(52) CPC 특허분류 A23K 10/16 ( ) A61K 35/74 ( ) C12R 1/38 ( ) 이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 부처명 연구관리전문기관 연구사업명 연구과제명 기여율 1/ HD060

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애란 견
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1 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (11) 공개번호 (43) 공개일자 2018년01월12일 (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) C12N 1/20 ( ) A01N 63/00 ( ) A23K 10/16 ( ) A61K 35/74 ( ) C12R 1/38 ( ) (52) CPC 특허분류 C12N 1/20 ( ) A01N 63/00 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일자 2016 년 07 월 04 일 심사청구일자 전체청구항수 : 총 14 항 2016 년 07 월 04 일 (71) 출원인 고려대학교산학협력단 서울특별시성북구안암로 145, 고려대학교 ( 안암동 5 가 ) (72) 발명자 류지훈 서울특별시용산구이촌로 201, 202 동 1502 호 ( 이촌동, 한가람아파트 ) 손혜리 경기도부천시원미구조마루로 134 ( 중동보람마을아주아파트 ) 1114 동 303 호 (74) 대리인 특허법인다나 (54) 발명의명칭슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P 및이를포함하는조성물 (57) 요약 본발명의슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P 는식품위해미생물인스타필로코커스아우레우스 (Staphylococcus aureus) 및아스퍼질러스플라버스 (Aspergillus flavus) 에대해항균활성을나타내고, 건조한환경에서도환경표면에바이오필름을형성할수있으므로, 상기균주를포함하는조성물은생물학적제제로써사용되어식품, 농업, 환경산업등에넓게적용시킬수있다. 대표도 - 도 4-1 -

2 (52) CPC 특허분류 A23K 10/16 ( ) A61K 35/74 ( ) C12R 1/38 ( ) 이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 부처명 연구관리전문기관 연구사업명 연구과제명 기여율 1/ HD060 농림수산식품부 농림기술기획평가원 수출전략기술개발사업 [ 협동 ] 건전종자생산을위한종자살균기술개발 주관기관 국립종자원 연구기간 ~

3 명세서청구범위청구항 1 수탁번호 KACC 92125P의슈도모나스아조토포만스 {Pseudomonas azotoformans} 균주. 청구항 2 슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P, 이의배양물, 이의추출물또는이의현탁물을유효성분으로포함하는, 스타필로코커스아우레우스 (Staphylococcus aureus) 및아스퍼질러스플라버스 (Aspergillus flavus) 에대한항균용조성물. 청구항 3 슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P, 이의배양물, 이의추출물또는이의현탁물을포함하는사료또는사료첨가제조성물. 청구항 4 슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P, 이의배양물, 이의추출물또는이의현탁물을포함하는, 스타필로코커스아우레우스 (Staphylococcus aureus) 및아스퍼질러스플라버스 (Aspergillus flavus) 에대한생물학적방제제. 청구항 5 제4항의방제제를가축, 축사또는그부근에처리하는단계를포함하는, 스타필로코커스아우레우스 (Staphylococcus aureus) 및아스퍼질러스플라버스 (Aspergillus flavus) 의활성억제방법. 청구항 6 슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P, 이의배양물, 이의추출물또는이의현탁물을포함하는, 아스퍼질러스플라버스 (Aspergillus flavus) 에의한이삭마름병방제제. 청구항 7 제6항의방제제를식물에처리하는단계를포함하는, 아스퍼질러스플라버스 (Aspergillus flavus) 의활성억제방법. 청구항 8 슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P, 이의배양물, 이의추출물또는이의현탁물을포함하는, 가축에게서스타필로코커스아우레우스 (Staphylococcus aureus) 및아스퍼질러스플라버스 (Aspergillus flavus) 에의한감염질환의예방또는치료용약제학적조성물. 청구항 9 제8항에있어서, 상기감염질환은식중독, 장염, 유선염, 부종성피부염, 관절염, 폐렴, 당뇨병, 골수염, 심장내막염, 균혈증, 패혈증, 경구개궤양및간암으로이루어진군에서선택된하나이상의질환인약제학적조성물. 청구항 10 슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P, 이의배양물, 이의추출물또는이의현탁물을표면에처리하는단계를포함하는표면의항균처리방법

4 청구항 11 제10항에있어서, 표면에처리하는단계는슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P, 이의배양물, 이의추출물또는이의현탁물을표면에분사하여배양하는단계를추가로포함하는표면의항균처리방법. 청구항 12 제11항에있어서, 분사후 20 내지 30 에서 6 내지 120시간동안배양하는단계를포함하는표면의항균처리방법. 청구항 13 제10항에있어서, 표면은스테인리스스틸, 유리, 나무, 비닐, 플라스틱, 고무및타일류로이루어진군에서선택된하나이상인표면의항균처리방법. 청구항 14 제10항에있어서, 상기항균처리방법은스타필로코커스아우레우스 (Staphylococcus aureus) 및아스퍼질러스플라버스 (Aspergillus flavus) 에대한항균처리방법인, 표면의항균처리방법. 발명의설명 [0001] 기술분야본발명은스타필로코커스아우레우스 (Staphylococcus aureus) 및아스퍼질러스플라버스 (Aspergillus flavu s) 에대해항균활성을나타내는신규슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P, 이를포함하는조성물및이를이용한병원성미생물의활성억제방법에관한것이다. [0002] [0003] [0004] 배경기술스타필로코커스아우레우스 (Staphylococcus aureus) 는그람양성의통성혐기성세균으로건강한사람이나가축의피부와비강표면에존재하여사람이나동물의피부, 호흡기, 부비강등에염증을유발할수있다. 상기균에의해식품이오염되면, 균이식품중에서증식하면서장내독소 (enterotoxin) 를생산하게되어이를함유한식품을섭취할경우식중독을일으킬수있다. 또한, 이균은식세포를죽이는독소 ( 류코시딘 ), 용혈소, 응고효소등을분비하여감염숙주세포의저항성에서벗어나화농성감염증을일으킨다. 뿐만아니라, 소금농도가높은곳에서도증식하며, 특히건조상태에서저항성이강하여식품이나가검물등에서장기간 ( 수개월 ) 생존하여식중독을유발한다. 포도상구균식중독 (Staphylococcal food poisoning) 은전세계적으로가장흔하게보고되고있는식중독중하나이며, 주로스타필로코커스아우레우스에의해생성된포도상구균의장내독소 (staphylococcal enterotoxin) 이포함된식품을섭취했을때발생한다 ( 비특허문헌 1). 식품의약품안전처의통계정보에따르면, 우리나라에서는최근 5년간스타필로코커스아우레우스에인해총 46건의집단식중독사고가발생하였으며, 총환자수는 807명에이른다고보고하였다. 스타필로코커스아우레우스에의해발생하는식중독으로인한주요증상으로는메스꺼움, 구토, 경련성복통등이나타난다. 한편, 아스퍼질러스플라버스 (Aspergillus flavus) 는곰팡이독소이며, 발암물질로알려진아플라톡신 (aflatoxin) 을생성하여식품을오염시킬수있다. 아스퍼질러스플라버스가생성하는아플라톡신은인간및동물에게노출될경우면역기능이억제됨으로써감염에대한저항성이낮아지는것으로나타났고, 성장장해와폐사, 사료효율감소, 질병별감염율증가를야기하는것으로알려져있다 ( 비특허문헌 2). 동물은종에따라독성에대한감수성이달라지며, 같은종안에서도연령, 성별, 몸무게, 식이, 감염물질에의노출, 기타곰팡이 - 4 -

5 독소또는약물등의존재에따라상당한차이가있다. 특히, 곰팡이독소는가축을키우는농가에심각한피해 를주는요인이되고있다. [0005] [0006] [0007] [0008] 또한, 건조환경과같은스트레스에대해저항성이강한스타필로코커스아우레우스는식품제조설비와환경표면에서흔히발견되며, 이는식품으로의오염또는재오염의원인이되며, 다양한종류의식품으로교차오염을유발할수있다. 따라서, 이와같이위해미생물이다양한환경으로교차오염되는것을예방하기위해서는효과적인살균처리방법이개발되어야한다. 현재환경표면에오염된위해미생물을억제하기위하여하이포아염소산염 (hypochlorite), 이산화염소 (chlorine dioxide), 에탄올 (ethanol), 과산화수소 (hydrogen peroxide) 와같은화학적살균제가개발되어있고, 이살균제들의살균력역시검증되어있지만, 이러한화학적살균제는작업자에게피부염증, 독성물질의축적과같은부작용을유발할수있다. 따라서, 식품접촉표면에서화학적합성물보다천연물제제를이용하여을억제할수있는방법의개발이필요하다. 한편, 바이오필름은생물학적또는비생물학적표면에부착된미생물과미생물이분비하는다당류 (EPS; extracellular polymetric substances) 의결합층이다. 미생물들이식품접촉표면에바이오필름을형성하게되면건조와같은환경스트레스에저항성이상당히증가하게된다. 만약스타필로코커스아우레우스에대한항균특성을가진길항미생물들을이용하여다양한환경표면에바이오필름을형성시킨다면, 이표면은스타필로코커스아우레우스에대한지속적인항균활성을나타낼수있을것이다. 현재까지환경표면에오염된식중독세균을억제할수있는신규미생물을발굴한사례는거의없고, 특히바이오필름형성을유도하여길항미생물들의환경스트레스에대한저항성을향상시킨연구도거의없었다. 따라서, 다양한환경표면에서위해미생물을억제할수있는신규미생물의발굴은계속적으로이루어져야하며, 발굴된신규의유용미생물을적용하기위한방법들역시개발되어야한다. 선행기술문헌 [0009] 비특허문헌 ( 비특허문헌 0001) Seo, S., Bohac, G. A., Staphylococcus aureus. In: Doyle, M. P., Buchanan, R. L. (Eds.), Food Microbiology: Fundamentals and Frontiers. ASM Press, Washington D.C., pp ( 비특허문헌 0002) Nam, K, H., Korean Journal of Poultry Science (1994) 21(2), 발명의내용 [0010] 해결하려는과제본발명의목적은스타필로코커스아우레우스 (Staphylococcus aureus) 및아스퍼질러스플라버스 (Aspergillus flavus) 에대해항균활성을나타내는신규균주인슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P, 이를포함하는조성물및이를이용한병원성미생물의활성억제방법을제공하는것이다. [0011] [0012] [0013] 과제의해결수단이에, 본발명자들은토양, 식품, 식품접촉표면으로부터약 2,100개의미생물을분리하였고, 이미생물중스타필로코커스아우레우스 (Staphylococcus aureus) 및아스퍼질러스플라버스 (Aspergillus flavus) 에대해우수한항균활성을나타내는균주를찾고자노력한결과, 신규한슈도모나스속균주인슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P를분리, 동정하여본발명을완성하게되었다. 본발명에따른슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P(Pseudomonas azotoformans strain KACC 92125P) 는식품유래의슈도모나스아조토포만스신규균주이다. 비록본발명에서의슈도모나스아조토포만스균주는식품으로부터분리, 동정하기는했으나, 입수경로가이에한정되는것은아니다. 본발명에의실시예를통해분리된스타필로코커스아우레우스및아스퍼질러스플라버스에대해우수한항균효과를나타내는미생물의동정및분류를위한 16S rrna 염기서열분석결과, 도 3의핵산서열을갖는것으로나타났다. 또한, 분석결과, 상기균주는도 4의트리에서볼수있는바와같이, Pseudomonas azotoformans - 5 -

6 strain NBRC 와가장높은분자계통학적유연관계를보였다. [0014] [0015] [0016] [0017] [0018] [0019] [0020] [0021] [0022] [0023] 따라서, 도 3의 16S rrna 염기서열을갖는본발명의미생물을슈도모나스아조토포만스렉투스 (Pseudomonas azotoformans lettuce) 로명명하고, 국립농업과학원에 2016년 03월 30일자로기탁하였다 ( 수탁번호 KACC 92125P). 본발명에있어서, 상기슈도모나스아조토포만스렉투스 (Pseudomonas azotoformans lettuce) 는슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P(Pseudomonas azotoformans strain KACC 92125P) 와상호교환적으로사용할수있다. 본발명의슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P는스타필로코커스아우레우스 (Staphylococcus aureus) 와아스퍼질러스플라버스 (Aspergillus flavus) 에대해동시에항균활성을나타냄으로써, 본발명의균주를포함하는조성물은생물학적제제로써사용되어식품, 농업, 환경산업등에넓게적용시킬수있다. 하기실시예에서는, 본발명의슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P가스타필로코커스아우레우스와아스퍼질러스플라버스에대해동시에항균활성을나타내는것을확인하였다. 뿐만아니라, 상기슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P의현탁액을스테인리스스틸에분사건조하여배양한표면에서상기균주의개체수를측정하여바이오필름형성능력이우수함을확인하였다. 그러므로, 본발명에따른슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P는스타필로코커스아우레우스및아스퍼질러스플라버스에대한항균성물질로서가축, 축사등에서상기병원성미생물의활성억제용도로다양하게활용될수있다. 이에, 본발명의한구체예에서는, 슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P, 이의배양물, 이의추출물또는이의현탁물을포함하는조성물을제공한다. 본발명에따른조성물에포함되는슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P는생균체또는사균체로서존재할수있으며, 또한건조또는동결건조된형태로존재할수도있다. 다양한조성물내에포함시키기적합한균주의형태및제제화방법은당업자에게잘알려져있다. 예를들어, 추출물, 배양물, 농축물, 현탁물등의형태로포함될수있으나, 이에제한되는것은아니다. 본발명의한구체예에서는슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P, 이의배양물, 이의추출물또는이의현탁물을포함하는항균용조성물을제공한다. 본발명에따른항균용조성물은스타필로코커스아우레우스 (Staphylococcus aureus) 및아스퍼질러스플라버스 (Aspergillus flavus) 에대해항균활성을나타낸다. 스타필로코커스아우레우스는젖소와염소류에게유선염을유발할수있으며, 닭에게부종성피부염과관절염을유발할수있고, 폐렴, 당뇨병, 골수염, 심장내막염, 균혈증패혈증등의감염질환을유발할수있다. 또한, 아스퍼질러스플라버스는옥수수에서이삭마름병을유발할수있고, 특히, 아스퍼질러스플라버스는곡류에아플라톡신 (aflatoxin) 이라는곰팡이독소를형성할수있는데, 이곰팡이독소가형성된곡류를동물이섭취했을경우부종, 소화불량, 간질환, 암, 낙태, 기형발생, 경구개궤양, 안면신경마비등의증상또는질환을유발할수있다. 또한, 상기스타필로코커스아우레우스와아스퍼질러스플라버스는대표적인식중독균으로알려져있어, 가축에게서식중독, 장염등을유발할수있다. 따라서, 상기조성물은동물또는식물의병원성미생물의감염에의한질환의예방, 치료, 개선에이용될수있으며, 바람직하게는상기동물은소, 말, 돼지와같은가축과식물은밀, 보리, 귀리, 호밀, 쌀등의곡류를포함한다. [0025] [0026] [0027] 또한, 본발명은슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P, 이의배양물, 이의추출물또는이의현탁물을포함하는사료또는사료첨가제조성물을제공한다. 사료로서이용될경우, 상기조성물은동물의식이욕구를충족시키는데통상적으로사용되는임의의단백질-함유유기곡분을포함할수있다. 이러한단백질-함유곡분은통상적으로옥수수, 콩곡분, 또는옥수수 / 콩곡분믹스로주로구성되어있다. 사료첨가제로서이용될경우, 상기조성물은 20 내지 90% 고농축액이거나분말또는과립형태로제조될수있다. 상기사료첨가제는구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산등의유기산이나인산나트륨, 인산칼륨, 산성피로인산염, 폴리인산염 ( 중합인산염 ) 등의인산염이나, 폴리페놀, 카테킨, 알파-토코페롤, 로즈마리추출물, - 6 -

7 비타민 C, 녹차추출물, 감초추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산등의천연항산화제중어느하나또는하나이 상을추가로포함할수있다. 사료로서이용될경우, 상기조성물은통상의사료형태로제제화될수있으며, 통상의사료성분을함께포함할수있다. [0028] [0029] [0030] [0031] [0032] 상기사료첨가제및사료는곡물, 예를들면분쇄또는파쇄된밀, 귀리, 보리, 옥수수및쌀 ; 식물성단백질사료, 예를들면평지, 콩, 및해바라기를주성분으로하는사료 ; 동물성단백질사료, 예를들면혈분, 육분, 골분및생선분 ; 당분및유제품, 예를들면각종분유및유장분말로이루어지는건조성분등을더포함할수있으며, 이외에도영양보충제, 소화및흡수향상제, 성장촉진제등을더포함할수있다. 상기사료첨가제는동물에게단독으로투여하거나식용담체중에서다른사료첨가제와조합하여투여할수도있다. 또한, 상기사료첨가제는탑드레싱으로서또는이들을동물사료에직접혼합하거나또는사료와별도의경구제형으로용이하게동물에게투여할수있다. 상기사료첨가제를동물사료와별도로투여할경우, 당해기술분야에잘알려진바와같이약제학적으로허용가능한식용담체와조합하여, 즉시방출또는서방성제형으로제조할수있다. 이러한식용담체는고체또는액체, 예를들어옥수수전분, 락토오스, 수크로오스, 콩플레이크, 땅콩유, 올리브유, 참깨유및프로필렌글리콜일수있다. 고체담체가사용될경우, 사료첨가제는정제, 캡슐제, 산제, 트로키제또는함당정제또는미분산성형태의탑드레싱일수있다. 액체담체가사용될경우, 사료첨가제는젤라틴연질캡슐제, 또는시럽제나현탁액, 에멀젼제, 또는용액제의제형일수있다. 또한, 상기사료및사료첨가제는보조제, 예를들어보존제, 안정화제, 습윤제또는유화제, 용액촉진제등을함유할수있다. 상기사료첨가제는침주, 분무또는혼합하여동물의사료에첨가하여이용될수있다. 본발명의사료또는사료첨가제는포유류및가금류를포함하는다수의동물식이에적용할수있다. 상기포유류로서돼지, 소, 양, 염소, 실험용설치동물및실험용설치동물뿐만아니라, 애완동물 ( 예 : 개, 고양이 ) 등에게사용할수있으며, 상기가금류로서닭, 칠면조, 오리, 거위, 꿩, 및메추라기등에도사용할수있으나, 이에한정되는것은아니다. [0034] [0035] 또한, 본발명은슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P, 이의배양물, 이의추출물또는이의현탁물을포함하는생물학적방제제를제공한다. 본발명에있어서, 상기방제제에사용되는슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P는임의의다른성분을전혀첨가하지않고그대로사용할수있다. 필요에따라, 고체담체또는액체담체등의임의의각종담체와합하여제조된조성물, 또는첨가제등의제제용보조제를첨가하여, 균주또는물질을수화제, 용액제, 현탁제, 과립제, 분제, 마이크로캡슐제등으로제제화하여수득된제형물을사용할수있다. 상기제제는슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P를약 0.1 내지 99 중량 % 로포함할수있고, 이에제한되는것은아니나 제제 1g 당약 10 3 내지 CFU 의상기균주를포함할수있다. [0036] [0037] [0038] [0039] 제제화에사용되는고체담체로는예를들어, 미네랄분말 ( 예, 카올린클레이, 벤토나이트, 규조토, 합성함수산화규소, 탈크, 석영, 버미큘라이트, 펄라이트등 ), 무기염 ( 예, 황산암모늄, 인산암모늄, 질산암모늄, 우레아및염화암모늄등 ), 유기분말 ( 소맥분, 대두분, 밀기울, 키틴, 쌀겨, 탈지분유및전지분유등 ), 활성탄및탄산칼슘등을들수있다. 액체담체로는, 예를들어물, 글리세롤, 식물유 ( 예, 대두유및유채씨유 ), 액체동물유 ( 예, 어유 ), 에틸렌글리콜, 폴리 ( 에틸렌글리콜 ), 프로필렌글리콜및폴리 ( 프로필렌글리콜 ) 등을들수있다. 제제용보조제로는, 예를들어카제인, 젤라틴, 다당류 ( 예, 전분가루, 아라비아고무, 셀룰로오스유도체및알긴산 ), 리그닌유도체, 벤토나이트, 당류, 식물유, 광물유, 합성수용성고분자 ( 예, 폴리 ( 비닐알콜 ), 폴리 ( 아크릴산 ) 등 ), 프로필렌글리콜, 에틸렌글리콜등의동결방지제 ; 실리콘계화합물등의소포제 ; 천연다당류 ( 예, 잔탄검등 ), 무기물 ( 예, 알루미늄및벤토나이트등 ), 합성수용성고분자 ( 예, 폴리 ( 아크릴산 ) 등 ) 등의증점제등을들수있다. 본발명에있어서, 상기방제제는항균제, 축사소독제, 음수첨가제등으로적용할수있다. 또한, 본발명에따른방제제는살충제, 살선충제, 살진드기제, 살진균제, 살균제, 제초제, 식물생장조절제, 전착제, 비료, 미생물재료, 토양개량제등과혼합하여사용하거나, 또는혼합하지않고동시에사용할수도있다

8 [0041] [0042] [0043] [0044] 또한, 본발명은상기생물학적방제제를가축, 축사또는그부근에처리하는단계를포함하는, 병원성미생물의활성억제방법을제공한다. 본발명에따른병원성미생물의활성억제방법은가축, 축사또는그부근에직접처리하거나바이오필름을형성시켜처리하는단계를모두포함할수있으나, 이에제한되는것은아니다. 예를들어, 상기생물학적방제제를사료에첨가하여가축에게급여하거나, 축사또는그부근에살포함으로써가축에감염을일으킬수있는병원성미생물의활성을억제시키는방법과축사및그부근환경에상기생물학적방제제를부착하거나바이오필름형성을유도하여병원균에대해항균성을부여하는방법등을포함할수있다. 본발명에있어서, 상기병원성미생물은스타필로코커스아우레우스 (Staphylococcus aureus) 및아스퍼질러스플라버스 (Aspergillus flavus) 일수있다. 앞서설명한바와같이, 상기병원성미생물의활성을억제시킴으로써, 가금류, 가축등의동물에게스타필로코커스아우레우스로부터유발되는식중독, 장염, 유선염, 부종성피부염, 관절염, 폐렴, 당뇨병, 골수염, 심장내막염, 균혈증, 패혈증등과아스퍼질러스플라버스로부터유발되는경구개궤양, 간암등의병원성미생물에의한감염질환을예방할수있다. [0046] [0047] [0048] [0049] [0050] [0051] [0052] [0053] [0054] [0055] 본발명은슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P, 이의배양물, 이의추출물또는이의현탁물을포함하는, 아스퍼질러스플라버스 (Aspergillus flavus) 에의한이삭마름병방제제를제공한다. 또한, 본발명은상기방제제를식물에처리하는단계를포함하는아스퍼질러스플라버스 (Aspergillus flavus) 의활성억제방법을제공한다. 본발명에따른아스퍼질러스플라버스 (Aspergillus flavus) 의활성억제방법은상기방제제를식물에살포함으로써식물에감염을일으킬수있는아스퍼질러스플라버스의활성을억제시킬수있다. 앞서설명한바와같이, 아스퍼질러스플라버스의활성을억제시킴으로써밀, 보리, 귀리, 호밀, 쌀등의곡류에서이삭마름병을예방할수있다. 또한아스퍼질러스플라버스에의해형성되는아플라톡신 (aflatoxin) 의곰팡이독소역시예방할수있다. 상기아플라톡신은안면신경마비, 경구개궤양, 간암등을유발할수있다. 본발명은슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P, 이의배양물, 이의추출물또는이의현탁물을포함하는병원성미생물에의한감염질환의예방또는치료용약제학적조성물을제공한다. 본발명에있어서, 상기병원성미생물은스타필로코커스아우레우스 (Staphylococcus aureus) 및아스퍼질러스플라버스 (Aspergillus flavus) 를포함한다. 본발명에따른조성물은가금류, 가축등의동물에게스타필로코커스아우레우스로부터유발되는식중독, 장염, 유선염, 부종성피부염, 관절염, 폐렴, 당뇨병, 골수염, 심장내막염, 균혈증, 패혈증등의감염질환과아스퍼질러스플라버스로부터유발되는경구개궤양, 간암등의병원성미생물또는곰팡이독소에의한감염또는독소형질환을예방또는치료할수있다. 본발명의조성물이약제학적조성물로활용될경우, 본발명의약제학적조성물은상기유효성분이외에약제학적으로적합하고생리학적으로허용되는보조제를사용하여제조될수있으며, 상기보조제로는부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제또는향미제등을사용할수있다. 상기약제학적조성물은투여를위해서상기기재한유효성분이외에추가로약제학적으로허용가능한담체를 1 종이상포함하여약제학적조성물로바람직하게제제화할수있다. 예를들어, 정제또는캡슐제의형태로의제제화를위해, 유효성분은에탄올, 글리세롤, 물등과같은경구, 무독성의약제학적으로허용가능한불활성담체와결합될수있다. 또한, 원하거나필요한경우, 적합한결합제, 윤활제, 붕해제및발색제또한혼합물로포함될수있다. 적합한결합제는이에제한되는것은아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스또는베타-락토오스와같은천연당, 옥수수감미제, 아카시아, 트래커캔스또는소듐올레이트와같은천연및합성검, 소듐스테아레이트, 마그네슘스테아레이트, 소듐벤조에이트, 소듐아세테이트, 소듐클로라이드등을포함한다. 붕해제는이에제한되는것은아니나, 녹말, 메틸셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄검등을포함한다. 액상용액으로제제화되는조성물에있어서허용가능한약제학적담체로는, 멸균및생체에적합한것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충식염수, 알부민주사용액, 덱스트로즈용액, 말토덱스트린용액, 글리세롤, 에탄올및이들성분중 1 성분이상을혼합하여사용할수있으며, 필요에따라항산화제, 완충액, - 8 -

9 정균제등다른통상의첨가제를첨가할수있다. 또한희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제및윤활제를부가 적으로첨가하여수용액, 현탁액, 유탁액등과같은주사용제형, 환약, 캡슐, 과립또는정제로제제화할수 있다. [0056] 나아가해당분야의적절한방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA 에개시되어있는방법을이용하여각질환에따라또는성분에따라바람직하게제제화할수있다. [0058] [0059] [0060] [0061] [0062] 또한, 본발명은슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P, 이의배양물, 이의추출물또는이의현탁물을표면에처리하는단계를포함하는표면의항균처리방법을제공한다. 본발명에있어서, 표면에처리하는단계는상기균주, 균주의배양물, 균주의추출물또는균주의현탁물을표면에분사하여건조하는단계를포함할수있다. 또한, 분사건조한후, 20 내지 30 의온도범위에서 3시간내지 120시간동안, 바람직하게는 3시간내지 72시간동안, 더바람직하게는 6시간내지 48시간동안배양기에서배양하는단계를추가로포함할수있다. 본발명에있어서, 상기표면은스테인리스스틸, 유리, 나무, 비닐, 플라스틱, 고무또는타일류일수있으나, 표면의종류가이에제한되는것은아니다. 하기실시예에서, 상기슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P의현탁액을스테인리스스틸쿠폰에분사하여건조한후, 25 의온도에서 120시간동안배양한결과, 배양 24시간만에상기균주의개체수가약 100배이상증가하여그후에는개체수가유지되는것을확인함으로써, 상기균주가스테인리스스틸쿠폰에바이오필름을형성하여항균활성을나타낼수있음을확인하였다. 따라서, 본발명에따른균주는표면에비선택적으로바이오필름을형성하여스테인리스스틸, 유리, 나무, 비닐, 플라스틱, 고무, 타일류등의표면에바이오필름을형성함으로써항균활성을나타낼수있으므로, 스타필로코커스아우레우스 (Staphylococcus aureus) 및아스퍼질러스플라버스 (Aspergillus flavus) 에대해우수한항균활성을나타낼수있다. [0063] 발명의효과본발명의슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P는식품위해미생물인스타필로코커스아우레우스 (Staphylococcus aureus) 및아스퍼질러스플라버스 (Aspergillus flavus) 에대해항균활성을나타내고, 건조한환경에서도슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P는잘생존하므로, 상기균주를포함하는조성물은생물학적제제로써사용되어식품, 농업, 환경산업등에넓게적용시킬수있다. [0064] 도면의간단한설명 도 1 은본발명에따른균주의스타필로코커스아우레우스 (Staphylococcus aureus) 에대한항균활성을저해환 의형성을통해나타낸결과이다. 도 2는본발명에따른균주의아스퍼질러스플라버스 (Aspergillus flavus) 에대한항균활성을저해환의형성을통해나타낸결과이다. 도 3은본발명의슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P의 SEQ ID NO: 1에기재된염기서열을나타낸것이다. 도 4는본발명의슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P의분자계통학적유연관계를보여주는트리이다. 도 5는본발명의슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P의바이오필름성장곡선을그래프로나타낸결과이다. 도 6은본발명의슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P가형성한바이오필름의형태를 SEM을통해관찰한결과이다. 도 7은본발명의슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P로부터형성된바이오필름의건조환경스트레스에대한저항성을확인한결과이다. 도 8은본발명의슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P로부터형성된바이오필름의스타필로코커스아우 - 9 -

10 레우스에대한항균활성을확인한결과이다. [0065] 발명을실시하기위한구체적인내용본발명의이점및특징, 그리고그것들을달성하는방법은상세하게후술되어있는실시예들을참조하면명확해질것이다. 그러나본발명은이하에서개시되는실시예들에한정되는것이아니라서로다른다양한형태로구현될것이며, 단지본실시예들은본발명의개시가완전하도록하고, 본발명이속하는기술분야에서통상의지식을가진자에게발명의범주를완전하게알려주기위해제공되는것이며, 본발명은청구항의범주에의해정의될뿐이다. [0067] [0068] [0069] [0070] [0071] [ 실시예 1] 토양, 식품, 식품접촉표면으로부터스타필로코커스아우레우스 (Staphylococcus aureus) 에대해항균력을보이는길항미생물의발굴토양샘플은대한민국의여러산, 호수, 댐등에존재하는흙을채집하여확보하였다. 흙은 10cm정도깊이로땅을파서내부에있는흙을채취하였다. 이흙 1g을 10ml의멸균된물에현탁시키고 1 내지 3시간정도 25 에서 200rpm으로진탕배양하였다. 배양후, 배양액에서흙이가라앉으면상등액 0.1ml를취해 humic acid vitamin agar에도말하여 28 에서 3일내지 14일간배양한후자란미생물콜로니를백금이 (inoculation loop) 로취하여 20% 글리세롤에넣고 -80 에서냉동보관하였다. 보관해둔토양유래미생물의단일콜로니를백금이를이용하여 Bennet's agar에획선도말하고 25 배양기에서총 6일동안배양하였다. 이때, 3일배양후, 균주가잘자랐는지확인하여잘자라지못한균주는멸균면봉을이용하여 2차획선도말한후배양하였다. 6일후콜로니가자라면약 1 내지 5개의콜로니를작은사이즈의구슬이포함된 10ml의 TSB에접종하여약 200rpm으로 25 에서 3일동안진탕배양하였다. 3일배양후, 이토양미생물들을 TSA에 10μl씩점접종하고 15분내지 30분동안층류생물안전캐비닛후드 (laminar flow biosafety cabinet hood) 에서건조한후, 25 배양기에서 24시간동안정치배양하였다. [0073] [0074] [0075] [0076] 식품으로부터미생물을분리하기위하여서울에소재한재래시장에있는상점들중무작위로 8곳을선정하여신선채소 ( 상추, 얼음양상추, 양배추, 적양배추, 배추, 깻잎, 어린양배추, 치커리그리고겨자잎 ) 와수산물 ( 어류 [ 고등어, 참조기 ], 갑각류 [ 새우 ] 그리고패류 [ 홍합, 피조개 ]) 을구입하였다. 10g의신선채소또는수산물을 100ml의멸균된 0.1% 펩톤수 (peptone water, PW) 와함께 400ml의폴리올레핀용기에넣고균질기를이용하여 2분간균질화하였다. 균질화된샘플들은각각 0.1% PW로희석하고, 0.1%(w/v) 피루빈산나트륨 (sodium pyruvate) 이첨가된 TSA(tryptic soy agar) 배지에평판도말한후, 25 에서 48시간동안배양하였다. 배양한후, 모양과색깔이서로다른콜로니들을선별하여백금이로 TSA 배지에획선도말한후 25 에서 24시간동안배양하여 4 에서냉장보관하였다. 식품과식품접촉표면에서분리한미생물의경우, 단일콜로니를 10 ml의 TSB에접종하여 25 배양기에서 24시간간격으로세번계대배양하였다. 10ml의 TSB에서배양한식품유래미생물을 TSA에각각 10μl씩점접종하고층류생물안전캐비닛후드 (laminar flow biosafety cabinet hood) 에서 15분내지 30분동안건조한후, 25 배양기에서 24시간동안정치배양하였다. [0078] [0079] 토양에서분리한미생물의경우점접종 3일배양후, 식품에서분리한미생물의경우는점접종 24 시간배양후, 45 로유지한 TSA 99 ml와 1ml의스타필로코커스아우레우스 (Staphylococcus aureus) 10 7 CFU/ml와혼합하여 10 5 CFU/ml의균을포함하는 100ml의 agar를준비하였다. 스타필로코커스아우레우스가혼합된 agar를균주가자란 TSA에 10ml씩분주하였다. 이 agar plate를층류생물안전캐비닛후드 (laminar flow biosafety cabinet hood) 에서 30분동안건조한후, 37 에서 24시간배양하여저해환의크기를확인하였다. 그결과를도 1에나타내었다

11 [0081] 도 1 에서보는바와같이, agar plate 에형성된저해환의직경을측정한결과, 식품으로부터분리한길항미생물 ( 상추 -9) 에의한저해환의직경이 3.9cm 로가장크게나타나는것을확인하였다. [0083] [0084] [ 실시예 2] 토양, 식품, 식품접촉표면으로부터아스퍼질러스플라버스 (Aspergillus flavus) 에대해항균력을보이는길항미생물의발굴항균대상으로아스퍼질러스플라버스 (Aspergillus flavus) 를사용한것을제외하고는상기실시예 1에서와동일한방법으로저해환의크기를확인하였다. 도 2를통해저해환의크기를확인하였다. [0086] 도 2 에서보는바와같이, agar plate 에형성된저해환의직경을측정한결과, 식품으로부터분리한길항미생물 ( 상추 -9) 에의해직경이 1.1cm 인저해환을형성하는것을확인하였다. [0088] [0089] [0090] [ 실시예 3] 길항미생물의동정스타필로코커스아우레우스 (Staphylococcus aureus) 및아스퍼질러스플라버스 (Aspergillus flavus) 에대해항균력을보인길항미생물을 TSA 배지에획선도말하여 25 에서 2일동안정치배양한뒤, 16S rrna 유전자서열분석을의뢰한결과, 도 3의핵산서열을갖는것으로나타났다. 16S rrna 유전자서열정보를 NCBI( 의 blast 분석을통해균을동정하였다. 동정결과이미생물은슈도모나스속 (Pseudomonas spp.) 일가능성이 99% 인것으로확인되었다. SEQ ID NO: 1의핵산서열을도 3에나타내었다. 이슈도모나스속 (Pseudomonas spp.) 의종명을확인하기위하여, 먼저계통도 (phylogenetic tree) 를그려분석하였다. 계통도는분석된 16S rrna 유전자서열정보를 Mega software(version 5.05) 의 neighbor-joining 방법으로도시한도 4의트리에서볼수있는바와같이, Pseudomonas azotoformans strain NBRC 12693의유전자서열정보와유사한것으로확인되어슈도모나스아조토포만스와가장높은분자계통학적유연관계를보였다. 따라서, 실시예 1 및 2에서분리한상기길항미생물 ( 상추-9) 을슈도모나스아조토포만스렉투스 (Pseudomonas azotoformans lettuce) 로명명하고, 국립농업과학원에 2016년 03월 30일자로기탁하여수탁번호 KACC 92125P를부여받았다. [0092] [0093] [0094] [0095] [0096] [0097] [ 실시예 4] 슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P의바이오필름형성능력확인상기실시예를통해식품에서분리한슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P의단일콜로니를 10ml의 TSB 배지에접종하여 25 배양기에서 48시간간격으로세번계대배양하였다. 10ml TSB에서 48시간동안배양한슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P의배양액을 2,002rcf로원심분리한후, 1ml의현탁액을 99ml의 PBS(phosphate buffer saline) 를이용하여 100배로희석하고, 동일한방법으로한번더희석하여최종적으로 5 log CFU/ml의슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P의현탁액을준비하였다. 이렇게준비한현탁액을스테인리스스틸쿠폰에멸균된스프레이를이용하여분사한후, 1시간동안 laminar flow biosafety hood에서건조시킴으로써쿠폰표면에단순부착시켰다. 슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P의 cells이부착된쿠폰에 4ml의 TSB를공급하고 25 배양기에서최대 120시간동안저장하였고, 저장 24시간마다슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P의개체수를확인하여바이오필름형성능력을확인하였다. 이때, 스테인리스스틸표면에서슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P의개체수가유의적으로증가한경우에바이오필름이형성되었다고판단하였다. 도 5에바이오필름이형성되는성장곡선을나타내었다. 25 에서 120시간저장후, 스테인리스스틸에서슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P이형성한바이오필름을확인하기위하여주사현미경 (SEM) 을찍어이균의특성을파악하였다. SEM을통해바이오필름을형성한모습을도 6에나타내었다

12 [0098] [0099] 도 5에서보는것과같이, 스테인리스스틸에부착된슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P의초기개체수는 3.3log CFU/coupon이었고, 저장 24시간만에유의적으로증가하였고, 저장 48시간이후에는 8.5 log CFU/coupon까지증가하였으나, 그이후에는개체수가유지되었다. 이러한결과는 TSB를공급해준후 25 에저장하는동안에슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P가스테인리스스틸표면에바이오필름을형성할수있다는것을의미한다. 또한, 슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P가스테인리스스틸표면에바이오필름을형성한모습을 SEM을이용하여모습을관찰한결과 ( 도 6), 스테인레스스틸표면에전반적으로슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P가많은군집을형성하고있고, 스테인리스스틸표면과균또는서로다른균사이를연결하는섬유질과같은끈들이발견된것을확인하였다. [0101] [0102] [0103] [0104] [0105] [ 실시예 5] 슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P의건조환경스트레스에대한저항성확인스테인리스스틸표면에슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P를부착시키기위해, TSB 배지 10 ml에서 48 시간동안 25 의온도조건에서배양된슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P 9 log CFU/ml를멸균된스프레이를이용하여분사하고, 1시간동안건조시키면서부착시켰다. 스테인리스스틸표면에슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P의바이오필름을형성시키기위해, TSB 배지 10 ml에서 48시간동안 25 의온도조건에서배양된슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P 5 log CFU/ml를멸균된스프레이로분사하고 1시간동안건조시킨후, TSB 배지 4 ml를공급하여 25 에서 5일동안저장하였다. 슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P가부착된또는바이오필름이형성된스테인리스스틸쿠폰은 25, 43% 의상대습도조건에서 5일동안저장하였고, 저장 24시간마다슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P의개체수를확인하였다. 그결과를도 7에그래프로나타내었다. 그결과, 슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P이단순부착된경우에는저장 24시간이후 3.4 log CFU/coupon 이상의개체수감소를보였지만, 바이오필름을형성한경우에는단지 0.8 log CFU/coupon의개체수감소를보였다. 이러한결과들은테스트된슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P이스테인리스스틸표면에바이오필름을형성할경우, 건조환경에대한저항성이증가한다는것을의미한다. [0107] [0108] [0109] [ 실시예 6] 슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P의스타필로코커스아우레우스 (Staphylococcus aureus) 에대한저감화효과확인실시예 5와동일한방법으로슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P의바이오필름이형성된스테인리스스틸쿠폰을준비한후, 스타필로코커스아우레우스 (Staphylococcus aureus) 현탁액을 0.1ml( 약 4 log CFU/coupon) 취하여슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P의바이오필름을포함한또는포함하지않은스테인리스스틸쿠폰위에 18±2 drops 정도로점접종 (spot-inoculation) 하였다. 그후, 43% 의상대습도와 25 의온도조건에서 48시간동안저장하였고, 저장 0, 3, 6, 12, 24 그리고 48시간마다스타필로코커스아우레우스의개체수를확인하였다. 그결과를도 8에그래프로나타내었다. 실험결과, 접종된스타필로코커스아우레우스의초기개체수는 4.2 log CFU/coupon이었다. 바이오필름을형성하지않은스테인리스스틸쿠폰의표면에존재하는스타필로코커스아우레우스의개체수는저장 48시간후에 3.0 log CFU/coupon이남아있었다. 반면, 슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P가형성한바이오필름을포함하고있는스테인리스스틸쿠폰에접종된스타필로코커스아우레우스가더빠르게사멸하는것을확인하였다. 즉, 슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P가형성한바이오필름에노출된스타필로코커스아우레우스의개체수는저장시간동안유의적으로감소하여, 저장 48시간후에는 1.9 log CFU/coupon으로감소되었다. 이를통해슈도모나스아조토포만스균주 KACC 92125P의스타필로코커스아우레우스에대한강한살균력을확인할수있었다. [0110] 수탁번호

13 기탁기관명 : 국립농업과학원 ( 국내 ) 수탁번호 : KACC92125P 수탁일자 : 도면 도면 1 도면

14 도면 3 도면

15 도면 5 도면

16 도면 7 도면 8 서열목록 <110> KOREA UNIVERSITY RESEARCH AND BUSINESS FOUNDATION <120> Pseudomonas azotoformans strain KACC 92125P and composition for comprising the same <130> P16U13C0801 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1481 <212> RNA <213> Pseudomonas azotoformans strain KACC 92125P

17 <400> 1 tcagattaac gctggcggca ggcctaacac atgcaagtcg agcggtagag agaagcttgc 60 ttctcttgag agcggcggac gggtgagtaa tgcctaggaa tctgcctggt agtgggggat 120 aacgttcgga aacggacgct aataccgcat acgtcctacg ggagaaagca ggggaccttc 180 gggccttgcg ctatcagatg agcctaggtc ggattagcta gttggtgggg taatggctca 240 ccaaggcgac gatccgtaac tggtctgaga ggatgatcag tcacactgga actgagacac 300 ggtccagact cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgg acaatgggcg aaagcctgat 360 ccagccatgc cgcgtgtgtg aagaaggtct tcggattgta aagcacttta agttgggagg 420 aagggttgta gattaatact ctgcaatttt gacgttaccg acagaataag caccggctaa 480 ctctgtgcca gcagccgcgg taatacagag ggtgcaagcg ttaatcggaa ttactgggcg 540 taaagcgcgc gtaggtggtt tgttaagttg gatgtgaaat ccccgggctc aacctgggaa 600 ctgcattcaa aactgactga ctagagtatg gtagagggtg gtggaatttc ctgtgtagcg 660 gtgaaatgcg tagatatagg aaggaacacc agtggcgaag gcgaccacct ggactaatac 720 tgacactgag gtgcgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc 780 cgtaaacgat gtcaactagc cgttggaagc cttgagcttt tagtggcgca gctaacgcat 840 taagttgacc gcctggggag tacggccgca aggttaaaac tcaaatgaat tgacgggggc 900 ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggcc 960 ttgacatcca atgaactttc cagagatgga ttggtgcctt cgggaacatt gagacaggtg 1020 ctgcatggct gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgt aacgagcgca 1080 acccttgtcc ttagttacca gcacgtcatg gtgggcactc taaggagact gccggtgaca 1140 aaccggagga aggtggggat gacgtcaagt catcatggcc cttacggcct gggctacaca 1200 cgtgctacaa tggtcggtac agagggttgc caagccgcga ggtggagcta atcccataaa 1260 accgatcgta gtccggatcg cagtctgcaa ctcgactgcg tgaagtcgga atcgctagta 1320 atcgcgaatc agaatgtcgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac 1380 accatgggag tgggttgcac cagaagtagc tagtctaacc ttcgggagga cggttaccac 1440 ggtgtgattc atgactgggg tgaagtcgta caggggaacc c

(52) CPC 특허분류 A23L 1/3002 ( ) A23L 1/337 ( ) A61K 2236/19 ( ) - 2 -

(52) CPC 특허분류 A23L 1/3002 ( ) A23L 1/337 ( ) A61K 2236/19 ( ) - 2 - (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) A61K 36/03 (2006.01) A23L 1/30 (2006.01) A23L 17/60 (2016.01) A23L 33/00 (2016.01) (52) CPC 특허분류 A61K 36/03 (2013.01) A23L 1/29 (2013.01) (21) 출원번호