대한구강내과학회지 Vol. 33, No. 1, 2008 한국인소아의타액에서 Helicobacter pylori 의검출 조선대학교치과대학구강내과학교실 유지원 이장근 이영수 윤창륙 안종모 Helicobacter pylori(h. pylori) 는위 십이지장궤양및위암의발생과관련되어있으며, 감염은대부분유년기에발생되어나이가먹어감에따라증가한다. 감염경로에있어서구강은매우중요한역할을하기때문에소아의타액에서 H. pylori 의발현율을조사하여감염경로를규명하기위해위장관과관련된증상및전신질환이없는 10 세이하 20 명과 10 대 20 명의실험군과 20 세이상 71 명의대조군을대상으로연구하였다. 10 세미만에서 5 명 (25%), 10 대에서 6 명 (30%) 그리고 20 세이상 17 명 (23.9%) 에서 H. pylori 가타액에서검출되었다. 실험군과대조군간의검출율비교에있어서차이는없었다 (P>0.05). 이상의결과를종합해볼때건강한한국인소아의타액내에서 H. pylori 는비교적흔히존재하며, 구강이 H. pylori 감염에근원이될수있음을추론할수있다. 주제어 : Helicobacter pylori 감염, 소아, 타액 `1) Ⅰ. 서론 Helicobacter pylori(h. pylori) 는위 십이지장궤양과위암의발생과관련되어있다. 1,2) 전세계인구의절반이상이감염되었다할지라도감염에대한유병율은지역, 연령그리고사회 경계적인상태등에따라다양하다. 일반적으로감염율은불량한위생이나낮은사회 경제적상태를보유하고있는후진국에서높게나타나는데, 감염은대부분유년시절동안에일어난다. 3-5) 감염경로는잘알려져있지않지만배설물 - 구강, 구강 - 구강경로와위장 - 구강경로등이제시되고있다. 일반적으로후진국에서는배설물및먹는물의위생적처리가제대로이루어지지않아배설물 - 구강경로가흔하며, 음식물을씹어서어린아이 교신전자 : 안종모광주광역시동구서석동 421 조선대학교치과대학구강내과학교실전화 : 062-220-3896 Fax : 062-234-2119 E-mail : jmahn@chosun.ac.kr 원고접수일 : 2007-12-10 심사완료일 : 2008-03-09 * 이논문은 2007 년도조선대학교학술연구비의지원을받아연구되었음. 에게먹이는것과같은식이습관으로인해구강 - 구강경로로도감염되는것으로알려져있다. 선진국에서는배설물 - 구강경로로인한감염은사라지고있으며, 구강 - 구강경로를통한감염이나구토, 기능성소화불량과같은상태에서유발되는위 인두반사 (gastroesophageal reflex) 로인해위장 - 구강경로를통한감염등이제시되고있다. 6,7) H. pylori 는구강의치태내에서 Fusobacterium nucleatum 그리고 Fusobacterium periodontium 과결합할수있고, 구강상피를덮고있는 salivary mucin 과결합하는능력을가지고있기때문에 8,9) 구강이 H. pylori 전염의근원이며영구적인서식지라는연구들이계속되고있다. 10-12) Cześnikiewicz-Guzik 등 13) 은 100 명의구강내타액과위장점막에서 H. pylori 존재여부를연구한결과위장점막에서 51%, 타액에서 54% 가발견되었다고보고하였으며, Kim 등 14) 은한국인의치태와타액에서 H. pylori 를발견한후구강이 H. pylori 의서식지로서역할을수행할수있다고제안하였다. 한편, H. pylori 감염은대부분유년기에일어난다고보고있는데 Dupont 등 5) 은 6~16 세사이유럽지역어린이의 H. pylori 감염율은 6% 전후라고보고하고있으며, Rawland 등 15) 은어린이에게서감염된시기는명확하지않지만대부분 5 세이전에일어나는데 9
유지원 이장근 이영수 윤창륙 안종모 후진국에서는 75% 이상의어린이가 10 세까지감염된다고보고하고있다. 위의연구들로미루어볼때 H. pylori 는유년기에대부분감염이이루어지는것으로생각되며, 감염경로에있어서구강은매우중요한역할을하는것같다. 그러나우리나라에서는위 십이지장질환의유병율이높기때문에 H. pylori 의감염율에대한연구들은대부분위장에서만이루어졌다. 따라서감염에있어서구강내요인을파악하는것이중요하리라사료되고유년기에구강내감염의정도를파악하는것이감염경로를규명하는데필수적사항이라고판단되어한국인어린이의타액에서 H. pylori 의발현율을확인하고자본연구를시행하였다. 1. 연구대상 Ⅱ. 연구대상및방법 위장관과관련된증상및전신질환이없는자원자를대상으로하여실험하였다. 10 세이하 20 명과 10 대 20 명을실험군 ( 남자 20 명, 여자 20 명 ) 으로하였고, 20 세이상에서 59 세미만 71 명을대조군 ( 남자 33 명, 여자 38 명 ) 으로하였다 (Table 1). 실험군을 10 세이하와 10 대로구분하여채취한이유는유아기에연령이나라마다기준이달라 10 세를기준으로구분하여실험하였다. 2. 연구방법 1) 타액채취연구대상자로하여금물로구강을헹구게한다음, 자극없이 10 분간기다리게하여타액이분비되도록하였다. 분비된타액을 1.5ml microcentrifuge tube 에채취하여, 실험전까지 -20 에서냉동보관하였다. 타액채취가어려운어린이들은멸균된면봉을이용하여타액을채취하였다. 2) DNA 추출수집된타액으로부터 AccuPrep R Genomic DNA Extraction Kit(Bioneer, Daejeon, Korea) 를이용하여다음과같이 DNA를추출하였다. 먼저 200 μl의 phosphate buffered saline(pbs), 20 μl의 proteinase K(20mg/ml) 및 200 μl의 binding buffer(gc) 를타액및면봉이담겨있는 1.5 ml microcentrifuge tube에넣 어혼합하였다. 60 에서 10분간반응시킨후반응이끝난 tube에 100 μl의 isopropanol을넣고 5초정도가볍게혼합한다. 이렇게혼합된용액을준비된 binding column tube에옮긴후 8,000 rpm으로 1분간원심분리하여여과된용액은버렸다. Column 내에 500 μl의 W1 buffer를넣고 8,000 rpm으로 1분간원심분리후여과액을버리고 500 μl의 W2 buffer를넣고 8,000 rpm으로 1분간원심분리하여여과액을버리고마지막으로 12,000 rpm으로한번더 1분간원심분리하여 column 내에남아있는 ethanol을완전히제거하였다. Binding column tube를멸균된새로운 1.5 ml microcentrifuge tube로옮기고 50 μl의 EL buffer를 binding column tube에넣고실온에약 1분간반응시킨후 8,000 rpm으로 1분간원심분리하여여과된용액을중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction :PCR) 을위해사용하였다. 3) Nested PCR 분석 H. pylori Genomic DNA 의첫번째 PCR 을위해 10 mm Tris-HCl(pH9.0), 40 mm KCl, 1.5 mm MgCl 2, 250 μm의 dntp, 그리고 1U 의 Tag DNA Polymerase 가포함된 AccuPower PCR Premix (Bioneer, Daejeon, Korea) 에 10 μl의주형 DNA 와각각 Primer(20pmole/ μl ) 1 μl씩을넣고최종부피가 20 μl가되도록 8-mop 를넣었다. 모든 PCR 은첫온도순환에앞서 94 에서 5 분간가열한다음 94 30 초, 62 30 초, 72 60 초로이루어진총 33 회의온도순환후 72 에서 5 분간반응시켰다. H. pylori Genomic DNA 의두번째 PCR 을위한혼합물은 10mM Tris-HCl(pH9.0), 40 mm KCl, 1.5 mm MgCl 2, 250 μm의 dntp, 그리고 1U 의 Tag DNA Polymerase 가포함된 AccuPower PCR Premix (Bioneer, Daejeon, Korea) 에 2 μl의첫번째 PCR 산물과각각프라이머 (20pmole/ μl ) 1 μl씩을넣고최종부피가 20 μl가되도록 8-mop 를넣었다. PCR 온도조건은첫온도순환에앞서 94 에서 5 분간가열한다음 94 30 초, 58 30 초, 72 60 초로이루어진총 33 회의온도순환후 72 에서 5 분간반응시켰다. 한편, 모든 PCR 증폭시에음성대조군 (negative control) 과양성대조군 (positive control) 도매번동시에증폭하여오염여부와위양성의가능성을배제하였다. 모든 PCR 과정은 MiniCycler TM (MJ Research, Massachusetts, U.S.A) 에서수행하였다. 10
한국인소아의타액에서 Helicobacter pylori 의검출 4) 전기영동 Ethidium bromide(0.5 μg / ml ) 가포함된 1.5% agarose gel 상에 3 μl의중합효소연쇄반응산물을전기영동한후 UV Transilluminator 를이용하여중합효소연쇄반응산물의크기를분석하였다 (Fig. 1). Marker 로는 100bp DNA Ladder(Bioneer, Daejeon, Korea) 를사용하였다. 5) 통계처리통계처리를위해서 SPSS(Version 11.0) 프로그램을사용하였다. 10 세이하와 10 대의실험군과대조군의 H. pylori 발현율에대하여각군간의차이는 ANOVA 를이용하여검정한후, 각군간의사후검정은 Tukey's studentized Range Test 의 HSD 방법으로시행하였다. 20 세미만실험군 ( 소아집단 ) 과대조군 ( 성인집단 ) 의차이는 t-test 로검정하였다. Ⅲ. 결과 1. 연령분포에따른타액에서 H. pylori 의검출율 10 세미만에서 5 명 (25%), 10 대에서 6 명 (30%) 그리고 20 세에서 59 세까지 17 명 (23.9%) 에서 H. pylori 가검출되었다. 통계적유의성은없었다 (P>0.05, Table 2). Table 1. Age distribution of Volunteers Age(yrs) No. of volunteers male female Total Below 10 10 10 20 10 ~ 19 10 10 20 20 ~ 59 33 38 71 yrs : years No. : Number Table 2. The incidence of H. pylori according to age distribution Age(yrs) Frequency % Below 10 (N=20) 10 ~ 19 (N=20) 20 ~ 59 (N=71) P-Value 0.05 25 30 23.9 yrs : years N : Number of individual a : Symbols for grouping established with Turkey's Studentized Range Table 3. The incidence of H. pylori according to study group and control group Group infant (N=40) adult (N=71) Total (N=111) Frequency % 11 17 28 27.5 23.9 25.2 N : Number of individual P>0.05 When compared to the corresponding group 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Fig. 1. Result of nested PCR products to H. pylori DNA analyzed on 1.5% agarose gel electrophoresis Lane 1 : 100bp DNA Ladder Lane 2, 3, 5, 9 : Saliva sample [Positive] Lane 4, 6, 7, 8, 10 : Saliva sample [Negative] Lane 11 : Positive control (325bp) Lane 12 : Negative control 2. 20 세미만실험군과대조군에따른타액에서 H. pylori 의검출율 11 명 (27.5%) 의실험군과 17 명 (23.9%) 의대조군에서 H. pylori 가검출되었다. 두군간에검출율의비교에있어서통계적유의성은없었다 (P>0.05, Table 3). 11
유지원 이장근 이영수 윤창륙 안종모 Ⅳ. 고찰 H. pylori 균은자체에서만드는 Urease 라는효소에의해알칼리를생성하여강산에서도살수있는유일한균이다. 한번감염되면자연적으로치유되지않고일생동안감염이지속되며, 선진국보다는후진국, 소아보다는성인에서높은감염율을나타낸다. 한국인에있어서도높은감염율을나타내는데, 20 대이상소화기질환의증상이없는성인에서 90% 이상이감염되었다고보고된바있다. 16) 위암발생과의관계는논란이되고있지만여전히세계보건기구에서는 H. pylori 를위암, 위림프종과관련있는발암물질로규정하고있다. 17) H. pylori 는유일한서식지로인간의위장이제시되고있지만돼지, 고양이, 양이나원숭이의위장점막에서발견됨이입증되었다. 가능한오염원은구토물, 타액그리고배설물등으로제시되고있으며, H. pylori 는자연환경에서도몇시간생존할수있다고한다. 6) 이러한사실로볼때 H. pylori 감염은배설물, 구강그리고위장사이의감염경로에각각영향을받는것같다. Andersen 등 8) 과 Veerman 등 9) 의연구에의해제시된 H. pylori 의치주염을유발하는세균에대한특수한결합력과 salivary mucin 위에 sulfated oligosaccharide 의역할로인해 H. pylori 는구강내어느부위에도항상존재할수있는데, Souto 등 18) 은타액보다는치은연하치태에서더많이발견되며정상성인보다는치주염환자에서더많이발견되었다고보고하고있다. 그리고 Gebard 등 19) 은위장내감염된 H. pylori 를제거하기위해 3 개월간약물치료후구강내타액과치태를분석한결과환자의 60% 에서 H. pylori 가구강내검출되었다고보고하였으며, Nguyen 등 20) 은 H. pylori 가구강내균일하게분포되어있지않는데일반적으로치은연상치태에서더많이발견된다고하였다. 이러한차이는 H. pylori 가미세호기성이기때문으로공기중에노출되는환경에따라발현율에차이를나타내는것으로사료된다. H. pylori 의감염은대부분유년기에얻어지는데감염되는시기는명확하지않지만많은연구들에서 5 세이전에일어난다고보고되고있다. 15) 이때감염은주로가족간에일어나는데, Rotheubacher 등 21) 은 5~7 세사이 305 명의어린이와이들부모를분석한결과어린이의감염율은어머니가 H. pylori 에대한타액항체반응을보이면 17.3%, 반응을보이지않으면 5.1%, 아버지가 H. pylori 에대한타액항체반응을보이면 19.1% 반응을보이지않으면 6.8% 라고보고하여감염된부모는아이들에게 H. pylori 전염에있어서중요한역할을한다는이전연구들을뒷받침해주고있다. 이러한감염율은나이를먹어감에따라증가하는데선진국에서는 10 세이하어린이에서 10% 정도의감염을보이나사회나경제적인상태가좋지않은후진국에서는 16~83% 정도의감염율을나타낸다고한다. 22) 본연구에서는소아의연령을 20 세미만으로설정하여연구하였으나감염시기에영향을고려하여 10 세미만과 10 세이상에서 20 세미만으로구분하여연구하였고, 통계적의의는없었으나각각 25% 와 30% 의검출율을나타내었다. 이러한소아의타액내검출율의결과는후진국의감염율보다는적다고볼수있으나이렇게검출율이성인과차이가없고선진국의감염율에비해높게나온이유는한국인의식생활문화등의영향으로 H. pylori 감염이비교적이른나이에일어났을것으로생각된다. 성인의감염율과비교할때는차이를나타내지않았다. 실험군과대조군전체타액내검출율은 25.2% 로국내연구로제시된김 8) 등의한국인타액내 H. pylori 발현율 28.6% 와안등 23) 의성인형치주염환자의구강내 H. pylori 발현율 29.4% 와비슷함을알수있었다. 이러한결과로볼때구강은 H. pylori 의서식지로작용할수있는데구강이 H. pylori 감염의근원이될수있다는것을파악하기위해서는향후위장내감염율과함께연구되어야할것으로사료된다. Ⅴ. 결론 H. pylori 의감염은대부분유년기에발생되어나이가먹어감에따라증가한다. 감염경로에있어서구강은매우중요한역할을하기때문에소아의타액에서 H. pylori 의발현율을조사하여감염경로를규명하기위해위장관과관련된증상및전신질환이없는 10 세이하 20 명과 10 대 20 명의실험군과 20 세이상 71 명의대조군을대상으로연구하였다. 10 세미만에서 5 명 (25%), 10 대에서 6 명 (30%) 그리고 20 세이상 17 명 (23.9%) 의타액에서 H. pylori 가검출되었다. 실험군과대조군간의검출율비교에있어서차이는없었다 (P>0.05). 이상의연구결과를종합해보면, 건강한한국인소아의타액내에서 H. pylori 는비교적흔히존재하며, 12
한국인소아의타액에서 Helicobacter pylori 의검출 구강이 H. pylori 감염에근원이될수있음을추론할수있었다. 참고문헌 1. Tytgat GN, Noach LA, Rauwa EA. Helicobacter pylori infection and deuodenal ulcer disease. Gastroenterol Clin North Am 1993;22:127-139. 2. Hansson LE, Eugstrand L, Nyren O et al. Helicobacter pylori infection : independent risk indicator of gastric adenocarcinoma. Gastroenterology 1993;105: 1098-1103. 3. Leclerc H. Epidemiological aspects of Helicobacter pylori infection. Bull Acad Natl Med 2006;190: 949-962. 4. Oderda G. Transmission of Helicobacter pylori infection. Can J Gastroenterol 1999; 13(7):595-597. 5. Dupont C. Benhamou PH. Kalach N, Raymond H. Helicobacter pylori infection in children. Rev Prat 2000;50(13):1437-1441. 6. Megrand F. When and how does Helicobacter pylori infection occur. Gastrenterol Clin Biol 2003;27:374-379 7. Leung WK, Siu KLK, Kwork CKL, Chan SY, Sung R, Sung JJY. Isolation of Helicobacter pylori From vomitus in childrens and its implication in Gastrooral transmission. Am J Gastroenterol 1999;94(10): 2881-2884. 8. Andersen RN, Ganeshkumar N, Kolenbrander PE. Helicobacter pylori adheres selectively to Fusobacterium spp. Oral Microbiol Immunol 1998;13(1): 51-54. 9. Veerman EC, Bank CN, Namavar F et al. Sulfated glycan on oral mucin as receptors for Helicobacter pylori. Glycobiology 1997;7(6):737-743. 10. Li C, Musich PR, Ha T et al. High prevalence of Helicobacter pylori in saliva demonstrated by a novel PCR assay. J Clin Pathol 1995;48(7):662-666. 11. Peng H, Pan G, Chao S et al. The significance of detection of Helicobacter pylori in saliva. Zhonghua Nei ke za zhi 1999;38(3):171-173. 12. Kignel S, de Almeida Pina F, Andre EA, Alves Mayer MP, Birman EG. Occurence of Helicobacter pylori in dental plaque and saliva of dyspeptic patients. Oral Dis 2005;11(1):17-21. 13. Cześnikiewicz-Guzik M, Karczewska E, Bieloński W. Association of the presence of Helicobacter pylori in the oral cavity and in the stomach. J Physiol Pharmacol 2004;55(2)105-115. 14. Kim N, Lim SH, Lee KH et al. Helicobacter pylori in dental plaque and saliva. Korea J Intern Med 2000;15:187-194. 15. Rowland M, Imrie C, Bourke B, Drumm B. How should Helicobacter pylori infected children be managed? Gut 1999;45(1):136-139. 16. Baik SC, Kim JB, Cho MJ et al. Prevalence of Helicobacter pylori infection among normal korean adults. J Korean Soc Microbiol 1990;25(6):455-462. 17. Kitchens DH, Binkley CJ, Wallace DL, Darling D. Helicobacter pylori infection in people who are intellectually and developmentally dislabled : a review. Spec Care Dentist 2007;27(4):127-133. 18. Souto R, Colombo AP. Detection of Helicobacter pylori by Polymerase Chain Reaction in the subgingival biofilm and saliva of non-dyspeptic periodontal patients. J periodontol 2008;79(1):97-103. 19. Gebara EC, Faria CM, Pannuti C, Chehter L, Mayer MP, Lima LA. Persistence of Helicobacter pylori in the oral cavity after systemic eradication therapy. J Clin Periodontol 2006;33(5):329-333. 20. Nguyeu AM, Engstrand L, Gento RM, Graham DY, el-zaatari FA. Detection of Helicobacter pylori in dental plaque by reverse transcription-polymerase chain reaction. J Clin Microbiol 1993;31:783-787. 21. Rothenbacher D, Winkler M, Gonser T, Adler G, Brenner H. Role of infected parents in transmission of Helicobacter pylori to their children. Pediatr Infect Dis J 2002;21(7):674-679. 22. Bittencourt PF, Rocha GA, Penna FJ, Queiroz DM. Gasttroduodenal peptic ulcer and Helicobacter pylori infection in children and adolescents. J Pediatr 2006;82(5):325-334. 23. Ahn JM, Na MS, Kim BO. The mode of detection of Helicobacter pylori in saliva and subgingival plaque of adult periodontitis patients. J Korean Acad Periodontol 2004;34:723-731. 13
유지원 이장근 이영수 윤창륙 안종모 - ABSTRACT - Detection of Helicobacter Pylori in Saliva of Korean Infant Ji-Won Ryu, D.D.S.,M.S.D., Jang-Keun Lee, D.D.S.,M.S.D., Yong-Su Lee, D.D.S.,M.S.D., Chang-Lyuk Yoon, D.D.S.,M.S.D.,Ph.D., Jong-Mo Ahn, D.D.S.,M.S.D.,Ph.D. Department of Oral Medicine, College of Dentistry, Chosun University Helicobacter pylori(h. pylori) has been associated with the cause of peptic ulcer and gastric cancer. H. pylori infection occur mostly during childhood and increase by aging. In route of transmission, Oral cavity does important role. So we employed this study to elucidate route of transmission by detection of H. pylori in infant saliva. We investigated 20 infants aged below 10 years and 20 teens aged below 20 years as study group and 71 adults aged 20 and over years as control group. H. pylori DNA was isolated from 5(25%) infants aged below 10 years, 6(30%) teens and 17(23.9%) adults by nested polymerase chain reaction(n-pcr). There was no statistically significant difference(p>0.05). The obtained results suggest that H. pylori infection is relatively common in saliva of Korean infant and oral cavity may be reservoir of H. pylori. Key wards : H. Pylori infection, Infant, Saliva 14