(19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) C12N 1/20 (2006.01) A01N 63/02 (2006.01) C12R 1/07 (2006.01) (21) 출원번호 10-2011-0138408 (22) 출원일자 2011 년 12 월 20 일 심사청구일자 전체청구항수 : 총 6 항 2011 년 12 월 20 일 (11) 공개번호 10-2013-0071086 (43) 공개일자 2013년06월28일 (71) 출원인 경기도 경기도수원시팔달구효원로 1 ( 매산로 3 가 ) (72) 발명자 이현주 경기도수원시영통구영통 2 동벽적골 8 단지우성아파트 822-2006 홍순성 경기도수원시권선구호매실동 LG 삼익아파트 113-605 ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 특허법인동원 (54) 발명의명칭잔디의주요병해에길항반응을갖는신규한균주인바실러스발리스모르티스 GG290, 상기균주의배양방법및이균주를포함하는방제용미생물제제및그제조방법 (57) 요약 본발명은잔디의주요병해에대해길항반응을갖는신규한균주인 Bacillus vallismortis에관한것으로, 더욱상세하게는잔디의주요병해중특히갈색잎마름병 (Rhizoctonia solani) 와동전마름병 (Sclerotinia homoeocarpa) 에대해길항반응을보이는균주인 Bacillus vallismortis GG290( 기탁번호 : KCCM11211P) 및상기균주의배양방법, 그리고이들의균주를유효성분으로하는미생물제제에관한것이다. 본발명의신규한균주는잔디환경과유사한토양에서분리하여배양하였으며, 상기균주의배양과정에서탄소원, 질소원등의배양원을개량하여잔디병해에대하여우수한활성능과지속적인방제효능이나타남을확인하였다. 또한본발명의신규한균주는잔디병해중가장넓게분포되는갈색잎마름병 (Rhizoctonia solani) 와동전마름병 (Sclerotinia homoeocarpa) 에대해현저한길항능을나타내었고, 특히상기잔디병원균에대한방제효과가장기간지속되는것으로확인되어매우경제적이고환경친화적인미생물제제의가능성을나타내었다. 대표도 - 도 8-1 -
(72) 발명자 김성기 경기도수원시영통구영통동살구골 7 단지아파트 704-1601 소호섭 경기도성남시분당구서현동 301 효자촌삼환아파트 511-702 이지영 서울특별시관악구봉천 6 동낙성대현대홈타운아파트 302-502 한영희 경기도수원시팔달구지동 114-6 김희동 경기도화성시석우동 55 동탄예당마을롯데캐슬아파트 147-1701 임재욱 경기도수원시권선구권선동신안풍림아파트 303 동 1002 호 김영호 경기도수원시영통구영통동 1046-1 삼성래미안아파트 433 동 1204 호 - 2 -
특허청구의범위청구항 1 토양에분리및배양되고, 잔디의병해에대해길항반응을갖는것을특징으로하는신규한잔디병해길항균주 Bacillus vallismortis GG290( 기탁번호 : KCCM11211P). 청구항 2 제1항에있어서, 상기신규한잔디병해길항균주 Bacillus vallismortis GG290( 기탁번호 : KCCM11211P) 는갈색잎마름병 (Rhizoctonia solani) 와동전마름병 (Sclerotinia homoeocarpa) 의잔디의병해에대해길항반응을가지는것을특징으로하는신규한잔디병해길항균주 Bacillus vallismortis GG290( 기탁번호 : KCCM11211P). 청구항 3 Bacillus vallismortis GG290( 기탁번호 : KCCM11211P) 의균주를배양하는방법에있어서, 상기배양배지의탄소원은 sorbitol으로이루어져, 잔디의병해에대한길항반응의항균활성능이우수하게배양하는것을특징으로신규한잔디병해길항균주 Bacillus vallismortis GG290( 기탁번호 : KCCM11211P) 의균주의배양방법. 청구항 4 Bacillus vallismortis GG290( 기탁번호 : KCCM11211P) 의균주를배양하는방법에있어서, 상기배양배지의질소원은 yeast와 bactotryptone로이루어져, 잔디의병해에대한길항반응의항균활성능이우수하게배양하는것을특징으로신규한잔디병해길항균주 Bacillus vallismortis GG290( 기탁번호 : KCCM11211P) 의균주의배양방법. 청구항 5 Bacillus vallismortis GG290( 기탁번호 : KCCM11211P) 의균주를배양하는방법에있어서, 상기배양배지의무기염류는 MgSO 4 7H 2 O, K 2 HPO 4, KH 2 PO 4 로이루어져, 잔디의병해에대한길항반응의항균활성능이우수하게배양하는것을특징으로신규한잔디병해길항균주 Bacillus vallismortis GG290( 기탁번호 : KCCM11211P) 의균주의배양방법. 청구항 6 잔디병해길항균주 Bacillus vallismortis GG290( 기탁번호 : KCCM11211P) 을유효성분으로포함하며, 갈색잎마름병 (Rhizoctonia solani) 와동전마름병 (Sclerotinia homoeocarpa) 에의한잔디병해의치료및예방효과를갖는것을특징으로하는미생물제제. 명세서 [0001] [0002] 기술분야본발명은잔디의주요병해에대해길항반응을갖는신규한균주인 Bacillus vallismortis GG290( 기탁번호 : KCCM11211P) 에관한것으로, 더욱상세하게는잔디의주요병해중특히갈색잎마름병 (Rhizoctonia solani) 와동전마름병 (Sclerotinia homoeocarpa) 에대해길항반응을보이는균주인 Bacillus vallismortis GG290( 기탁번호 : KCCM11211P) 및상기균주의배양방법, 그리고이들의균주를유효성분으로하는미생물제제에관한것이다. 본발명의신규한균주는잔디환경과유사한토양에서분리하여배양하였으며, 상기균주의배양과정에서탄소원, 질소원등의배양원을개량하여잔디병해에대하여우수한활성능과지속적인방제효능이나타남을확인하였다. 또한본발명의신규한균주는잔디병해중가장넓게분포되는갈색잎마름병 (Rhizoctonia solani) 와동 - 3 -
전마름병 (Sclerotinia homoeocarpa) 에대해현저한길항능을나타내었고, 특히상기갈색잎마름병 (Rhizoctonia solani) 와동전마름병 (Sclerotinia homoeocarpa) 에대한방제효과가장기간지속되는것으로확인되어매우경 제적이고환경친화적인미생물제제의가능성을나타내었다. [0003] [0004] 배경기술우리나라국민의소득수준증가와다양한레져문화의확산보급으로골프에대한관심이증폭되었고골프장이용객도매년증가하고있다. 반면, 골프가국민들상당수가즐기는운동이지만, 환경적측면에서골프장조성시산림을훼손시키고, 잔디의관리를위해과도하게비료나농약등을살포하여환경에악영향을주는등사회적으로부정적문제가여전히발생되기도한다. 특히, 우리나라골프장잔디의주요병해인갈색잎마름병 (Large Patch), 동전마름병 (Dollar Spot), 브라운패취 (Brown Patch), 피시움병 (Pythium) 등주로토양병으로그방제가어렵고한번조성된잔디는수년간그식재상태를유지하기위해농약과비료사용이크게줄지않고있다. 지속적인농약사용에대한약제내성균에대한해결과친환경적인잔디관리를위해항균기능미생물을이용하여주요잔디병해를방제및관리하기위한방법이다. 발명의내용 [0005] 해결하려는과제잔디의주요병해에대해길항반응을갖는신규한균주인 Bacillus vallismortis GG290( 기탁번호 : KCCM11211P) 를제공하고, 특히갈색잎마름병 (Rhizoctonia solani) 와동전마름병 (Sclerotinia homoeocarpa) 에대해길항반응을보이는균주인 Bacillus vallismortis GG290( 기탁번호 : KCCM11211P) 및상기균주의배양방법, 그리고이들의균주를유효성분으로하는미생물제제를제공함으로써, 지속적인농약사용에대한약제내성균에대한해결과친환경적인잔디관리를위해항균기능미생물을이용하여주요잔디병해를방제및관리하는데에기여하고자한다. [0006] [0007] [0008] [0009] [0010] 과제의해결수단상기와같은기술적과제를달성하기위한본발명은토양에서분리한잔디병해길항균주인 Bacillus vallismortis GG290( 기탁번호 : KCCM11211P) 을제공하고, 상기균주의방제효과를최대로할수있는배양방법및미생물제제를제공함으로써, 농약을사용하지않고미생물제제를이용하여잔디병해를방제하는데에기여하고자한다. 이하본발명의구성을구체적으로설명하고자한다. 첫째, 토양에서분리및배양되고, 잔디의병해에대해길항반응을갖고, 특히갈색잎마름병 (Rhizoctonia solani) 과동전마름병 (Sclerotinia homoeocarpa) 의잔디의병해에대해길항반응을가지는것을특징으로하는신규한잔디병해길항균주 Bacillus vallismortis GG290( 기탁번호 : KCCM11211P) 을제공한다. 둘째, Bacillus vallismortis GG290( 기탁번호 : KCCM11211P) 의균주를배양하는방법에있어서, 잔디의병해에대한길항반응의항균활성능이우수하게배양하는것을특징으로하는배양방법을제공한다. 잔디의병해에대한길항반응의항균활성능이우수하게하는배양배지는, [0011] 탄소원은 sorbitol 으로, 질소원은 yeast 와 bactotryptone 으로, 무기염류는 MgSO 4 7H 2 O, K 2 HPO 4, KH 2 PO 4 로이 루어진배양원을이용하여잔디의병해에대한길항반응의항균활성능이우수하게배양하는것을특징으로하는 배양방법을제공한다. [0012] 셋째, 잔디병해길항균주 Bacillus vallismortis GG290( 기탁번호 : KCCM11211P) 을유효성분으로포함하며, 갈 색잎마름병 (Rhizoctonia solani) 와동전마름병 (Sclerotinia homoeocarpa) 에의한잔디병해의치료및예방효과 를갖는것을특징으로하는미생물제제및그제조방법을제공한다. - 4 -
[0013] 발명의효과상기에서설명한바와같이, 본발명은잔디병해, 특히갈색잎마름병과동전마름병에대한길항작용을갖는균주인 Bacillus vallismortis GG290( 기탁번호 : KCCM11211P) 을제공하고, 상기균주의배양방법및높은방제효과를나타낼수있는배양조건을제공하고, 상기균주의미생물제제및그제조방법을제공함으로써농약없이잔디병해를효과적으로방제할수있는데에크게기여할수있다. [0014] 도면의간단한설명 도 1 은 Bacillus vallismortis GG290 의사진이다. 도 2는 Bacillus vallismortis GG290의적정배양온도를나타내는그래프로, x축은온도 ( ) 를나타낸다. 도 3은 Bacillus vallismortis GG290의배양에적절한산도 (ph) 를나타내는그래프이다. 도 4는 Bacillus vallismortis GG290의셀룰라제분해효과를확인한사진이다. 도 5는 Bacillus vallismortis GG290의달라스팟병원균의방제효과를확인한사진이다. 도 6은 Bacillus vallismortis GG290의잔디갈색잎마름병의방제효과를확인한사진이다. 도 7은 Bacillus vallismortis GG290의동전마름병의방제효과를확인한사진이다. 도 8은 Bacillus vallismortis GG290의갈색잎마름병의항균효과, 동전마름병의항균효과, 그리고봄마름병의항균효과를확인한사진이다. 도 9는 Bacillus vallismortis GG290의 16s rrna 염기서열이다. [0015] [0016] 발명을실시하기위한구체적인내용 이하, 실시예를통하여본발명을더욱상세히설명하고자한다. 본원발명의실시는실시예 1 내지 3 으로나누어구체적으로설명하면이하와같다. [0017] 먼저, 실시예 1 은, Bacillus vallismortis GG290 균주의분리, 동정, 배양에적절한온도및산도에대한 것이다. [0018] [0019] [0020] 실시예 1 (1) 균주의분리 2008년 1월경기도수원시권선구입북동의논토양을채취하여, 채취한토양 1 g을정량하여 10 ml의멸균수에넣어현탁한후현탁액 1 ml을멸균수 9 ml가담긴시험관에차례대로 10 배씩희석하였다. 현탁액에희석된멸균수를 200 μl씩취하여 NA(Nutrient Agar) 고체평판배지의중앙에넣고멸균된스프레드로골고루밀어준후 25 항온기에서 3일간배양하였다. 각각의모양으로형성된콜로니를취하여균주번호를붙여주고항진균반응에이용하여효과가있는균주를선발하였다. [0021] [0022] (2) 균주의동정잔디의주요병해인갈색잎마름병 (Rhizoctonia solani) 와동전마름병 (Sclerotinia homoeocarpa) 에대해길항반응을보이는균주를동정하기위해주사전자현미경 (Scanning Electronic microscope, HITACHI S-3000) 으로형태적특징을관찰하였고 ( 도 1), 세균검정기 VITEK compact II의 BCH 카드를이용하여생화학적반응검정을확인하고균의종류를확인하였으며 ( 표 1), 16s rrna의염기서열을분석 ( 도 9) 한후, NCBI blast를검색하여균주동정을하였다. 동정결과형태적으로단간균형의균주로, VITEK compact BCH카드동정결과와, 염기서열분석결 - 5 -
과 Bacillus vallismortis로동정되었다. 이에분리된동정균을 Bacillus vallismortis GG290으로명명하였다. 이균은출원시첨부한미생물기탁증에서제시한바와같이, 한국미생물보존센터에기탁번호 KCCM11211P로기탁하였다. [0023] [ 표 1] 생화학적특성 [0024] [0025] [0026] (3) 적정배양온도분리한균주의적정배양온도를확인하기위해 TSB(Triptic Soy Broth) 배지 200 ml에전배양액 2 ml를접종하여온도별로 15, 20, 25, 30, 35, 40 에서 24시간동안 180 rpm으로배양한후배양액을 UV 스펙트로포토메타 (BECKMAM DU730) 600 nm 파장에서흡광도를조사하여균의생육정도를확인하였다. 그결과도 2에서나타낸바와같이 30 에서 24시간배양하였을때가장생육이잘되었다. [0027] [0028] (4) 적정 ph 이균주의생육에적정한산도를확인하기위해 TSB 배지 200 ml를 NaOH와 HCl로산도를 3, 4, 5, 6, 7, 8로조절하여 24시간, 48시간동안 180 rpm 으로진탕배양한후배양액을 UV 스펙트로포토메타 600nm파장에서흡광도를조사하여균의생육정도를비교하였다. 결과도 3에서나타낸바와같이 ph7에서균주의생육이대체로잘되었다. [0029] 다음으로, 실시예 2 는, Bacillus vallismortis GG290 균주의잔디병해에대한길항반응의항균활성능이우수하 게배양하는것을특징으로하는배양방법및잔디병해에대한방제효과에대한것이다. [0030] [0031] [0032] 실시예 2 (1) 최적배지영양원과항균활성검정 균주의생육에필요한영양원을결정하기위해최소배지 (K 2 HPO 4 0.7%, KH 2 PO 4 0.2%, Glucose 0.5%, (NH 4 ) 2 SO 4 0.1%, MgSO 4 7H 2 O 0.01%) 를조제하여탄소원에서는 Glucose를제외시키고각각의탄소원을 1% 첨가하여 25 에서 180 rpm으로 24시간배양한후배양정도를측정하였다. 질소원을결정하기위해최소배지에서 (NH 4 ) 2 SO 4 0.1% 대신각각의질소원을 0.5% 씩첨가하였으며, 적정무기염류를확인하기위해최소배지에서무기염류인 K 2 HPO 4 0.7%, KH 2 PO 4 0.2%, MgSO 4 7H 2 O 0.01% 대신각각의무기염류를 5 mm씩첨가하여 25 에서 180 rpm으로 24시간배양한후배양정도를측정하였다. 항균활성은 PDA배지에서각각의탄소원, 질소원, 무기염류로배양된배양액을 - 6 -
종이디스크위에 100 μl씩접종하고주요잔디병원균과 25, 7일간대치배양후저지대를조사하여항균활성을측정하였다. 그결과표 2에서나타난바와같이, sorbitol을탄소원으로이용하였을경우, 배양이잘되었고, 주요잔디병원균에대해서도항균력이가장좋았다. 질소원은표 3에서와같이, yeast extract에서배양이잘되었으며 yeast와 bactotryptone을이용하였을때항균활성이가장좋았다. 무기염류는 MgSO 4 7H 2 O, K 2 HPO 4, KH 2 PO 4 를배지원로사용하였을경우균주의항균활성이좋았다 ( 표 4). [0033] [ 표 2] 최적탄소원과항균활성검정 [0034] [0035] [ 표 3] 최적질소원과항균활성검정 [0036] [0037] [ 표 4] 최적무기염류원과항균활성검정 [0038] - 7 -
[0039] [0040] (2) 길항미생물의식물병원균에대한항진균검정분리한길항미생물의잔디병원균뿐만아니라, 주요식물병원균에대한항균력을알아보기위하여 Sclerotinia sclerotiorum, Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum, Alternaria panax, Colletotrichum sp. Rhizoctonia sp., Phytophthora capsici 등에대해 paper disc법으로대치배양하였다. 잔디병원균인갈색잎마름병 Rhizoctonia solani AG2-2, R. solani AG1, 동전마름병 Sclerotinia homoeocarpa 뿐만아니라작물의주요병해인잿빛곰팡이병, 시들음병, 탄저병등에대해서도높은항균력을보였다 ( 표 5). [0041] [ 표 5] GG290 의잔디주요병해에대한항균력 [0042] [0043] [0044] (3) 길항미생물의셀룰라제분해효과분리한길항미생물의항균효과뿐만아니라, 골프장의깎여진잔디가쌓여생긴대취층을분해할수있는셀룰라제분해효과를확인하였다. 식물세포벽의주요성분인셀룰로스분해기능을확인하기위해 DCAB 배지를만들어분리한미생물을 30 3일간배양후 0.1% congo red 30분처리후 NaCl 1 M을 15분간처리하여셀룰로즈가분해된것을확인하였다 ( 도 4). 골프장은한번조성이되면수년간그재식형태가유지되며, 빈번한예초로인한상처와답압에의한스트레스, 과다한대취층형성등으로발병이조장되어다른식물보다많은병해가발생하고방제가어려워농약사용량이증가하기쉽다. 이러한이유로항균기능과함께잔디의주성분인셀룰로스분해기능이함께있는미생물을골프장에처리하여예초된잔디가쌓인과다한대취층생성을줄임과동시에병원균의서식처를없애므로미생물의항균기능을더높일수있다. [0045] [0046] (4) 길항미생물의항균력포트검정 플라스틱상자에파종하여재배한크리핑벤트그라스에 GG290 미생물을 30, 180 rpm 으로 24 시간배양한후 1 10 7 cfu/ml 농도의배양액을 1 L/m 2 씩일주일간격으로 3 회처리하였다. 1 회처리후 3 일뒤상자내네지점에 오트밀샌드배지에 20 일간배양된달라스팟병원균을 1 g 씩접종하여발병유무를확인하였으며, 무처리발병면 적 25% 에비해미생물처리구에서는발병이되지않아예방효과가있었다 ( 표 6, 도 5). - 8 -
[0047] [ 표 6] GG290 의달라스팟병원균방제효과 [0048] [0049] [0050] (5) 길항미생물의포장검정 라지패취병에대한 GG290 의항균효과를확인하기위해홍천비발디골프장내한국잔디에서매년라지패취병이발 병되고있는지점에 TSB 배지에서 180 rpm으로 24시간배양한 GG290 미생물을 1 10 7 cfu/ml 농도로조절한후 1 L/m 2 씩 8월말부터매주 1회씩 5회살포하였으며라지패취병반의진행정도를조사하였으며, 동전마름병에대한 GG290의항균효과는스카이72골프장내조성된크리핑벤트그라스포장에서위와동일한방법으로배양및살포하여포장내발생된병반을조사하였다. 결과라지패취병은 GG290을처리한경우무처리와비교하여 82% 의방제효과가있었고, 동전마름병은 GG290을처리하였을때 73% 의방제효과가있었다 ( 표 7, 표 8). [0051] 이상의결과로 Bacillus vallismortis GG290 미생물은잔디에서문제되는갈색잎마름병과동전마름병을비롯하 여다른작물에서발생하는주요병해를예방할수있는우수한미생물로이용할수있다 ( 도 6, 도 7, 도 8). [0052] [ 표 7] GG290 의잔디갈색잎마름병방제효과 [0053] [0054] [ 표 8] GG290 의동전마름병방제효과 [0055] [0056] 다음으로, 실시예 3 은, Bacillus vallismortis GG290 균주를포함하는방제용미생물제제의제조방법에대한것 이다. [0057] [0058] 실시예 3 미생물을이용한제제는병원균에대한길항력과기주의근권에잘정착하고, 다른미생물과의경쟁에서이겨야하며다양한환경조건에잘적응하여야한다. 미생물을안정화된상태로이용하기위해 TSB 배지에서 180 rpm으로 24시간배양한 GG290 미생물배양액에식물성오일에틸렌옥사이드부과물 5%, 구연산 1% 를첨가한후 100배희석하여매주 1회씩 5회크리핑벤트그라스포장에처리하였을때동전마름병의발생이무처리대비약 78% 의방제효과를보였다 ( 표 9, 도 7). - 9 -
[0059] [ 표 9] GG290 의동전마름병방제효과 [0060] [0061] 수탁번호 기탁기관명 : 한국미생물보존센터 수탁번호 : KCCM11211P 수탁일자 : 20111010 도면 도면 1 도면 2 도면 3-10 -
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