Trans. of Korean Hydrogen and New Energy Society, Vol. 28, No. 6, 2017, pp. 697-703 DOI: https://doi.org/10.7316/khnes.2017.28.6.697 KHNES pissn 1738-7264 eissn 2288-7407 보리를이용한고효율바이오에탄올생산연구 전형진 1 고경모 1 김신 2, 정준성 1, 1 창해에탄올종합기술원, 2 한국석유관리원석유기술연구소 A Study on the High-efficient Bioethanol Production Using Barley HYUNGJIN JEON 1, KYOUNG-MO GO 1, SHIN KIM 2,, JUN-SEONG JEONG 1, 1 Advanced Institue of Technology, Changhae Ethanol Co., Ltd., 15 Wonmanseong-ro, Deokjin-gu, Jeonju 54854, Korea 2 Research Institute of Petroleum Technology, Korea Petroleum Quality and Distribution Authority, 33 Yangcheong 3-gil, Ochang-eup, Cheongwon-gu, Cheongju 28115, Korea Corresponding author : Junpapapa@naver.com Shinnara@kpetro.or.kr Received 20 October, 2017 Revised 4 December, 2017 Accepted 29 December, 2017 Abstract >> This study investigated the high-efficient process for bioethanol from barley by various condition. First, higher concentrations of ethanol could be produced without loss of yield by using reducing water consumption. This is because it could prevent to increase viscosity despite reducing water consumption. Second, the ethanol yield could be improved by using reducing particle size of biomass (increase of enzyme reactive surface). Third, The addition of protease could have a considerable effect on yield of fermentation, which provides nutrients to the yeast. This results showed that bioethanol production would provide efficient ethanol production and lower production costs. Key words : Bioethanol( 바이오에탄올 ), Barley( 보리 ), Particle size( 입도 ), Protease ( 프로테아제 ) 1. 서론 수송용에너지부분에서액체연료는매우중요한에너지원으로대부분현재가솔린과디젤이사용되고있지만화석연료의유한성, 환경오염등으로대체에너지의필요성이점점대두되고있다. 이에바이오에탄올은가솔린을대체할수있는에너지원으로서가치를인정받아사용하는국가가꾸준히증가하고있다 1-3). 현재바이오에탄올을수송용연료로사용하는 대표적인국가는미국과브라질로서지역및기후적인특성을살려미국에서는옥수수, 수수와같은전분질계바이오매스를에탄올생산원료, 브라질에서는사탕수수기반의당질계바이오매스를기질로서사용하고있다. 이외에도동남아등지에서도카사바등을이용하여바이오에탄올을수송용에너지로사용하는국가가점점증가하고있다 4,5). 자국의풍부한바이오매스를이용하여바이오에탄올을보급하고있는해외사례와달리우리 697 2017 The Korean Hydrogen and New Energy Society. All rights reserved.
698 보리를이용한고효율바이오에탄올생산연구 나라의경우에는다양한국내바이오매스를이용한바이오에탄올생산을위한연구가활발히진행되어왔으나노동집약적인원료생산의특성으로바이오매스의확보에대한어려움때문에바이오에탄올의생산과상용화에대한현실적인부담이많은것이사실이다. 국내에서의바이오에탄올의사용을위해서는일부물량에대한바이오매스및에탄올수입은불가피하지만국내산바이오매스사용이병행되어야수입의존도탈피, 에너지안보강화, 농촌경제활성화, 환경적이점등을지니기때문에바이오에탄올의연료로서의사용에대한의미를가질수있다 6,7). 우리나라의음용에탄올생산은국산원료인재고현미를주원료로사용되고있지만이는식량자원과의경합으로인해상당한위험성을가지고있으며이를보완할수있는바이오매스의발굴이중요하다. 이에본연구에서는식량자원과의경합을줄이며최근재배면적이급감하고있는동계작물인보리에주목하였고이를이용하여효과적인에탄올생산기술에대한연구를실시하였다. 보리의경우에는 1990년대연간 20만톤이상의생산량이가격경쟁력상실, 수요급감에따라 2016년에는 10만톤에그치고있는실정이다. 만약바이오에탄올생산용으로국산보리를이용한다면수요증가로인해겨울철유휴농지에보리를다시재배하게되어 1990년대수준인 20만톤이상의생산이가능할것으로예상되며기존소비용 10만톤을제외하고도 10만톤의보리를바이오에탄올생산용바이오매스로활용할수있을것으로예상된다. 10만톤의보리는바이오에탄올을약 4만 KL생산이가능한수량으로 E3 사용시국내필요량 30만 KL의 13% 를공급할수있을것이다. 국내의유휴농지는전국적으로 16만 ha 수준 (2009년) 이며이중 20% 만활용하여도약 12만톤의 (1 ha당 4톤생산 ) 보리를추가적으로확보할수있기에불가능한수치는아닐것이다. 2012년에폐지된정부의보리수매방식이아닌바이오에탄올생산업계등민간기업의바이오매스확보 를위해구매할것이기에수확시설및저장시설의확충및지원이자연스럽게이루어져국내경제활성화와농가소득의증대에크게기여할수있을것이다 8-11). 본연구에서는바이오에탄올생산용으로서의가능성이있는국산바이오매스인보리를기질로이용하여바이오에탄올을생산하고생산성증대및수율상승을위한방법에대한다양한실험을진행하였다. 2. 실험 2.1 실험재료 본연구에사용된바이오매스는 창해에탄올에음료용에탄올생산용으로입고되고있는보리 (2016 년수확 ) 를분쇄하여이용하였다. 전분의액화에사용된효소는 Novozyme사의 α-amylase 를이용하였고, 당화효소는 Solid-glucoamylase( 이오엔자임 ) 을이용하였다. 추가적으로점도개선을위해 Novozymes사의 β-glucosidase를이용하였으며, 효모의 free amino nitrogen (FAN) 공급을위해사용된 Protease는 Novozymes사의제품을이용하였다. 발효공정에사용된효모는현재 창해에탄올에서음료용에탄올생산에이용되고있는산업용균주인 Saccharomyces cerevisiae CHY 1011 (KCTC11250BP) 를 YPD배지 (10 g/l yeast extract, 20 g/l peptone, 100 g/l glucose) 에서 33 에서 24시간배양후사용하였다. 2.2 실험방법 2.2.1 원료의분쇄및전분가분석본실험에사용된보리는분쇄기 (PC-7-F, 성창기계 ) 를이용하여미분화를실시하였으며, 분쇄입도는각각 2.5 mm, 2.0 mm, 1.5 mm, 1.0 mm, 0.5 mm 의 Sieve를통해조절하였다. 전분가의분석은산당화법과효소당화법을이용하여생성된환원당을분석하였다. 산당화법은 >> 한국수소및신에너지학회논문집제 28 권제 6 호 2017 년 12 월
전형진 고경모 김신 정준성 699 Table 1. Condition of Fermentation test Test name Condition Ratio of water addition Control of water addition (350% - 250%) Particle size of raw material 0.5 mm - 2.5 mm Addition of protease 0.005% 화발효를진행하였다 (Fig. 1). 2.2.3 원료분체입도별발효실험각각 2.5 mm, 2.0 mm, 1.5 mm, 1.0 mm, 0.5 mm 로분쇄된보리 320 g과증류수 928 ml를혼합한후 160 µl의 α-amylase와 160 µl의 β-glucosidase 를첨가하여 95 에서 2.5시간호화, 액화한후 33 로냉각하여 1.92 g의 Solid-glucoamylase를첨가하고종균배양액 70 ml를접종시킨후 96 시간동안동시당화발효를진행하였다 (Fig. 1). 2.2.4 Protease 첨가발효실험 Fig. 1. Schemaitic diagram of experimental procedure and condition. 1 mm 이하로분쇄된원료 2 g, 증류수 120 ml, 5% HCl 100 ml를 500 ml 삼각플라스크에혼합한후 95 상압에서 2.5시간가수분해후 NaOH로중화하고증류수를첨가하여 500 ml로 mass-up 하여 HPLC 로분석하였다. 효소당화법은분쇄된원료 5 g을증류수 100 ml와 α-amylase SC 50 µl를첨가한후 9 5 에서 2.5시간호화및액화후 60 로냉각하여 0.1N HCl 로 ph를 4.5로조절한후 Solid-glucoamylase 를 0.6 g을첨가한후 18시간당화후 1 L로 mass-up 하여 HPLC 로분석하였다. 2.2.2 급수비별발효실험 1.5 mm Sieve에서분쇄된보리 320 g에 Table 1 과같이증류수를조절하여가한후 160 µl의 α -amylase 와 160 µl의 β-glucosidase를첨가하여 95 에서 2.5시간호화, 액화한후 33 로냉각하여 1.92 g의 Solid-glucoamylase를첨가하고종균배양액 70 ml를접종시킨후 96 시간동안동시당 1.5 mm Sieve에서분쇄된보리 320 g에 Table 1 과같이증류수를조절하여가한후 160 µl의 α -amylase 와 160 µl의 β-glucosidase를첨가하여 95 에서 2.5시간호화, 액화한후 33 로냉각하여 1.92g의 Solid-glucoamylase와 protease 16 µl를첨가하고종균배양액 70 ml를접종시킨후 96시간동안동시당화발효를진행하였다 (Fig. 1). 2.2.5 분석방법발효실험에서생성된당, 유기산및에탄올의분석은발효액을 Sampling하여 Syringe filter (0.2 µm) 를이용하여여과한후 high performance liquid chromatography (HPLC; waters) 를이용하여분석하였다. Column 은 Bio-rad사의 Aminex HPX-87H column 을사용하였으며 oven temperature는 60, detector temperature 는 40 로설정하였다. 3. 결과및고찰 3.1 보리전분가분석 Table 2는산당화법과효소당화법에의해분석된보리의전분함량결과를나타내었다. 분석결과효소당화법보다산당화법에의해측정된전분가가 4.4% 높게분석되었다. 이는효소당화법은효소에의해발효가가능한환원당만이측정되지 Vol. 28, No. 6, December 2017 Transactions of the Korean Hydrogen and New Energy Society <<
700 보리를이용한고효율바이오에탄올생산연구 Table 2. Starch value of rew material (Barley) Methods Acid hydrolysis Enzymatic hydrolysis Starch value (%) 64.8 60.4 만산당화의경우에는원료에포함된모든환원당이분석되기때문이다. 보리의경우는맥강에함유된섬유질이나비발효성당인 β-glucan 등의존재로기인되는기질의특성때문이다. 3.2 급수비별발효실험에탄올생산공정에서초기호화및액화에사용되는용수를저감할수있다면높은에탄올농도발효액의상승을통한단위설비당생상성향상과증기, 전기, 용수등사용되는유틸리티의저감으로생산비용을줄일수있는장점이있다. 이에본실험에서는보리의급수비에따른에탄올농도변화및에탄올생산수율을비교하였다. Fig. 2는급수비조건별에탄올농도와생산수율을나타낸그래프이다. 먼저국내상용화급수조건인 330% ( 원료대비 ) 보다급수비를줄이게되면에탄올농도가높아지는경향이보였으나에탄올생산수율이저하되는현상이나타났다. 이는보리에함유된섬유질이나 β-glucan 성분때문에점도상승현상이발생되어효소및균주의활성도저하되어문제가발생되었다. 이러한현 상을방지하기위해서는보리에함유된섬유질이나 β-glucan 성분을분해하여점도문제를해결해야급수비를낮출수있을거라판단하고 β -glucanase를첨가한조건으로실험을진행하였으며결과를 Fig. 3에나타내었다. 분석결과급수율이 290% ( 원료대비 ) 까지는에탄올농도가상승 (9.46 10.49 v/v%) 하는동시에 Blank인 330% 급수조건의에탄올생산수율 (374 L/ton) 을유지하여앞선실험에서발생된문제를해결할수있었다. 다만 270% 급수비조건부터는에탄올의농도저하와동시에에탄올생산수율이급격하게낮아지는경향을보여 290% 내외의조건으로급수비를조절하는것이가장좋은조건인것으로분석되었다. Table 2에서볼수있듯이급수비가 270% 조건이하부터효모의활성도가급격히저하되어에탄올로전환되지못하고잔류된당이급격하게높아진것을확인할수있었다. 3.3 원료분체입도별발효실험에탄올생산공정에서원료의전처리를위해일반적으로분쇄공정이이루어진다. 분쇄공정에서는바이오매스를미분화로충분한표면적확보를통해효소의효율적인반응을이끌어낼수있다. 이를통해원료에서에탄올의생산수율을극대화할수있다면에탄올의생산비용의저감을기대할수있을것이다. 이에본실험에서는 Fig. 2. Final ethanol concentration and ethanol yield in ratio of water addition(no beta-glucosidase) Fig. 3. Final ethanol concentration and ethanol yield in ratio of water addition(beta-glucosidase) >> 한국수소및신에너지학회논문집제 28 권제 6 호 2017 년 12 월
전형진 고경모 김신 정준성 701 Table 3. Comparison of residual sugar(rds-residual direct sugar, RTS-Residual Total sugar) Ratio of water 330% 310% 290% 270% 250% 230% addition (%) RDS (%) 0.08 0.08 0.09 1.48 1.63 1.89 RTS (%) 0.25 0.26 0.28 1.91 2.04 2.41 원료의입도별로에탄올농도에따른생산수율변화를분석하였다. 분석결과분체의입도가작을수록에탄올농도가상승되어에탄올생산수율이상승되는것을확인할수있었다 (Fig. 4). 0.5 mm의분체를이용하여발효시 10.84 v/v% 로분석되어 2.5 mm의분체를이용한발효결과인 10.37 v/v% 보다 0.47 v/v% 높게분석됨에따라에탄올생산수율측면에서 369.79 L/ton에서 387.05 L/ton으로보리 1 ton당 17.26 L의에탄올을더생산할수있는것으로분석되었다. 이는분쇄공정의목적은전술하였듯이효소에의한가수분해시효소의반응표면적을넓히기위함이라고하였는데이는실험결과에서보듯이분체의입도가작을수록효소에의한가수분해능이개선되어입도가큰분체에서는분해되지못한당이효모가발효에이용할수있도록환원당으로분해가가능하여에탄올로전환한것으로판단된다 (Table 3). 3.4 Protease 첨가발효실험에탄올발효균주인효모의생육조건을위한영양원으로는 FAN, mineral, vitamin 등여러가지가있지만 FAN은효모가개체를증식하고유지하며에탄올발효시매우중요한질소영양원이다. 카사바를사용하는상업화공정에서는 FAN을공급하기위해인위적으로 UREA 나인산암모늄을첨가하여운영하고있다. 하지만보리에는원료자체에매우풍부한 protein 이존재하고있어본실험에서는 protein 분해효소인 protease 첨가에따른에탄올생산수율변화를분석하였다. Fig. 5는 protease의첨가에유무에따라발효 Fig. 4. Final ethanol concentration and ethanol yield in particle size conditions Fig. 5. Time course of ethanol concentration. Table 4. Results of ethanol concentration, organic acid concentration and yield No protease Protease Ethanol (v/v%) 10.52 10.79 Yield (L/ton) 375.15 385.04 Lactic acid (g/l) 3.52 1.48 Acetic acid (g/l) 0.95 0.35 시간별로에탄올농도추세를나타낸것이다. 분석결과 protease의첨가로인해에탄올의농도도높게분석되었으며발효속도도개선된것을확인할수있었다. 최종분석된에탄올농도를비교하면 protease 첨가로 0.27 v/v% 의에탄올농도상승으로 10 L/ton의에탄올생산수율효과가나타난것으로분석되었다 (Table 4). 먼저발효속도측면에서 protein의분해로인해효모가이용가능한 FAN으로전환되어발효초기효모의개체수증가속도에긍정적인효과로인해에탄올발 Vol. 28, No. 6, December 2017 Transactions of the Korean Hydrogen and New Energy Society <<
702 보리를이용한고효율바이오에탄올생산연구 효속도에영향을준것으로판단되며, 에탄올농도및수율상승측면에서는 protease 첨가로인해효모의생육조건이강화됨에따라타오염원에의한유기산발효를억제하고목적산물이에탄올로의전환이원활히이루어졌기때문이다. 4. 결론 본연구에서는연료용바이오에탄올생산용으로서의국내산바이오매스인보리를이용하여바이오에탄올생산하고생산성증대및생산수율향상을위해다양한조건으로실험을실시하였고이를통해얻은결론은다음과같다. 1) 사용되는용수의저감가능성모색을위해투입바이오매스대비급수비를다양한조건으로발효실험을실시한결과 β-glucosidase를통해보리에함유된 β-glucan의분해로급수량을줄이더라도점도상승현상억제로인한효소및균주활성도저하를방지할수있었다. 그결과현재상용화규모에서사용되는급수비인 330% 를 290% 까지줄이더라도에탄올수율변화측면에서는큰차이가없는것으로분석되어현재보다고농도의에탄올발효액생산이가능한것으로판단된다. 이는용수, steam, 전기, 수처리비용의저감으로에탄올생산비용저감효과, 단위설비당더많은에탄올생산이가능하여생산성향상이기대되며, 초기투자비의저감도기대할수있다. 2) 분체의입도크기별로발효실험을실시한결과분체의입도가미분화될수록에탄올의생산수율이상승되어생산비용저감이가능한것으로분석되었다. 이는초기원료의전처리공정인분쇄공정에미분화할수록이후호화, 액화및당화공정에서사용되는효소의반응표면적향상으로인한가수분해능개선으로에탄올생산수율이개선될것으로판단된다. 3) 효모의질소원공급을위한 protease 첨가 test를진행한결과효모의개체수증식및생육조건개선으로발효속도및에탄올생산수율에 서긍정적인효과가나타났고, 오염에의한유기산농도상승을억제하는효과도있는것으로분석되었다. 본연구에서는단위공정별로보리에대한에탄올생산가능성을탐색할수있었으나향후바이오에탄올보급을위해서본연구결과를바탕으로구체적이고통합적인연구를통해공정으로의적용가능성을판단하고최적화연구의진행이필요할것으로판단된다. 후기 본연구는 2017년산업통상자원부에너지기술개발사업의제원으로지원을받아수행되었으며, 이에감사드립니다 ( E3급수송용바이오연료의국내적용성향상을위한기술개발, No. 2016010092160). References 1. S. Ture, D. Uzum, and I. E. Ture, The potential use of sweet sorghum as a non polluting source of energy, Energy, Vol. 22, 1997, pp. 17-19. 2. K. L. Kadam, Environmental benefits on a life cycle basis of using bagasse-derived ethanol as a gasoline oxygenate in India, Proceedings of the South African Sugar Technology, Vol. 75, 2002, pp. 358-362. 3. G. W. Choi, M. H. Han, and Y. Kim, Study on Optimizing Pretreatment & Simultaneous Saccharification and Fermentation Process for High-efficiency Bioethanol, Korean J. Biotechnol. Bioeng., Vol. 23, 2008, pp. 276-280. 4. G. W. Choi, Y. Kim, and S. K. Moon, Bioethanol Production using Endogenous Triticale Enzyme, Korean J. Biotechnol. Bioeng., Vol. 23, 2008, pp. 504-508. 5. G. W. Choi, M. H. Han, and Y. Kim, Development of Glucoamylase & Simultaneous Saccharification and Fermentation Process for High-yield Bioethanol, Korean J. Biotechnol. Bioeng., Vol. 23, 2008, pp. 499-503. 6. S. K. Moon, S. W. Kim, and G. W. Choi, Simultaneous saccharification and continuous fermentation of sludge-containing mash for bioethanol production by Saccharomyces cerevisiae CHFY0321, Journal of Biotechnology, Vol. 157, 2012, pp. 584-589. 7. G. W. Choi, H. W. Kang, Y. R. Kim, and B. W. Chung, >> 한국수소및신에너지학회논문집제 28 권제 6 호 2017 년 12 월
전형진 고경모 김신 정준성 703 Comparison of Ethanol Fermentation by Saccharomyces cerevisiae CHY1077 and Zymomonas mobilis CHZ2501 from Starch Feedstocks, Korean Chem. Eng. Res., Vol. 46, 2008, pp. 977-982. 8. J. Sheehan, A. Aden, K. Paustian, J. Brenner, M. Walsh, and R. Nelson, Energy and Environmental Aspects of Using Corn Stover for Fuel Ethanol, Journal of Biotechnology, Vol. 7, 2003, pp. 117-146. 9. H. J. Jeon, B. O. Lee, K. W. Kang, J. S. Jeong, B. W. Chung, and G. W. Choi, Production of Bioethanol by using Beverage Waste, Korean J. Biotechnol. Bioeng., Vol. 26, 2011, pp. 417-421. 10. Y. N. Choi, Status Biomass and Bioethanol, Korea Alcohol Liquor Industry Association, 2013, pp. 31-45. 11. D. Johnston and A. McAloon, Protease increases fermentation rate and ethanol yield in dry-grind ethanol production, Bioresource Technology., Vol. 154. 2014, pp. 18-25. Vol. 28, No. 6, December 2017 Transactions of the Korean Hydrogen and New Energy Society <<