본초학표지

大韓本草學會誌제 28 권제 6 호 (213 년 11 월 ) Kor. J. Herbology 213;28(6):111-117 ISSN 1229-1765 http://dx.doi.org/1.6116/kjh.213.28.6.111. 淫羊藿발효추출물이면역활성에미치는영향 정형민 1, 한효상 2, 이영종 1 1 : 가천대학교한의과대학본초학교실, 2 : 중부대학교보건행정학과 Effect of Fermented Epimedii Herba Extract on the Immuno modulating Activity Hyung-Min Jeong 1, Hyo-Sang Han 2, Young-Jong Lee 1 1 : Department of Herbology, College of Oriental Medicine, Gachon University Seongnam 461-71, Korea 2 : Department of Health Administration, College of Social Sciences, Joongbu University Geumsan 312-72, Korea ABSTRACT Objectives : This research aimed at studying the immuno modulating activity of Fermented Epimedii Herba (EHS). Method : The impacts on the cell viability, hydrogen peroxide and nitric oxide (NO) generation in cells, and cytokines such as tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), interleukin (IL)-6, IL-1β, monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) level have been measured by using Raw 264.7 cells with the specimen EHS as the fermented extract of Epimedii Herba with Saccharomyces cerevisiae STV89. Result : As a result of MTT assay to confirm the cytotoxicity of extracts from fermented Epimedii Herba, the toxicity was not excessively induced in Raw 264.7 cells when EHS were processed by concentration. EHS increased hydrogen peroxide generation in Raw 264.7 cells. EHS suppressed NO generation in Raw 264.7 cells while they significantly suppressed the increase of NO generation induced by LPS in macrophage. EHS significantly decreased the generation amount of TNF-αand IL-6 induced by LPS in Raw 264.7 cells at μg /ml or more. Conclusion : It appeared that the fermented extract of Epimedii Herba manufactured from Epimedii Herba significantly has the immuno modulating acitivity as it did not excessively trigger cytotoxicity to Raw 264.7 cells, increased hydrogen peroxide generation in Raw 264.7 cells, decreased NO generation in macrophage, and especially, suppressed both TNF-αand IL-6 generation in macrophage induced by LPS. Key words : Epimedii Herba, ferment, cytotoxicity, immuno modulating acitivity, reactive oxygen species (ROS) 서론 1) 1) 淫羊藿은神農本草經中品에 淫羊藿, 味辛寒. 主陰痿絶傷, 莖中痛, 利小便, 益氣力, 强志. 一名剛前. 生山谷. 이라고처음收載되었으며, 임상에서陽痿遺精, 虛冷不育, 尿頻失禁, 腎虛喘咳, 腰膝酸軟, 風濕痹痛, 半身不遂, 四肢不仁등을치료하는약물로사용되고있다 2). 淫羊藿의기원으로대한약전 3) 에 삼지구엽초 Epimedium koreanum Nakai, 음양곽 ( 淫羊藿 ) E. brevicornum Maximowicz, 유모음양곽 ( 柔毛淫羊藿 ) E. pubescens Maximowicz, 무산음 양곽 ( 巫山淫羊藿 ) E. wushanense T. S. Ying 또는전엽음양곽 ( 箭葉淫羊藿 ) E. sagittatum Maximowicz( 매자나무과 Berberidaceae) 의지상부 라고수재되어있다. 淫羊藿의성분으로잎과줄기에다량의 flavonoids 화합물을함유하고있는데, 주로 icariin, des-o-methylicariine, β-anhydroicaritine 등이다. E. brevicornum에는 icariin, icarisid Ⅰ이있고, E. koreanum에는 icariin, epimedin A, B, C, quercetin, epimedokoreanoside Ⅰ, Ⅱ, campesterol, β-sitosterol, ikarisoside A가있다 4). 약리작 교신저자 : 이영종, 경기도성남시수정구성남대로 1342. 가천대학교한의과대학본초학교실 Tel : 31-75-5415 E-mail : garak@gachon.ac.kr 제 1 저자 : 정형민, 경기도성남시수정구성남대로 1342. 가천대학교한의과대학본초학교실 HP : 11-9121-1775 E-mail : ktmd7596@naver.com 접수 :213 년 1 월 13 일 수정 :213 년 11 월 26 일 채택 :213 년 11 월 27 일

112 大韓本草學會誌 Vol. 28 No. 6, 213 용으로는면역증강작용 5), 항노화작용 6), 항산화작용 7), 항고혈압작용 8), 간독성억제작용 9), 혈관확장작용 1), 멜라닌생성작용 11) 등이보고되었다. 발효한약은전통발효공법을통해전통한약재를미생물이잘이용할수있게찌거나삶은다음, 공기중의미생물또는혹은유산균과같은순수분리미생물을이용하여발효한한약재를말한다. 현재다양한제법과형태의발효한약이개발되고있으며특히발효홍삼제품과발효한방화장품등을그대표적제품으로꼽을수있다 12). 발효한약에대한선행연구논문으로유산균으로발효된한국산겨우살이추출물의항종양활성및면역자극효과 13), 버섯균사체로발효시킨茯苓과厚朴의항산화및항암효과 14), 茵蔯蒿, 金銀花, 枳椇子등의한방소재를주원료로제조된발효한약추출물로숙취해소효능 12), 차가버섯과어성초함유발효조성물로암예방및항암식 의약품의소재개발가능성 15) 을제시하였다. 이러한최근의발효연구동향에주목하여약리작용과한의학에서補腎壯陽, 强筋健骨, 祛風除濕의효능이있는淫羊藿발효추출물의면역활성에대한연구를하게되었다. 이에著者는본연구에서淫羊藿을 Saccharomyces cerevisiae STV89로발효추출하여제조한시료 EHS를대상으로마우스대식세포에서세포증식율, 세포내과산화수소 (H 2O 2) 생성과 lipopolysaccharide(lps) 에의해촉발되는산화질소 (nitric oxide; NO) 생성및각종사이토카인 (TNF-α, IL-6, IL-1β, MCP-1) 생성에미치는영향을조사하여유의한결과를얻었기에이에보고하는바이다. 1. 재료 재료및방법 1) 약재실험에사용된淫羊藿 (Epimedii Herba, Epimedium koreanum Nakai) 은한국서울의경동시장에서 27년 1 월에구입하였으며, 약재의진위와품질의우열을가천대학교한의과대학본초학교실에서감정하였고 (No. 27-112) 모든약재는쓰기전에초음파세척기 (Branson, USA) 를이용하여불순물을제거하고실험에사용하였다. 淫羊藿의발효에사용한균주로는효모균주중 Saccharomyces cerevisiae STV89를사용하였다. 2) Cell line 실험에사용된대식세포는마우스복강대식세포 (mouse macrophage line) 인 Raw 264.7 세포로서한국세포주은행 (KCLB, Korea) 으로부터구입하여사용하였다. 3) 시약및기기본실험을위해서 ethyl alcohol (Samchun Chemical, Korea), DMSO (Sigma, USA), DMEM (Sigma, USA), 1 PBS (Sigma, USA), EDTA (Sigma, USA), isopropanol (Sigma, USA), trypsin-edta (Sigma, USA), Bio-Plex cytokine assay kit (Panomics, USA) 등이사용되었다. 본실험에사용된기기는 CO2 incubator (Nuaire, USA), rotary vacuum evaporator (Eyela, Japan), research microscope (Becton dickinson, USA), centrifuge (Hanil, Korea), fume hood (Hanil, Korea), clean bench (Jeio thec, Korea), ultrasonic cleaner (Branson, USA), microplate reader (Bio-Rad, USA), vortex mixer (Vision Scientific Co, Korea), water bath (Intron Biotech, Korea), ice-maker (Vision Scientific Co, Korea) 등이다. 2. 방법 1) 시료의제조淫羊藿 5 g을정확하게중량을측정한뒤환류추출기에 1 차증류수 2, ml와함께넣은뒤탕액이끓는시점으로부터 2시간동안가열하여추출한다음추출액을 filter paper (Advantec No.2, Japan) 로감압여과한여과액을 rotary vacuum evaporator 를이용하여농축액을얻었다. 이농축액을동결건조기를이용하여건조한분말을시료로사용하였다. 동결건조추출물은 8 g을얻었으며, 수율은 16% 였다. 위에서제조된淫羊藿추출물을이용하여다음과같은방법으로淫羊藿발효추출물을제조하였다. 1 조효소조제 : 조효소제인 α-herbzyme ( 한국효소 ) 3 g에증류수 1 ml를가하고 37 에서 3분간침출하여여과시킨후그여액을조효소액으로사용하였다. 2 열수출하여건조한淫羊藿추출물 (3. g, ph:4.72) 을 Screw cap tube에담고미리추출된조효소액 2.2 ml를첨가하여 37 에서 2시간효소반응하였다. 3 효소반응후 95 에서 1분간살균하였다. 4 Saccharomyces cerevisiae STV89를淫羊藿추출물에 4 % 씩접종하여 3 에서 4일간배양하였다. 5 배양후 6 에서 2분간열처리하였다. 6 Saccharomyces cerevisiae STV89에서배양후 ph는 4.75였다. 7 발효가끝난후, 동결건조하여시료로사용하였으며, 세포에처리시에는 PBS에녹여서사용하였다. 2) 세포배양 Raw 264.7 세포는 37, 5% CO 2 조건에서 1% FBS, penicillin(1 U/mL), streptomycin(1 μg /ml) 이첨가된 DMEM 배지로배양되었다. Raw 264.7 세포를 75 cm2 flask (Falcon, USA) 에서충분히증식된후배양 3일간격으로배양세포표면을 phosphate buffered saline (PBS) 용액으로씻어준후 5 ml flask 당 1 ml의.% trypsin-edta 용액을넣고실온에서 1분간처리한다음 trypsin 용액을버리고 37 에서 5분간보관하여세포를탈착하여계대배양하였다. 탈착된세포는 1% FBS가첨가된 DMEM 배양액 1 ml에부유시킨다음새로운배양용기 (5 ml culture flask) 에옮겨 1 : 2의 split ratio로 CO 2 배양기 (37, 5% CO 2) 에서배양하였다. 3) 세포증식율검사준비된시료가 Raw 264.7 세포의증식율에미치는영향

淫羊藿발효추출물이면역활성에미치는영향 113 을알아보기위하여 MTT assay를실시하였다. 96 well plate에 1 1 4 cells/well 의세포를 1μl씩넣고 37, 5% CO 2 incubator 에서 24시간동안배양한후배지를버리고배양세포표면을 phosphate buffered saline(1 PBS) 용액으로씻어주었다. 같은양의배지와 PBS에녹인시료를각 well에처리하고 24시간동안배양하였다. 배양이끝난후 PBS에녹인 1 mg /ml MTT (Sigma, USA) 를 1μl씩각 well에처리하여알루미늄호일로차광시킨후 2시간동안같은조건에서배양하였다. 배양액을모두제거한후 DMSO 를 1μl처리하고 37 에서 2시간방치후 microplate reader(molecular Devices, USA) 를이용하여 54 nm에서흡광도를측정하였다. Cell Proliferation은다음공식으로계산되었다. Cell Proliferation(%) = 1 AT / AC AC : absorbance of control AT : absorbance of tested extract solution. 4) 과산화수소 (Hydrogen peroxide) 생성측정세포내의과산화수소 (hydrogen peroxide, H 2O 2) 의생성양은 dihydrorhodamine 123(DHR) assay를이용하여측정하였다. 먼저, 96 well plate 1 1 4 cells/well의 cell을 1 μl씩넣고 37, 5 % CO 2 Incubator 에서 24시간동안배양한후배지를버리고배양세포표면을 phosphate buffered saline(1 PBS) 용액으로씻어주었다. 시료를처리하기전에우선 DHR(1 um) 이담긴배지를 3 분간각 well에처리한뒤배지를제거하였다. 다양한농도의시료를배지에담아각 well에처리하고 24시간동안 37, 5 % CO 2 Incubator에서배양한후 microplate reader(bio-rad, USA) 를이용하여 49 nm에서흡광도를측정하였다. 세포내 H 2O 2 생성은다음공식으로계산하였다. Intracellular Productions of H 2O 2(%) = 1 AT / AC AC : absorbance of control AT : absorbance of tested extract solution. 5) 산화질소 (Nitric oxide) 생성측정산화질소 (nitric oxide, NO) 의기질인 L-알기닌은 L-시트룰린과일산화질소로변하는데, 이는빠르게안정된이산화질소, 아질산염, 질산염으로변한다. 그리스시약 (griess reagent :.5 % sulfanilamide, 2.5 % phaphate,.5 % naphthylethylenediamine dihydrochloride, NED) 은아질산염과화학반응하여보라색의아조염을형성하고이것은일산화질소의농도와일치하기때문에, 아조염의농도로부터아질산염의농도를추정하기위해 Microplate Reader 를이용하여 54 nm에서흡광도를측정하여 NO의생성정도를비교하였다. 이를위해다음과같이실험하였다. LPS를단독처리 (2 μg /ml) 하거나혹은다양한농도의시료와함께배지에담아각 well에처리하고 37, 5 % CO 2 Incubator 에서배양한후세포배양상등액 6 μl을채취하여여기에그리스시약 6 μl을혼합하여 15분동안반응시킨후 Microplate Reader(Bio-Rad, USA) 를이용하여 54 nm에서흡광도를 측정하였다. 세포의 nitric oxide 생성은다음공식으로계산하였다. Productions of Nitric oxide(%) = 1 AT / AC AC : absorbance of control AT : absorbance of tested extract solution. 6) 사이토카인 (cytokine) 분비측정사이토카인분비와관련된시료의영향을알아보기위해 Anderson 등 16) 의방법을응용하여 Bio-Plex Cytokine Assay를다음과같이시행하였다. 96 well plate에 1 1 5 cells/ml의 cell을 1 μl씩넣고 37, 5 % CO 2 Incubator 에서 24 시간동안배양한후배지를버리고배양세포표면을 1 PBS 용액으로씻어준뒤각 well에 LPS를단독처리 (2 μg /ml) 하거나혹은다양한농도의시료와함께배지에담아처리하고배양하였다. 배양이끝나면상등액을채취하여 Bio-Plex Suspension Array System의 Bio-Plex Cytokine Assay를실시하여각종의사이토카인류 (TNF-α, IL-6, IL-1β, MCP-1) 의발현에대한시료의영향을계산, 비교하였다. 3. 통계처리 본실험에서얻은결과에대해서는 mean ± SD로나타내었으며, 대조군과각실험군과의평균의차이는 Student's t-test와 ANOVA test로분석하여 p-value값이.5 미만일때통계적으로유의한차이가있는것으로판정하였다. 결과 1. EHS 가대식세포에미치는영향 1) 세포증식율에대한효과 EHS가대식세포의증식에미치는영향을비교하였다. 24 시간배양처리한결과 μg /ml 이상의모든농도에서세포증식율이증가하였다 (Fig. 1). Cell Proliferation (% of normal) 3 2 15 1 5 Normal 5 1 2 Fig. 1. Effect of EHS on cell proliferation in Raw 264.7 cells. Cells were incubated for 24 hrs. Values are the mean ± SD of three independent experiments. cerevisiae STV89. Normal : Treated with media only. represents P <.5 compared to the normal.

114 大韓本草學會誌 Vol. 28 No. 6, 213 2) 과산화수소생성에대한효과 EHS가대식세포의과산화수소 (hydrogen peroxide, H 2O 2) 생성에미치는영향을비교하였다. 24시간의배양결과, 5 μg /ml 이상의농도에서유의한증가를나타내었다 (Fig. 2). H2O2 production (% of normal) 1 1 75 5 Normal 5 1 2 Fig. 2. Effect of EHS on the intracellular production of hydrogen peroxide in Raw 264.7 cells. Cells were incubated for 24 hrs. Values are the mean ± SD of three independent experiments. cerevisiae STV89. Normal :Treated with media only. represents P <.5 compared to the normal. 3) 산화질소의생성에대한효과 EHS가정상대식세포의산화질소 (NO) 생성에미치는영향을비교하였다. 24시간의배양결과, μg /ml이상의농도에서유의한감소를나타내었다 (Fig. 3). NO production (% of normal) 15 1 1 75 5 Normal 5 1 2 Fig. 3. Effect of EHS on the nitric oxide production in Raw 264.7 cells. Cells were incubated for 24 hrs. Values are the mean ± SD of three independent experiments. cerevisiae STV89. Normal : Treated with media only. represents P <.5 compared to the normal. 4) LPS로활성화된대식세포의산화질소생성증가에대한효과 EHS가 LPS로활성화된대식세포로부터 NO의생성증가에미치는영향을비교하였다. 그결과, 24 시간동안 LPS 단독으로배양한경우정상군 (Normal) 보다 NO 생성이유의하게증가하였으며 LPS로활성화된대식세포에 EHS를처리한경우 EHS는, 5, 1 μg /ml의농도에서유의하게감소되었다. 48 시간동안 LPS 단독으로배양한경우에도정상군 (Normal) 보다 NO 생성이유의하게증가하였으며 LPS로활성화된대식세포에 EHS를처리한경우 EHS는 5, 1 μg /ml 의농도에서유의하게감소되었다 (Fig. 4). NO production (% of control) 1 1 75 5 Normal Control 5 1 LPS (2 μg /ml) 24 hrs 48 hrs Fig. 4. Effect of EHS on the nitric oxide production in Raw 264.7 cells treated with lipopolysaccharide (LPS; 2 μg /ml). Cells were incubated for 24 and 48 hrs. Values are the mean ± SD of three independent experiments. cerevisiae STV89. Normal : Treated with media only. Control : Treated with LPS only. represents P <.5 compared to the normal. represents P <.5 compared to the control. 5) 면역사이토카인생성에대한효과 (1) TNF-α 생성에대한효과 EHS가 LPS로활성화된대식세포에서 TNF-α생성증가에미치는영향을비교하였다. 그결과, 3시간동안 LPS 단독으로배양한경우정상군 (Normal) 보다유의하게 TNF-α생성이증가하였으며, LPS로활성화된대식세포에 EHS를처리한경우, 5, 1 μg /ml의농도에서모두유의하게감소되었다 (Fig. 5). TNF-α production (pg/ml) 2 15 1 5 Normal Control 5 1 LPS (2 μg /ml) Fig. 5. Effect of EHS on the IL-6 production in Raw 264.7 cells treated with lipopolysaccharide (2 μg /ml). Cells were incubated for 3 hr. Values are the mean ± SD of three independent experiments. cerevisiae STV89. Normal : Treated with media only. Control : Treated with LPS only. represents P <.5 compared to the normal. represents P <.5 compared to the control. (2) IL-6 생성에대한효과 EHS가 LPS로활성화된대식세포에서 IL-6 생성증가에미치는영향을비교하였다. 그결과, 3시간동안 LPS 단독으로배양한경우정상군 (Normal) 보다유의하게 IL-6 생성이증가하였으며, LPS로활성화된대식세포에 EHS를처리한경

淫羊藿발효추출물이면역활성에미치는영향 115 우 μg /ml 이상의모든농도에서모두유의하게감소되었다 (Fig. 6). IL-6 production (pg/ml) 2 15 1 5 Normal Control 5 1 LPS (2 μg /ml) Fig. 6. Effect of EHS on the IL-6 production in Raw 264.7 cells treated with lipopolysaccharide (2 μg /ml). Cells were incubated for 3 hr. Values are the mean ± SD of three independent experiments. cerevisiae STV89. Normal : Treated with media only. Control : Treated with LPS only. represents P <.5 compared to the normal. represents P <.5 compared to the control. (3) IL-1β 생성에대한효과 EHS가 LPS로활성화된대식세포에서 IL-1β생성증가에미치는영향을비교하였다. 그결과, 24시간동안 LPS 단독으로배양한경우정상군 (Normal) 보다유의하게 IL-1β생성이증가하였으며, LPS로활성화된대식세포에 EHS를처리한경우 μg /ml 일때만유의하게감소되었다. (4) MCP-1 생성에대한효과 EHS가 LPS로활성화된대식세포에서 monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) 생성증가에미치는영향을비교하였다. 그결과, 24시간동안 LPS 단독으로배양한경우정상군 (Normal) 보다유의하게 MCP-1 생성이증가하였으며, LPS로활성화된대식세포에 EHS를처리한경우 μg /ml 일때만유의하게감소되었다. 고찰 1) 淫羊藿은神農本草經中品에처음收載되었으며, 名醫別錄 17) 에 治喉痺, 多服令人溏洩 이라고한이래味辛, 甘, 性溫하고, 補腎壯陽, 强筋健骨, 祛風除濕의효능이있다 2). 淫羊藿의기원으로대한약전 3) 과중국약전 18) 에 삼지구엽초 Epimedium koreanum Nakai, 음양곽 ( 淫羊藿 ) E. brevicornum Maximowicz, 유모음양곽 ( 柔毛淫羊藿 ) E. pubescens Maximowicz, 무산음양곽 ( 巫山淫羊藿 ) E. wushanense T. S. Ying 또는전엽음양곽 ( 箭葉淫羊藿 ) E. sagittatum Maximowicz( 매자나무과 Berberidaceae) 의지상부 라고수재되어있다. 그러나북한약전 19) 은 E. koreanum 1종을기원식물로, 대만약전 2) 은 E. brevicornum 및동속근연식물로, 일본약전 21) 은대한약전에수록되어있는기원종과함께 E. grandiflorum Morren var. thunbergianum Nakai 및 E. sempervirens Nakai를포함하고있다. 산지는우리나라에서는강원, 경기, 평남북, 함남북에분포하며, 중국에서는그기원식물에따라다양한지역에서산출되는데, E. brevicornum Maximowicz 은주로陝西, 山西, 安徽, 江西등지에서, E. sagittatum Maximowicz은주로湖北, 四川, 浙江, 湖南, 陝西, 江西등지에서, E. koreanum Nakai는遼寧, 吉林등지에서, 柔毛淫羊藿은주로四川에서생산된다 22). 淫羊藿의성분으로최근 flavonol glycoside 인 korepimedoside A 및 B가국산음양곽에서분리되어있다. 채취시기에따른함량변화의연구에의하면개화기인 5월에채취한경우 flavonoid 함량이가장많다고알려져있다 23). 발효 (fermentation) 는넓은의미에서미생물을이용하여그효소작용으로유기물을전환시키는것을뜻한다 24). 최근한약제형의다양화를위한시도중에한약혹은한약재를발효하여한약의안전성을확보면서효능의증대를시도하거나새로운약효를발굴하는등의다양한연구들이보고되고있으며, 쑥을발효하는방법개발이나발효쑥의효용성증대에대한보고또한많이이루어지고있다 ). 이에著者는발효한약의유의성을적용하여淫羊藿을발효추출하여만들어진시료 EHS로마우스대식세포를이용한세포증식율, 세포내과산화수소및산화질소생성, 그리고사이토카인 (TNF-α, IL-6, IL-1β, MCP-1) 생성에미치는영향을측정하였다. 발효미생물 Sacchromyces 계통은생화학적성질이일정하고, 물에잘분산되며, 자기소화에대한내성이있어서보존성이좋고, 당밀배지에서증식속도가빠르고수득률이높은성질이있다 26). 이에본실험에서는 Saccharomyces cerevisiae STV89( 효모 ) 를균주로이용하여발효하였다. 본연구에서는마우스대식세포인 Raw 264.7에발효淫羊藿추출물을, 5, 1, 2 μg /ml의농도로처리하여세포증식율에대한영향을검사한결과, μg /ml 이상의모든농도에서발효淫羊藿추출물이세포증식율감소를나타내지않았으며이는발효淫羊藿추출물이세포독성을유발하지않는다는것으로볼수있다. 또한 5 μg /ml 이상의농도에서는세포증식율을유의하게증가시키는것이확인되었는데, 이는본추출물이대식세포의수를늘림으로써면역기능을강화하는것으로해석될수있을것이다. 이와같은결과를바탕으로다음단계의실험에서는 2 혹은 1 μg /ml 의농도까지사용하였다. 과산화수소 (Hydroperoxide, H 2O 2) 는대부분의세포내에서발생하는활성산소종 (reactive oxygen species, ROS) 의일종으로산화스트레스 (oxidative stress) 와관련되며, 대식세포와같은면역세포에있어서는감염체를공격하거나노후화된세포를제거함에이용된다 27). DHR은비형광이지만세포내에서세포내 H 2O 2 에의하여산화되어녹색의형광을발현하는물질인 rhodamine 123(R123) 로바뀌게된다. 그러므로여러가지산화적반응을일으키는물질들로인해 mouse의대식세포내에서발생하는 reactive oxygen species(ros) 의수준을 dihydrorhodamine 123(DHR) assay을이용하여측정할수있다. 본연구결과 EHS는 5 μg /ml 이상의모든농도에서대식세포로부터의과산화수소생성을유의하게증가시키는것으로나타났다. 비록 EHS에

116 大韓本草學會誌 Vol. 28 No. 6, 213 의한세포증식율증가에는미치지못하지만, 유의한증가가나타났다는것은 EHS가대식세포의항병 ( 抗病 ) 능력을감퇴시키지않음을의미하는것이다. 질소중간산대사물중하나인산화질소 (nitric oxide, NO) 는면역전달물질인사이토카인의영향으로면역세포로부터생산되어, 염증반응부위에유리됨으로서 Fe-S를함유하는효소의작용을억제시키거나 DNA에소산을미쳐항미생물, 항균작용이나항암작용을나타낸다. 28) 그러나감염등으로유발되는인체의염증반응에있어서 NO의과잉생성은급만성의염증질환발생 악화와연관되어진다고할수있다. 본연구에서 EHS는 24시간에서 μg /ml이상의모든농도에서대식세포로부터 NO의생성을감소시켰으며, 또한 LPS로활성화된대식세포에서는 24시간의배양에서, 5, 1 μg /ml 일때, 48시간의배양에서는 5, 1 μg /ml의농도에서 NO 생성증가를유의하게억제시키는것으로나타났다. 이는 EHS가활성화된대식세포로부터분비되는 NO의증가를효과적으로억제함으로써 NO 증가로악화될수있는급성혹은만성의염증반응을제어할수있는효능을가지고있음을의미한다. TNF-α는다양한면역학적기능을가진사이토카인으로, 염증반응의초기에생산되어 IFN-v, IL-6, IL-8, IL-1 등과같은사이토카인과여러세포부착물질의생산을유발한다. 29,3) EHS가 LPS로활성화된대식세포에서 TNF-α 생성증가에미치는영향을비교했을때 3 시간동안 LPS 단독으로배양한경우정상군 (Normal) 보다유의하게 TNF-α생성이증가하였으며 LPS로활성화된대식세포에 EHS를처리한경우 μg /ml이상의모든농도에서모두유의하게감소되었다. IL-6는면역세포와지방조직에서생성되는사이토카인으로서, 간에서생산되는급성기반응물질 (acute phase reactant) 의강력한유발인자이며당대사와지질대사에관여한다. 31,32) EHS가 LPS로활성화된대식세포에서 IL-6 생성증가에미치는영향을비교하였는데 3 시간동안 LPS 단독으로배양한경우정상군 (Normal) 보다유의하게 IL-6 생성이증가하였으며 LPS로활성화된대식세포에 EHS를처리한경우 μg /ml 이상의모든농도에서모두유의하게감소되었다. 이밖에 LPS에의한 24 시간의배양으로유발된 IL-1β와 MCP-1의면역사이토카인생성증가에대해서는 EHS가별다른유의성을나타내지않았다. 본연구를통해발효淫羊藿 (EHS) 의염증억제작용에대한효과는확인한결과 LPS에의해활성화된대식세포에서의 NO, TNF-α그리고 IL-6의생성증가가억제됨을확인하였으며, 이는 EHS가면역조절사이토카인의발현을조절함으로써염증반응조절효능이있음을의미하는것이다. 이상의결과, 발효淫羊藿추출물은대식세포에세포증식율감소를유발하지않는농도에서과산화수소의생성을증가시키고산화질소의생성을감소시켰으며 LPS로활성화된대식세포에서산화질소와 TNF-α, IL-6의면역사이토카인생성증가를억제시킴으로써유의한면역조절활성이있음을알수있었다. 앞으로발효淫羊藿추출물을이용한대식세포연관면역질환치료제로의개발을위하여더욱많은연구가필요할것으로사료된다. 결론 Saccharomyces cerevisiae STV89 효모로발효추출한淫羊藿의마우스대식세포인 Raw 274.7 세포에서의염증유발물질생성에미치는영향을측정하여다음과같은결론을얻었다. 1. 淫羊藿발효추출물은대식세포에서세포증식율감소를유발하지않았다. 2. 淫羊藿발효추출물은정상대식세포의과산화수소 (hydrogen peroxide, H 2O 2) 생성을유의하게증가시켰다. 3. 淫羊藿발효추출물은정상대식세포의산화질소 (nitric oxide, NO) 의생성을억제시켰으며, 또한 LPS로활성화된대식세포의 NO 생성증가를유의하게감소시켰다. 4. 淫羊藿발효추출물은 LPS로활성화된대식세포에서 TNF-α와 IL-6 생성을모두유의하게감소시켰다. 이상의결과, 발효淫羊藿추출물은대식세포에세포증식율감소를유발하지않는농도에서과산화수소생성증가및활성화된대식세포로부터산화질소의생성과면역조절사이토카인의생성을억제함으로써유의한면역활성을가지는것으로나타났다. References 1. Wu B. Shennongbencaojing. Beijing : Kexuejishuwenxian publisher. 1999 : 63. 2. State Administration of Traditional chiense medicine of the People s Republic of China. Zhonghuabencao. Vol. 3. Shanghai : Shanghai Scientific and Technical Publishers. 1999 : 38-15. 3. Korea Food and Drug Administration. The Korean Pharmacopoeia Tenth Edition. Seoul. Korea Food and Drug Administration. 212 : 88-9. 4. Kim HC. Hanyakyakri-Hak. Seoul : Jipmoondang. 21 : 445-7. 5. Liang HR, Vuorela P, Vuorela H, Hiltunen R. Isolation and immunomodulatory effect of flavonol glucosides fromepimedium hunanense. Planta Med. 1997 ; 63(4) : 316-9. 6. Chiba K, Yamazaki M, Umegaki E, Li MR, Xu ZW, Terada S, Taka M, Naoi N, Mohri T. Neuritogenesis of herbal (+)- and (-)-syringaresinols separated by chiral HPLC in PC12h and Neuro2a cells. Biol Pharm Bull. 22 ; (6) : 791-3. 7. Lee JW, Do JH, Lee SK. Antioxidant Activity of the Aerial Part of Epimedium koreanum NAKAI. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2 ; 29(4) : 732-6. 8. Choi HI, Lee SI, Ahn DK, Kim HC. A Study on the

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