발간등록번호 11-1480523-002434-01 NIER-GP2015-157 독성평가를위한생체지표연구 2015
목차 요약문 1 Ⅰ. 세포독성시험 2 1. MTT Assay 2 2. LDH leakage Assay 4 3. Neutral red Assay 5 Ⅱ. 산화적손상시험 7 1. ROS Assay 8 2. NO Assay 10 3. GSH/GSSG Assay 12 III. 염증성단백질분석시험 14 1. IL-1α/β 14 1) IL-1α 14 2) IL-1β 15 2. IL-6 16 3. IL-8 16 4. IL-10 17 5. VEGF 17 6. TNF-α 18 7. TGF-β 19 - i -
8. 사이토카인측정방법 19 1) ELISA 원리 20 2) 시험방법 22 IV. 참고문헌 26 V. 부록 29 - ii -
그림목차 그림 1. MTT Assay 원리 2 그림 2. 산화제와항산화제간의불균형모식도 7 그림 3. ROS Assay 원리 8 그림 4. NO Assay 원리 10 그림 5. GSH/GSSG Assay 원리 12 그림 6. 면역시스템에서다양한세포들의사이토카인네트워크모식도 15 그림 7. ELISA 종류 21 그림 8. 일반적인 ELISA 시험순서모식도 22 그림 9. Microplate layout 예시 23 - iii -
독성평가를위한생체지표연구ㅣ 2015 요약문 1. 제목 독성평가를위한생체지표연구 (2015) 2. 목적 - 화학물질의유해성평가를위해독성발현시나타나는다양한생체이상반응을활용하여독성발생및기전을규명하는방법론제시 - 다양한독성시험을단기간또는중 장기간내에나타나는독성을질적 양적으로검사하여독성여부를규명하기위한참고지표제시 - In vivo 및 In vitro 시험을통해생성된다양한샘플로측정가능한독성지표제시 3. 연구내용 - 세포독성시험 MTT, LDH, Neutral Red Assay - 산화적손상시험 ROS, NO, GSH/GSSG Assay - 염증성단백질분석시험 염증관련단백질 8종 Assay - 1 -
Ⅰ. 세포독성시험 세포독성은광범위하게사용하는 in vitro 독성학연구이다. MTT assay, LDH leakage assay, Neutral red assay는독성물질혹은유해물질노출에의한세포독성또는세포생존율을측정하는가장일반적인시험법이다. 대표적인 3가지시험에대한원리와시험방법은아래와같다. 1. MTT Assay 1) MTT assay원리 Tetrazolium-based colorimetric (MTT) 시험법은많은시료를쉽게빠르게판독할수있어배양된세포에서세포독성에관한연구에주로사용된방법이다. 이방법은대사과정이온전한세포의미토콘드리아내의탈수소효소가노란색수용성 tetrazoliumsalt[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2-5-diphenyltetrazolium bromide] (MTT) 를비수용성의짙은자주색 MTT formazan 결정으로환원시키는원리를이용한것으로적절한파장 ( 주로 500 ~ 600nm) 에서흡광도를측정하여세포독성을평가할수있다. 1),2) 그림 1. MTT 원리 http://en.wikipedia.org/wiki/mtt_assay - 2 -
독성평가를위한생체지표연구ㅣ 2015 2) 실험재료및방법 1 실험재료 - PBS - MTT 용액 : MTT 2 ~ 5mg/ml 로 PBS에녹인뒤, 필터하여 tube에담아빛차단후 4 보관 - DMSO - 96well plate (flat bottom) 2 실험방법 - 96well plate에각 well 당 1 10 4 ~ 1 10 6 으로세포를분주한다. - 측정하고자하는물질을농도별로각 well에첨가한다. - 시험물질이충분히노출될수있도록적절한시간동안 37, 5%, CO 2 incubator에배양한다. - 상층액을다른실험에사용한다면제거하고그렇지않다면 plate에그대로둔다. - 2 ~ 5mg/ml MTT 용액을넣는다. (MTT 용액은빛에민감하므로빛의노출은최소화 ) - 37, 5%, CO 2 incubator에 4시간방치한다. - MTT 용액을제거또는제거하지않은채로 DMSO를분주한다. - 빛차단한상태에서 plate를 10 ~ 30분동안충분히흔들어준다. - Plate reader를이용하여흡광도를측정한다. ( 파장 : 500nm ~ 600nm) - 3 -
2. LDH leakage Assay 1) LDH (latate dehydrogenase) leakage assay원리 LDH assay는젖산탈수소효소의활성을측정하는시험법으로빠르고, 간단하며신뢰성이높은것이특징이다. 젖산탈수소효소는일반적으로세포막을통과하지못하여세포밖으로배출되지않으나, 세포막이손상되거나세포가죽는경우배지중으로방출된다. 따라서배지중의젖산탈수소효소양은치사또는상해를입은세포의수와비례하게된다. 2),4) 2) 시험방법 1 실험재료 - 시판되고있는다양한 LDH Assay kit 중에서선택 - 96well plate (flat bottom) 2 실험방법 - 96well plate에각 well 당세포현탁액을 50 ~ 200μl씩분주한다. ( 대조군 : 세포는없고배지만있는대조군준비, 양성대조군은옵션 ) - Triton X-100 용액을각 kit에서권장하는용량만큼첨가한다. - 측정하고자하는물질을농도별로각 well에첨가한다. - 시험물질이충분히노출될수있도록적절한시간동안 37, 5%, CO 2 incubator에배양한다. - 원심분리기를이용하여 400 ~ 600g, 5분동안세포를침전시킨다. - 새로운 96well plate에상층액을옮긴후 LDH reaction 용액을각 well에첨가한다. - 상온또는 37 에서 30분간방치한다. ( 빛차단필수 ) - Plate reader를이용하여흡광도를측정한다. ( 파장 : 450nm ~ 490nm) - 4 -
독성평가를위한생체지표연구ㅣ 2015 3. Neutral red Assay 1) Neutral red assay원리 Neutral red는비확산에의해세포막을통과하여리소좀안에축적되는양이온성염색시약이다. 상해입지않은세포의리소좀에흡수된 neutral red dye가누적되고외부물질또는화학물질에의해세포막이나리소좀이손상되면 neutral red 가세포내부에있지않고외부로빠져나가게되는원리를통해세포독성을평가할수있다. 2),3),4) 2) 시험방법 1 실험재료 - 시판되고있는다양한 Neutral red Assay kit 중에서선택 - 96well plate (flat bottom) 2 실험방법 - 세포현탁액이들어있는 96well plate에시험물질을농도별로각 well에첨가한다. - 시험물질이충분히노출될수있도록적절한시간동안 37, 5%, CO 2 incubator에배양한다. - 96well plate에세포만남기고배지는제거한다. - Neutral red 용액을각 well에분주한다. - 2 ~ 4시간동안 37, 5%, CO 2 incubate에방치한다. - 조심스럽게용액을제거하고, PBS 또는 HBSS로빠르게세척한다. ( 용액제거전현미경으로세포내빨간색결정확인 ) - Neutral red 고정액을분주한다. - 고정액또는세척액을제거하고가용화용액을분주한다. ( 처음배지용량과동 - 5 -
일한용량분주 ) - 10 분간상온에서 shaker 또는피펫팅을통해결정을녹여준다. - Plate reader 를이용하여흡광도를측정한다. ( 파장 : 540nm) - 6 -
독성평가를위한생체지표연구ㅣ 2015 Ⅱ. 산화적손상시험 현대인의다양한질병과노화의원인으로산화적스트레스가위험인자로알려져있다. 각종산화제의생체내작용은생체막지질의과산화, DNA 변성, 단백성분의손상, 효소불활성화등다양한세포손상과연관이되어있다. 이로인한기능장해로각종성인병, 암, 염증질환그리고노화의원인이되는것이다. 6),7) 정상적인경우생체내항산화효소와항산화물질이존재하여보호작용을하나물리적, 화학적영향으로인해이상이발생할경우활성산소가생성되어방어기작으로산화적스트레스가나타나게된다. 6),7) 이와같은기전으로독성물질혹은유해물질노출에의해발생한산화적스트레스를측정하는대표적인 3가지시험에대한원리와시험방법은아래와같다. Amira A.M. Adly., 2010 그림 2. 산화제와항산화제간의불균형모식도 - 7 -
1. ROS Assay 1) ROS (Reactive Oxygens Species) assay원리 생체내에서유해활성산소형성은산소를사용하는과정에서자연스레생성된다. 산소는전자를획득하기쉬운상태가되어강력한산화제가될수있다. 이산소분자는호흡과정에서 4개의전자에의해환원되어물로바뀌는데불완전하게환원되는것을 ROS라고한다. 이러한 ROS 발생정도를 DCFH-DA (Dichlorofluorescin diacetate) 염색방법을이용하여측정한다. 소수성물질인 DCFH-DA는세포막을투과한후, 세포내에스테라제에의해아세틸화되어형광을띠지않는 DCFH로분해된다. 이때 DCFH가 ROS에의해산화되면녹색형광을띠는 DCF로변환되게된다. 이형광세기를측정하여세포내 ROS 농도를평가할수있다. 7) 그림 3. ROS assay 원리 Gomes, A., et al. 2005-8 -
독성평가를위한생체지표연구ㅣ 2015 2) 시험방법 1 실험재료 - 시판되고있는다양한 ROS Assay kit 중에서선택 - 96well plate (flat bottom) 2 실험방법 - 세포를 96 well clear 또는 black plate에 37, 5%, CO 2 incubator에배양한다. - 배지를제거하고 DPBS 또는 HBSS로세척한다. - 시험물질이충분히노출될수있도록적절한시간동안노출시킨다. - 배지를제거하고 DPBS 또는 HBSS로세척한다. - DCFH_DA를포함하는배지용액을만들어분주후 30 ~ 60분간처리한다. - 배지를제거하고 DPBS 또는 HBSS로 2 ~ 3번세척후용액을모두제거한다. - Microplate fluorometer로 λ excitation 499 nm, λ emission 522 nm에서형광의세기를측정하고, 형광현미경으로관찰한다. - 9 -
2. NO Assay 1) NO (Nitric Oxide) assay원리 NO는혈액응고및혈압조절기능, 암세포에대한면역기능등에중요한역할을하지만 ROS처럼산화되어활성 NO로변화된다. 이는단백질및지질의과산화를유도하고세포독성을야기하는강력한산화제인 peroxynitrite (ONOO - ) 를생산한다. 염증성매개물질에노출된세포에의해서생성된 NO의증가는 NO가생체방어와자유기에의해유발된조직손상에기여한다고알려져있으며다양한염증성질환시증가된다. 9) NO 활성도는대사산물인 nitrate (NO - 3 ) 와 nitrite (NO - 2 ) 의생성농도를확인할수있으며이를그리스반응 (Griess reaction) 을통해확인한다. 질산환원효소를이용하여 NO - 3 를 NO - 2 로환원시키고 Griess 시약을이용한발색반응으로 NO - 2 의농도를측정할수있다. 10) 그림 4. NO assay 원리 Nims R.W., et al. 1995-10 -
독성평가를위한생체지표연구ㅣ 2015 2) 시험방법 1 실험재료 - 시판되고있는다양한 NO Assay kit 중에서선택 2 실험방법 - 시험물질에노출시킨샘플준비다양한샘플측정가능 : Urine, culture media, plasma, serum, tissue homogenate - 실험전샘플전처리실시 - Griess 시약은외부요인들에영향을받아 NO 2 로환원되지않을수있다. 세포배지, 동물의경우식이섭취로인한 NO - 3 의영향을줄이기위해필터방법또는 kit 내용액으로전처리를한다. - 전처리한샘플을 96well plate에분주한다. - 질산환원효소를첨가한다. - 상온에서 1시간방치한다. - Griess 시약을첨가한후상온에서약 10분간방치한다. - Plate reader를이용하여흡광도를측정한다. ( 파장 : 540 ~ 550nm) - 11 -
3. GSH/GSSG Assay 1) GSH/GSSG assay원리 Glutathione은세포내주요물질로써 glutamic acid, cysteine, glycine으로구성된다. 이는산화적스트레스에대한항산화제역할로세포및조직을보호하는기능을한다. Glutathione peroxidase는 GSH 환원제롤사용하여세포의과산화지질을낮추는역할을한다. 생체내에 glutathione은 GSH와 GSSG로존재하며정상일경우전체 glutathione 중 90% 이상 GSH, 10% 이하 GSSG의비율이다. GSH와 GSSG의비율은세포내의산화-환원상태를반영하고앞서말한바와같이 GSH가 GSSG보다많이존재하고있다. 산화된 GSH가 GSSG로산화되면비율은급격하게변화하게된다. 전체 GSH와산화된 GSH의차이로환원된 GSH의양을형광색소를이용하여측정할수있다. 11) Owen J.B., et al. 2010 그림 5. GSH/GSSG assay 원리 - 12 -
독성평가를위한생체지표연구ㅣ 2015 2) 시험방법 1 실험재료 - 시판되고있는다양한 GSH/GSSG Assay kit 중에서선택 2 실험방법 - 시험물질에노출시킨샘플준비다양한샘플측정가능 : Urine, culture media, plasma, serum, tissue homogenate - 실험전샘플전처리실시 : Kit 내설명서에따라처리 - 전처리한샘플을 96well plate에분주한다. - 발색단이포함된 Ellman s 시약 (glutathione 환원효소역할 ) 을첨가한다. - 빛차단후회전교반기에반응시킨다. - End point method: 25 ~ 30분간방치후 plate reader를이용하여흡광도를측정한다. ( 파장 : 405 ~ 414nm) - Kinetict method: 30분동안 5분간격으로 plate reader를이용하여흡광도를측정한다. ( 파장 : 405 ~ 414nm) - 13 -
Ⅲ. 염증성단백질분석시험 면역균형을유지하기위해서는면역세포들의직접또는간접적인상호작용이있어야가능하다. 세포간의상호작용은수용체간의직접적인결합뿐아니라세포가분비한단백질에의해서발생하는경우가많다. 이단백질들은다양한면역세포의증식과분화유도, 기능과활성의변화를유도할수있으며이를사이토카인 (cytokine) 이라고부른다. 12) 외부또는내부인자로인한상해가일어날경우보호작용으로써염증반응이나타나게되는데이때사이토카인을분비하여병원체등에대항하기위해백혈구생성신호를보내는역할을담당하게된다. 이러한염증은초기에제어하지못하면생체기능이상실되고항상성이깨져만성감염, 자가면역질환, 대사성질환등다양한질병이야기될수있다. 13) 질병은대부분염증과관련되어있으며, 염증세포들이염증을유도시키는물질을분비하게된다. 이때분비되는것을염증성단백질 (inflammatory cytokine) 이라하며, 환경유해인자, 바이러스, 약물등이체내에들어오게되면증가하게된다. 13) 이처럼독성물질혹은유해물질노출에의해발생하는대표적인염증성단백질종류와측정방법은아래와같다. 1. Interleukin-1α/β(IL-1α/β) 1) Interleukin-1alpha (IL-1α) IL-1α는주로활성화된대식세포, 호중구, 상피세포, 내피세포에의해생성된다. 대사, 생리, 조혈과정에관여하며단백질가수분해과정과세포손상에대한반응, 세포자멸사를유도하는등면역반응조절에서중요한역할을담당한다. 14),15) 정상사람표피에서상당량발견되며상피세포와각질층은 1:1 비율로분포되어있다. 신체에병원성미생물침입으로부터보호하는장벽으로써피부장벽기능을유지하는역할을한다. 관련된질병으로는류머티즘성관절염과알츠하이머 - 14 -
독성평가를위한생체지표연구ㅣ 2015 병과의연관성이알려진사이토카인이다. 16) Stenken J.A., Poschenrieder A.J. 2015 그림 6. 면역시스템에서다양한세포들의사이토카인네트워크모식도 2) Interleukin-1beta (IL-1β) IL-1β는활성형인카스파제 1로단백질가수분해를통해프로단백질 (proprotein) 로써활성화된대식세포에의해생성되며염증반응의매개체와세포증식 분화 자멸사를포함한다양한세포활성에중요한역할을하는사이토카인이다. 사이클로옥시게나제 (COX-2, cyclooxygenase-2) 효소유도로인해중추신경계에서염증성통증과민증에기인하는사이토카인으로알려져있다. IL-1β 생성이증가되면자가염증성질환이야기된다. 17) - 15 -
2. Interleukin-6 (IL-6) T 세포와대식세포의면역반응자극으로인해분비되며염증과 B 세포성숙기능에관련된사이토카인이다. 정신적외상과감염특히화상또는염증을초래하는다른조직손상들로인해분비된다. 자가면역질환또는감염성질환환자에발열을유도한다. 염증초기에생성되며, IL-6 수용체를통해전사염증반응을유도하고혈청안에서분비된다. 진성당뇨병, 전신소아류머티즘과같은다양한염증관련질병과연관되어있음을보여준다. 18) 또한다른사이토카인과협력하여선천면역과후천면역간의연관성을제공한다. 천식환자의객담에서는비만세포활성화후 IL-6의양이증가하는것이발견되었다. 그리고 IL-6는 Th2와 Th17세포를증가하는역할을해서천식에있어전염증 (proinflammation) 기능을하며 TNF-a, IL-1과 IL-10 활성을억제하는효과를통한항염증사이토카인으로써의역할도한다. 마우스에서도폐렴연쇄구균에대항하기위해 IL-6가요구되는것을보여주었다. 19) 3. Interleukin-8 (IL-8) IL-8은다양한조직과상피세포, 대식세포, 호중구등의세포에서분비되고염증반응의주요매개자중의하나이다. 호중구에대한강력한화학주성인자로써염증부위에호중구를소환하고활성화시키는다양한생물학적효과를나타낸다. 20) 이러한특성으로기관지천식, 아토피피부염같은알레르기성질환뿐아니라호지킨병 ( 악성림프종 ), 류머티즘성관절염, 건선등만성염증성질환발병에중요한역할을하는것으로알려져있다. 그리고낭포성섬유증의원인으로호중구를폐상피로소환하여기도내호중구의과잉자극과기능장애로폐조직의손상을초래하게한다. 알레르기성기관지천식환자의폐세척액에서 IL-8을확인할수있으며, 바이러스로인한호흡기감염인경우기도상피세포에서바이러스가증식하여 IL-8의분비가발생하게되어 - 16 -
독성평가를위한생체지표연구ㅣ 2015 결국기도폐쇄를일으켜천식등의증상을야기하게하는사이토카인이다. 21) 4. Interleukin-10 (IL-10) IL-10은대식세포, 비만세포, 자연살해세포, 호산구, 호중구등선천면역과후천면역시스템세포에의해발현되는사이토카인이다. 그리고 T 세포와비만세포를자극하여 B 세포성숙과항체를생성한다. 또한강력한항염증사이토카인으로전염증성 (proinflammatory) 사이토카인 IFN-γ, IL-2, IL-3, TNF-α, GM-CSF 등의합성을억제하여지나친면역반응에대항하는중요한역할을담당한다. 22) 동물실험을통한 IL-10의효과를보면 IL-10 결핍된마우스는소장에염증반응을나타내는데 IL-10을처리하면염증반응이멈추었다는연구결과가있다. 이뿐만아니라자가면역뇌척수염, 췌장염, 1형당뇨병등에효과적인영향을미치는것으로보고 23) 되었으며천식, COPD (chronic obstructive pulmonary disease) 발병시 IL-10의과한발현으로항원제시가억제되는등강력한면역조절자로의역할을하는사이토카인이다. 19) 5. Vascular endothelial growth factor (VEGF) 혈관내피세포성장인자로써혈관내피세포의증식과이동을유도하며, 새로운혈관을형성하고혈관투과성을증가시킨다. 최근연구결과에서 VEGF는직접적으로 nuclear factor-κb (NF-κB) 를활성화시키고, 혈관내피세포로부터 IL-8와 monocyte chemoattractant protein-1의합성을유도한다고알려졌다. 이를통해 VEGF가신생혈관생성부위를향해백혈구의충원이이루어지도록염증세포를직접자극하거나활성화시킬수있음을보여준다. 24) 기도평활근세포에분비되어혈관및기관지벽재생및투과도증가와부종을유발한다고알려졌다. 그리고천식, 폐결핵등만성폐질환과급성하기도염증성질환에서도증가하는것으로보고되고있다. 25) 이는 VEGF가기도에서혈관누수와새로운혈관의성장조절에있어중요한역할을담당하고 VEGF와 VEGF - 17 -
수용체발현증가는천식성기도에서혈관분포증가와관련있음을보여준다. 대조적으로 VEGF 농도는 COPD 환자의폐와객담에서는감소한다. 게다가폐기종의발달과치경음내피세포의자멸사를유도하는 VEGF 수용체를차단한다는결과를보여준다. 19) 호흡기관련질환뿐아니라증식성망막증 (proliferative retinopathies), 연령관련황반퇴화 (age-related macular degeneration, AMD), 류머티즘성관절염, 암, 건성등다양한질환과관련된사이토카인이다. 26) 6. Tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) 대식세포, 비만세포, T 세포, 상피세포, 기도평활근세포 (airway smooth muscle cell) 등많은세포에서분비하는사이토카인이다. 이러한세포를활성화시켜 IL-1 또는 IL-6와같은친염증성사이토카인을생성하게한다. 19) 바이러스성감염, 암세포등의세포자멸사를유도하거나폐혈증유발, 체내발열유도, 종양생성과바이러스복제억제능력등을가진사이토카인이다. 또한 TNF-α의만성적인생성은신진대사의이상으로악액질과관련된질환으로써만성기생충감염과암이발생할수있으며, 류머티즘성관절염또는다발성경화증같은자가면역질환에서도과다생성되는사이토카인이다. 27) TNF-α는사람기도평활근세포에직접적으로작용하여연축유발인자 (spasmogens) 에대응하여수축성을증가시켜천식질환에있어기도과민반응성 (airway hyperresponsiveness, AHR) 에중요한역할을한다. 천식성기도내다양한세포에서 TNF-α는발현되며그중비만세포에서염증반응을증폭시킨다고알려졌다. TNF-α를차단했을때 AHR 감소하며폐기능이개선되었다고보고된바있다. 19) 이처럼 TNF-α는양면성을지닌사이토카인으로써작용시점, 질환등에따라다른경향을보일수있는사이토카인이다. - 18 -
독성평가를위한생체지표연구ㅣ 2015 7. Transforming growth factor-beta (TGF-β) T 세포, 혈소판, 단핵구등에서분비되며다기능성장인자로알려진사이토카인이다. T 세포와자연살해세포증식과활성을억제로염증에있어중요한역할을담당한다. 혈소판에저장되었던 TGF-β가손상부위에서탈과립화되어많은양의 TGF-β 방출로단핵구와백혈구가손상부위로모이게되어만성염증의초기단계에이르게한다. 이로인해조직회복이조절되지않아점진적인섬유증과비슷한결과를초래할수있게한다. 27) 동물실험을통해혈관사이증식성사구체염, 당뇨성신장병, 폐섬유증, 전신성경화증, 콜라겐유도로인한관절염등에영향을미친다는보고가있다. 사람유래세포실험결과에서는기관지상피세포의편평상피세포분화를유도하며유해인자로인한급성폐손상의섬유화과정을돕는다고보고하였다. 27),28) 또한 COPD 환자폐를 microarray를통해분석한결과 TGF-β의분비가증가되었으며중증천식환자에서도발현양이증가한다는결과를나타냈다. 19) TGF-β는전염증성또는항염증성두가지효과를가진사이토카인으로도알려져있다. 국소조직에서는면역촉진, 체순환 (systemic circulation) 에는면역억제에효과를나타낸다고보고되었다. 27) 8. 사이토카인측정방법 사이토카인은생물지표로써널리사용되고있으며질병진행예측과치료효과를모니터할수있어중요한측정방법중하나이다. 염증성질병뿐만이라동종이계반응성 (alloreactivity), 알츠하이머병, 천식, 죽상경화증 (atherosclerosis), 대장암, 암, 우울증, 심장병, 인간면역결핍바이러스, 신장장애, 파킨스병, 패혈증, 류머티즘성관절염등거의모든질병의생물지표로사용되고있다. 12) 이러한사이토카인은다양한방법을통해측정할수있는데일반적으로많이사용하는 ELSIA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 를이용한시험방법 29) 을소개하고자한다. - 19 -
1) ELISA 원리효소결합면역흡착분석법또는효소면역정량법이라고하여가장널리사용되고있는분석법이다. 항원-항체간의특이적결합반응과효소기질을이용한발색반응으로항원또는항체를정성, 정량할수있는방법이다. 단백질, 펩타이드, 호르몬, 비타민, 의약품뿐아니라유전자조작식물, 식품, 알레르겐, 살충제, 제초제등다양한분야에적용시켜서측정할수있으며, 매우낮은농도임에도불구하고특이적인반응을통해높은수준의항체또는항원을분석할수있는시험법이다. 이는높은민감도를지녔다고할수있으며경제적, 시간적소모가적어현재가장널리이용되고있는이유이다. 측정방법에따라 direct ELISA, indirect ELISA, sandwich ELISA, competitive ELISA 4가지종류로나눌수있다. 1 Direct ELISA (1971년개발 ) : 많은양의고분자량항원을안정적으로측정할수있는방법이다. Microplate well 표면에바로항원또는항체를효소와결합시켜측정한다. 항원또는항체에결합한효소의발색반응을분석한다. 2 Indirect ELISA (1978년개발 ) : Direct ELISA에서고안된방법이다. 질병에걸린혈청을항원이코팅된 microplate well에첨가하면여기에대항하는항원-항체복합체가생성되는데효소가없어측정할수없다. 이것과결합하는 2차항체에포함된효소반응을통해발색반응을분석한다. 3 Sandwich ELISA (1977년개발 ) : 항원에대한항체를 plate에결합하고그항체에대한항원을결합시켜분석하는방법으로 microplate well에 capture antibody를코팅하고시료를첨가시켜항체와결합시킨다. 그리고 direct 또는 indirect 방법으로분석한다. 4 Competitive ELISA (1976년개발 ) : Microplate well 표면에항원-특이항체또는항체-특이항원을코팅하여시료첨가로항원또는항체에결합한효소방응을측정한다. 표지되고표지되지않은항원또는항체간의경쟁에의해발색반응을분석한다. - 20 -
독성평가를위한생체지표연구ㅣ 2015 그림 7. ELISA 종류 Aydin S. 2015-21 -
2) 시험방법 그림 8. 일반적인 ELISA 시험순서모식도 Aydin S. 2015-22 -
독성평가를위한생체지표연구ㅣ 2015 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Blank CONTROL 1 SAMPLE 7 SAMPLE 15 SAMPLE 23 SAMPLE 31 B Standard CONTROL 2 SAMPLE 8 SAMPLE 16 SAMPLE 24 SAMPLE 32 C Standard SAMPLE 1 SAMPLE 9 SAMPLE 17 SAMPLE 25 SAMPLE 33 D Standard SAMPLE 2 SAMPLE 10 SAMPLE 18 SAMPLE 26 SAMPLE 34 E Standard SAMPLE 3 SAMPLE 11 SAMPLE 19 SAMPLE 27 SAMPLE 35 F Standard SAMPLE 4 SAMPLE 12 SAMPLE 20 SAMPLE 28 SAMPLE 36 G Standard SAMPLE 5 SAMPLE 13 SAMPLE 21 SAMPLE 29 SAMPLE 37 H Standard SAMPLE 6 SAMPLE 14 SAMPLE 22 SAMPLE 30 SAMPLE 38 그림 9. Microplate layout 예시 1 실험재료 - 96well plate (flat bottom) - Coating buffer: PBS 또는 TBS 사용 - Capture antibody: 1 ~ 15μg / ml농도에서사용, coating buffer를통해농도조절 - Washing buffer: PBS + 0.05% Twteen 20, ph 7.2 ~7.4 - Blocking standard sample buffer ( 희석용액 ): 1 ~ 5% Bovine Serum Albumin + PBS, ph 7.2 ~7.4 - Detection antibody: 0.5 ~ 10μg / ml농도에서사용, 희석용액을통해농도조절 - Enzyme conjugate: 희석용액으로 200배희석해서사용 - Substrate: 용액 A(H 2 O 2 ) 와용액 B(Tetramethylbenzidine) 를 1:1 비율로제조해서사용 - Stop 용액 : 1 ~ 2M H 2 SO 4 사용 시판되고있는 cytokine 종류별 kit 중에서적절한것을선택한후제조사에서 - 23 -
제시한시약제조법및시험방법에맞게실시하면간편하게측정할수있다. 2 실험방법 - Blank well은비어있는상태로유지시킨다. - Capture antibody를적절한농도로 blank 제외하고 100μl분주한다. - Microplate cover 또는 sealer를이용해서이물질이들어오는것을막는다. - 상온에서 2시간또는 4 에서하룻밤동안방치한다. - ELISA plate 세척기또는 multi-channel pipette을이용해서세척용액을 300 ~ 400μl분주하여 3 ~ 4번세척을반복한다. - Blocking buffer를 blank 제외하고 200 ~ 300μl분주후 cover 또는 sealer로덮는다. - 상온에서 1 ~ 2시간동안방치한다. - Standard well에적절한농도로희석한 standard 용액을 100μl /2well 분주한다. - Control well에농도범위를알고있는 control 용액을 100μl /2well 분주한다. - Sample well에 standard 범위로되게원액또는희석한 sample 용액을 100μl /2well 분주후 cover 또는 sealer로덮는다. - 상온에서 2 ~ 4시간정도방치한다. - ELISA plate 세척기또는 multipipet을이용해서세척용액을 300 ~ 400μl분주하여 3 ~ 4번세척을반복한다. - Biotin이부착된 detection antibody를적절한농도로 blank 제외하고 100μl분주후 cover 또는 sealer로덮는다. - 상온에서 1 ~ 2시간정도방치한다. - ELISA plate 세척기또는 multipipet을이용해서세척용액을 300 ~ 400μl분주하여 3 ~ 4번세척을반복한다. - Sreptavidin-horseradish peroxidase 용액 (enzyme conjugate) 을 blank 제외하 - 24 -
독성평가를위한생체지표연구ㅣ 2015 고 100μl분주후 cover 또는 sealer로덮는다. - 빛을차단하고상온에서 1 ~ 2시간정도방치한다. - ELISA plate 세척기또는 multipipet을이용해서세척용액을 300 ~ 400μl분주하여 3 ~ 4번세척을반복한다. - TMB 용액 (substrate) 을 100μl분주후 cover 또는 sealer로덮는다. - 빛을차단하고상온에서발색되는정도를관찰하면서방치한다. - Stop 용액 (2M H2SO4) 을 100μl분주후 plate reader를이용하여 450nm에서흡광도를측정한다. - 결과계산 Standard 농도와측정된 O.D 값으로그래프를그린다. y=ax+b 기울기공식을토대로 sample O.D 값을넣어농도계산 - 25 -
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독성평가를 위한 생체지표 연구 ㅣ 2015 Ⅴ. 부 록 Cytokine 종류 및 기능30),31),32,)33) - 29 -
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독성평가를 위한 생체지표 연구 ㅣ 2015-31 -
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독성평가를위한생체지표연구 (2015) 편 집 : 환경건강연구부위해성평가연구과임연미, 권도영, 김은지, 김현미, 권정택, 김필제, 최경희 인 발 쇄 : 2015 년 12 월 행 : 2015 년 12 월 펴낸이 : 국립환경과학원장 주 소 : ( 우 ) 22689 인천시서구환경로 42 종합환경연구단지국립환경과학원환경건강연구부위해성평가연구과 전화 : 032) 560-7172 팩스 : 032) 568-2037 ISBN NO. 978-89-6558-333-2 93530