Hematoxylin Hematoxylin 의산화제와매염제 Hematoxylin 염료자체는조직과친화성이거의없어 HgO (mercuric oxide), NaIO 3 (sodium iodate) 과같은산화제를첨가한후산화과정을거쳐자색의 hematein 으로전환시키는숙성 (ripening) 과정을거친다. 그러나이 hematein 도조직성분과강하게결합할수있는화학적기능기가없기때문에염료로서의결합능을획득하기위해서는매염제의도움을받아야핵과결합할수있다.
Hematoxylin Hematoxylin 의산화제와매염제 매염제가첨가되면 hematein 내의 OH 기와금속이온사이에정전기적결합이일어나고, 다음 hematein 산소원자가금속이온과배위결합 (coordinate bond) 하여오각형의고리 (AI-O=C-C-O) 가형성되면서안정한구조인 hematein-mordant complex 인 hematein lake 가형성 이 lake 는양 (+) 으로하전되며, 조직성분중음 (-) 의성질을띤부위 ( 세포핵등 ) 와이온결합하여청자색내지청색으로염색
Hematoxylin Hematoxylin 의산화제 자연산화 빛이나공기중에노출시켜자연적으로산화시켜숙성시키는방법으로숙성기간이 3~4 개월이걸리지만일단숙성되면염색능의보유시간이길다 Ehelich 와 Delafield hematoxylin
Hematoxylin Hematoxylin 의산화제 화학적산화 화학적산화제를사용하여인위적으로숙성시켜사용하는방법으로산화가신속히진행되므로염색능의보유기간이짧다. Sodium iodate, potassium permanganate, mercuric oxide, hydrogen peroxide, sodium perborate 등의산화제와혼합하면매우신속히산화 hematein 으로 1 차산화된후에도계속적인산화반응을하여용액위에금속성침전물막을형성하므로 hematoxylin 용액은사용전에필히여과
Hematoxylin 의산화 Hematoxylin Before filtration After filtration Hematoxylin solution Hematoxylin 용액의 사용여부판별법
Hematoxylin Hematoxylin 의매염제 Hematein 이조직구조에대한친화력이약하기때문에매염제가같이사용 매염에쓰이는금속염은 ferric ammonium alum, ferric chloride, common alum(nh 4, K salt), iron, phosphomolybdic acid, phosphtungstic acid, chromium, copper, aluminium 등의물질 ( 염 ) 과혼합하여사용 조직검사실에서는매염제로 aluminium 과 iron 을주로이용 Iron 과 ferric salt 는산화제와매염제의기능을갖고있어산화제를첨가하지않는다.
Type of hematoxylin Aluminium mordanted hematoxylin Aluminium 으로매염된 hematoxylin 용액은병리검사실에서핵염색액으로널리이용되며, 조직표본에서정상핵과비정상핵을잘구별 Dye-mordant lake 는조직과결합할때초기정전기적결합에서공유결합으로전환되어결합력이강해 alcohol 처리에도저항성이있다. 대부분의 alum hematoxylin 용액의 ph 는 2.2~2.9 범위인데, 이는핵산의등전점이 ph 1.5~2.0 이므로그이상에위치
Type of hematoxylin Aluminium mordanted hematoxylin 종류 Harris hematoxylin 산화제 : Mercuric oxide 핵염색이명확히나타나검사실에서가장많이사용 퇴행성염색으로사용 Mayer hematoxylin 산화제 : Sodium iodate 진행성염색으로사용되며, 특수염색에서핵을대조염색하는경우이용
Type of hematoxylin Aluminium mordanted hematoxylin 종류 Delafield hematoxylin 마개를하고 3~5 일간빛과공기에노출하여자연숙성시켜산화시킨후여과 Ehrlich hematoxylin 2 주이상공기중에서산화 Gill's hematoxylin (#1, #2, #3) 산화제 : Sodium iodate Carazzi's hematoxylin 산화제 : Potassium iodate
Type of hematoxylin Aluminium mordanted hematoxylin alcohol 의기능 곰팡이 ( 진균류 ) 의증식을억제시키는보존제 Glycerol 의기능 과산화를막아주며, 용액의증발을방지 빙초산 (glacial acetic acid) 의기능 핵염색의선택성을증진시키고과산화작용을완화하며, 산화제의기능을촉진하여보다좋은염색성을나타내도록하는염색강화제
Type of hematoxylin Iron mordant hematoxylin Alum 다음으로핵염색에많이쓰이는매염제 Iron mordant hematoxylin 용액에사용되는철염 (iron salt) 은산화제와매염제의두작용을공유 Ferric chloride 와 ferric ammonium sulfate 가많이사용되며, 매염제는철염을함유하고있어강한산화능을소유하고있기때문에종종 hematoxylin 염색의탈색액으로이용 가장주의해야될것은산화로서, 항상매염제와 hematoxylin 용액을분리하여두었다가사용전즉시혼합 (Weigert's hematoxylin) 하여염색하거나따로분리하여사용 (Heidenhain)
Type of hematoxylin Iron mordant hematoxylin 일반염색보다특수염색의핵염색에사용되는데, 염색과정에산성용액이있는경우 alum mordanted hematoxylin 은염색력이약화되기때문 종류 Weigert iron hematoxylin Ferric chloride 를매염제와산화제로동시에사용 특수염색에서더욱좋은결과를나타낸다. Heidenhain's hematoxylin Ferric ammonium sulfate 를산화제와매염제로동시에사용
Type of hematoxylin Iron mordant hematoxylin 종류 Verhoeff's hematoxylin 탄력섬유의증명에이용하며 Ferric chloride 와 Lugol's iodine 을매염제와산화제로사용 Tungsten hematoxylin Tungsten (1% phosphotungstic acid) 을매염제로사용하며, Mallory's PTAH 염색에사용 그외 Loyez's, Molybdenum, Lead, Bohmer, Bullard hematoxylin 등
Type of hematoxylin
Routine staining 감별 (differentiation) Harris hematoxylin 은퇴행성염색법에사용하므로핵을과염색한후 1% HCl-alcohol 용액으로감별 alum hematoxylin 은 ph 가 2.95 정도이므로 acid alcohol 용액으로분별하면붉은색을나타낸다. 감별이완료된조직은수돗물이나 alkali 용액 ( 약 ph8.0) 으로처리 - blueing. 일반적으로수돗물에서충분히 (10 분정도 ) 수세하는방식이좋으나 ph 8.0 ammonium hydroxide 용액이나 lithium carbonate 용액또는 ph 8.2 Scott s tap water 등을사용
Routine staining 핵의청화액 (blueing: 중화 ) Alum 은용해되면해리되어 aluminium 과수용액내의 OH 기가결합하여불용성의 aluminium hydroxide 을형성 수용액내에많은양의산이존재하면 aluminium hydroxide 가형성되지않고 OH 이온의결핍으로인해 alum hematoxylin 도불용성의 dye lake 를형성할수없게되어산용액내의 alum hematoxylin 은적색으로변화 청색화하기위해서는유리산 (free acid) 을중화시킬수있는 hydroxyl 기 ( 알칼리용액 ) 을첨가
Routine staining 핵의청화액 (blueing: 중화 ) 물에녹지않는안정된청색의불용성의 dye lake (aluminium-hematein-tissue lake) 가형성 중화제 ( 청화액 ) 로는 40~50 의따듯한물, 암모니아수용액, lithium carbonate ( 탄산리튬 ) 수용액이거나 0.5% potassium 또는 sodium bicarbonate, Scott's tap water substitute( 가장우수 ) 등의알칼리용액이사용
Eosin Eosin 염색용액 ( 세포질염색액 ) Eosin 염색용액은절편을먼저 hematoxylin 용액으로핵을염색한후 hematoxylin 에염색되지않은나머지부분에옅은적색으로염색 핵의청색이주위의적색과대조되어 (contrast) 더욱잘보일수있도록하기위한목적으로시행하는염색 세포질염색액은대개산성염료이며조직구조의염색은 eosin Y 와 phloxine B 가주로사용 사용되는 eosin Y 의농도는 0.5~2% 사이이며 RBC, muscle fiber, 세포질등을 pinkish- red 로염색
Eosin Eosin 염색용액 ( 세포질염색액 ) Eosin 염료 Eosin 은산성잔텐 (acid xanthene), 프탈레인 (phtalein) 계염료로서, eosin Y, eosin B, phloxine, erythrosine 의네종류가있다. 브롬 (Br) 원자를 4 개갖고있어서 tetrabromofluorescein 이라한다. alcohol 보다물에대한용해도가대단히높다. Eosin 은 hematoxylin 과같은핵염색에대한대조로적합하기때문에대조염색중가장흔히사용되는염료중하나
Eosin Eosin 염색용액 ( 세포질염색액 ) Eosin 의염색원리 산성염료인 eosin 염료분자는수용액내에서음 (-) 으로하전되어있어서조직내의양 (+) 으로하전된성분과결합 단백질의총전하를양 (+) 으로변화시키기위해서는 eosin 수용액의 ph 를 6.0 이하로낮춰야하기때문에초산 (acetic acid) 를소량첨가하여용액의 ph 를조절 Eosin 의 ph 는약 4.6~5.0 사이에서가장좋은염색성을나타낸다.
Routine staining precedure 박절후 paraffin ribbon 을 60 oven 에 1 시간정도건조시킨다음일반염색과정은다음단계를거친다. 탈 paraffin 과정 조직내부에침투된 paraffin 과조직외부에포매된 paraffin 을제거하는과정 주로 xylene 이사용 박절표본은뿌옇게보이는것은완전히건조되지않아물이 xylene 에혼합되었기때문 함수과정 고농도의 alcohol 로부터저농도의 alcohol 을단계적으로거친다음수세하는것으로이과정의목적은염색용액이대부분수용액상태이기때문
Routine staining precedure 염색과정 탈수및투명과정 염색후단계적인탈수와 xylene 으로투명 Xylene 투명과정을다거치면조직절편은투명하게보여야하며, 만약절편이혼탁하게보이는것은탈수가불완전한것 탈 paraffin 에사용했던 xylene 은용액내에 paraffin 을함유하고있기때문에봉입제의경화작용을방해하므로탈수후의투명제로는적합하지않다.
stain jar & rack
Autostainer
Dye vs Chromogen picric acid(2,4,6 trinitrophenol) 2,4,6-trinitrobenzene 염료 (dye) 와색원체 (chromogen) 의차이를보여주는그림이다. 두화학적구조의차이는무엇의존재여부에따른것인가? 1. 발색단 2. 조색단 3. 벤젠 4. 변색제
Hematoxylin(C 16 H 14 O 6 ) Hematein(C 16 H 12 O 6 ) 다음중다음중 hematoxylin과 hematein에대한설명으로틀린것은? 1. hematoxylin은옅은갈색색소이다 2. hematein은 hematoxylin의산화물이다 3. hematein은매염제와결합해야염기성염료로작용한다 4. hematoxylin으로도핵을염색할수있다
HE 염색에사용되는자동염색기이다. 염색용기의배열이맞게되어있는것은? 1. 탈파라핀 함수-수세-핵염색-수세-세포질염색 -탈수-투명-봉입 2. 탈파라핀 탈수 수세-핵염색-수세-세포질염색- 함수-투명-봉입 3. 탈파라핀 함수 수세-세포질염색- 수세-핵염색-탈수-투명-봉입 4. 탈파라핀 함수 수세-핵염색-수세-세포질염색- 투명-탈수-봉입
HE 염색을완성한후조직표본내에서관찰된것이다. 무엇 때문에생긴것인가? 1. 탈수불충분 2. 박절결함 3. 기포발생 4. 자가융해
HE염색을완성한후조직표본내에서관찰된것이다. 무엇때문에생긴것인가? 1. 헤마톡실린을여과하지않았을때 2. 혈액이많은조직일경우 3. 투명이불충분할때 4. 탈수가불충분할때
Section 1-12 Mounting 봉입
Mounting 봉입의개요 봉입은염색이완료된조직표본에봉입제를묻힌 cover glass 로밀착시켜씌우는일이며, 조직표본제작을완성하는마지막단계 염색표본을명확히관찰하기위해서 slide 와굴절률이유사한점도가높고투명한매질을떨어뜨린후 cover glass 를덮어영구보존해야하는데이때사용하는매질을봉입제 (mounting medium) 라한다.
Mounting 봉입의의의와기능 염색표본의물리적손상, 산화에의한퇴색의방지하여염색성에변화를주지않고, 염색의퇴색과조직절편의부패를방지하며, 표본을오래투명하게유지할목적으로사용되어지고있다.
Mounting 준비기구및재료 봉입용 forcep 여과지 (filter paper) Gauze 봉입제, balsam 병 Slide 정돈판 (mappe) Slide lable sticker (slide 부착용 ) Cover glass 증기흡입기, Hume hood 나 clean bench
Mounting 봉입제가갖춰야할조건 봉입제의굴절률 (refractive index) 이조직의평균굴절률인 1.530~1.540 에가까워야하고 slide 위에부착한조직절편과 cover glass 사이에고르게펴져야하며 비교적짧은시간에굳어져야하고 무색투명해야하며 접착력이있어야한다. 기포가잘빠져야한다. 염색결과에영향을주어서는안되므로 ph 가중성이되어야한다.
Mounting 수용성봉입제 지방염색 지방은 alcohol 에용해되므로탈수과정없이봉입 amyloid( 유전분체 ) 의이염색성염색, 변색성염색 alcohol 이나 xylene 등에의해퇴색되며, 변색성염색을한후비수용성봉입제로봉입하면염색성이정색성으로변화하기때문 면역형광법을이용하는검사 조직내의효소검출시
Mounting 수용성봉입제 수용성봉입제의종류 Glycerol(glycerin) Mineral oil(liquid paraffin) Glycerin jelly(glycerol gelatin) 봉입후단단히굳힌후에 coverslip 의가장자리를메뉴큐어로잘밀봉하여두면몇년간염색표본의보존이가능 Apathy gum syrup Levulose(fructose) syrup
Mounting 비수용성봉입제 최초로사용된봉입제는천연에서생산되는 Canada balsam 천연수지를가공하지않은상태로사용하면봉입이더디고 cover glass 가단단히굳기까지시간이오래걸리며, 염색된조직이점점퇴색되는등의단점이있다. 수지를원료로하는봉입제는항상 xylene 등과같은용매로적당한점도를유지시켜사용해야되므로염색된절편을완전히탈수하지않으면잘혼합되지않아혼탁을일으켜검경을방해
Mounting 비수용성봉입제 천연수지봉입제 천연수지는완전히굳는데 2~3 개월걸리며, 오래되면황색으로변하고, 용매가증발하고나면균열이발생 장기간보관할경우천연수지에포함되어있는산성성분이염색색조를퇴색시키는단점 종류 Canada balsam ( 굴절률 1.541~1.547) Gum dammer
Mounting 비수용성봉입제 합성수지 (synthetic resin) 봉입제 Synthetic resin 은대부분중성이며비교적빨리굳으며염색표본의장기간보존상태가좋다. 주로 β-pinene polymer 로이루어졌다. 장점 화학조성을알수있으며안정되고순수하다. 휘발성유기용매에쉽게용해된다. 색상이투명하며, 오랜시간이지나도황색변화가발생하지않는다. 1 시간이내에건조 조직절편과슬라이드의굴절율이동일한굴절율을갖는다. (Rf=1.53~1.54)
Mounting 비수용성봉입제 합성수지봉입제의종류 Eukitt : 굴절률 1.510 Harleco synthetic resin : 굴절률 1.548 Permount : 굴절률 1.529 Bioloid : 굴절률 1.550 Histoclad : 굴절률 1.560 Caedax
Mounting 봉입의방법 봉입제의양이적으면기포가생기기쉽고, 후에봉입제가건조되면서공기가들어가면표본의질이떨어진다. 봉입제의양이너무많으면봉입제가 cover glass 밖으로새어나와 slide 가지저분하게되고현미경검경시뿌옇게보이므로이때는여과지에 slide 를세워여액을흘려보내고 xylene 을묻힌 gauze 로가장자리를닦아낸다. 조직표본에 xylene 이말랐을경우 xylene 에담궈두었다가다시봉입한다.
Mounting 봉입의방법 작은기포들이생겼을때는예리한 forcep 으로가만히눌러빼낸다. Forcep 으로눌러도잘빠지지않는것은 xylene 용액에담그어두었다가 cover glass 를떼어내고다시봉입한다. 지방염색후수용성봉입제로봉입할때는기포가생겼다고 forcep 으로눌러주면지방방울의위치가변할수있으므로눌러서는안된다.
봉입의방법 Mounting
봉입의방법 Mounting
Automatic coverslipping machine
염색후봉입하는과정이다. 지방염색을하였다면다음중어떤봉입제가적당한가? 1. Canada balsam 2. Glycerin jelly 3. Permount 4. Caedax
Hematoxylin Hematein-lake Harris hematoxylin용액이다. 왼쪽은알코올에헤마톡실린만을녹인것이고오른쪽은매염제와산화제를넣어만든완성용액이다. 사용된산화제는? 1. Pot. Permanganate 2. Hydrogen peroxide 3. Sodium iodate 4. Mercuric oxide