(19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) A61K 31/19 (2006.01) A23K 1/16 (2006.01) A23L 1/30 (2006.01) (52) CPC 특허분류 A61K 31/19 (2013.01) A23K 20/00 (2016.05) (21) 출원번호 10-2015-0162806 (22) 출원일자 2015 년 11 월 19 일 심사청구일자 2015 년 11 월 19 일 (65) 공개번호 10-2016-0060586 (43) 공개일자 2016 년 05 월 30 일 (30) 우선권주장 1020140161606 2014 년 11 월 19 일대한민국 (KR) (56) 선행기술조사문헌 WORLD JOURNAL OF PHARMACY AND PHARMACEUTICAL SCIENCES VOL 4, ISSUE 01, 2015. US20040247700 A1 US20020076452 A1 US20110190388 A1* * 는심사관에의하여인용된문헌 (45) 공고일자 2017년09월13일 (11) 등록번호 10-1777770 (24) 등록일자 2017년09월06일 (73) 특허권자 한국생명공학연구원 대전광역시유성구과학로 125 ( 어은동 ) (72) 발명자 노문철 대전광역시유성구과학로 125 이우송 대전광역시유성구과학로 125 ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 손민 전체청구항수 : 총 7 항심사관 : 박수진 (54) 발명의명칭우르솔릭산아세테이트를포함하는 STAT3 매개질환의예방또는치료용약학적조성물및이의용도 (57) 요약 본발명은우르솔릭산아세테이트 (ursolic acid acetate) 를포함하는, STAT3 매개질환의예방또는치료용약학적조성물및상기조성물을이용한 STAT3 매개질환의치료방법에관한것이다. 또한, 본발명은우르솔릭산아세테이트를포함하는 STAT3 매개질환의예방또는개선용식품조성물, 의약외품조성물, 사료및사료첨가제에관한것이다. 대표도 - 도 1-1 -
(52) CPC 특허분류 A23L 33/10 (2016.08) A23V 2002/00 (2013.01) A23V 2200/30 (2013.01) A23V 2250/02 (2013.01) (72) 발명자 오현미 대전광역시유성구과학로 125 이소영 대전광역시유성구과학로 125 이승웅 대전광역시유성구과학로 125 정경숙 대전광역시유성구과학로 125 김상현 대구광역시중구국채보상로 680 의과대학 ( 동인동 2 가, 경북대학교 ) 이철 대전광역시유성구과학로 125 이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 부처명 연구관리전문기관 KGM2221423 미래창조과학부 기초기술연구회 연구사업명주요사업 ( 연구개발과제 ) 연구과제명 기여율 1/2 ( 일반사업 ) 면역클러스터분자의기능조절생물소재개발 주관기관 한국생명공학연구원 연구기간 2014.01.01 ~ 2014.12.31 이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 부처명 연구관리전문기관 314011-05-1-SB010 농림축산식품부 농림수산식품기술기획평가원 연구사업명생명산업기술개발사업 ( 舊농림기술 ) 연구과제명 기여율 1/2 곰보배추를활용한골다공증치료용식 의약소재의개발및산업화 주관기관 한국생명공학연구원 연구기간 2014.07.29 ~ 2015.07.28-2 -
명세서청구범위청구항 1 우르솔릭산아세테이트 (ursolic acid acetate) 또는이의약학적으로허용가능한염을포함하는, STAT3 매개질환의예방또는치료용약학적조성물로서, 상기 STAT3 매개질환은골다공증, 아토피성피부염, 류마티스관절염, 크론병또는다발성경화증인것인, 약학적조성물. 청구항 2 제 1 항에있어서, 상기 STAT3 매개질환은골다공증, 아토피성피부염또는류마티스관절염인것인, 약학적조 성물. 청구항 3 제 1 항에있어서, 상기 STAT3 매개질환은골다공증인것인, 약학적조성물. 청구항 4 삭제청구항 5 삭제청구항 6 제1항의조성물을 STAT3 매개질환이의심되는인간을제외한개체에투여하는단계를포함하는, STAT3 매개질환의치료방법으로서, 상기 STAT3 매개질환은골다공증, 아토피성피부염, 류마티스관절염, 크론병또는다발성경화증인것인, 치료방법. 청구항 7 우르솔릭산아세테이트또는이의생리학적으로허용가능한염을포함하는, STAT3 매개질환의예방또는개선용식품조성물로서, 상기 STAT3 매개질환은골다공증, 아토피성피부염, 류마티스관절염, 크론병또는다발성경화증인것인, 식품조성물. 청구항 8 우르솔릭산아세테이트또는이의생리학적으로허용가능한염을포함하는, STAT3 매개질환의예방또는개선용의약외품조성물로서, 상기 STAT3 매개질환은골다공증, 아토피성피부염, 류마티스관절염, 크론병또는다발성경화증인것인, 의약외품조성물. 청구항 9 우르솔릭산아세테이트또는이의생리학적으로허용가능한염을포함하는, STAT3 매개질환의예방또는개선 - 3 -
용사료또는사료첨가제로서, 상기 STAT3 매개질환은골다공증, 아토피성피부염, 류마티스관절염, 크론병 또는다발성경화증인것인, 사료또는사료첨가제. 발명의설명 [0001] 기술분야본발명은우르솔릭산아세테이트 (ursolic acid acetate) 또는이의약학적으로허용가능한염을포함하는, STAT3 매개질환의예방또는치료용약학적조성물및상기조성물을이용한 STAT3 매개질환의치료방법에관한것이다. 또한, 본발명은우르솔릭산아세테이트또는이의생리학적으로허용가능한염을포함하는 STAT3 매개질환의예방또는개선용식품조성물, 의약외품조성물, 사료및사료첨가제에관한것이다. [0002] 배경기술인터루킨-6(IL-6) 는 B 세포자극인자 2(BSF2) 또는인터페론-2(INF-2) 로도불리는사이토카인 (cytokine) 으로, B 임파구의활성화에관여하는분화인자로발견되었다. 그후, 여러가지세포의기능에영향을미치는다기능사이토카인이라는것이밝혀졌다. IL-6는세포막위에두종류의단백질을매개로그생물학적활성을전달한다. 하나는 IL-6가결합하는단백질인 IL-6 수용체로, IL-6 수용체는세포막을관통하여발현되어있으며약 80kDa의분자량을가지는막결합형단백질이다. 다른하나는, 비리간드결합성의시그날전달에속하는약 130kDa의분자량을가지는막단백질 gp130이다. IL-6와 IL-6 수용체는 IL-6/IL-6 수용체복합체를형성하고, 이어서 gp130과결합한다. 이러한리간드와수용체들의결합후, 세포내에서는 JAK2(Janus Kinase 2) 가인산전이반응 (transphosphorylation) 에의해활성화된다. 활성화된 JAK2에의해수용체세포질도메인 (cytoplasmic domains) 의여러타이로신잔기 (tyrosine residues) 가인산화 (phosphorylation) 되고, 이것은 SH2나다른인산타이로신결합모티프 (phosphotyrosine binding motif) 를가지고있는 STAT3(signal transducers and activators of transcription 3) 와같은세포질내단백질의도킹사이트 (docking site) 역할을하게된다. 수용체의세포질도메인 (cytoplasmic domain) 에결합한 STAT3는 JAK2에의해인산화가된후수용체에서떨어져나오며, 이러한활성화된 STAT3들은세포질내에서로서로결합하여호모다이머 (homodimer) 또는헤테로다이머 (heterodimer) 를이룬후핵내로들어가목적유전자의인식서열 (recognition sequence) 에결합하여전사를증가시킨다. [0003] 이러한 IL-6에의해유도되는신호전달체계와염증성질환, 자가면역질환및대사성질환에대한관련성이이미알려져있다. 염증성, 자가면역질환등의치료를위해서 IL-6에의해유도되는신호전달체계의억제에대하여연구가활발히진행되고있으며, 현재 IL-6의신호전달체계의억제에대하여항 IL-6 R 항체 (anti-il-6 receptor antibody) 를이용한것이가장많이알려져있다. 상기항 IL-6 R 항체를이용한류마티스성관절병에대한활액세포성장억제제 ( 국제특허공개제1996/011020호 ), 항 IL-6 R 항체를이용한형질구증가증, 초면역글로불린혈증, 빈혈, 신염, 악액질, 류마티스성관절염, 목축업자질병및맥관증식신염과같은 IL-6 산물에기인하는질병의치료등이이미알려진바있다 ( 국제공개특허제1996/012503호 ). 또한, 항 IL-6 R 항체는다발성경화증, 포도막염, 만성갑상선염, 지연성과민증및아토피성피부염과같은민감성 T 세포관련질병 ( 국제특허공개공보제1998/042377호 ), 전신성에리테마토스의치료, 크론병의치료 ( 국제특허공개공보제1999/047170 호 ), 췌장염의치료 ( 국제특허공개공보제2000/010607호 ), 건선의치료 ( 국제특허공개공보제2002/034292호 ) 및연소성만성관절염의치료 ( 국제특허공개공보제2002/080969호 ) 에적용될수있음이보고되었다. 그러나, 상기항 IL-6 R 항체의경우개체내에도입되는경우외래단백질로서인지될수있는부분인에피토프를가질수있으므로, 치료제로서사용될경우여전히면역원성일수있다. 상기와같은문제점을해결하기위하여면역체계에인지되지않는단백질이아닌작은분자화합물 (small molecule compound) 을이용하여 IL-6 및 STAT3에의해매개되는질병의치료제를개발하기위하여많은연구가이루어지고있다. [0004] 한편, 인터루킨-11(IL-11) 은 IL-6 패밀리에속해있는염증성사이토카인으로 IL-6와거의같은신호전달체계를갖는것으로알려져있으며, 조혈, 면역반응, 염증및각종암세포에서그발현이증가된것으로알려져있다. 최근 IL-11이그수용체인 IL-11R와 gp130에결합하여위암, 대장암세포증식및암침윤을촉진시키는것이보고되었고 (Nakayama T 등 Int J Oncol, 2007, 30, 825-833, Yoshizaki A 등, Int J Oncol 2006, 29, 869- - 4 -
876), IL-11/STAT3 신호에의해 smad7가활성화되고동시에 TGF 시그날을유도하는 smad 활성인자 (smad activator) 가차단됨으로서항세포사멸유전자, 전혈관형성유전자또는증식유전자가관여하는발암프로그램 (oncogenic program) 이활성화되어염증관련위종양이유도될수있다 (Ernst 등 J. Clin. Invest 2008, 118(5), 1728-1738). 또한, IL-11은뼈세포의증식및분화의조절에관여하고있어, 골다공증에있어치료표적이될수있음이알려져있다 (Sims NA el al., J Bone Miner Res. 2005 Jul;20(7):1093-102.). 이러한사실들이밝혀지면서 IL-11에의한 gp130/jak/stat3 경로가골다공증과같은다양한질병의치료에있어서새로운표적으로부각되고있다. [0005] 이러한배경하에, 본발명자들은상기 IL-6 또는 IL-11에의해활성화되는 STAT3 경로를표적으로하는제제를개발하기위하여예의연구노력한결과, 우르솔릭산아세테이트가 IL-6에의해활성화되는염증, 자가면역질환등에관련된전사인자인 STAT3의전사활성및인산화를저해하고, 파골세포로의분화를억제함을확인함으로써본발명을완성하였다. 발명의내용 [0006] [0007] [0008] [0009] [0010] 해결하려는과제본발명의목적은우르솔릭산아세테이트 (ursolic acid acetate) 또는이의약학적으로허용가능한염을포함하는, STAT3 매개질환의예방또는치료용약학적조성물을제공하는것이다. 본발명의다른목적은상기조성물을 STAT3 매개질환이의심되는개체에투여하는단계를포함하는, STAT3 매개질환의치료방법을제공하는것이다. 본발명의또다른목적은우르솔릭산아세테이트또는이의생리학적으로허용가능한염을포함하는, STAT3 매개질환의예방또는개선용식품조성물을제공하는것이다. 본발명의또다른목적은우르솔릭산아세테이트또는이의생리학적으로허용가능한염을포함하는, STAT3 매개질환의예방또는개선용의약외품조성물을제공하는것이다. 본발명의또다른목적은우르솔릭산아세테이트또는이의생리학적으로허용가능한염을포함하는, STAT3 매개질환의예방또는개선용사료또는사료첨가제를제공하는것이다. [0011] [0012] 과제의해결수단상기목적을달성하기위한본발명의일구현예는우르솔릭산아세테이트 (ursolic acid acetate) 또는이의약학적으로허용가능한염을포함하는, STAT3 매개질환의예방또는치료용약학적조성물을제공한다. 본발명의우르솔릭산아세테이트또는이의약학적으로허용가능한염은 IL-6에유도되는 STAT3 신호전달체계를효율적으로저해시키고, 파골세포의분화및형성저해효과를가지는바, STAT3 매개성질환, 예컨대염증성질환, 자가면역질환또는대사성질환의예방또는치료에있어서유용하게이용될수있다. 또한, 본발명의우르솔릭산아세테이트또는이의약학적으로허용가능한염은우르솔릭산에비해파골세포의분화및형성에훨씬높은저해효과를가지므로상기질환의예방또는치료에있어서우르솔릭산보다매우유용하게이용될수있다. [0013] [0014] 본발명에서, " 우르솔릭산아세테이트 (ursolic acid acetate)" 란, 하기화학식 1로표시되는화합물로서, IUPAC(International Union of Pure and Applied Chemistry) 에따르면, (1S,2R,4aS,6aR,6aS,6bR,8aR,10S,12aR,14bS)-10-acetyloxy-1,2,6a,6b,9,9,12a-heptamethyl- 2,3,4,5,6,6a,7,8,8a,10,11,12,13,14b-tetradeca hydro-1h-picene-4a-carboxylic acid로명명된다. 본발명일실시예에서는곰보배추추출물에서우르솔릭산을분리하였으며, 이로부터우르솔릭산아세테이트를합성, 동정하여하기화학식 1의구조를나타냄을확인하였다. - 5 -
[0015] [ 화학식 1] [0016] [0017] [0018] [0019] 본발명에서 " 약학적으로허용가능한염 " 은산부가염과같이, 당업계에서통상적으로사용되는것으로특별히제한되는것은아니다. 구체적으로, 약학적으로허용가능한산부가염으로는, 예를들어염산, 브롬화수소산, 인산, 오르토인산또는황산과같은무기산 ; 또는예를들어메탄술폰산, 벤젠설폰산, 톨루엔술폰산, 아세트산, 프로피온산, 락트산, 시트르산, 푸마르산, 말산, 숙신산, 살리실산, 말레산, 글리세로인산또는아세틸살리실산과같은유기산을들수있다. 또한, 염기를사용하여통상적인방법으로약학적으로허용가능한금속염을얻을수있다. 예를들어우르솔릭산아세테이트를과량의알칼리금속수산화물또는알칼리토금속수산화물용액중에용해시키고, 비용해화합물염을여과한후여액을증발, 건조시켜약학적으로허용가능한금속염을얻을수있다. 이때금속염으로서, 특히나트륨염, 칼륨염또는칼슘염을제조하는것이바람직하며, 이들금속염을적당한염 ( 예를들어, 질산염 ) 과반응시킬수있다. 본발명의조성물은상기약학적으로허용가능한염뿐만아니라이로부터제조될수있는가능한용매화물및수화물을모두포함하고, 가능한모든입체이성체도포함할수있다. [0020] 본발명의우르솔릭산아세테이트또는이의약학적으로허용가능한염은공지된합성방법으로합성하여사용 할수도있고, 자연에서분리및정제하여사용할수도있으며, 자연에서분리및정제한후공지된합성방법 으로합성하여사용할수도있다. [0021] 본발명에서용어, "STAT3 매개질환 " 은 IL(interleukin)-6 또는 IL-11이그의수용체에결합하여 STAT3의인산화, 즉 STAT3의활성화를유도하고, 인산화된 STAT3가핵내로이동하여자가면역질환, 염증성질환또는대사성질환의발병또는진행에관여하는그의표적유전자를발현시킴으로써발병되는질환을총칭하는의미이다. 상기 STAT3 매개질환은특별히이에제한되지는않으나, 자가면역질환, 염증성질환또는대사성질환일수있다. [0022] 본발명에서용어, " 자가면역질환 " 은병적인개체의자체항원에대한면역반응이직간접적원인으로나타나는질환을총칭하는의미로서, 구체적으로본발명의목적상 IL-6 또는 IL-11에의해활성화된 STAT3에의하여매개되는자가면역질환일수있다. 상기자가면역질환은이에제한되지는않으나, 그예로아토피성피부염, 류마티스관절염, 골관절염, 건선, 천식, 이식편대숙주질환, 면역결핍증, 전신홍반성루푸스또는다발성경화증일수있다. 자가면역질환에서활성화된 STAT3는주요전사인자로작용하므로, IL-6에의해매개되는 STAT3의활성화를억제시키는본발명의조성물은자가면역질환의치료에유용하게사용될수있다. [0023] 본발명에서용어, " 염증성질환 " 은염증을주병변으로하는질병을총칭하는의미로서, 구체적으로본발명의목적상상기 IL-6 또는 IL-11에의해활성화된 STAT3에의하여매개되는염증성질환일수있다. 상기염증성질환은이에제한되지는않으나, 형질구증가증, 초면역글로불린혈증, 빈혈, 신염, 악액질, 목축업자질병, 맥관증식신염, 포도막염, 만성갑상선염, 지연과민증, 크론병, 췌장염, 연소성특발성위축증, 당뇨병및알츠하이머를포함한다. - 6 -
[0024] 본발명에서용어, " 대사성질환 " 은생체내물질대사장애에의해서발생하는질환을총칭하는의미로서, 구체적으로본발명의목적상 IL-6 또는 IL-11에의해활성화된 STAT3에의해매개된대사성질환일수있다. 상기대사성질환은이에제한되지않으나, 골다공증, 동맥경화또는심근경색일수있다. 상기골다공증의원인중하나로골흡수를촉진하는 IL-6의과도한생산을들수있으며, 이에따라 IL-6에의해매개되는 STAT3의활성을억제하는본발명의조성물은골다공증의치료에효과적일수있다. [0025] STAT3는염증성빈혈에서활성화되어대식세포의철의분비를막는헵시딘 (Hepcidin) 의발현을증가시키는것으로알려져있고 (Wrighting DM et al, Blood. 2006 Nov 1;108(9):3204-9), 사구체신염 (Arakawa T et al, Nephrol Dial Transplant. 2008 Nov;23(11):3418-26.), 악액질, 크론병 (Lovato P et al., J Biol Chem. 2003 May 9;278(19):16777-81.), 만성췌장염 (Fukuda A et al, Cancer Cell. 2011 Apr 12;19(4):441-55) 과같은염증성질환에서활성화되어있으므로, 상기우르솔릭산아세테이트를포함하는본발명의조성물은상기염증성질환의예방또는치료에유용하게사용될수있다. [0026] 또한, STAT3는류마티스관절염에있어서골흡수의치료에새로운표적으로여겨지고있으며, 천식의경우기도 (air way) 의상피에존재하는 STAT3는천식등에있어알러지성염증반응을유도하는것으로보고되었으며 (Simeone-Penney MC et al., J Immunol. 2007 May 15;178(10):6191-9.), 이식편대숙주질환의발생 (Ma HH et al., Cell Immunol. 2011;268(1):37-46.), 다발성경화증환자및동맥경화가발생된 ApopE -/- 마우스에서는 STAT3가인산화되어활성화되어있음이알려져있다. [0027] [0028] [0029] [0030] 본발명의일실시예에서는우르솔릭산아세테이트가 IL-6에의해유도되는 STAT3 루시퍼라제활성을농도의존적으로저해시킴을확인하였다 ( 도 1). 또한, 본발명의일실시예에서는우르솔릭산아세테이트가우르솔릭산에비해매우높게파골세포의분화및형성을저해하는것을확인하였다 ( 도 2). 또한, 본발명의일실시예에서는난소적출에의해유도되는마우스골다공증모델을이용하여우르솔릭산아세테이트가골다공증예방및치료효과를가지는것을확인하였다 ( 도 3 및 4). 상기와같은결과로부터우르솔릭산아세테이트또는이의약학적으로허용가능한염이우수한 STAT3 억제활성, 파골세포의분화및형성저해효과, 및골다공증예방및치료효과를나타냄을알수있었으며, 이는우르솔릭산아세테이트또는이의약학적으로허용가능한염을포함하는조성물이자가면역질환, 염증성질환및대사성질환의예방및치료에있어유용하게사용될수있음을나타내는것이다. [0031] 본발명에서용어, " 예방 " 은상기조성물의투여에의해 STAT3 매개질환을억제하거나발병을지연시키는모든 행위를의미하며, " 치료 " 는상기조성물의투여에의해 STAT3 매개질환에의한증세가호전되거나이롭게변경 하는모든행위를의미한다. [0032] [0033] 본발명의약학적조성물은약학적조성물의제조에통상적으로사용하는적절한담체, 부형체또는희석제를추가로포함할수있다. 이때, 상기조성물에포함되는우르솔릭산아세테이트또는이의약학적으로허용가능한염의함량은특별히이에제한되지않으나, 조성물총중량에대하여 0.0001 내지 10 중량 % 로, 구체적으로는 0.001 내지 1 중량 % 를포함하도록제조될수있다. 상기약학적조성물은정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제및좌제으로이루어진군으로부터선택되는어느하나의제형을가질수있으며, 경구또는비경구의여러가지제형일수있다. 제제화할경우에는보통사용하는충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제등의희석제또는부형제를사용하여조제된다. 경구투여를위한고형제제에는정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제등이포함되며, 이러한고형제제는하나이상의화합물에적어도하나이상의부형제예를들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스 (sucrose) 또는락토오스 (lactose), 젤라틴등을섞어조제 - 7 -
된다. 또한단순한부형제이외에스테아린산마그네슘, 탈크등과같은윤활제들도사용된다. 경구투여를위한액상제제로는현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제등이해당되는데흔히사용되는단순희석제인물, 리퀴드파라핀이외에여러가지부형제, 예를들면습윤제, 감미제, 방향제, 보존제등이포함될수있다. 비경구투여를위한제제에는멸균된수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브오일과같은식물성기름, 에틸올레이트와같은주사가능한에스테로등이사용될수있다. 좌제의기제로는위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴등이사용될수있다. [0034] [0035] [0036] [0037] 상기본발명의조성물은약제학적으로유효한양으로투여할수있다. 본발명에서용어, " 약제학적으로유효한양 " 은의학적치료에적용가능한합리적인수혜 / 위험비율로질환을치료하기에충분한양을의미하며, 유효용량수준은개체종류및중증도, 연령, 성별, 질병의종류, 약물의활성, 약물에대한민감도, 투여시간, 투여경로및배출비율, 치료기간, 동시사용되는약물을포함한요소및기타의학분야에잘알려진요소에따라결정될수있다. 본발명의조성물은개별치료제로투여하거나다른치료제와병용하여투여될수있고종래의치료제와는순차적또는동시에투여될수있다. 그리고단일또는다중투여될수있다. 상기요소를모두고려하여부작용없이최소한의양으로최대효과를얻을수있는양을투여하는것이중요하며, 당업자에의해용이하게결정될수있다. 본발명의조성물의바람직한투여량은환자의상태및체중, 질병의정도, 약물형태, 투여경로및기간에따라다르지만, 바람직한효과를위해서, 본발명의우르솔릭산아세테이트를포함하는조성물은 1일 0.0001 내지 100mg/kg으로, 구체적으로는 0.001 내지 100mg/kg으로투여될수있다. 투여는하루에한번투여할수도있고, 수회나누어투여할수도있다. 상기조성물은쥐, 가축, 인간등의다양한포유동물에다양한경로로투여될수있다. 투여의모든방식은예상될수있는데, 예를들면, 경구, 직장또는정맥, 근육, 피하, 자궁내경막또는뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사등의다양한방식이고려될수있다. [0038] [0039] [0040] 본발명의또다른일구현예는상기조성물을 STAT3 매개질환의심개체에투여하는단계를포함하는, STAT3 매개질환치료방법을제공한다. 구체적으로, 본발명의치료방법은상기약학적조성물을약학적유효량으로 STAT3 매개질환의심개체내에투여하는것을포함한다. 상기개체는개, 소, 말, 토끼, 마우스, 래트, 닭또는인간을포함한포유류전체를의미하나, 상기예에의해본발명의포유류가한정되는것은아니다. 상기약학적조성물은비경구, 피하, 복강내, 폐내, 및비강내로투여될수있고, 국부적면역억제치료를위해, 필요하다면병변내투여를포함하는적합한방법에의해투여된다. 비경구주입에는근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내또는피하투여가포함될수있으며, 구체적으로정맥주사, 피하주사, 피내주사제, 근육주사및점적주사를이용할수있다. 본발명의상기약학적조성물의바람직한투여량은개체의상태및체중, 질병의정도, 약물형태, 투여경로및기간에따라다르지만, 당업자에의해적절하게선택될수있다. 본발명의약학적조성물을 STAT3 매개질환의심개체에투여하여, STAT3 매개질환의발생또는진행을막아 STAT3 매개질환을치료할수있다. 상기 STAT3 매개질환에대해서는상기에서설명한바와같다. [0041] [0042] 본발명의또다른일구현예는우르솔릭산아세테이트또는이의약학적으로허용가능한염을포함하는, STAT3 매개질환의예방또는개선용식품조성물을제공한다. 우르솔릭산아세테이트및이의약학적으로허용가능한염에대해서는상기에서설명한바와같다. 구체적으로, 본발명의식품조성물은 STAT3 매개질환의예방또는개선을목적으로, 보다구체적으로는자가면역질환, 염증성질환또는대사성질환의예방또는개선을목적으로식품조성물일수있으며, 식품첨가물로사용될수도있다. 본발명의용어 " 생리학적으로허용가능 " 은생리학적으로허용되고생물체에게투여될때, 통상적으로위장장애, 현기증등과같은알레르기반응또는이와유사한반응을일으키지않으면서, 투여되는화합물이목적하는효과를발휘할수있는통상적으로사용되는것을의미한다. - 8 -
[0043] [0044] [0045] [0046] [0047] 본발명의우르솔릭산아세테이트또는이의약학적으로허용가능한염을식품첨가물로사용할경우, 상기우르솔릭산아세테이트또는이의약학적으로허용가능한염을그대로첨가하거나다른식품또는성분과함께사용할수있고, 통상적인방법에따라적절하게사용할수있다. 유효성분의혼합량은사용목적에따라적합하게결정할수있다. 본발명의식품의종류에는특별한제한은없다. 상기우르솔릭산아세테이트또는이의약학적으로허용가능한염을첨가할수있는식품의예로는육류, 소시지, 빵, 초코렛, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타면류, 껌류, 아이스크림류를포함하는낙농제품, 각종스프, 음료, 차, 드링크제, 알코올음료및비타민복합제등이포함될수있으며, 통상적인의미에서의식품을모두포함할수있다. 상기외에본발명의식품조성물은여러가지영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산및그의염, 알긴산및그의염, 유기산, 보호성콜로이드증점제, ph 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에사용되는탄산화제등을함유할수있다. 그밖에천연과일주스, 과일주스음료및야채음료의제조를위한과육을함유할수있다. 이러한성분은독립적으로또는조합하여사용할수있다. 또한, 상기식품은공지의제조방법에따라정제, 과립, 분말, 캅셀, 액상의용액및환등의제형으로도제조될수있다. 또한, 통상의여러가지향미제또는천연탄수화물등을추가성분으로서포함할수있다. [0048] [0049] [0050] [0051] [0052] 본발명의또다른일구현예는우르솔릭산아세테이트또는이의약학적으로허용가능한염을포함하는, STAT3 매개질환의예방또는개선용의약외품조성물을제공한다. 우르솔릭산아세테이트및이의약학적으로허용가능한염에대해서는상기에서설명한바와같다. 구체적으로, 본발명의조성물은 STAT3 매개질환이예방또는개선을목적으로, 보다구체적으로는자가면역질환, 염증성질환또는대사성질환의예방또는개선을목적으로하는의약외품조성물일수있다. 본발명에서용어, " 의약외품 " 은사람이나동물의질병을치료, 경감, 처치또는예방할목적을사용되는섬유, 고무제품또는이와유사한것, 인체에대한작용이약하거나인체에직접작용하지아니하며, 기구또는기계가아닌것과이와유사한것, 감염형예방을위하여살균, 살충및이와유사한용도로사용되는제제중하나에해당하는물품으로서, 사람이나동물의질병을진단, 치료, 경감, 처치또는예방할목적으로사용하는물품중기구, 기계또는장치가아닌것및사람이나동물의구조와기능에약리학적영향을줄목적으로사용하는물품중기구, 기계또는장치가아닌것을제외한물품을의미한다. 또한상기의약외품은피부외용제및개인위생용품을포함할수있다. 또한본발명의우르솔릭산아세테이트또는이의약학적으로허용가능한염을의약외품첨가물로사용할경우, 이를그대로첨가하거나다른의약외품또는의약외품성분과함께사용할수있고, 통상적인방법에따라적절하게사용할수있다. 유효성분의혼합량은사용목적에따라적합하게결정될수있다. 상기피부외용제는특별히이에제한되지않으나, 구체적으로는연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 산제, 현탁제, 겔제또는젤의형태로제조되어사용될수있다. 상기개인위생용품에는특별히이에제한되지않으나, 구체적으로는비누, 화장품, 물티슈, 휴지, 샴푸, 피부크림, 얼굴크림, 치약, 립스틱, 향수, 메이크- 업, 파운데이션, 볼터치, 마스카라, 아이섀도우, 선스크린로션, 모발손질제품, 에어프레쉬너겔또는세정겔일수있다. 또한, 본발명의의약외품조성물의또다른예로소독청결제, 샤워폼, 구강청결제, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기충진제, 마스크, 연고제또는필터충진제가있으며, 이에제한되는것은아니다. [0053] [0054] 본발명의또다른일구현예는우르솔릭산아세테이트또는이의약학적으로허용가능한염을포함하는, STAT3 매개질환의예방또는개선용사료또는사료첨가제를제공한다. 우르솔릭산아세테이트및이의약학적으로허용가능한염에대해서는상기에서설명한바와같다. 구체적으로, 본발명의조성물은 STAT3 매개질환이예방또는개선을목적으로, 보다구체적으로는자가면역질환, 염증성질환또는대사성질환의예방또는개선을목적으로하는사료또는사료첨가제일수있다. 본발명의상기사료첨가제는우르솔릭산아세테이트또는이의약학적으로허용가능한염을포함하는조성물 - 9 -
을사료첨가제형태로따로제조하여사료에혼합시키는방식으로사용하거나, 상기화합물을포함하는조성물 을사료제조시직접첨가하는방식으로사용할수있다. [0055] [0056] [0057] 사료의종류는특별히제한되지않으며, 당해기술분야에서통상적으로사용되는사료를사용할수있다. 상기사료의비제한적인예로는, 곡물류, 근과류, 식품가공부산물류, 조류, 섬유질류, 제약부산물류, 유지류, 전분류, 박류또는곡물부산물류등과같은식물성사료 ; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포단백질류, 동물성플랑크톤류또는음식물등과같은동물성사료를들수있다. 이들은단독으로사용되거나 2 종이상을혼합하여사용될수있다. 상기사료첨가제는액상또는건조상태일수있으며, 구체적으로는건조된분말형태일수있다. 본발명의상기사료첨가제를건조된분말형태로제조하기위한건조방법은특별히제한되지아니하며, 당해기술분야에서통상적으로사용하는방법을사용할수있다. 상기건조방법의비제한적인예로는, 통풍건조, 자연건조, 분무건조, 동결건조등을들수있다. 이들은단독으로사용되거나 2 가지이상의방법을함께이용하는방식으로수행될수있다. 상기사료또는사료첨가제는필요에따라기타첨가제를추가로포함할수있다. 상기사용가능한첨가제의비제한적인예로는, 사료또는사료첨가제의품질저하를방지하기위하여첨가하는결착제, 유화제, 보존제등 ; 사료또는사료첨가제의효용증대를위하여첨가하는아미노산제, 비타민제, 효소제, 생균제, 향미제, 비단백질태질소화합물 ( 非蛋白質態窒素化合物 ), 규산염제, 완충제, 착색제, 추출제또는올리고당등이있으며, 그외에사료혼합제등을추가로포함할수있다. 이들은단독으로사용되거나 2 종이상이함께첨가될수있다. [0058] 발명의효과본발명의우르솔릭산아세테이트또는이의약학적으로허용가능한염은 IL-6에유도되는 STAT3 신호전달체계를효율적으로저해시키므로, STAT3 매개성질환, 예컨대염증성질환, 자가면역질환또는대사성질환의예방또는치료에있어서유용하게이용될수있다. [0059] 도면의간단한설명 도 1 은우르솔릭산아세테이트화합물의 IL-6 에의해유도되는 STAT3 루시퍼라제의발현저해활성을나타낸것 이다 (UAA: 우르솔릭산아세테이트, OAA: 올레아놀릭산아세테이트 ). 도 2는우르솔릭산아세테이트화합물의파골세포로의분화억제활성을나타낸것이다. 도 3은우르솔릭산아세테이트화합물을처리한골다공증마우스모델의형태학적변화를나타낸것이다 (OVX only: 난소적출된마우스, UAA: 우르솔릭산아세테이트 ). 도 4는우르솔릭산아세테이트화합물을처리한골다공증마우스모델에서골질량 (BV/TV), 골소주간격 (Tb.Sp) 및골소주두께 (Tb.Th) 변화를나타낸것이다 (OVX only: 난소적출된마우스, UAA: 우르솔릭산아세테이트 ). [0060] 발명을실시하기위한구체적인내용 이하, 본발명을실시예에의해상세히설명한다. 단, 하기실시예는본발명을예시하는것일뿐, 본발명이 하기실시예에의해한정되는것은아니다. [0061] 실시예 1. 곰보배추추출물의제조 [0062] 곰보배추는물로깨끗이세척하여그늘에서건조한후, 건조된곰보배추 30 kg을분쇄하여건조중량대비 5 배 (kg/l) 의에탄올을추출용매로사용하여 5 시간동안 70 에서추출하여여지로감압여과하였다. 이후, 진공회 전농축기로실온에서에탄올용매를제거한후추출된잔사로서곰보배추에탄올추출물 2.64 kg 을수득하였다. - 10 -
[0063] 실시예 2. 곰보배추추출물에서의우르솔릭산 (ursolic acid) 의분리 [0064] [0065] 상기조추출물에서활성분획물을분리하기위하여, 곰보배추에탄올추출물을 100g 당물 1l 비율로현탁시켜이를분별깔대기에넣고, 동량의 n-헥산및에틸아세테이트를이용하여순서대로각각 3회씩분별추출한후, 감압농축하여 n-헥산가용추출물 (778.5g), 에틸아세테이트가용추출물 (541g) 및물가용추출물 (1.3kg) 을수득하였다. 상기에서수득한에틸아세테이트가용추출물 541g을클로로포름, 메탄올및이들의혼합용매 (100:0 ~ 0:100) 를이동상으로하여실리카겔컬럼크로마토그래피를수행하여 14개의하위분획물로분리하였다. 이중 6번분획물을 MPLC (Teledyne Technologies, Inc.) 기기를이용하여클로로포름 : 메탄올 (100:0 ~ 0:100 (v/v)) 의혼합용매를이동상으로하여 15개의하위분획물로구분하였으며, 이중 3번분획물이우르솔릭산임을확인하였다 ( 순도 80% 이하 ). 이를 RP18 컬럼크로마토그래피를활용하여추가분리정제하여우르솔릭산 (1.3g) 을수득하였다. [0066] 실시예 3. 우르솔릭산으로부터의우르솔릭산아세테이트 (ursolic acid acetate, UAA) 의반합성 [0067] 상기실시예 2 에서수득한우르솔릭산의일부 (500 mg) 를무수피리딘 5 ml 에완전히녹인후, 아세틱안하이드라 이드 (Ac 2 O, 0.5 ml) 와 24 시간동안반응시켰다. 그후반응물을실리카겔컬럼크로마토그래피 ( 이동상, 메틸렌 클로라이드 : 메탄올 =100:2, isocratic) 를통해우르솔릭산아세테이트 (120 mg) 를수득하였다. [0068] 상기와같이수득한우르솔릭산아세테이트를기기분석 (NMR, MS) 결과를참고문헌과비교하여구조동정하였 다 (Kwon, et al, Bull. Kor. Chem. Soc. 2009, 30(1), 119-123). 수득한우르솔릭산아세테이트의화학구조는 하기화학식 1 과같다. [0069] [ 화학식 1] [0070] [0071] 실시예 4. 우르솔릭산아세테이트의 IL-6 에의해유도되는 STAT3 의전사활성억제효과분석 [0072] 4-1. 루시퍼라제 (luciferase) 가도입된형질전환체의제조 [0073] Hep3B 세포 (ATCC HB-8064) 에 STAT3 리포터유전자를포함하는 pstat3-luc와 pcdna3.1(+)(clontech laboratories, Palo Alto, CA) 를리포펙타민플러스 (lipofectamine plus, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 를이용하여형질감염 (transfection) 시켰다. 형질감염이틀후, 하이그로마이신 (hygromycin) 을상기형질감염시킨세포에 100μg / ml의농도로처리하여루시퍼라제 (luciferase) 가안정하게발현되는클론 (clone) 을얻었다. 이클론에서루시퍼라제가안정하게발현되는지여부는루시퍼라제어세이를통하여확인하였다. - 11 -
[0074] 4-2. IL-6 반응성 STAT3 루시퍼라제검사 [0075] 상기형질감염된세포를 DMEM(GIBCO 119950965) 배지로무혈청배양 (serum starvation) 하고시료를하기와같 이 1 시간처리한후, 10ng/ ml IL-6(R&D system, USA) 를첨가하여 12 시간동안배양하였다. [0076] [0077] [0078] [0079] 1: 음성대조군 ( 비처리군 ); 2: 양성대조군 (IL-6 10ng/ ml ); 3: 우르솔릭산아세테이트 (UAA) 처리군 (0.5, 1, 5μM); 및 4: 올레아놀릭산아세테이트 (Oleanolic acid acetate, OAA) 처리군 (1μM) [0080] [0081] 상기반응한세포를 PBS로세척한다음, 50μl용해완충용액 (luciferase assay system, promega, USA) 을넣고 20분간교반한다음, 30 내지 100μl의루시퍼라제기질 (luciferase assay system, promega, USA) 을넣고발색정도를루미노미터 (luminometer; EG&G BERTHOLD, USA) 를이용하여 5분안에측정하였다. 실험결과, 우르솔릭산아세테이트가 0.5, 1, 5μM 에서농도의존적으로 STAT3 루시퍼라제활성을저해하며, 올레아놀릭산아세테이트보다더높게저해하는것을확인하였다 ( 도 1). 이러한결과는우르솔릭산아세테이트가 IL-6에의해유도되는 STAT3 활성화를효과적으로억제시킬수있음을나타내는것이다. [0082] 실시예 5. 우르솔릭산및우르솔릭산아세테이트의파골세포분화및형성억제활성확인 [0083] [0084] ICR mouse (age: 3-6 weeks) 의대퇴골로부터 bone marrow 세포를분리하고 M-CSF(30 ng/ml) 를 3일동안처리하여 bone marrow macrophage(bmm) 으로분화를유도하였다. 이후 BMM 세포에 M-CSF(30 ng/ml) 과 RANKL(100 ng/ml) 을 4일동안처리하여파골세포로의분화를유도하였다. 파골세포로의분화과정에서의우르솔릭산아세테이트가갖는효능을시험하기위하여, 파골세포로분화되기전 BMM 세포에우르솔릭산아세테이트또는우르솔릭산을각각 10, 30μM의농도로처리한후 M-CSF와 RANKL을 4일동안처리하여파골세포가분화및형성되었는지를 TRAP assay를통해관찰하였다. 그결과, 우르솔릭산아세테이트가우르솔릭산에비해매우높게파골세포의분화및형성을저해하는것을확인하였다 ( 도 2). [0085] 실시예 6. 우르솔릭산아세테이트의골다공증예방및치료효과확인 [0086] [0087] [0088] UAA의골다공증치료효과를확인하기위해, 인간의노령화에따른에스트로겐감소와더불어나타나는골다공증의마우스모델을제작하였다. 8주령 C57BL/6 암컷마우스에서전신마취후난소적출술 (ovariectomy, OVX) 을실시하였다. 그후 6주간칼슘이제거된특수제작사료를급여후, 6주간 vehicle(0.5% CMC), 시판치료제인알렌드로네이트 (Alendronate 2 mg/kg), UAA(5 mg/kg 또는 10 mg/kg) 을매일 1회경구투여하였다. 투여종료후, 골밀도측정및조직학적관찰을실시하였다. 투여실험종료후, 대퇴골샘플을채취하여, 4% 파라포름알데하이드 (paraformaldehyde) 에고정하고, 탈석회화과정 (decalcification) 을거친후에파라핀블럭 (paraffin block) 을만들었다. 그후형태학적인관찰을위하여, 헤마톡실린-에오신 (Hematoxylin-Eosin, H-E) 염색을실시하였다. 그결과, Sham 그룹에비해 OVX 그룹은골소주간격이더커지고, 골소주의수가감소하나, 이에반해알렌드로네이트치료그룹과 UAA 10 mg/kg 투여그룹은 OVX 그룹에비해골소주간격이감소하고, 골소주의수가증가함을확인하였다 ( 도 3). 마우스의대퇴골을분리하여 micro CT 촬영을통해골질량 (Bone volume/tissue volume, BV/TV), 골소주두께 - 12 -
(Trabecular bone thickness, Tb.Th), 골소주수 (Trabecular bone number, Tb. N), 골소주간격 (Trabecular bone space, Tb. Sp) 등을측정하여, UAA의골다공증치료효과를확인하였다. 그결과, 알렌드로네이트치료그룹과 UAA 10 mg/kg 투여그룹은골질량, 골소주두께및골소주간격이정상수준 (Sham) 으로회복됨을확인하였다 ( 도 4). [0089] [0090] 이와같은결과는우르솔릭산아세테이트는뼈를파괴하는세포인파골세포의분화및형성을감소시킴으로써뼈의성장을촉진시키고, 골다공증등을예방및치료할수있음을시사하는것이다. 상기와같은결과를종합하면, 우르솔릭산아세테이트또는이의약학적으로허용가능한염은우수한 STAT3 억제활성, 파골세포의분화및형성저해효과, 골다공증등의예방및치료효과를나타내는바, 우르솔릭산아세테이트또는이의약학적으로허용가능한염을포함하는조성물을염증성질환, 자가면역질환및대사성질환과같은다양한 STAT3 매개질환의예방및치료에이용할수있음을알수있다. [0091] 이상의설명으로부터, 본발명이속하는기술분야의당업자는본발명이그기술적사상이나필수적특징을변경하지않고서다른구체적인형태로실시될수있다는것을이해할수있을것이다. 이와관련하여, 이상에서기술한실시예들은모든면에서예시적인것이며한정적인것이아닌것으로서이해해야만한다. 본발명의범위는상기상세한설명보다는후술하는특허청구범위의의미및범위그리고그등가개념으로부터도출되는모든변경또는변형된형태가본발명의범위에포함되는것으로해석되어야한다. 도면 도면 1-13 -
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