나해에따라국부적으로발생하여간혹피해를가져온다. 이중 Botrytis cinerea에의한잿빛곰팡이병과 Fulvia fulva 에의한잎곰팡이병이가장중요하고다음으로는앞서언급한역병과 Alternaria spp. 균에의한겹무늬병, Stemphilium spp. 균에의한점무늬병이흔히발생하는데, Leveillula spp. 에의한흰가루병과 Sclerotinia spp. 에의한균핵병은지역적으로간혹발생하여피해를주고있다. 위와같은병해들은환경이알맞으면정식직후부터수확기까지의생육기간동안내내발생할수있으므로상기병해를대상으로한종합적인방제대책이마련되지않으면안되므로, 이러한병해를효과적으로방제하기위해서는토마토의정식전부터방제관리에신경을쓰고특히포장주위에남아있는이병잔재물의처리와토양내분포하고있는토양전염성병원균들의사멸혹은밀도감소를유도하는대책들이다. - 139 -
경상남도기술원은최근야간기온이내려가면서밀폐된시설하우스내습도가높아짐에따라재배중인겨울철시설채소등작물에잿빛곰팡이병, 오이노균병및토마토잎곰팡이병등저온다습한환경에서많이발생하는병해충의발생을우려하고있는데, 특히토마토잎곰팡이병은바깥온도가낮고시설재배및포장의온도가다습할때주로발생한다. 병원균의증식이대단위로이루어 지므로병발생초기의병원균밀도가낮을때방제하지않으면큰피해를가져온다. 현재까지잎 곰팡이병의방제는주로화학농약에의존하여왔지만이는환경오염에의한생태계파괴및인축에대한독성그리고약제저항성균주의출현으로전세계적으로심각한문제점들이대두되고있어이를위해최근에는길항미생물을이용한미생물농약및비료등이실용화되어제품들이시판되고있다. 따라서, 본연구에서개발된토마토잎곰팡이병방제용엽면살포제들의생물학적방제법및현장적용시험을통한본미생물제제들의제품화개발가능성을탐색하고자하였다. - 140 -
제 2 절개발미생물제제의방제효과검정및우수제형선발 1. 연구수행방법 가. 항균물질활성균 Bacillus amyloliquefaciens A-2 균주를이용한엽면살포제의방제효과검정 1) 우수제형선발 A 2 균주를이용하여제조한 1차미생물제제 ( 수화제형 A2-A, A2-B, A2-F / 액상수화제형 A2-C, A2-D), 2차미생물제제 ( 수화제형 A2-G~A2-L), 3차미생물제제 ( 수화제형 A2-H, A2-M), 4차미생물제제 ( 수화제형 A2-MP, A2-O) 의잎곰팡이병방제효과를생육실포트재배에서검정하였다. 먼저, 미생물제제 100배희석액과화학농약트리후미졸 (Triflumizole)( 품목명 : 트리후민수화제 ) 3000배희석액을분무기를사용하여포트재배한 7주된토마토잎의앞뒷면에골고루각각 30 ml씩살포하고, 살포 24시간후에잎곰팡이병균 F, fulva TF13 균주의균사조각부유액접종원 (A 550 =0.4) 10 ml을잎의앞, 뒷면에골고루살포한후, 생육실 ( 상대습도 90%, 온도 22±2 ) 에보관하였다. 접종 4일후이병엽율 (%) 를조사하였다. 이때각처리구는포트당 1주씩 6포트. 3반복으로 3회조사되었으며이를평균하여주당이병엽율로표시하고이것을다음과같이방제가로환산하였다. A B 방제가 (%) = A 100 A: 무처리구의이병엽율, B: 처리구의이병엽율 균사조각부유액은 300 ml의 PDB (Potato Dextrose broth) 배지에 PDA배지에서전배양한 TF13 균주의균사절편 ( 직경 1 mm) 12개를접종하여 4일간진탕배양 (25, 150 rpm) 한후균사를걸러내어세척후, 이를분쇄기 (Warning, USA) 로 10초간균사를마쇄한후농도를 A 550 =0.4이되도록완충용액으로조정하여이용하였다. 2) 우수미생물제제의희석배수별방제효과검정토마토잎곰팡이병방제용으로최종선발된수화제형 A2-MP제제를생육실포트재배에서의방제효과를검정하였다. 수화제형 A2-MP제제를각각 100, 500, 1000배로, 화학농약트리후민수화제는 3,000배로희석하여포트재배한 7주된토마토잎의앞뒷면에 1주당 30 ml씩골고 - 141 -
루처리하였다. 24 시간뒤잎곰팡이병균 TF13 균주균사조각부유액 (A 550 =0.4) 10 ml을접종하고이를 22±2, 상대습도 90% 의생육실에서 5일간보관한뒤이병엽율 (%) 을조사하여방제가로환산하였다. 균사조각부유액은앞서의생육실포트재배에서의잎곰팡이병방제효과검정과동일하였다. 나. 키티나아제활성균 CH-10 균주를이용한엽면살포제의방제효과검정 CH-10균주를이용하여제조한수화제형미생물제제 (CH10-G~CH10-K) 의잎곰팡이병방제효과를생육실포트재배에서검정하였다. 미생물제제 100배희석액과화학농약 Triflumizole 3,000배희석액을분무기로포트재배한 7 주된토마토잎의앞뒷면에골고루각각 30 ml씩살포하고, 살포 24시간후에잎곰팡이병균 F. fulva TF13 균주의균사조각부유액접종원 (A 550 =0.4) 10 ml을잎의앞뒷면에골고루살포하여, 생육실 ( 상대습도 90%, 온도 22±2 ) 에보관하였다. 접종 5일후이병엽율 (%) 를조사하고방제가로환산하였다. 균사조각부유액은앞서의생육실포트재배에서의잎곰팡이병방제효과검정과동일하였다. 다. 키티나아제활성균 CH-67 균주의최종선발및방제효과검정 1) CH-67균주의플라스크배양액을이용한방제효과검정키티나아제활성이매우높은 CH-10균주를이용한미생물제제 (CH10-G~CH10-K) 의방제효과검정에서만족할만한결과를도출하지못하였으며, 그후키티나아제활성이매우높은균주가지속적으로분리되어 CH-67과 CH-74 균주가각각선발되었다. 이들을 colloidal chitin이 3% 포함된 LB배지에 20시간배양 (30, 200 rpm) 한후농도를 OD 1.0으로보정하여이를 30 일된토마토잎에 50 ml씩골고루살포하고생육실 (22±2, 상대습도 90% 이상 ) 에서하루동안보관하였다. 이때, 트리후미졸 (Triflumizole) 화학농약을 3,000배로희석하여살포하였으며처리 24시간후병원균 F. fulva TF13 균주의균사조각부유액을 A 550 =0.4로보정하여포트당 10 ml씩토마토에접종하고생육실에 7일간보관하면서이병엽율을방제가로환산하였다. 2) CH-67 균주의발효기배양액을이용한방제효과검정앞서의항균활성과 chitinase 활성이뛰어나선발된 CH-67균주를대량배양용배지인현미유배지에 3일간배양 (30, 300 rpm) 한후, 배양액을세균과배양상등액으로나누어 30일된성체식물에 50 ml씩골고루살포하고생육실 (22±2, 상대습도 90% 이상 ) 에보관하였다. 병원균접종은앞서의 CH-67 균주의플라스크배양액의방제효과검정과동일하게처리하였다. - 142 -
3) CH-67 균주를이용한엽면살포제의방제효과검정 ( 가 ) 우수제형선발 CH-67 균주를이용하여제조한 1차개발미생물제제 (CH67-A~CH67-C) 와 2차개발미생물제제 (CH67-D~CH67-F) 의잎곰팡이병방제효과를생육실포트재배에서검정하였다. 먼저, 미생물제제 100배희석액과화학농약 Triflumizole 3,000배희석액을분무기로포트재배한 7 주된토마토잎의앞뒷면에골고루각각 30 ml씩살포하고, 살포 24시간후에잎곰팡이병균 F. fulva TF13 균주의균사조각부유액접종원 (A 550=0.4) 10 ml을잎의앞뒷면에골고루살포하여, 생육실 ( 상대습도 90%, 온도 22±2 ) 에보관하였다. 접종 5일후이병엽율 (%) 를조사하고방제가로환산하였다. 균사조각부유액은앞서의생육실포트재배에서의잎곰팡이병방제효과검정과동일하였다. ( 나 ) 우수미생물제제의희석배수별방제효과검정토마토잎곰팡이병방제용으로최종선발된수화제형 CH67-C제제를생육실포트재배에서의방제효과를검정하였다. 수화제형 CH67-C제제를각각 100, 500, 1000배로, 화학농약트리후민수화제는 3,000배로희석하여포트재배한 7주된토마토잎의앞뒷면에 1주당 30 ml씩골고루처리하였다. 24 시간뒤잎곰팡이병균 TF13 균주균사조각부유액 (A 550 =0.4) 10 ml을접종하고이를 22±2, 상대습도 90% 의생육실에서 5일간보관한뒤이병엽율 (%) 을조사하여방제가로환산하였다. 균사조각부유액은앞서의생육실포트재배에서의잎곰팡이병방제효과검정과동일하였다. 라. 항균활성제제 A2-MP와키티나아제활성제제 CH67-C의혼합방제효과검정 A-2 균주와 CH-67균주의엽면살포용제제로써최종선발된 A2-MP제제와 CH67-C제제를이용하여미생물제제의잎곰팡이병방제효과를 A2-MP제제와 CH67-C제제의동시처리시방제효과증진을알아보고자, 단독처리또는 A2-MP제제와 CH67-C제제와의혼합처리를포트재배에서검정하였다. 미생물제제 100배희석액과화학농약 Triflumizole 3,000배희석액을분무기로포트재배한 7 주된토마토잎의앞뒷면에골고루각각 30 ml씩살포하고, 살포 24시간후에잎곰팡이병균 F. fulva TF13 균주의균사조각부유액접종원 (A 550=0.4) 10 ml을잎의앞뒷면에골고루살포하여, 생육실 ( 상대습도 90%, 온도 22±2 ) 에보관하였다. 접종 5일후이병엽율 (%) 를조사 - 143 -
하고방제가로환산하였다. 균사조각부유액은앞서의생육실포트재배에서의잎곰팡이병방제효과 검정과동일하였다. 마. 재조합균주 A-2.5균주를이용한엽면살포제의방제효과검정재조합균주인 A-2.5 균주를이용하여제조한미생물제제의잎곰팡이병방제효과를 A2.5-MP제제단독처리또는 CH67-C제제와의혼합처리를통하여포트재배에서검정하였다. 미생물제제 100배희석액과화학농약 Triflumizole 3,000배희석액을분무기로포트재배한 7 주된토마토잎의앞뒷면에골고루각각 30 ml씩살포하고, 살포 24시간후에잎곰팡이병균 F. fulva TF13 균주의균사조각부유액접종원 (A 550 =0.4) 10 ml을잎의앞뒷면에골고루살포하여, 생육실 ( 상대습도 90%, 온도 22±2 ) 에보관하였다. 접종 5일후이병엽율 (%) 를조사하고방제가로환산하였다. 균사조각부유액은앞서의생육실포트재배에서의잎곰팡이병방제효과검정과동일하였다. - 144 -
2. 연구결과 가. 항균물질활성균 B. amlyloliqiefaciens A-2 균주를이용한미생물제제의생육실 포트에서의방제효과 1) 1차제제 ( 수화제형 A2-A, A2-B, A2-E, A2-F / 액상수화제형 A2-C, A2-D) 하우스내포트재배한토마토잎에 6종의 1차제조된미생물제제와화학농약을토마토잎에분무접종하고 24시간후병원균을접종한뒤 10일후에이병엽율을조사하고방제가로환산하였다. 그결과, A-2A제제와 A-2B제제의방제가가각각 63.2%, 72.2% 로서서로유의차가없이높았으며, 화학농약트리후민의 68.9% 와유사하였다. 반면, A2-C, A2-D, A2-E, A2-F, A2-F 제제는 60% 이하의낮은방제가를보여 A2-A, A2-B제제가 1차우수제제로선발되었다 (Table 1, Fig. 1). Table 1. Dissease control effects of 6 formulations using B. amyloliquefaciens A-2 and chemical fungicide against leaf mold caused F. fulva TF13 on tomato plants at pots in a growth chamber Formulations A2-A + Pa A2-B + Pa A2-C + Pa A2-D + Pa A2-E + Pa A2-F + Pa Triflumizole + Pa Pathogen(Pa) only Control Disease severity a (Control value b, %) 10 days 36.8 (63.2) a 27.8 (72.2) a 79.4 (20.6) cd 39.2 (60.8) ab 84.9 (15.1) cd 61.2 (38.8) bc 31.1 (68.9) a 100 (0.0) d 0.0 (100) a a Disease severity index (%) was made by estimating the percentage (%) of infected leaf area on each plant by F. fulva TF13. b Control value (%)=[(Disease severity in control plants-disease severity in treated plants) / (Disease severity in control plants)] x 100-145 -
Fig. 1. Disease occurred on tomato plants treated with formulations using B. amyloliquefaciens A-2 and chemical fungicide against leaf mold caused by F. fulva TF13 on tomato plants at pots in a growth chamber. A, A-2A formulation ; B, A-2B ; C, chemical fungicide, Triflumizole ; D, Pathogen ; E, Control 2) 2차제제 ( 수화제형 A2-G~A2-L) 2차제조된 6종의미생물농약과화학농약을토마토잎에처리하고방제효과를생육실에서검정하였다. 그결과, A2-H제제의방제가가 82.6% 로우수한방제가를나타내었으며, 다음은 A2-G제제로 73.3% 의방제가를보여유의차가있었다. 반면, A2-I~A2-L제제는 55% 이하의낮은방제가를보였다. 따라서, A2-G, A2-H제제가 2차로선발되었다 (Table 2, Fig. 2). - 146 -
Table 2. Disease control effects of 6 formulations using B. amyloliquefaciens A-2 and chemical fungicide against leaf mold caused F. fulva TF13 on tomato plants at pots in a growth chamber Formulations A2-G + Pa A2-H + Pa A2-I + Pa A2-J + Pa A2-K + Pa A2-L + Pa Triflumizole + Pa Pathogen(Pa) only Control Disease severity a (Control value b, %) 10 days 26.7 (73.3) ab 17.4 (82.6) a 61.6 (38.4) c 74.7 (25.3) d 44.4 (55.6) bc 70.5 (29.5) d 32.7 (67.3) bc 100 (0.0) e 0.0 (100) a a Disease severity index (%) was made by estimating the percentage (%) of infected leaf area on each plant by F. fulva TF13. b Control value (%)=[(Disease severity in control plants-disease severity in treated plants) / (Disease severity in control plants)] x 100-147 -
Fig. 2. Disease control effects of 6 formulations using B. amyloliquefaciens A-2 and chemical fungicide against leaf mold caused by F. fulva TF13 on tomato plants at pots in a growth chamber. A, A2-G formulation ; B, A2-H ; C, chemical fungicide, Triflumizole ; D, Pathogen ; E, Control 1차와 2차로선발된 4종의수화제형미생물농약 (A2-A, A2-B, A2-G, A2-H 제제 ) 을포트재배한토마토잎에처리하여화학농약과방제효과를생육실에서비교, 검정하였다. 그결과, A2-H제제의방제가가 81.6% 로가장우수하였으며, A2-A, A2-B, A2-G제제의방제가는각각 55.2%, 65.3%, 62.2% 로대체로낮았으며, 화학농약은 53.8% 로가장낮아, A2-H제제를우수제제로선발하였다 (Table 3, Fig. 3). - 148 -
Table 3. Disease control effects of 4 formulations using B. amyloliquefaciens A-2 and chemical fungicide against leaf mold caused F. fulva TF13 on tomato plants at pots in a growth chamber Formulations A2-A + Pa A2-B + Pa A2-G + Pa A2-H + Pa Triflumizole + Pa Pathogen only Control Disease severity a (Control value b, %) 10 days 44.8 (55.2) bc 34.7 (65.3) ab 37.8 (62.2) abc 18.4 (81.6) a 46.2 (53.8) c 100 (0.0) d 0.0 (100) a a Disease severity index (%) was made by estimating the percentage (%) of infected leaf area on each plant by F. fulva TF13. b Control value (%)=[(Disease severity in control plants-disease severity in treated plants) / (Disease severity in control plants)] x 100-149 -
Fig. 3. Disease occurrence on tomato plants treated with 4 formulations using B. amyloliquefaciens A-2 and chemical fungicide against leaf mold caused by F. fulva TF13 on tomato plants at pots in a growth chamber. A, A2-A formulation ; B, A2-B ; C, A2-G ; D, A2-H ; E, chemical fungicide, Triflumizole ; F, Pathogen ; G, Control 3) 3차제제 ( 수화제형 A2-H, A2-M) 앞서 1, 2차제제에서선발된 A 2H 제제는 80% 의높은방제가를보였으나, 제제의단점인분무기의막힘현상으로인해 A2-H제제의주재료인타피오카를끓여 A2-M제제를제형화하고, 이미우수제제로선발되었던 A2-H제제를화학농약인트리후민과방제효과를비교검정하였다. 그결과, A2-H 제제와 A2-M 제제의방제가는각각 80.1%, 77.8% 로유의차없이높았으며, 화학농약의 70.2% 와도유의차가없었다 (Table 4, Fig. 4). - 150 -
Table 4. Disease control effects of formulation and chemical fungicide against leaf mold caused by F. fulvum TF13 on treated tomato plants in a growth chamber 5 days Treatment Control value(%) (Disease severity(%)) Ⅰ Ⅱ means(%) A2-H 84.8(15.3) 75.4(24.7) 80.1(20.0)±3.8 bc A2-M 80.5(19.5) 75.1(24.9) 77.8(22.2)±2.2 bc Triflumizole 71.6(28.5) 68.7(31.3) 70.2(29.9)±1.2 c Pathogen only(pa) 0.0(100.0) 0.0(100.0) 0.0(100.0)±0.0 d a Control 100.0(0.0) 100.0(0.0) 100.0(0.0)±0.0 a Disease severity (%) was made by estimating the percentage (%) of infected leaf area on each plant by F.fulva b Control value (%) =[(Disease severity in control plant Disease severity in treated plant) / (Disease severity in control plants)] 100-151 -
Fig. 4. Disease symptoms on tomato leaves treated with microbial formulations and chemical fungicide against leaf mold caused by F. fulva TF13 on treated tomato plants in a growth chamber. A, A2-H formulation ; B, A2-M formulation ; C, Triflumizole ; D, Control ; E, Pathogen. 4) 4차제제 ( 수화제형 A2-MP, A2-O) 3차제형화제제인 A2-M제제의제조시첨가되는기존의구슬형의타피오카 (Tapioca) 대신파우더형태의타피오카를이용하여제조한 A2-MP제제를 A2-M제제및 A2-O제제와방제효과를비교하였다. 그결과, A2-M과 A2-MP제제의방제가는각각 88.4% 와 89.0% 로서로유의차없이우수하였으며특히, A2-MP제제는화학농약의 88.8% 와도유의차가없었고 A2-O 제제의 67.6% 보다월등히우수하였다. 결론적으로 대조구인화학농약과유의차없이 방제가가높고제형화의효율성을고려하여 A2-MP 제제를최종우수제제로선발하였다 (Table 5, Fig. 5). - 152 -
Table 5. Disease control effects of 4 formulations using B. amyloliquefaciens A 2 and chemical fungicide against leaf mold caused by F. fulva on treated tomato plants in a growth chamber Treatments Disease severity (%) a 3 days Control value (%) b A2-M 7.9 11.2 7.9 85.4(±3.1) b A2-MP 4.7 4.7 10.4 88.0(±4.6) ab A2-O 23.2 17.2 19.7 67.6(±4.9) c Triflumizole 4.3 8.6 7.9 88.8(±3.7) ab Pathogen (Pa) only 65.0 58.6 61.8 0.0(±0.0) d Control 0.0 0.0 0.0 100(±0.0) a a Disease severity (%) was made by estimating the percentage (%) of infected leaf area on each plant by F.fulva b Control value (%) =[(Disease severity in control plant Disease severity in treated plant) / (Disease severity in control plants)] 100-153 -
Fig. 5. Disease control effects of 4 formulations using B. amyloliquefaciens A 2 and chemical fungicide against leaf mold caused by F. fulva on treated tomato plants in a growth chamber. A, A2-M formulation ; B, A2-MP formulation ; C, A2-O ; D, 트리후미졸 (Triflumizole) ; E, Control ; F, Pathogen 5) 최종선발된미생물제제 A2-MP제제의희석배수별방제효과검정앞서방제효과가가장우수하여최종선발된 A2-MP제제를희석배수별로처리하여가장적합한처리농도를선발하고자하였다. 그결과 100배, 500배, 1000배에서각각 84.3%, 79.4%, 72.0% 로희석배수가높아질수록방제가가다소감소하였으나서로간의유의차는없었으며, 특히, 100배와 500배처리구에서는화학농약 90.8% 와도유의차가없어매우효과가우수하였다. 따라서, 경제성을고려해볼때 500배의농도로살포되어도적합할것으로조사되었다 (Table 6). - 154 -
Table 6. Disease control effects of formulations and chemical fungicide against leaf mold caused by F. fulva TF13 on treated tomato plants in a growth chamber. 5 days Treatment Disease severity(%) a Control value(%) b Ⅰ Ⅱ Ⅲ mean(%) A2-MP (100-fold spraying) A2-MP (500-fold spraying) A2-MP (1000-fold spraying) 88.4 (7.5) 89.0 (8.3) 75.4 (8.8) 84.3 (8.2)±4.5 bc 78.0 (14.3) 88.0 (9.1) 72.1 (10.0) 79.4 (11.1)±4.6 bc 69.9 (19.6) 78.4 (16.3) 67.8 (11.6) 72.0 (15.8)±3.2 c Triflumizole 96.1 (2.5) 88.5 (8.7) 87.7 (4.4) 90.8 (5.2)±2.7 ab Pathogen(Pa) only 0.0 (65.0) 0.0 (75.8) 0.0 (35.9) 0.0 (58.9)±0.0 d a Control 100.0 (0.0) 100.0 (0.0) 100.0 (0.0) 100.0 (0.0)±0.0 a Disease severity (%) was made by estimating the percentage (%) of infected leaf area on each plant by F.fulva b Control value (%) =[(Disease severity in control plant Disease severity in treated plant) / (Disease severity in control plants)] 100-155 -
나. 키티나아제활성균 CH-10 을이용한방제효과검정 1) CH-10균주를이용한미생물제제키티나아제활성이우수한 C. cellulans CH-10균주를이용하여만든 5종의수화제형미생물제제를공시하여토마토잎곰팡이병에대한방제효과를생육실에서검정한결과, CH10-G제제의방제가가 70.8% 로가장높았으며, 화학농약처리구의 51.3% 보다높은효과를나타내었다. 반면, CH10-H, I, J, K는모두 55% 이하의낮은방제가를보였다. 따라서, 키티나아제활성이우수한미생물제제의개발을위해새로운균주의탐색이지속적으로진행되었다 (Table 7, Fig. 6). Table 7. Disease control effects of 5 formulations using Celluosimicrobium cellulans CH-10 and chemical fungicide against leaf mold caused F. fulva TF13 on tomato plants at pots in a growth chamber Formulations CH10-G + Pa CH10-H + Pa CH10-I + Pa CH10-J + Pa CH10-K + Pa Triflumizole + Pa Pathogen (Pa) only Control Disease severity index a (Control value b, %) 10 days 28.2 (71.8) a 44.2 (55.8) c 60.2 (39.8) b 56.9 (43.1) bc 63.2 (36.8) c 48.7 (51.3) bc 100 (0.0) d 0.0 (100) a a Disease severity index (%) was made by estimating the percentage (%) of infected leaf area on each plant by F. fulva TF13. b Control value (%)=[(Disease severity in control plants-disease severity in treated plants) / (Disease severity in control plants)] x 100-156 -
Fig. 6. Disease on tomato plants treated with 5 formulations using Celluosimicrobium cellulans CH-10 and chemical fungicide against leaf mold caused by F. fulva TF13 on tomato plants at pots in a growth chamber. A, CH10-G formulation ; B, CH10-H ; C, CH10-I ; D, CH10-J ; E, CH10-K ; F, chemical fungicide, Triflumizole ; G, Pathogen ; H, Control - 157 -
다. 키티나아제활성균 CH-67 균주의최종선발과방제효과검정 1) CH-67 균주배양액의방제효과검정키티나아제활성이매우높은 CH-67과 CH-74 균주의배양액을토마토잎에처리하고 24시간뒤에병원균을접종하여방제효과를검정한결과 CH-67 균주가 79.0% 의방제가로가장높았으며화학농약의 71.4% 보다방제가가높았으며유의차가있었다 (Table 9). 따라서, CH-67 균주가항균활성및키티나아제활성을동시에하는우수길항균으로재분리되어미생물제제의제형화후방제효과가기대되었다. Table 9. Disease control effects of mixture of formulation, culture solution and chemical fungicide against leaf mold caused by F. fulva on treated tomato plants in a growth chamber Isolates Disease severity (%) a Control value (%) b CH-67 + Pa 8.3±2.93 79.0b CH-74 + Pa 17.8±8.46 54.9c Triflumizole + Pa 71.4±2.14 71.4b Pathogen (Pa) only 39.5±5.44 0.0d Control 0 100a a Disease severity index (%) was made by estimating the percentage (%) of infected leaf area on each plant by F. fulva TF13. b Control value (%)=[(Disease severity in control plants-disease severity in treated plants) / (Disease severity in control plants)] x 100 2) CH-67 균주의발효기배양액의방제효과검정키티나아제활성과길항능이동시에높았던 CH-67 균주의발효기배양액을배양액 ( 항균불질과세균포함 ), 세균만분리하여처리하고방제가를검정한결과, CH-67 균주의세균만을처리한경우방제가 92.4% 로가장높았으며, 다음은세균과항생물질이모두포함된배양액에서 76.6% 의방제가로다음으로높았으며서로간에유의차가있었다. 반면, 항생물질만이포함된처리구 (supernatant) 에서는 50.1% 의방제가로그다음으로높았으며화학농약 37.9% 의방제가보다도높고유의차가있었다. 따라서, 세균만을처리한경우가항생물질만을처리한경우보다우수하였으며 - 158 -
두가지를혼합하면세균만을처리하는경우보다는낮고항생물질만을처리하는경우보다는높아지므로이는 CH-67 균주가분비하는키티나아제활성능이항균물질활성능보다좀더우수한것으로예측되었다 (Table 9). 따라서, chtinase 활성이우수한 CH-67 균주를미생물제제로제조하여항균활성이높았던 A2-H제제와복수처리하여방제효과를증진시키는연구를수행하고자하였다. Table 9. Disease control effects of cell suspension, supernatant and culture solution against leaf mold caused by F. fulva on tomato plants in a growth chamber Treatments Disease severity (%) a Control value(%) b CH-67 cell + Pa 3.3 (±5.7) 92.4 (±13.2) a CH-67 supernatant + Pa 21.9 (±7.3) 50.1 (±16.6) bc CH-67 cell + supernatant + Pa 10.2 (±7.8) 76.6 (±17.8) ab Triflumizole + Pa 27.3 (±4.5) 37.9 (±10.2) c Pathogen (Pa) only 43.9 (±23.5) 0 Control 0 100 a a Disease severity index (%) was made by estimating the percentage (%) of infected leaf area on each plant by F. fulva TF13. b Control value (%)=[(Disease severity in control plants-disease severity in treated plants) / (Disease severity in control plants)] x 100 3) CH-67 균주를이용한엽면살포제의생육실내포트검정 가 ) 1차제제 (CH67-A, CH67-B, CH67-C) B. cepacia CH 67 균주를이용한 3종의미생물제제를 1차제조하여토마토잎곰팡이병에대한방제효과를화학농약트리후미졸 (Triflumizole) 과비교검정하였다. 그결과, CH67-C 제제의방제가가 97.0% 로화학농약의 94.1% 와유사하였다. 따라서, CH67-C제제를우수제제로 1 차선발하였다 (Table 11, Fig. 8) - 159 -
Table 11. Disease control effects of formulations and chemical fungicide against leaf mold caused by F. fulva on treated tomato plants in a growth chamber Treatments Disease severity (%) a 4 days Control value (%) b CH67-A +Pa 16.3 16.1 10.8 72.2 (±0.8) d CH67-B +Pa 7.3 6.3 6.5 88.5(±0.8) c CH67-C +Pa 2.7 0.3 2.1 97.0(±1.3) a Triflumizole +Pa 3.7 2.3 4.3 94.1 (±1.1) b Pathogen (Pa) only 55.5 60.6 59.3 0.0 (±0.0) e a Control 0.0 0.0 0.0 100 (±0.0) a : Disease severity index (%) was made by estimating the percent (%) of infected leaf area on each plant by F. fulva TF13 b : Control value (%) = [(Disease severity index in control plants Disease severity index in treated plants) / Disease severity index in control plants] x 100-160 -
Fig. 8. Tomato leaf mold symptom on tomato treated with varios formulations and chemical fungicide in a growth chamber. A, CH67-B formulation ; B, CH67-C formulation ; C, Triflumizole ; D, Contol ; E, Pathogen 나 ) 2차제제 (CH67-D, CH67-F) 1차제제에서선발된 CH67-C 제제를포함하여 2차제제 2종에대한토마토잎곰팡이병에대한방제효과를화학농약트리후미졸 (Triflumizole) 과비교검정하였다. 그결과, 수화제형 CH67-C, CH67-D와 CH67-F제제의방제가는각각 92.6%, 86.3% 와 92.5% 로유의차없이높았으며화학농약의 89.5% 와도유의차가없었다. 그러나 CH67-D와 CH67-F 제제는 1차선발제제인 CH67-C제제의 97.0% 의방제가보다낮고제제를토마토에처리하였을때약흔이발생되어미관상문제점이발견되어 1차에서선발된 CH67-C제제를토마토잎곰팡이병방제용엽면살포제의우수제형으로최종선발하였다 (Table 12. Fig. 9) - 161 -
Table 12. Disease control effects of formulations and chemical fungicide against leaf mold caused by F. fulva on treated tomato plants in a growth chamber Treatments Disease severity (%) a 4 days Control value (%) b CH67-C +Pa 92.8 89.8 95.2 92.6 (±1.6) a CH67-D +Pa 78.2 94.4 79.4 86.3 (±6.6) a CH67-F +Pa 88.5 96.3 92.7 92.5 (±2.3) a Triflumizole +Pa 81.2 91.2 96.1 89.5 (±4.4) a Pathogen (Pa) only 20.4 20.4 75.8 0.0 (±0.0) b a Control 0.0 0.0 0.0 100 (±0.0) a : Disease severity index (%) was made by estimating the percent (%) of infected leaf area on each plant by F. fulva TF13 b : Control value (%) = [(Disease severity index in control plants Disease severity index in treated plants) / Disease severity index in control plants] x 100-162 -
Fig. 9. Tomato disease symptoms on tomato leaves treated with microbial formulations and chemical fungicide against the leaf mold caused by F. fulva TF13 on tomato plants in a growth chamber. A, CH67-C formulation ; B, CH67-D formulation ; C, CH67-F formulation ; D, Triflumizole ; E, Contol ; F, Pathogen - 163 -
4) 최종선발된 CH67-C제제의희석배수별방제효과최종선발된 CH67-C제제를희석배수별로 100, 500, 1000배로희석하여토마토잎곰방이병에대한방제효과를화학농약트리후미졸 (Triflumizole) 과비교검정한결과, 100, 500, 1000 배에서각각 97.7%, 84.3%, 78.2% 의방제가로화학농약의 83.5% 와비교하여도유의차가없이높은방제가를보였다 (Table 13. Fig. 10). Table 13. Disease control effects of formulations and chemical fungicide against leaf mold caused by F. fulva on treated tomato plants in a growth chamber Treatments Disease severity (%) a 4 days Control value (%) b CH67-C + Pa (100 fold-spraying) CH67-C + Pa (500 fold-spraying) CH67-C + Pa (1000 fold-spraying) 9.2 8.6 0.8 89.0 (±7.1) a 8.4 7.1 5.6 84.3 (±2.8) a 9.3 10.5 7.8 78.5 (±5.4) a a Triflumizole + Pa 14.7 6.2 4.4 83.5 (±2.1) a Pathogen (Pa) only 20.3 34.3 35.9 0.0 (±0.0) b Control 0.0 0.0 0.0 100 (±0.0) a : Disease severity index (%) was made by estimating the percent (%) of infected leaf area on each plant by F. fulva TF13 b : Control value (%) = [(Disease severity index in control plants Disease severity index in treated plants) / Disease severity index in control plants] x 100-164 -
Fig. 10. disease symptoms on tomato leaves treated with formulations and chemical fungicide against the leaf mold caused by F. fulva TF13 on tomato plants in a growth chamber. A, CH67-C 100-fold spaying ; B, CH67-C 500-fold spaying ; C, CH67-C 1000 fold spaying ; D, Triflumizole ; E, Contol ; F, Pathogen 라. 항균물질활성제제 (A-2MP) 와키티나아제활성제제 (CH-67C) 의혼합방제효과검정 A 2 균주와 CH-67균주의엽면살포용수화제형제제로최종선발된 A2-MP제제와 CH67-C제제를토마토잎곰팡이병에단독또는혼합처리하여화학농약과그방제효과를비교검정하였다. 그결과, 단독처리시에 CH67-C제제가 93.6% 로 A2-MP제제의 78.4% 보다유의차있게우수하였고, 혼합처리 (A2-MP+CH67-C) 시에는 87.5% 로 CH67-C제제의단독처리보다는유의차없이낮으나 A 2MP의단독처리보다는유의성있게높았다. 반면, 화학농약은 81.5% 로써 CH67-C보다낮았으나 A2-MP제제와유사하였다. 따라서, CH67-C제제의단독처리는잎곰팡이병방제에매우우수한것으로조사되었으며, 시너지효과를위한 A2-MP제제와 CH67-C제제의혼합처리는 CH67-C제제의단독처리가월등히우수하여혼합처리를할수가없으니, A2-MP제제보다는우수하므로 CH67-C제제의단독처리또는 A2-MP제제와 CH67-C의혼합처리가효과적인것으로판단되었다 (Table 14). - 165 -
Table 14. Disease contorl effects of 2 formulations against F. fulva on tomato plant at pots in a growth chamber. Treatments Disease severity (%) a 4 days Control value (%) b A2-MP + Pa 9.0 7.9 11.1 78.4 (± 3.8) c CH67-C + Pa 2.5 2.9 2.9 93.6 (± 0.5) ab A2-MP+CH67-C + Pa 4.0 9.0 3.2 87.5 (± 7.3) bc Triflumizole + Pa 4.3 8.6 7.9 81.5 (± 2.6) c Pathogen (Pa) only 65.0 58.6 61.8 0.0 (± 0.0) d Control 0.0 0.0 0.0 100 (± 0.0) a a Disease severity index (%) was made by estimating the percent (%) of infected leaf area on each plant by F. fulva TF13 b Control value (%) = [(Disease severity index in control plants Disease severity index in treated plants) / Disease severity index in control plants] x 100-166 -
Fig. 11. Disease control effects of formulations and chemical fungicide against the leaf mold caused by F. fulva TF13 on tomato plants in a growth chamber. A, A2-MP ; B, CH67-C ; C, A2-MP+CH67-C ; D, 트리후미졸 (Triflumizole) ; E, Contol ; F, Pathogen 마. 재조합 A 2.5 균주를이용한미생물제제의방제효과 항균물질활성과키티나아제활성을동시에가지도록재조합된 A 2.5균주를이용하여 A2.5-MP 제제를제조하고이를 CH67-C제제와화학농약트리후미졸 (Triflumizole) 에의한잎곰팡이병방제를비교검정하였다. 그결과, 항균물질활성균 A-2에 N1의 chitinase gene을삽입하여제조합된 A-2.5균주를이용하여제조한 A2.5-MP제제의방제가가 80.1% 로항균활성만가진 A-2균주로제조된 A2-MP 제제의장제가 78.4% 보다는유의적으로높지않아서재조합균주에의한방제가의증진은크지않았다 (Table 14, Fig 11). - 167 -
Table 14. Disease control effects of 2 formulations against F. fulva on tomato plant at pots in a growth chamber. Treatments Disease severity (%) a 4 days Control value (%) b A2-MP + Pa 9.0 7.9 11.1 78.4 (± 3.8) c A2.5-MP + Pa 7.9 4.7 13.2 80.1 (± 10.0) b CH67-C + Pa 2.5 2.9 2.9 93.6 (± 0.5) ab A2.5-MP+CH67-C + Pa 3.6 7.2 3.2 89.2 (± 5.1) ab Triflumizole + Pa 4.3 8.6 7.9 81.5 (± 2.6) b Pathogen(Pa) only 65.0 58.6 61.8 0.0 (± 0.0) c a Control 0.0 0.0 0.0 100 (± 0.0) a : Disease severity index (%) was made by estimating the percent (%) of infected leaf area on each plant by F. fulva TF13 b : Control value (%) = [(Disease severity index in control plants Disease severity index in treated plants) / Disease severity index in control plants] x 100 이상의생육실에포트검정결과항균물질활성균 B. amyloliquefaciens A-2 균주와키티 나아제활성균 B. cepacia CH-67 균주를이용하여각각제조한수화제형 A2-MP 제제와 CH67-C 제제를토마토잎곰팡이병방제용엽면살포제로최종선발하였다. - 168 -
Fig. 5. Disease symptoms on tomato leaves treated with formulations and chemical fungicide against the leaf mold caused by F. fulva TF13 on tomato plants in a growth chamber. A, A2.5-MP ; B, CH67-C ; C, A2.5-MP+CH67-C ; D, Triflumizole ; E, Contol ; F, Pathogen - 169 -
제 3 절플라스틱하우스내토경재배에서의방제효과검정 1. 연구수행방법 토마토잎곰팡이병방제용으로최종선발된수화제형 A 2MP제제와 CH 67C제제를공시하여플라스틱하우스내토경에서재배한토마토에서잎곰팡이병에대한방제효과를검정하였다. 플러그포트에파종하여 4주된유묘를하우스내에재식한지 15주된토마토잎의앞, 뒷면에미생물농약을 100배로희석하여 200 ml씩골고루처리하였다. 24시간뒤토마토잎곰팡이병원균 TF13 균주의균사조각부유액접종원 (A 550 =0.4) 60 ml을역시잎앞, 뒷면에골고루살포접종하였다. 이때대조약제로서화학농약트리후민 ( 품목명 : 트리후미졸 (Triflumizole) 수화제 ) 를 3000 배희석하여사용하였으며, 병원균 TF13 균주의균사조각부유액은 PDA배지에이식한 TF13 균주를항온기에 2주간배양 ( 암,25 ) 한뒤, 절취한균사절편 ( 직경 1 cm) 을 PDB배지에 100 ml당 4 개씩넣고 4~5일간진탕배양 (25, 150 rpm) 한다음, 배양된균사를걸러내어 PDB를이용하여분쇄기 (warning, U.S.A) 로 10초간균사를갈아농도를 A 550=0.4으로조정하여사용하였다. 각처리구는한주당간격을 20 cm로하여한처리구에 12주씩, 3반복, 완전임의배치법으로실시하였다. 약제처리는 1주일간격으로총 3회처리하였으며, 마지막약제처리후 1주일뒤발병엽율을조사하여방제가로환산하였다. 2. 연구결과 가. 개발미생물농약의포장에서의방제효과검정 생육실포트검정에서최종선발된 B. amyloliquefaciens A 2 균주의수화제형 A2-MP제제와 B. cepacia CH 67 균주의수화제형 CH67-C제제를공시하여플라스틱하우스내토경재배한토마토에서잎곰팡이병에대한방제효과를검정하였다. 그결과, A2-MP제제와 CH67-C 제제의 100배희석처리구가각각 79.4% 와 76.6% 로써유의차가없이우수하였다. 반면, 500배희석처리구에서는각각, 72.6% 와 68.2% 를보여 100배처리구와는서로간의유의차는없게다소낮았졌다. 한편, 화학농약트리후미졸처리구는 79.6% 의방제가로모든처리구와유의차는없었다 (Table 15. Fig. 12). - 170 -
Table 15. Disease control effects of formulations and chemical fungicide against leaf mold caused by F. fulva on treated tomato plants in the field Treatments Total 3 weeks spray at every 1 week Disease severity (%) a Control value (%) A2-MP (100-fold spraying)+pa 12.5 17.4 12.5 79.4 (±4.1) a A2-MP (500-fold spraying)+pa 22.4 20.2 14.0 72.6 (±6.4) a CH67-C (100-fold spraying)+pa 18.5 16.0 13.8 76.6 (±3.4) a CH67-C (500-fold spraying)+pa 13.9 29.8 21.9 68.2 (±11.6) a Triflumizole+Pa 15.9 11.8 14.3 79.6 (±3.0) a Pathogen (Pa) only 65.7 77.5 63.1 0.0 (±0.0) b a Disease severity (%) was made by estimating the percentage (%) of infected leaf area on each plant by F.fulva b Control value (%) =[(Disease severity in control plant Disease severity in treated plant) / (Disease severity in control plants)] 100-171 -
Fig 12. Disease control effects of 2 formulations using B. amyloliquefaciens A 2 and B. cepacia against leaf mold caused F. fulva TF13 on tomato plants at soil in the plastic house in Dae jeo, Kim Hae, Gyeongsangnam Do on February, 2007. - 172 -
제 4 절 미생물농약의자연발생농가실증시험 1. 연구수행방법 2007년 1월말경토마토잎곰팡이병이자연발생하기시작한경상남도김해시대저동소재의농가의플라스틱하우스를임대하였으며, 생육실포트검정과하우스내토경재배검정을통하여선발된수화제형 A2-MP제제, CH67-C 제제및제조합 A-2.5균주로제조한 A2.5-MP제제를화학농약과비교하여자연발생농가에서방제효과를검정하였다. 품종은서건을 2006년 9월 15 일에파종하고 45일후인 11월 1일에재식하였으며 130~140일후에첫수확하였다. 처리방법은미생물농약수화제형 A2 MP 제제와 CH67 C제제그리고 A2.5 MP제제를농도별과처리횟수별, 각각제제간의교호및동시처리, 제제와화학농약간의교호및동시처리로나누어서실험을실시 하였다. 각각의제제를 농도별, 횟수별처리구를제외하고나머지처리구는 1 주간격으로 3 회처 리되었다. 최초약제살포는 2007년 2월 2일에살포되었고방제가는최종살포 1주일후인 2007 년 2월 23일에발병율은다음과같이발병도로계산하고방제가로환산하였다. 각처리구는평균면적 (25 cm x 56cm) 6주씩 3반복, 완전임의배치법으로실시하였다. 이때사용된화학농약은등록고시된트리후미졸 3,000배를사용하였다 ( 한국농약공업협회. 2001). 발병도 (%) = ( 발병엽수 x 계수 ) 7 x 조사엽수 100 계수 0 - 발병무 1 - 병반면적율 0-20% 3 - 병반면적율 20-50% 5 - 병반면적율 50-70% 7 - 병반면적율 70% 이상 A B 방제가 (%) = A 100 A: 무처리구의발병도, B: 처리구의발병도 - 173 -
2. 연구결과 가. 개발미생물제제의처리횟수별방제효과 2007년 1월말경잎곰팡이병이자연발생하기시작한토마토의경상남도김해시재배포장에서선발제제인수화제형 A2 MP, A2.5 MP, CH67 C 제제를각각 3주동안매1주마다살포횟수별로처리하고화학농약트리후미졸 (Triflumizole) 과방제효과를비교검정하였다. 그결과, CH-67 제제의경우, 매주 3회처리가 1회와 2회처리보다 84.1% 로월등히높았으며서로간에유의차가있었다. 반면 A2-MP제제의경우도역시 1회와 2회처리에서는각각 25.1%, 22.8% 로유의차가없이낮았으나지속적인 3회처리에서는 60.0% 로방제가가높아졌다. 재조합균주를이용한 A2.5-MP제제의경우도앞서두제제와동일한경향을보였으며 3회처리시의 79.1% 의방제가는 A2-MP제제의 3회처리보다우수하였다. 화학농약트리후미졸 (Triflumizole) 처리구는 81.6% 로각제제의 3회처리와유의차가없이우수하였다. 따라서, 각제제들은매주 1회씩 3주간처리하는것이화학농약과동일한방제가를보여효과적이며, 이들중 CH67-C제제가가장산업화의가능성이높은제제로확인되었다 (Table 16. Fig 13). - 174 -
Table 16. Disease control effects of 3 formulations against leaf mold caused by Fulvia fulva TF13 Three treatments with one week interval on tomato plants in the plastic house formulations (spray times/3 weeks) Total 3 weeks spray Disease severity (%) a Control value (%) Ⅰ Ⅱ Ⅲ MEAN Ⅰ Ⅱ Ⅲ MEAN CH67-C (1time) 41.7 50.1 47.6 46.5 (±4.3)ab 33.0 19.4 23.4 25.3 (±7.0)c CH67-C (2times) 28.7 13.6 29.7 24.0 (±9.0cd 53.8 78.0 52.2 61.3 (±14.5)ab CH67-C (3times) 18.8 3.8 7.0 9.9 (±7.9)d 69.7 93.9 88.7 84.1 (±12.7)a A2-MP (1time) 40.5 45.6 53.6 46.6 (±6.6)ab 34.9 26.6 13.9 25.1 (±10.6)c A2-MP (2times) 43.6 54.3 46.2 48.0 (±5.6)a 29.9 12.7 25.7 22.8 (±9.0)c A2-MP (3times) 25.5 17.6 31.5 37.2 (±7.0)bcd 59.0 71.6 49.4 60.0 (±11.1)ab A2.5-MP (1time) 52.3 50.0 36.0 46.1 (±8.8)abc 15.9 19.6 42.2 25.9 (±14.2)c A2.5-MP (2times) 48.1 52.7 33.6 44.8 (±10.0)abc 22.6 15.2 46.0 27.9 (±16.0)bc A2.5-MP (3times) 8.6 14.8 17.6 13.7 (±4.6)d 86.2 79.5 71.6 79.1 (±7.3)a Triflumizole 6.9 3.0 6.0 5.3 (±2.0)d 88.8 65.2 90.8 81.6 (±14.2)a control 76.3 52.4 57.9 62.2 (±12.5)c 0.0 0.0 0.0 0.0 (±0.0)c a Disease severity index (%) was made by estimating the percentage (%) of infected leaf area on each plant by F.fulva. b Control value (%) =[(Disease severity in control plant Disease severity in treated plant) / (Disease severity in control plants)] 100-175 -
Fig. 13. Disease control effects of 3 formulations against leaf mold caused by Fulvia fulva TF13 Three treatments with one week interval on tomato plants in the plastic house. A, CH67 C (3 times) ; B, A2 MP (3 times) ; C, A2.5 MP (3 times) ; D, Triflumizole ; E, Control - 176 -
나. 개발미생물제제의혼합및교호처리에의한방제효과 수화제형 A2-MP, A2.5-MP, CH67-C 제제를이용하여혼합및교호처리에의한방제효과를비교하여검정한결과, 혼합처리구인 CH67-C+Triflumizole과 A2-MP+CH67-C의방제가는각각 93.0%, 88.5% 로화학농약트리후미졸 (Triflumizole) 처리의 81.6% 와유의차가없이높았으며, 교호처리구에서는화학농약과교호처리한 A2-MP/Triflumizole/A2-MP의방제가가 91.4% 로가장높았으며, 다음으로는 CH67-C/Triflumizole/CH67-C의 90.0% 와 A2-MP/CH67-C+Triflumizole의 88.1% 의방제가순으로높았다. 한편, 화학농약을 1회도처리하지않고제제만을교호처리한 A2-MP/CH67-C/CH67-C처리구의방제가가 85.5% 로화학농약트리후미졸 3회연속처리구의 81.6% 보다다소높았으나유의차가없었다 (Table 17. Fig 14). 따라서, 화학농약을교호하여살포하는것이제제만을살포하는경우보다다소우수하였으므로화학농약과혼합또는교호살포하는것을권장할수있음을확인하였다. - 177 -
Table 17. Disease control effect of mixture of formulation and chemical fungicide against leaf mold caused by Fulvia fulva TF13 on treated tomato plants in the plastic house. Total 3 weeks spray Disease severity (%) a Control value (%) Ⅰ Ⅱ Ⅲ MEAN Ⅰ Ⅱ Ⅲ MEAN A2-MP+CH67-C b 6.6 4.9 10.0 7.2 (±2.6)c 89.5 92.1 83.9 88.5 (±4.2)a CH67-C+Triflumizole 2.0 7.1 4.1 4.4 (±2.6)c 96.9 88.7 93.5 93.0 (±4.1)a A2-MP/CH67-C/A2-MP c 43.1 46.7 34.8 41.5 (±6.1)b 30.7 24.9 44.0 33.2 (±9.8)b A2.5-MP/CH67-C/A2.5-MP 48.9 45.3 50.2 48.1 (±2.5)b 21.4 27.2 19.2 22.6 (±4.1)b A2-MP/Triflumizole/A2-MP 5.3 5.4 5.4 5.4 (±0.1)c 91.5 91.3 91.4 91.4 (±0.1)a CH67-C/Triflumizole/CH67-C 6.7 2.9 9.0 6.2 (±3.1)c 89.2 95.3 85.6 90.0 (±4.9)a A2-MP/CH67-C/Triflumizole 8.2 9.5 4.6 7.4 (±2.5)c 86.8 84.7 92.7 88.1 (±4.2)a A2-MP/CH67-C/CH67-C 11.2 7.4 7.9 8.8 (±2.1)c 82.0 88.0 87.3 85.8 (±3.3)a Triflumizole 6.9 3.0 6.0 5.3 (±2.0)c 88.8 65.2 90.8 81.6 (±3.3)a CONTROL 76.3 52.4 57.9 62.2 (±12.5)a 0.0 0.0 0.0 0.0 (±0.0)c a Disease severity index (%) was made by estimating the percentage (%) of infected leaf area on each plant by F.fulva. b were equally mixed (1:1, v/v) and sprayed on the whole tomato plants for three weeks c Each formulation sprayed on the whole tomato plants for three weeks by turns - 178 -
Fig. 14. Disease control effect of mixture of formulation and chemical fungicide against leaf mold caused by Fulvia fulva TF13 on treated tomato plants in a growth chamber A, A2 MP/CH67 C ; B, A2 MP+CH67 C+A2 MP ; C, A2 MP+CH67 C+CH67 C ; D, A2.5 MP+CH67 C+A2.5 MP ; E, Triflumizole ; F, CH67 C/Triflumizole ; G, CH67 C+Triflumizole+CH67 C ; H, A2 MP+Triflumizole+A2 MP ; I, A2 MP+CH67 C+Triflumizole ; J, Control - 179 -
제 5 절 선발미생물농약의작물에서의엽권정착력및저장안정성검정 1. 연구수행방법 가. 작물에서의 A7-2 제제의엽권정착력검정 우수미생물제제인액상수화제형 A2-MP 제제의엽권정착력검정을위해, 플라스틱하우스내 포트재배한토마토 ( 파종후 7~8 주 ) 에 A-2MP 제제를 1 회처리한후 10 일까지잎부위별 1g 과 1cm 2 당에존재하는 B. amyloliquefaciens A-2 균주의생균수를조사하였다. 이때, 공시된 A2-MP 제제는 A-2 균주를 rifampicin(100 μg /ml) 이포함된 Nutrient agar(na) 배지에 1주간계대배양하여획득한 rifampicin 저항성균주 (A-2R) 로액상수화제 (A2-RMP) 제제로제조하고결구상추잎의앞, 뒷면에골구로 1회살포하였다. A-2 균주의생균수는 rifampicin 100 μg /ml 이포함된 NA 배지에서희석평판법으로조사되었으며, 제제의초기생균수는 1.4 X 10 7 이었다. 나. 저장안정성검정 선발된미생물제제인수화제형 A7-A와액상수화제형 A7-2제제를실온과 4 에서각각보관하면서매달동일한날짜에제제에포함되어있는 A-7균주의생균수를 NA배지에서희석평판법으로조사하여미생물제제의안정성 (storage stability) 을조사하였다. 또한 4 에서 3개월과 8개월동안보관되어있던액상수화제 A7-2제제를 PDA배지상에서균핵병원균과대치배양하였으며, 1년간보관하였던 A7-2제제의농도별 (100, 500, 1000배 ) 희석액을균핵병원균과대치배양하여저지대 (inhibition zone) 를조사함으로서이들의장기간보관시의안정성을조사하였다. 다. 선발미생물제제의작물에서생육촉진효과검정 선발된미생물인 A-2, CH-67 균주의생육촉진검정을위해, NB 배지에서 24시간종균배양한 A-2, CH-67균주의세균부유액 5 ml을 1,000 ml 용삼각플라스크의 500 ml NB배지에접종하고 30 에서 160rpm으로 72hr 진탕배양한후플라스틱하우스내포트재배한토마토 ( 파종후 4주 ) 에 1포트당 100 ml 씩관주하였다. 관주후 1주일뒤다시같은양을각각의포트에다시관주하였다. 2회관주처리후 5주뒤각각의처리구별로뿌리및성체식물의생중량및건중량을측정하였다. - 180 -
다. 타작물의토양병에대한키티나아제활성균주의생물방제력검정 잎곰팡이병방제용으로최종선발된 A 2 균주와 CH 67 균주그리고재조합균주 A 2.5 균주의배양액을이용하여성체의토마토, 결구상추에처리하고토양병원균인 Rhizoctonia solani 밑둥썩음병원균을접종한후길항력을조사하였다. 플러그포트에파종하여 4주된유묘에 A 2, CH 67, A 2.5 균주의세균부유액을유묘한주당 3 ml씩분무접종하고 24시간후에병원균접종후 7일뒤 50% 의발병율을보이는농도와양인 A 550 =0.8과 1 ml의균사조각부유액을접종하였다. 방제가는다음과같이환산하였다. A B 방제가 (%) = A 100 A: 무처리구의이병엽율, B: 처리구의이병엽율 라. 저장안정성검정 선발된미생물제제인수화제형 A2-MP와 CH67-C 제제를실온과 4 에서각각보관하면서매달동일한날짜에제제에포함되어있는 A-2 균주와 CH-67 균주의생균수를 NA배지에서희석평판법으로조사하여미생물제제의안정성을조사하였다. 또한 4 와실온에서보관중이던 A2-MP 제제를토마토포트상에서잎곰팡이병에대한방제효과실험을실시하였다. - 181 -
2. 연구결과 가. 플라스틱하우스내포트재배한토마토에서의 A-2 제제의엽권정착력검정 Rifampicin 저항성 B. amyloliquefaciens A-2R 균주를이용하여제조한액상수화제형 A2-RMP 제제를토마토잎에 1 회처리한후 7 일동안 A-2 균주의생균수를잎부위에서측정하였 다. 그결과제제처리직후잎에서의초기생균수는 2.3x10 2 cfu/g, 2.1x10 1 cfu/cm 2 이었으며경 시적으로약간감소하였으나처리 5 일째에잎부위에서는 1.1x10 2 cfu/g 로써 A-2 균주의엽권정착 력이 5 일까지유지되는것으로확인되었다 (Table 18). Table 18. Survival of Bacillus amyloliquefaciens A-2, rifampicin resistance isolate of A-2R formulation on tomato leaves during 1 week in plastic house. 0day 1days 3days 5days 7days cfu/g 2.3x10 2 9.0x10 1 3.9x10 3 1.1x10 2 0 cfu/cm 2 2.1x10 1 4.2x10 1 1.5x10 2 0 0 나. 개발미생물제제의작물에서생육촉진효과검정 플라스틱하우스내포트재배한토마토에서의생육촉진효과검정을위해 A-2균주와 CH-67균주를이용하여토마토 1포트당세균부유액 100 ml 씩관주한후 5주뒤각각의처리구당뿌리와성체식물의생중량및건중량을측정하였다. 그결과, A-2 균주의세균부유액처리구의경우, 잎의생중량과건중량은각각 64.4 g와 8.3 g으로무처리구의 41.6 g, 6.4 g 그리고 Hyponex처리구의 47.0 g과 5.5 g보다유의차있게높았다. 그러나뿌리의생중량과건중량은각각 5.9 g, 1.8 g으로무처리구의 2.9g과 1.9 및 Hyponex처리구의생중량과건중량인 3.7 g, 1.3 g 과비교하였을때 서로간의유의차는없었다. 제제에서도역시전반적인경향이동일하였다. 하 지만, CH-67 균주의세균부유액과 CH67-C 제제의경우에는무처리구와생중량및건중량모두 유의차없이동알하였다. 따라서, A-2 균주는잎곰팡이병에대한항균활성뿐만아니라, 작물의생 육촉진에도영향을미치는것을알수있다 (Table 19, Fig 16). - 182 -
Table 19. Plant growth promotion effects of cell cultures and formulations of Bacillus amyloliquefaciens A-2 and Burkholderia cepacia CH-67 on fresh weight and dry weight treatments Fresh weight (g) Dry weight (g) leaves root leaves root cell suspension formulations A-2 64.4 (±9.9)a 5.9 (±2.2)a 8.3 (±1.2)a 1.8 (±0.4)a CH-67 47.4 (±9.4)ab 3.8 (±1.9)a 5.6 (±0.9)a 1.4 (±0.4)a A2-MP 49.8 (±6.1)ab 4.5 (±2.4)a 8.0 (±1.5)a 1.6 (±0.4)a CH67-C 54.8 (±13.9)ab 2.9 (±1.4)a 6.4 (±1.4)a 1.3 (±0.3)a Control(NB) 47.4 (±11.1)ab 3.5 (±0.6)a 6.9 (±0.9)a 1.3 (±0.4)a Hyponex 47.0 (±8.4)ab 3.7 (±2.9)a 5.5 (±0.9)a 1.3 (±0.5)a Control 41.6 (±11.3)b 2.9 (±1.4)a 6.4 (±2.1)a 1.3 (±0.4)a - 183 -
Fig 16. Growth Promotion effects of cultures and formulations using Bacillus amyloliquefaciens. A-2 and Burkholderia cepacia. CH-67. A, Control; B, Hyponex; C, NB; D, CH67-C; E, CH-67; F, A2-MP; G, A-2 다. 타작물의토양병에대한방제력검정 항균물질활성및키티나아제활성균인 CH 67, 항균물질활성균 A 2 균주그리고항생물질에내성균주인 A 2.5T 균주의세균부유액또는미생물제제 (CH67-C, A2-MP) 를결구상추및토마토에처리하여이들의밑둥썩음병에대한방제효과를검정하고자하였다. 그결과, 결구상추의경우에 CH 67 균주의세균부유액이 82.3% 의방제가를보여가장우수하였으며, A 2 균주와 A 2.5 균주의세균부유액에서는각각, 63.5% 와 68.8% 로서로간의유의차가없이 CH-67 균주보다는낮았다. 한편, CH67-C과 A2-MP 제제에서는모두낮은방제가를보였다 (Table 20, Fig 17). 또한, 토마토밑둥썩음병에대한방제효과를화학농약 ( 펜사이큐론 ) 과비교검정한결과, CH 67 균주의세균부유액처리구에서는 95.6% 로높은방제가를보였고, A 2 균주와 A 2.5 균주는각각, 38.5% 와 18.7% 로매우낮았다. 반면, CH67-C과 A2-MP제제에서는 - 184 -
각각 80.1%, 14.6% 로잎곰팡이병방제용으로선발된 CH 67 균주또는 CH67-C 제제에의한 타작물의토양병에대해서도우수한방제효과가있는것으로조사되었다 (Table 20, Fig 18). Table 20. Disease control effect of 2 formulations and 3 cell suspension against R. solani on crisphead lettuce and tomato plant at plugpots in a growth chamber. Head lettuce Tomato Disease severity (%) Control value Disease severity (%) Control value Ⅰ Ⅱ Ⅲ Mean (%) Ⅰ Ⅱ Ⅲ Mean (%) A-2 20.0 30.0 37.5 29.2 63.5 (±11.0) bc 65.0 56.7 41.7 54.5 38.9 (±13.3) bc A-2.5T 22.5 27.5 25.0 25.0 68.8 (±3.2) bc 64.2 80.9 72.5 72.5 18.7 (±9.4) b CH-67 27.5 5.0 10.0 14.2 82.3 (±14.8) ab 5.0 3.4 3.4 3.9 95.6 (±1.0) a CH67-C 32.5 30.0 45.0 35.8 55.2 (±10.0) c 15.0 20.0 18.3 17.8 80.1 (±2.9) a A2-MP 47.5 37.5 35.0 40.0 50.0 (±8.3) c 71.7 89.2 67.5 76.1 14.6 (±12.9) c Pencycuron 5.0 5.0 5.0 5.0 93.8 (±0.0) a 10.9 5.9 10.8 9.2 89.7 (±3.2) a Pathogen 82.5 80.0 77.5 80.0 0.0 (±0.0) d 88.4 92.5 86.7 89.2 0.0 (±0.0) d a Control 0.0 0.0 0.0 0.0 100.0 (±0.0) a 0.0 0.0 0.0 0.0 100.0 (±0.0) a : Disease severity index (%) was made by estimating the percent (%) of infected leaf area on each plant by R. solani AG 1 b : Control value (%) = [(Disease severity index in control plants Disease severity index in treated plants) / Disease severity index in control plants] x 100-185 -
Fig 17. Disease control effects of bacterial culture against R. solani AG 1 on crisphead lettuce at pots in growth chamber. A, A 2; B, A 2.5; C, CH 67; D, Chemical fungicide, Pencycuron; E, Control; F, Pathogen. Fig 18. Disease control effects of bacterial culture against R. solani AG 1 on crisphead lettuce at pots in growth chamber. A, A 2; B, A 2.5; C, CH 67; D, Chemical fungicide, Pencycuron; E, Control; F, Pathogen. - 186 -