Korean Journal of Obstetrics and Gynecology Vol. 49 No. 7 July 2006 자궁경부상피내종양에서 p16 INK4a 와 prb의이상발현과고위험군인유두종바이러스감염및재발의상관성에관한연구 연세대학교의과대학산부인과학교실, 병리학교실 * 남은지 김혜연김상운 윤보성 김재훈김영태 김재욱 조남훈* 김성훈 Relationship between p16 INK4a, prb and high risk HPV infection and recurrence Eun Ji Nam, M.D., Hye Yeon Kim, M.D., Sang Woon Kim, M.D., Bo Sung Yoon, M.D., Jae Hoon Kim, M.D., Young Tae Kim, M.D., Jae Wook Kim, M.D., Nam Hoon Cho, M.D.*, Sunghoon Kim, M.D. Department of Obstetrics and Gynecology, *Department of Pathology, Yonsei University College of Medicine, Seoul, Korea Objective:Thepurposeofthisstudywastoidentifytheabnormalexpressionsofp16 INK4a andprbincervicalintraepithelialneoplasia(cin), and then to determine the relationship between the levels of p16 INK4a and prb and high risk HPV infection and recurrence. Methods: The study group was composed of 265 formalin-fixed, paraffin-embedded tissue array sections of the uterine cervix collected from women who had underwent biopsy, conization or hysterectomy at our hospital from January 2001 to December 2003. Immunohistochemical stainings for p16 INK4a and prb were performed and the association of prb and p16 INK4a expressions with clinical features was analyzed retrospectively. Results: There was positive correlation between p16 INK4a expression rate and grade of cervical lesion. Meanwhile, there was reverse correlation between prb expression rate and grade of cervical lesion. The expression rate of p16 INK4a was higher (33%) in CIN I with highriskhpvinfection,thaninciniwithouthighriskhpvinfection(19%).inallcinlesions,themeanexpressionrateof p16 INK4a was lower in recurred group than in those which did not recur. In CINⅡ and CIN Ⅲ, the mean expression rate of prb was higher in recurred group than in those which did not recur. Conclusion: With increasing CIN grade, abnormal expression of p16 INK4a was increased, but prb expression was decreased. Relatively decreased p16 INK4a expressions and increased prb expressions significantly cooperate to predict a recurrence of the CIN lesions. Key Words: Cervical intraepithelial neoplasia, HPV, Recurrence, p16 INK4a, prb 서론자궁경부암은특히한국여성에서발생률이높은중 접수일: 2006. 2. 15. 교신저자 : 김성훈 E-mail: shkim70@yumc.yonsei.ac.kr 요한질환으로 5-15 년정도전구병소형태인자궁경부 상피내종양단계를거쳐침윤성병변으로진행된다. 인 유두종바이러스 (human papilloma virus, 이하 HPV) 의감염이자궁경부암의발생에가장중요한원인임은 현재까지광범위한역학조사및분자생물학적인연구에 의해이미밝혀져있다. 1 HPV 는 double stranded DNA - 1437 -
대한산부회지제49권제7 호, 2006 바이러스로서현재까지약 120여종이상이알려져있으 며, 이중생식기에존재하는인유두종바이러스는크게 고위험인유두종바이러스군 (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68, 69) 과, 저위험인유두 종바이러스군 (6, 11, 34, 40, 42, 43, 44) 으로나뉜 다. 특히고위험군 HPV 의지속적인감염이자궁경부 암의발생과직접연관이있는것으로보여진다. 2-4 HPV 가자궁경부암을유발하는기전은고위험군 HPV 의 E6 및 E7 단백이각각 p53 및 prb 세포주기억 제단백의기능을억제함으로써세포주기 G1에서 S로의 이행을억제하지못하여발생된다고생각되고있다. 5,6 p16 INK4a 는 cdk4 및 cdk6 와작용하여세포증식촉진단 백인 cyclin D/cdk4, 6 complex 의형성을방해하여 cdk에의한 prb 의인산화 (phosphorylation) 를억제하 여 cyclin dependent kinase inhibitor 로서작용한다. 7 종양억제단백인 prb가인산화되면 prb와결합하고있 던전사조절인자인 E2F가유리되어세포주기가 G1에 서 S 기로이행되도록유도한다. 8 그러나 HPV 감염으 로인하여 E7 단백이 prb와결합하게되면 E2F는 prb로부터유리되어 G1-S 세포주기이행에관련된 유전자의발현을촉진하게된다. 9 HPV E7 단백에의 해 prb의기능이불활성화되면 prb와 p16 INK4a 의음성 되먹임 (negative feedback) 기전으로인해상반적으 로 p16 INK4a 는과발현 (overexpression) 하게된다. 9-12 본연구에서는상기의문헌지견을바탕으로자궁경 부상피내종양의암발생 세포조절주기단백인 p16 INK4a 와 (tumoriogenesis) 에관계하는 prb 의발현을관찰하 고, 이와아울러고위험군 HPV 감염및재발여부와 세포주기단백발현정도를비교하여 p16 INK4a 와 임상적유용성을밝히고자하였다. 1. 연구대상 연구대상및방법 prb 의 2001년 1월부터 2003년 12월까지본원산부인과에 내원하여자궁경부착공생검 (punch biopsy) 및자궁경 부환상투열절제술 궁적출술 (LEEP) 또는제 1형확대형전자 (type I extended hysterectomy) 을시행받 고조직병리학적으로자궁경부상피내종양 (cervical intraepithelial neoplasia, 이하 CIN) 을진단받은환 자들의파라핀포매조직절편으로 하였다 tissue array 를제작 (Petagen Inc. Seoul, Korea). Tissue array 는 117개의 CINⅠ 병변과 44개의 CIN Ⅱ, 104개의 CINⅢ 로구성되었다. 자궁근종등양성병변으로전자궁적 출술을시행받고조직병리학적으로자궁경부에종양 성병변이없는 10 예를대조군으로사용하였다. 대상 환자들중고등급상피내병변 (CIN Ⅱ, CIN Ⅲ) 을진단 받은환자들은모두치료로서자궁경부환상투열절제 술또는제1 형확대형전자궁절제술을시행받았다. 저 등급상피내병변 료 (CIN I) 을진단받은환자들은냉동치 (cryotherapy), 레이저치료, 또는자궁경부환상투 열절제술을시행받았다. 자궁경부환상투열절제술또는 제 1형확대형전자궁절제술을시행받은경우그적출 물의조직학적검사결과절제연에잔류암소견은없었 다. 이후 3개월에서 6개월사이의간격으로추적검사로 서자궁경부세포도말검사또는질확대경검사를시행하 였으며의심되는병변이있는경우질확대경조준하자 궁경부착공생검을시행하였다. 2년이상추적관찰기 간중시행한생검결과상다시자궁경부상피내종양 병변이진단되는경우를재발로판정하였다. 2. 방법 1) 고위험군 HPV 의검출 고위험군 HPV 검출에는인유두종바이러스 oligonucleotide microarray DNA chip (Biomedlab Co., Seoul, Korea) 또는 HPV hybrid capture II R kit (Digene/Abbott, Clopper Road, Gaithersburg, Maryland, USA) 를사용하여검사하였다. 고위험군에 속하는아형은 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68, 69 형이며, 저위험군에속하는아형은 6, 11, 34, 40, 42, 43, 44 형이었다. - 1438 -
남은지외 8 인. p16 INK4a and prb in Cervical Intraepithelial Neoplasia 자 2) 면역조직화학염색 (immunohistochemical staining) 및판독 ( 가) p16 INK4a, prb 의면역조직화학염색 p16 INK4a 의염색은 CINtec TM p16 INK4a Histology kit (DAKOCytomation, Carpinteria, CA, USA) 를사용 하였고제작회사의사용설명서에따라염색을시행 하였다. prb의염색은 retinoblastoma (Rb) Ab-1 (Neomarkers, Drive Fremont, CA, USA) 을이용하여 시행하였다. Tissue array 로제작된파라핀포매조직 을섭씨 38도의열판과섭씨 60도의오븐에서각 2시간 동안둔후파라핀제거와함께함수과정을거쳤다. Xylene 에슬라이드를넣은후 5분씩 3회반복하여탈파 라핀을시행후 100%, 90%, 70% 알코올에슬라이드를 1분씩두어 xylene 이빠지도록하였다. 흐르는물에 5 분간씻은후 ckd4 와 prb 의경우 3% H 2 O 2 에 10분간담 갔다. Epitope retrieval 를위해 citrate buffer 를넣고 10분간예열후 slide 를넣고 15 분간데운다. 증류수에 슬라이드를담궈서 20 분간식힌후세척완충액 (wash buffer) 에 5 분간담갔다. 그후 peroxidase-blocking reagent 200 µ l를떨어뜨리고 10분간처리하고슬라이 드를꺼내어 citrate buffer 에 3 분간담근후 (3회반 복), 슬라이드를완충액에서꺼내어잘털어준다음미 리희석해둔일차항체와음성대조시약을 1:25 로희석 하여각각의검체에떨어뜨린다음습성배양기 (wet incubator box) 에마르지않도록뚜껑을잘덮어서실 온에서 1 시간동안반응시켰다. 슬라이드를꺼내어세 척완충액에 3분간담근후발색시약 200 µ l를각각의 검체에떨어뜨린다음습성배양기에마르지않도록뚜 껑을잘덮어서 30 분간습성시킨후, 슬라이드를꺼 내어세척완충액에 3 분간담갔다 (3 회반복). 슬라이 드를완충액에서꺼내어잘털어준후미리만들어놓 은 substrate-chromogen solution 200 µ l를각각의 검체에떨어뜨린다음습성배양기에 10분간습성시켰 다. 슬라이드를꺼내어증류수에헹구고, 슬라이드를 hematoxylin bath 에 1 분간담근후, 슬라이드를꺼내 어다시증류수에헹궜다. 100%, 90%, 70% 알코올에 1분씩둔후, xylene 에슬라이드를넣은후 10분간두었 다. Histomount 를사용하여 coverslip 으로 mount 하였 다. ( 나) 결과판독및통계처리 p16 INK4a, prb 의조직발현의판독은 400배광학현미 경하시야에서관찰하여전체관찰된상피세포중염색 된세포의수를세어백분율단위로표기하였다. 모든 슬라이드는두명의독립된관찰자에의해분석되었다. 각조직학적유형에따른고위험군 발여부, p16 INK4a 와 HPV 감염여부, 재 prb의발현정도의관계를 oneway ANOVA test, t-test, Pearson s correlation test (SPSS 12.0) 로분석하였고, p값이 0.05 미만인경우를 통계적으로유의하다고판정하였다. 결 과 Table 1 은자궁경부상피내종양의병기에따른 p16 INK4a, prb 의염색정도를나타낸표로서자궁경부 상피내종양의조직병리학적진행정도와 p16 INK4a, prb 의이상발현정도와는통계적으로유효하게차이가있 었다. Fig. 1, 2는 p16 INK4a, prb 의염색상이다. 저등급 자궁경부상피내종양에서고등급자궁경부상피내종양 으로진행함에따라 p16 INK4a 의이상발현정도가통계 적으로유의하게증가하여양의상관관계를보였다. 또한 prb의경우고등급자궁경부상피내병변으로진 행할수록이상발현정도가감소하여조직병리학적진 행정도와통계적으로유의하게음의상관관계를보였 다 (Fig. 3). 이관계는모두통계적으로유의하였다 (Pearson s correlation test, p<0.05). 고위험군 HPV 는 CINⅠ 에서는실험군의 69.9% 에서 검출되었고 CIN2 에서는 73.5%, CIN3 및 CIS에서는 70.1% 가검출되어조직병리학적등급과 HPV 고위험 군감염률과는관계는통계적으로유의한차이를보이 지않았다 (Table 2). 고위험군 HPV 감염여부에따라 p16 INK4a, prb 의발현정도와의관계를자궁경부상피내 종양의병기별로분석해본결과고위험군 HPV 에감 염되었을경우 p16 INK4a 의발현이증가되는경향을보였 - 1439 -
대한산부회지제49권제7 호, 2006 다. 저등급상피내종양 (CIN Ⅰ) 에서는고위험군 HPV 감염이있는경우유의하게 p16 INK4a 이상발현이증가하였다 (p<0.05). 그러나중등도또는고등급상피내종 양 (CIN Ⅱ, CIN Ⅲ) 의경우 p16 INK4a, prb 의발현은고 위험군 HPV 감염과통계적으로유의한관계를보이지않았다 (Table 3). p16 INK4a 의경우저등급및고등급상피내종양병변 모두에서재발군에서비재발군에비해통계적으로유 의하게발현률이낮았다. prb 는고등급자궁경부상피 내종양 (CIN Ⅱ and CIN Ⅲ) 에서통계적으로유의하게 재발군에서발현률이높았으며, 비록통계적으로유의 하지않았으나저등급상피내종양에서도재발군에서 prb 의발현률이높은경향을보였다 (Table 4). Table 1. The mean expression rates of p16 INK4a and prb according to pathologic grade of CIN Pathologic grade p16 INK4a* prb* No. Expression rate No. Expression rate CINⅠ 109 27.2% 110 47.8% CINⅡ 41 36.9% 39 41.3% CINⅢ 87 61.9% 87 19.4% Total 237 236 * p<0.05, statistical significance was tested by ANOVA test of variances among groups. No. specimen numbers of adequately stained for reading Table 2. High risk HPV infection rate according to pathologic grade of CIN Pathologic grade No. of HPV tested case No. of high risk HPV High risk HPV infected case infection rate (%) CINⅠ 93 65 69.9 CINⅡ 34 25 73.5 CINⅢ 87 61 70.1 Total (mean) 214 151 (70.6) Table 3. The mean expression rates of p16 INK4a and prb in CIN according to the high risk HPV infection status Mean expression rate±sd (%) p16 INK4a prb High risk HPV Negative Positive Negative Positive CINⅠ 18.9±14.3* 33.0±25.0* 50.0±18.6 47.2±22.4 CINⅡ 30.0±33.9 39.0±35.4 40.0±19.4 40.0±19.3 CINⅢ 59.1±33.0 63.4±30.8 22.7±17.1 18.2±16.5 * p value=0.001; p value was obtained using t-test in CIN Ⅰ. - 1440 -
남은지외 8 인. p16 INK4a and prb in Cervical Intraepithelial Neoplasia 자 A B C D Fig. 1. Representative examples of p16 INK4a immunoreactivity A. Negative p16 INK4a immunohistochemical staining in normal cervical tissues. B&C. 50-60% positive p16 INK4a immunohistochemical staining in CIN tissues. D. 90% positive for p16 INK4a immunohistochemical staining in invasive cervical cancers. 고 찰 HPV 감염은자궁경부암의발생에가장큰원인으로 알려져있다. HPV 감염에의한자궁경부의암화과정 은 HPV 의 E6 및 E7 단백이세포조절주기단백의기능 을저하함으로생겨남이알려져있다. 본연구에서는 자궁경부상피내종양에서 HPV의 E7의주요타겟으로 알려져있는 RB pathway (p16 INK4a -cdk4/cyclind1- prb pathway) 의변화를관찰하여고위험군 HPV 감염 과의연관성및예후와의관계를살펴보고자하였다. 이 전연구결과에서 p16 INK4a 의과발현 (overexpression) 이 자궁경부암을포함한대장암, 폐암, 식도암, 구강암등 에서이미알려진바있다. 13-16 p16 INK4a 의과발현의기 전은현재까지명확하게밝혀지지않았으나 HPV E7이 ubiquitin 의존성단백분해계에의해 prb 의분해를초 래하여상보적으로 p16 INK4a 발현이증가한다는의견이 제시된바있다. 16-18 본연구에서는자궁경부상피내종 양의조직병리학적등급이증가할수록 p16 INK4a 의발현 이증가하였으며 prb 의발현은감소하여위가설과일 치된결과를보였다. 특히 p16 INK4a 의경우자궁근종으 로전자궁적출술을시행한 10예를대상으로면역조직화 학검사를시행한결과 p16 INK4a 의발현이매우낮고 (0- - 1441 -
대한산부회지제49권제7 호, 2006 A B C D Fig. 2. Representative examples of prb immunoreactivity A. 80% positive prb immunohistochemical staining in normal cervical tissues. B. 60% positive prb immunohistochemical staining in CINⅠ tissues. C. 30% positive prb immunohistochemical staining in CINⅡ lesion. D. 10% positive for prb immunohistochemical staining in CIN Ⅲ. Fig. 3. Correlation between p16 INK4a and prb expression and CIN grade. 10%), 자궁경부상피내종양의이형세포의경우뚜렷 이염색되어자궁경부상피내종양진단의재현성 (reproducibility) 을증가시키는객관적인표지로서사 용될수있을것으로사료된다. 본연구에서는고위험군 HPV감염이있는경우 p16 INK4a 이상발현이증가하였으며이는이전연구결과 들과일치한다. 19,20 이는고위험군 HPV 의 E7 단백에 의해 prb 의발현이저하되어음성되먹이기기전에의 하여 p16 INK4a 의발현이더욱증가하기때문으로추정된 다. Nakao 등은 p16 INK4a 의과발현이늦게악성화 (late malignant transformation) 과정에관여하는것이아 - 1442 -
남은지외 8 인. p16 INK4a and prb in Cervical Intraepithelial Neoplasia 자 Table 4. The mean expression rates of p16 INK4a and prb in CIN according to recurrence Mean expression rate±sd (%) p16 INK4a prb Recurrence No Yes No Yes CINⅠ 29.0±22.8 25.4±22.6 47.4±22.4 48.1±16.4 CINⅡ 38.5±35.0 27.5±31.0 40.0±18.3 45.0±23.8 CINⅢ 63.9±30.9 44.3±38.7 17.6±15.1 33.8±26.7 Total 44.2±32.6* 31.0±29.0* 34.5±23.5 43.6±21.0 * p value=0.043 p value=0.034 p value was significant only in the high grade intraepithelial lesion (CINⅡ and CIN Ⅲ). 니라암발생초기불멸화과정 증가함을보고한바있다. 21 따라서 성화및 16 INK4a 의과발현은암발생 (immortalization) 에서 prb 의기능의불활 (carcinogenesis) 의 비교적초기과정에이루어지는것으로보이고특히 CIN1 병변에서통계적으로유의하게 p16 INK4a 의발현 이증가한본연구결과에부합하는것으로사료된다. Geradts 등은면역조직학적방법에의한 p16 INK4a 의핵 염색이 Western blot 의결과와일치하였다고보고하여 암화과정을연구하는데있어 p16 INK4a 의경우면역조직 화학검사가좋은연구방법이될수있음을시사한바 있다. 22 다만상피세포의기저층 (basal epithelium) 및가시층 강하게염색된데반해 (spinous epithelium) 에서는 p16 INK4a 가 HPV의감염에의해생겼다고 믿어지는원반세포 (koilocytes) 나 HPV의복제 (viral replication) 가가장활발히이루어지는과립 층 (granular layer) 에서는 p16 INK4a 가거의음성소견 을보였다. 결론적으로 p16 INK4a 의과발현이고위험군 HPV 감염을시사하는표지로서사용될수있는가능성 을다시한번확인할수있었다. Rb pathway 에관여하는세포주기조절단백의악성 종양의통상적인임상병리학적예후인자로서의역할 에대해서는현재까지는논란의여지가많다. p16 INK4a 의경우결과의불일치 난소암 (discrepancy) 가두드러진다. (ovarian carcinoma) 이나전립선암 (prostate cancer) 에서는 p16 INK4a 발현이증가하는것이나쁜예 후와관계가있다는논문들이발표된바있다. 23,24 반대 로악성흑색종 cancer) 에서는 (melanoma) 이나췌장암 (pancreatic p16 INK4a 의발현감소가나쁜예후와관 련이있다는보고들이있었다. 25,26 하지만이러한상반 되는결과들은암종의 prb status 와관련지어설명될 수있다. 즉주로 prb 가활성화된종양 (Rb positive tumor) 에서는 cdk4 를활성화하기위해 데반해주로 prb를불활성화시킬정도의충분한 p16 INK4a 의활성이감소되는 prb 가불활성화되어있는종양 (Rb negative tumor) 에서는 cyclin D1의과발현이필요치 않으므로 p16 INK4a 발현이상보적으로증가된다. 27 본연 구에서는 p16 INK4a 가재발군에서비재발군에서보다통 계적으로유의하게낮은발현을보였고 prb 와음의상 관관계를보여이전연구와일치된결과를보였다. 28 결론적으로조직병리학적등급이증가할수록 p16 INK4a 의발현은발현이증가하였고 prb 는발현이감소하였 다. 고위험군 HPV 에감염되어있는경우 CIN1 에서 p16 INK4a 의이상발현이증가하여 p16 INK4a 가암발생 (carcinogenesis) 의비교적초기과정에관여하는것으 로보인다. 또한재발군에서 p16 INK4a 의발현이저하되 고 prb 의발현이증가하여 p16 INK4a 및 prb 의면역조직 학적염색결과가예후인자로사용가능할뿐만아니라 치료방침을정하는데보조적수단으로이용가능할것 - 1443 -
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남은지외 8 인. p16 INK4a and prb in Cervical Intraepithelial Neoplasia 자 = 국문초록 = 목적 : 자궁경부상피내종양에서 p16 INK4a,pRb의이상발현정도를살피고이들이고위험군 HPV 감염및재발등임상적특성과연관이있는지알아보고자하였다. 연구방법 : 2001 년1월부터2003 년12월까지본원산부인과에내원하여자궁경부착공생검및환상투열절제술또는제 1형확대형자궁적출술을시행받고조직병리학적으로자궁경부상피내종양을진단받은 265개의파라핀포매조직절편으로 tissue array 를제작하였다. p16 INK4a, prb 에대한면역조직화학염색을시행하였다. 이상의결과를고위험군 HPV 감염여부및재발여부등임상적특징과연관지어분석하였다. 결과 : 자궁경부상피내종양의조직병리학적진행정도와 p16 INK4a 의발현정도는양의상관관계를보였으며반면pRb 의발현과는음의상관관계를보였다. 저등급상피내병변에서는고위험군 HPV 감염이있는경우p16 INK4a 단백이상발현이증가하였다.p16 INK4a 의경우자궁경부상피내병변에서재발군에서비재발군에비해통계적으로유의하게발현률이낮았다.pRb 는고등급자궁경부상피내종양에서통계적으로유의하게재발군에서발현률이높았으며비록통계적으로유의하지않았으나저등급상피내종양에서도재발군에서 prb 의발현률이높은경향을보였다. 결론 : 자궁경부상피내종양의 p16 INK4a 및pRb의면역조직화학염색결과가자궁경부상피내종양의예후인자로서치료방침을결정하는데도움을줄수있을것으로사료된다. 중심단어 : 자궁경부상피내종양, HPV, 재발, p16 INK4a, prb - 1445 -