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Journal of Korean Medicine Rehabilitation Vol. 24 No. 1, January 2014 pissn 1229-1854 eissn 2288-4114 Original Article 연잎 - 연근복합발효물이흰쥐의내당능및지질대사관련유전자발현에미치는영향 김형구 Shambhunath Bose 김동일 * 구병수 김호준동국대학교한의과대학한방재활의학과교실, 한방부인과학교실 *, 신경정신과학교실 Effects of Fermented Lotus Extracts on Glucose Intolerance and Lipid Metabolism-related Gene Expression Hyung-Gu Kim, O.M.D., Shambhunath Bose, Ph.D., Dong-Il Kim, O.M.D.*, Byung-Soo Koo, O.M.D., Hojun Kim, O.M.D. Departments of Oriental Rehabilitation Medicine, Obstetrics and Gynecology*, Neuropsychiatry, College of Oriental Medicine, Dongguk University 본논문은 2010 년예비기술창업자육성사업에의해지원되었으며이에감사드림. RECEIVED December 17, 2013 REVISED January 2, 2014 ACCEPTED January 3, 2014 CORRESPONDING TO Hojun Kim, Department of Oriental Rehabilitation Medicine, College of Oriental Medicine, Dongguk University, 27 Dongguk-ro, Ilsandong-gu, Goyang 410-773, Korea TEL (031) 961-9111 FAX (031) 961-9009 E-mail kimklar@dongguk.ac.kr Copyright 2014 The Society of Korean Medicine Rehabilitation Objectives This study was performed to evaluate the effects of fermented lotus extracts on prediabetes and hyperlipidemia in high fructose diet rats. Methods Extracts of lotus leaf and lotus root were fermented using 4 different probiotics separately, including Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus, Bifidobacterium breve, and Bifidobacterium longum. Expressions of adipogenic transcription factors including Adiponectin, GLUT-4, Leptin, PPAR gamma, Resistin and Visfatin were analyzed by Real time PCR and Western blotting analysis. Results Fermented lotus extracts reduced blood glucose. Fermented lotus extracts inhibited adipogenic transcription factors by inhibiting preadipocytes differentiation. The level of gene expression of Adiponectin, GLUT-4, Leptin, PPAR gamma, Resistin and Visfatin in relation to that of GAPDH were increase or decrease significantly with the Fermented lotus formulation group. Conclusions Fermented lotus extracts showed hypoglycemic and hypolipidemic effects by inhibiting preadipocyte differentiation and controlling insulin sensitivity in high fructose diet rats. (J Korean Med Rehab 2014;24(1):1-12) Key words Lotus, Probiotics, Fermentation, Insulin resistance, Hyperlipidemia 서론»»» 당뇨병은인슐린의절대적또는상대적결핍및조직에서의인슐린작용성저하에기인하는고혈당과이에수반되는대사장애를특징으로하는질환이다. 인류문명의발달에따른식이형태와생활양식의변화로인해비만인구와함께증가추세에있는제 2형당뇨병 (Type 2 Diabetes Mellitus) 은인슐린의분비가절대적으로부족한제 1형당뇨병 (Type 1 Diabetes Mellitus) 과는달리인슐린저항성이주요한병태생리학적특징이다. 인슐린저항성은유전적인요인과함께말초조직에서인슐린감수성을감소시키는식이형태나비만, 운동부족, 스트레스등의생활습관과밀접한관련이있다 1,2). 최근제 2형당뇨병환자의 85% 가비만이라는조사결 www.e-jkmr.org 1

김형구 Shambhunath Bose 김동일 구병수 김호준 과에서보듯이, 비만은제 2형당뇨병의가장중요한원인이다. 제 2형당뇨병의발병위험률은 BMI (Body Mass Index) 의증가와함께높아지는것으로알려져있으며, 과도한지방비율과복부에집중된지방은대사증후군을포함한여타대사장애에있어매우중요한위험인자이다 3-5). 연 (Nelumbo nucifera Gaertner) 은한국일본등에널리분포하는고생대의식물로수련과에속한다년생초본이다 6). 꽃은관상용과차재료로이용해왔으며잎과뿌리는식용으로사용되어왔다. 연잎에해당되는하엽 (Nelumbo nucifera leaves, 荷葉 ) 은더위를내리고습을제거하며지혈효과가있어暑濕으로인한설사및부종, 출혈질환에치료하는데사용되어왔고 7), 연근에해당되는우절 (Nelumbinis Rhizomatis Nodus, 藕節 ) 은연꽃의근경마디를잘라씻은뒤건조시킨약재로주름이져있고짧은원주상의모양을하고있으며횡단면이 7~9개의둥근구멍이있는것이특징이다. 어혈제거및지혈효과가있어열로인한각종출혈성만성질환에활용될수있다고알려져있다 8). 연잎과연근의약리작용에대하여국내외에서다양한연구들이진행되어왔다. 연잎과연근이약용과식용으로많이사용되고있고연근에는당단백질인뮤신이함유되어있어혈압강하, 콜레스테롤저하작용이있다고밝혀졌으며항산화작용도크다고알려졌다 9). 또한연잎과연근에인슐린작용을향상시키는인슐린민감성물질이함유되어있을가능성이높다는연구도진행되었다 10). 한의학에서는한약을사용하기위해가공하는포제법중하나로미생물이가지고있는효소를통해한약에포함된유기물의분해되는과정을통해유효한산물을얻어한약의효능을증가시키는방법을시행한것을발효한약이라고하였다. 발효한약을사용한선행연구로는항암효과, 소염효과, 비만치료, 퇴행성질환등에대한연구가주를이루고있으며최근발효한약에대한관심이높아지고있다 11). 현재제 2형당뇨병치료제를살펴보면인슐린분비능을증가시키는 sulfonlurea 계통의약물이있고, 인슐린작용력을향상시키는 peroxisome proliferator activated receptor gamma (PPAR gamma) agonist인 pioglitazone 과 rosiglitazone 의약물이있으며간에서당신생합성을감소시키는 metformin 계통의물질도있고탄수화물의소화흡수를방해하여식후혈당의상승을방지하는 acarbose 계통의약물도있다 12-14). 본실험에서는연잎-연근혼합발효물이비만억제, 혈당조절및지질강하효과에미치는영향에대해연구하기위해서연잎-연근혼합추출물을 4가지주요유산균으로각각발효시킨후 Glucose tolerance test, 혈청에서의혈당측정, Adiponectin, GLUT-4, Leptin, PPAR gamma, Resistin, Visfatin 의유전자발현정도를관찰하였다. 또한제 2형당뇨병치료제인 rosiglitazone 을양성대조군으로사용하여연잎-연근혼합물및혼합발효물과비교하였다. 재료및방법»»» 1. 재료 1) 실험재료하엽 ( 연잎, Nelumbo nucifera gaertner) 및우절 ( 연근 ) 분말은 local market으로부터제공받아 autoclave 처리한 Milli-Q water과 2% w/v 농도가되게섞어사용하였다. 실험동물은생후 8주령의체중 200±20 g인외관상건강한수컷 rat 30마리를 Orient Bio (Seongnam-si, Korea) 로부터구입하였다. 1주일간온도와습도가조절되는환경인동물사육실에서고형사료 (Soyagreentec, Hwaseong-si. Korea) 와물을섭취하게하여환경에적응시켰다. 고형사료는 20% 단백질, 4.5% 지방, 63% 탄수화물로구성되어있다. 온도 22±2 o C, 상대습도 40~60% 의환경을유지하였다. 12시간명암주기 (light; 7:00~19:00, dark; 19:00~ 7:00) 로일정하게유지되는동물사육실에서수행되었으며, 시험기간중동물실험실의온ㆍ습도는항온ㆍ항습기에의해일정하게유지하였다. 실험절차는 NIH의동물관리지침을준수했고, 동국대학교의동물실험윤리위원회의사전승인을받고수행되었다. 환경에적응된 30마리의수컷 rat을각케이지당 3~4마리씩배정한후, 일반식이군 (Normal Control, 이하 Normal, n=3), 고당식이대조군 (Disease control, 이하 DC, n=3), Unfermented lotus 처치군 (Disease control+unfermented lotus Group, 이하 DC+UFL, n=3), Fermented lotus 처치군 (Disease control+fermented lotus Group, 이하 DC+FL, n=3), Rosigitazone 처치군 (Disease control+ Rosigitazone, 이하 DC+Rosi, n=3) 의 5군으로만들었다. 2 J Korean Med Rehab 2014;24(1):1-12

연잎 - 연근복합발효물이흰쥐의내당능및지질대사관련유전자발현에미치는영향 2. 방법 1) Starter 제조발효에사용된균주는 Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum을이용하였다. 스타터배양액은 autoclave를이용하여 121 o C에서 20분간멸균한액체배지 (Lactobacilli MRS broth, Difco) 에 Lactobacilli MRS agar plate에서균주에따라최적의조건에서배양한균주를 1 회접종한취최적조건에서배양하여스타터로사용하였다. 균주에따른최적의조건은 Table I에제시하였다. 2) 추출물및발효물제조본실험에서는하엽및우절분말을 Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum 각각의균주로발효한발효추출물을시료로이용하여실험하였다. 한약재의추출은 shaking water bath를이용하여 70 o C에서 3시간동안열수추출하였다. 시료의추출물은 autoclave 를이용하여 121 o C에서 20분간멸균시킨후실온에서충분히식히고각시료에각각의균주 Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum을 2 10 7 CFU/ml 가되도록접종하여 37 o C 에서 24시간동안발효한뒤각각을 1:1:1:1 의비율로섞어실험에이용하였다. 각시료에균주대신 autoclave 한 media 를접종한뒤각각을 1:1:1:1 의비율로섞어발효하지않은추출물로실험에이용하였다. 3) Study design 각군은총 8주동안일반식이와고당식이를경구투여하였다. Normal 군은 rosiglitazone 과하엽및우절분말대신에물을경구투여하였다. DC군은 60% fructose 로구성된 High Fructose Diet ( 이하 HFD) 와물을경구투여하였다. DC+UFL 군, DC+FL 군, DC+Rosi 군의 3개군은 HFD와위에서언급한각각의분말및약물을경구투여하였다. 하엽및우절분말은 8주간의실험기간동안매일 1회 150 mg/kg/day 농도로경구투여하였다. Rosiglitazone은 8주간의실험기간동안매일 1회 0.8 mg/kg/day 농도로경구투여하였다. 실험기간이종료된실험동물은시료및조직채취를시행하였다. 복부정중선을따라개복한후심장에서주사기로필요한혈액을채혈하였다. 채혈한후간, 넓적다리근육과지방조직을적출하였다. 적출한장기및조직을식염수에몇번세척하여피를제거하고물기를제거한후액체질소에보관하였다. 4) Oral glucose tolerance test (OGTT) 실험시료투여 3주째에 Normal 군, DC군, DC+FL 군의 3개군에실험을진행하였다. Rat의꼬리정맥에서채혈하여공복시혈당농도를측정하였다. 이후 50% dextrose solution 2 ml를경구투여하였다. 2시간경과후꼬리정맥에서한번더채혈하였다. 채혈한혈액으로부터즉시 serum을분리한후 standard assay kit를사용하여혈당과 insulin 농도를측정하였다. 공복시혈당농도와 2시간경과후혈당농도의차이로혈당의증가를나타내었다. 5) Determination of serum adiponectin content Serum의 adiponectin은 adiponectin (rat) ELISA kit (AdipoGen Inc., Yeonsu-gu, Incheon, Korea) 를사용하여측정하였다. Serum은 1,000배희석하여분석에사용하였다. Table I. Culture Media and Major Ingredient Preparation Major ingredient Media type Bacterial strain A 2% (w/v) lotus leaf+2% (w/v) lotus root 5.5% MRS broth Lactobacillus plantarum B 2% (w/v) lotus leaf+2% (w/v) lotus root 5.5% MRS broth Lactobaciluus rhamnosus C 2% (w/v) lotus leaf+2% (w/v) lotus root 5.5% MRS broth+0.05% L-cystein Bifidobacterium breve D 2% (w/v) lotus leaf+2% (w/v) lotus root 5.5% MRS broth+0.05% L-cystein Bifidobacterium longum Unfermented lotus formulation (UFL): Unfermented preparations of A+B+C+D (1:1:1:1 vol/vol). Fermented lotus formulation (FL): Fermented preparations of A+B+C+D (1:1:1:1 vol/vol). www.e-jkmr.org 3

김형구 Shambhunath Bose 김동일 구병수 김호준 6) Determination of tissue gene expression of rat by qrt-pcr Total RNA는 Trizol R reagent (Invitrogen, Carsbad, CA, USA) 를사용하여 protocol 에따라분리정제하였다. 1μg의 total RNA를 cdna synthesis kit (Sprint TM RT- CompleteOligo-(dT) 18, Clontech, MountainView, CA, USA) 를이용하여 protocol 에따라역전사반응을수행하여 first strand cdna 를얻었다. RT-PCR 샘플은 Light Cycler- Fast Start DNA Master SYBR Green (Roche Applied Science, Indianapolis, ID, USA) 을이용하여최종반응용량을 20μl 로하여 LightCycler instrument (Roche Applied Science) 에서진행하였다. Primer 종류및서열은 Table II에표시한바와같다. PCR amplification 은 C/EBPα 에서 95 o C에서 10분동안 prior incubation 후, 50 cycle 의 amplification (95 o C에서 10초간 denaturation, 52 o C에서 10초간 annealing, 72 o C에서 15초간 extension) 하였고 GAPDH 에서는 95 o C에서 10분동안 prior incubation 후, 35 cycle의 amplification (95 o C에서 10초간 denaturation, 52 o C 에서 10초간 annealing, 72 o C에서 15초간 extension) 하였다. 데이터는 LightCycler Software (Roche Diagnostics, Penzberg, Germany) 로분석하였다. 각각의분석에서 cdna 대신물을음성대조군으로사용하여발생가능한 primer-dimer 형성을체크하였다. 유전자의전사레벨은 GAPDH 를기준으로삼아 2-ΔCt ( 목표한유전자의 threshold 값-GAPDH 의 threshold 값 ) 를구하는방식으로 계산되었고, 유전자의발현량은 differentiation media 만처리한대조군을 1.0으로간주하여상대적인값을측정하였다. 3. 통계처리 실험결과는평균값 ± 표준오차 (mean±standard error) 로표시하였고 SPSS 12.0 (SPSS Inc. Chicago IL, USA) 를이용한 one-way ANOVA 로각실험군간의통계학적분석을시행하였다. 실험의통계학적유의성은 p값이 0.05 이하인경우에유의한것으로보았다. 결과»»» 1. Glucose tolerance test and the level of serum glucose Normal 군을 100% 로설정한후 DC군, DC+FL 군과비교하였다. 1) Glucose tolerance test Normal 군을 100% 로설정하였을때, DC군은 171.51%, DC+FL 군은 119.62 로측정되었다. DC+FL 군이 DC군에비교해감소하였으나, 통계학적유의성은인정되지않았다 (p<0.05)(fig. 1). Table II. The Primer Sequence Used for Real-time PCR Genus specific primers Direction Sequence Size Annealing temp. GAPDH (RAT) F 5ʼ-ATGGCACAGTCAAGGCTGAGA-3ʼ 70 bp 53 o C R 5ʼ-CG CTC CTG GAA GAT GGT GAT-3ʼ Adiponectin (RAT) F 5ʼ-AATCCTGCCCAGTCATGAAG-3ʼ 658 bp 62 o C R 5ʼ-CATCTCCTGGGTCACCCTTA-3ʼ GLUT4 F 5ʼ-GGGCTGTGAGTGAGTGCTTTC-3ʼ 150 bp 60 o C R 5ʼ-CAGCGAGGCAAGGCTAGA-3ʼ Leptin (RAT) F 5ʼ-CACAGAGGTGGTGGCTCTGA-3ʼ 101 bp 62 o C R 5-CCCGGTGGTCTTGGAAACTT-3ʼ PPAR gamma (RAT) F 5ʼ-TATGCTGTTATGGGTGAAAC-3ʼ 100 bp 60 o C R 5ʼ-TGGTAATTTCTTGTGAAGTGCTC-3ʼ Resistin (RAT) F 5ʼ-CTACATTGCTGGTCAGTCTCC-3ʼ 222 bp 60 o C R 5ʼ-GCTGTCCAGTCTATGCTTCC-3ʼ Visfatin Pbef1 (RAT) F 5ʼ-TCTGGAAATCCGCTCGACAC-3ʼ 129 bp 62 o C R 5ʼ-CACTCCGTCCCCTTGAATGA-3ʼ 4 J Korean Med Rehab 2014;24(1):1-12

연잎 - 연근복합발효물이흰쥐의내당능및지질대사관련유전자발현에미치는영향 Fig. 1. Glucose tolerance test: Increase in the level of serum glucose of rats under different experimental groups on the 3 rd week of treatment being measured at 120 min after challenging with glucose (1 g/rat). DC: disease control, FL: fermented lotus. Fig. 3. The level of serum adiponectin of rats under different experimental groups at the end of the experimental period. DC: disease control, FL: fermented lotus. Fig. 2. The level of serum glucose of rats under different experimental groups at the end of the experimental period. DC: disease control, FL: fermented lotus. 2) The level of serum glucose Normal 군을 100% 로설정하였을때, DC군은 119.88%, DC+FL 군은 93.83로측정되었다. DC+FL 군이 DC, Normal 2개군에비해감소하였으나, 통계학적유의성은인정되지않았다 (p<0.05)(fig. 2). 2. The level of serum adiponectin Normal 군을 100% 로설정하였을때, DC군은 68.50%, DC+FL 군은 75.26으로측정되었다. DC, DC+FL 2개군이 Normal 군과비교시모두감소하였으나, DC+FL 군이 DC군에비해감소폭이더작았다. 통계학적인유의성은나타나지않았다 (p<0.05)(fig. 3). Fig. 4. The level of gene expression of GLUT-4 in relation to that of GAPDH in the liver of rats under different experimental 3. The level of gene expression of GLUT-4 in relation to that of GAPDH GLUT-4 유전자의발현정도를간조직에서측정하였을때 (Fig. 4), Normal 군은 0.0017, DC군은 0.0006으로측정되어 DC군이 Normal 군과비교해유의하게감소하였다 (p< 0.001). DC+UFL군은 0.0008, DC+FL군은 0.0013, DC+ Rosi군은 0.0015로측정되었다. DC+FL, DC+Rosi 2개군은 DC군과비교시통계학적으로유의하게 GLUT-4 유전자의발현정도가증가하였다 (p<0.01). GLUT-4 유전자의발현정도를 Adipose 조직에서측정하였을때 (Fig. 5), Normal 군은 1.0076, DC군은 0.6193으로측정되어 DC군이 Normal 군과비교해유의하게감소하 www.e-jkmr.org 5

김형구 Shambhunath Bose 김동일 구병수 김호준 Fig. 5. The level of gene expression of GLUT-4 in relation to that of GAPDH in the adipose tissue of rats under different experimental Fig. 7. The level of gene expression of Leptin in relation to that of GAPDH in the adipose tissue of rats under different experimental Fig. 6. The level of gene expression of Leptin in relation to that of GAPDH in the muscle of rats under different experimental 였다 (p<0.001). DC+UFL군은 0.6504, DC+FL군은 0.9203, DC+Rosi군은 1.0247로측정되었다. DC+FL, DC+Rosi 2 개군은 DC군과비교시통계학적으로유의하게 GLUT-4 유전자의발현정도가증가하였다 (p<0.01)(p<0.0001). GLUT-4 유전자의발현정도를근육조직에서측정하였을때, 통계학적인유의성은발견되지않았다 (p<0.05). 4. The level of gene expression of Leptin in relation to that of GAPDH Leptin 유전자의발현정도를근육조직에서측정하였을때 (Fig. 6), Normal군은 0.0000364, DC군은 0.0000134으 로측정되어 DC군이 Normal 군과비교해유의하게감소하였다 (p<0.001). DC+UFL군은 0.0000163, DC+FL군은 0.0000354, DC+Rosi 군은 0.0000283 로측정되었다. DC+ FL, DC+Rosi 2개군은 DC군과비교시통계학적으로유의하게 Leptin 유전자의발현정도가증가하였다 (p<0.0001) (p<0.01). Leptin 유전자의발현정도를 Adipose 조직에서측정하였을때 (Fig. 7), Normal군은 0.0132, DC군은 0.0027로측정되어 DC군이 Normal 군과비교해유의하게감소하였다 (p<0.001). DC+UFL군은 0.0062, DC+FL군은 0.0113, DC+Rosi 군은 0.0112 로측정되었다. DC+UFL, DC+FL, DC+Rosi 3개군은 DC군과비교시통계학적으로유의하게 Leptin 유전자의발현정도가증가하였다 (p<0.01)(p< 0.0001)(p<0.0001). Leptin 유전자의발현정도를간조직에서측정하였을때, 통계학적인유의성은발견되지않았다 (p<0.05). 5. The level of gene expression of PPAR gamma in relation to that of GAPDH PPAR gamma 유전자의발현정도를간조직에서측정하였을때 (Fig. 8), Normal군은 0.00105, DC군은 0.00013 으로측정되어 DC군이 Normal 군과비교해유의하게감소하였다 (p<0.0001). DC+UFL 군은 0.00012, DC+FL군은 0.00098, DC+Rosi 군은 0.00081로측정되었다. DC+FL, DC+ Rosi 2개군은 DC군과비교시통계학적으로유의하게 PPAR 6 J Korean Med Rehab 2014;24(1):1-12

연잎 - 연근복합발효물이흰쥐의내당능및지질대사관련유전자발현에미치는영향 Fig. 8. The level of gene expression of PPAR gamma in relation to that of GAPDH in the liver of rats under different experimental Fig. 10. The level of gene expression of PPAR Gamma in relation to that of GAPDH in the adipose tissue of rats under different experimental Fig. 9. The level of gene expression of PPAR Gamma in relation to that of GAPDH in the muscle of rats under different experimental gamma 유전자의발현정도가증가하였다 (p<0.00001)(p< 0.001). PPAR gamma 유전자의발현정도를근육조직에서측정하였을때 (Fig. 9), Normal군은 0.00027, DC군은 0.00005 로측정되어 DC군이 Normal 군과비교해유의하게감소하였다 (p<0.0001). DC+UFL군은 0.00007, DC+FL군은 0.00013, DC+Rosi 군은 0.00030 으로측정되었다. DC+FL, DC+Rosi 2개군은 DC군과비교시통계학적으로유의하게 PPAR gamma 유전자의발현정도가증가하였다 (p<0.01) (p<0.0001). PPAR gamma 유전자의발현정도를 Adipose 조직에서측정하였을때 (Fig. 10), Normal 군은 0.056, DC군은 0.018 으로측정되어 DC군이 Normal 군과비교해유의하게감 Fig. 11. The level of gene expression of Adiponectin in relation to that of GAPDH in the adipose tissue of rats under different experimental 소하였다 (p<0.001). DC+UFL 군은 0.045, DC+FL군은 0.053, DC+Rosi 군은 0.064 로측정되었다. DC+UFL, DC+FL, DC+ Rosi 3개군은 DC군과비교시통계학적으로유의하게 PPAR gamma 유전자의발현정도가증가하였다 (p<0.01) (p<0.001)(p<0.0001). 6. The level of gene expression of Adiponectin in relation to that of GAPDH Adiponectin 유전자의발현정도를 Adipose 조직에서측정하였을때 (Fig. 11), Normal 군은 0.088, DC군은 0.022으로측정되어 DC군이 Normal군과비교해유의하 www.e-jkmr.org 7

김형구 Shambhunath Bose 김동일 구병수 김호준 Fig. 12. The level of gene expression of Resistin in relation to that of GAPDH in the adipose tissue of rats under different experimental from DC, c: significantly different from DC+UF, d: significantly different from DC+FL. Fig. 13. The level of gene expression of Visfatin in relation to that of GAPDH in the adipose tissue of rats under different experimental from DC, c: significantly different from DC+UF, d: significantly different from DC+FL. 게감소하였다 (p<0.0001). DC+UFL군은 0.042, DC+FL 군은 0.065, DC+Rosi 군은 0.061로측정되었다. DC+UFL, DC+FL, DC+Rosi 3개군은 DC군과비교시통계학적으로유의하게 Adiponectin 유전자의발현정도가증가하였다 (p<0.05)(p<0.01)(p<0.01). Adiponectin 유전자의발현정도를근육조직에서측정하였을때, 통계학적인유의성은발견되지않았다 (p< 0.05). 하였을때 (Fig. 13), Normal군은 0.357, DC군은 0.072으로측정되어 DC군이 Normal 군과비교해유의하게감소하였다 (p<0.001). DC+UFL군은 0.132, DC+FL군은 0.202, DC+Rosi 군은 0.315으로측정되었다. DC+UFL, DC+FL, DC+Rosi 3개군은 DC군과비교시통계학적으로유의하게 Resistin 유전자의발현정도가감소하였다 (p<0.01)(p< 0.001)(p<0.00001). 7. The level of gene expression of Resistin in relation to that of GAPDH Resistin 유전자의발현정도를 Adipose 조직에서측정하였을때 (Fig. 12), Normal 군은 0.18, DC군은 0.70으로측정되어 DC군이 Normal 군과비교해유의하게증가하였다 (p<0.001). DC+UFL군은 0.47, DC+FL군은 0.29, DC+Rosi 군은 0.20으로측정되었다. DC+UFL, DC+FL, DC+Rosi 3개군은 DC군과비교시통계학적으로유의하게 Resistin 유전자의발현정도가감소하였다 (p<0.01)(p< 0.00001)(p<0.000001). 8. The level of gene expression of Visfatin in relation to that of GAPDH Visfatin 유전자의발현정도를 Adipose 조직에서측정 고찰»»» 연 (Nelumbo nucifera Gaertner, 連 ) 은국내를비롯하여아시아남부에널리서식하는식물로관상용혹은식용으로다양하게사용되고있다. 연잎에해당되는하엽 (Nelumbo nucifera leaves, 荷葉 ) 과연근에해당되는우절 (Nelumbinis Rhizomatis Nodus, 藕節 ) 은한의학적으로각각의효능과주치가있는데주로열로인해발생되는출혈성질환에효과가있다고알려져있다 15). 연의성분으로는진통작용, 진정작용이있는 roemerine, neciferin, armepavin, N-nornuciferine,pronuciferine, N-methylcoclaurine, leucodelphindin, nelunboside, gluconicacid, 10- nonacosanol, dehydroroemerine, dehydronuciferine, dehydroanonaine, N-methylisococlaurine, N-methylcoclaurine, 주석산, 구연산, 호박산, 탄닌등이알려져있다 16). 연의항비만작용뿐만아니라내분비대사및지질대사촉진에 8 J Korean Med Rehab 2014;24(1):1-12

연잎 - 연근복합발효물이흰쥐의내당능및지질대사관련유전자발현에미치는영향 유의한효과가있다는연구결과가나온바있으며, 연의성분이신경안정, 염증억제, 위장장애개선, 이뇨효과, 혈액순환개선, 탄수화물소화지연작용, 항산화효과와항균효과가있다고보고된바있다 17,18). 발효한약은약효성분의체내흡수율과생체이용률을모두극대화시켜약리적기능성뿐만아니라한약의제형개량과포제방법을향상시키고, 이를통해한약의새로운수요를창출하고고부가가치의한약제품을개발할수있어최근한의학계서관심을받고있다 19). 국내에서는발효한약이건강한사람의활력징후와면역체계에미치는영향에대한연구가많이수행되었으며, 중국에서는영지, 동충하초균을이용한발효연구가다수진행되어견관절주위염, 만성천표성위염, 전립성비대증, 당뇨성신병증, 만성 B형간염등의질환에대한발효한약의치료효과를검증하였다 20). 최근비만, 당뇨병과같은대사증후군과장내미생물사이의연관성에대한연구결과가발표되면서발효한약이장내미생물의균형을유지시켜주는데도움이된다는보고가있었다 21,22). 발효한약의다양한임상활용을위해새로운발효추출물의유의성을검증하는과정이필요한시기이며, 현재연의발효추출물이비만과전당뇨, 고지혈증을포함하는대사증후군에어떠한효과가있는지에대해서는거의연구가이루어지지않은실정이다. 본연구에서는연잎및연근성분이발효된상태에서비만억제, 혈당조절및지질강하효과를나타낼것인지에대한여부를 in vivo 실험을통해규명하고자하였다. 연잎-연근혼합발효물의혈당조절효과를조사하기위해 Glucose tolerance test를시행하고혈청에서당의양을관찰하였다. Glucose tolerance test와혈청에서당의양비교모두에서통계학적유의성을찾을수는없었다. 하지만 DC+FL군은 DC군과비교시감소하였으며, DC+FL군은혈청에서당의양비교시 Normal 군보다더감소한수치를나타내었다. 비만과관련하여최근지방조직이중성지방을합성하고저장하는역할외에도여러호르몬들을분비하는내분비기능이있음이밝혀졌다 23). 지방세포에서생성, 분비되어다양한신호전달에관여하는여러단백질들을통칭하여 ʻadipocytokineʼ 혹은 ʻadipokineʼ이라고부른다. 1994년처음발견된 leptin을비롯하여 adiponectin, TNF-α 등이비만과관련하여중요한 adipokine 이다 24-29). Adiponectin 은 247개의아미노산펩타이드로지방세포에서분비되며지방세포분화과정에서그발현이증가된다. 지방조직뿐아니라근육과간조직에서인슐린민감도를높이고, 당의항상성을유지하며, 지방의산화를증가시켜체중감소를유발한다. 당뇨나인슐린저항이있는환자에서 adiponectin 의혈중농도가낮고, 지방세포에서분비된 adiponectin 은지질축적을억제하며, 비만이있는경우더낮은 adiponectin 치를보인다. 여러연구들은 adiponectin 이비만과관련된합병증인대사증후군, 특히제 2형당뇨병과심혈관질환으로부터보호역할을한다고보고하였다 24,25). 본실험에서혈청에서측정한 adiponectin 은통계적인유의성이없었지만, DC+FL 군이 DC군에비하여약간증가하는경향을보여주었다. 근육에서의 adiponectin 의발현정도는통계적인유의성이없었다. Adiponectin 의유전자발현정도를 Adipose 조직에서측정하였을때, DC+UFL 군, DC+FL 군, DC+Rosi 군은통계적인유의성을나타내었다 (p<0.05)(p<0.01)(p<0.01). 위의 3개군중에서, DC+FL 군이가장발현정도가높게나타났다. 이는연잎-연근혼합발효물이인슐린저항성을감소시키고고혈당을개선하는데어느정도의미가있다고보여진다. GLUT-4 는인슐린분비시혈중포도당이근육과지방조직으로유입되도록한다 30). 고혈당조건에서인슐린에의해활성화된 GLUT-4 는말초조직으로의포도당유입을증가시켜체내의포도당항상성을유지하는주요한역할을하고있다 31). 본실험에서 GLUT-4 유전자의발현정도를간조직에서측정하였을때, DC+FL, DC+Rosi 2개군에서통계적인유의성을나타내었다 (p<0.01). Adipose 조직에서 GLUT-4 유전자의발현정도를측정하였을때역시 DC+FL, DC+Rosi 2개군에서통계적인유의성을나타내었다 (p<0.01)(p<0.0001). 이는연잎-연근혼합발효물이 GLUT-4 유전자발현정도증가하는데의의가있다고볼수있다. Leptin 은 1994년에처음으로발견된 adipocytokine 으로서 167개의아미노산으로구성된 16-kDa 폴리펩타이드이며, 구조나호르몬의역할이 cytokine 과같다. Leptin 은인간에서포만감에대한신호를전달하며식욕과체중을조절하는역할을하는데, 궁극적으로시상하부의중추회로에영향을주어음식섭취를억제하고교감신경계를활성화시켜에너지소비를촉진시킨다. 대부분의비만한 www.e-jkmr.org 9

김형구 Shambhunath Bose 김동일 구병수 김호준 사람들은경한정도의만성염증상태와중추및말초의 leptin 내성으로인해 leptin 농도가높다. 따라서 leptin 치는비만의지표가된다 24,25). 본실험에서 Leptin 유전자의발현정도는근육조직에서는 DC+FL, DC+Rosi 2개군에서통계적인유의성을나타내었다 (p<0.0001)(p<0.001). 앞의 2개군중 DC+FL 군이 DC+Rosi 군에비하여발현정도가더높게나타났다. Adipose 조직에서 Leptin 유전자의발현정도를관찰하였을때, DC+UFL, DC+FL, DC+ Rosi 의 3개군에서통계적인유의성을나타내었다 (p<0.01) (p<0.0001)(p<0.0001). 앞의 3개군중 DC+FL군이 DC+ Rosi군에비하여발현정도가더높게나타났다. Leptin 은다른생체내요인들에의해서많은영향을받으므로 leptin의인체내효과에대해서는아직도논란이많지만 32), 실험결과에서연잎-연근혼합발효물이 leptin 유전자발현정도의증가에어느정도의미가있다고생각된다. PPAR gamma는지방세포의전사조절분자중의하나이다. 이는지방세포의분화및지방합성과저장에관여하는효소들의발현을조절하는역할을하는데지방대사뿐만아니라대사증후군, 염증반응그리고동맥경화증에있어서여러가지유전자의발현을조절하는역할을한다고알려져있다 33,34). 또한말초조직에서인슐린민감도를항진시키는데있어서중요한기능을담당하는것으로예상되는데 PPAR gamma 작용제주입시에단백뇨의감소, 혈압강하효과및혈중지질대사에영향을준다는점과당뇨병치료제중 thiazolidinedione 계열에속하는 pioglitazone 이 PPAR gamma 작용제로서인슐린저항성을개선시켜혈당을조절한다는보고가이를뒷받침해주고있다 34,35). 본실험에서 PPAR gamma 유전자의발현정도는근육조직에서는 DC+FL, DC+Rosi 2개군에서통계적인유의성을나타내었다 (p<0.01)(p<0.0001). Adipose 조직에서는 DC+UFL, DC+FL, DC+Rosi 3개군에서 PPAR gamma 유전자의발현정도에통계적인유의성을나타내었다 (p<0.01)(p<0.001)(p<0.0001). 간조직에서 PPAR gamma 유전자의발현정도를관찰했을때, DC+FL, DC+ Rosi 2개군에서통계적인유의성을나타내었다 (p<0.00001) (p<0.001). 간조직에서는 DC+FL군이 DC+Rosi군에비해발현정도가더높게측정되었다. 역시연잎-연근혼합발효물이 PPAR gamma 유전자발현정도를높이는데의의가있다고볼수있다. Resistin은 11개의 cysteine 잔기를포함하는 94개의아 미노산으로구성된 12.5 kda 단백질로지방세포에서분비되는호르몬으로최근에발견되어졌다 36). 현재까지도연구자간의견차이가있기는하지만비만에의해지방세포에서의 resistin 의분비는증가되어지는것으로알려져있다 37). 본실험에서 resistin 유전자의발현정도는 Adipose 조직에서측정하였을때, DC+UFL, DC+FL, DC+ Rosi의 3개군이통계적인유의성을나타내었다 (p<0.01) (p<0.00001)(p<0.000001). 연잎-연근혼합물및혼합발효물이 Resistin 유전자발현정도를낮추는데의의가있다고생각할수있다. Visfatin 은여러연구들에서인슐린유사작용 (insulin mimetic effect) 을보인다고보고되었다 38). 자가분비 (autocrine) 와주변분비 (paracrine) 기능을통해성숙한지방조직의분화를촉진하고, 포도당수송과지방생성을통해지방의축적을촉진하며, 내분비기능을통해말초기관의인슐린민감성을조절한다고보고하고있다 39). 본실험에서 visfatin 유전자의발현정도는 Adipose 조직에서측정시, DC+UFL, DC+FL, DC+Rosi 의 3개군에서통계적인유의성을발견하였다 (p<0.01)(p<0.001)(p<0.00001). 연잎 -연근혼합물및혼합발효물이 visfatin 유전자의발현정도를높이는데어느정도의미가있다고볼수있다. 이번실험을종합하면, Glucose tolerance test와혈청내혈당검사시연잎-연근혼합발효물이혈당수치를감소시키는것을발견할수있었으며, Adiponectin, GLUT- 4, Leptin, PPAR gamma, Resistin, Visfatin의유전자발현정도를유의성있게각각증가, 감소시키는것을관찰할수있다. 이들은앞서설명하였듯이비만, 대사증후군, 혈중지질대사, 인슐린저항성, 인슐린민감성등에관여한다. 따라서이번연구에서는 in vitro 모델을통해연잎- 연근혼합물및혼합발효물이비만억제, 혈당조절및지질강하효과가있다는것을알수있었다. 또한연잎-연근혼합발효물이혼합물에비해좀더효과가있다는것을알수있었다. 추후지방세포의활성을억제시키는경로뿐만아니라인슐린과혈중지질조절의작용에관여하는다양한반응경로에대한추가적인연구가필요할것으로사료된다. 또한본연구에서이용된발효물질의보급및상품화를추진하기위해서는유산균과연사이에발생되는발효효과의안전성및추가적인약성에대한연구가필요할것으로생각된다. 10 J Korean Med Rehab 2014;24(1):1-12

연잎 - 연근복합발효물이흰쥐의내당능및지질대사관련유전자발현에미치는영향 결론»»» 고당식이를경구투여한 rat에연잎-연근혼합물, 혼합발효물, rosigitazone 을투여하여 Glucose tolerance 혈당, Adiponectin, GLUT-4, Leptin, PPAR gamma, Resistin, Visfatin 의유전자발현정도에미치는영향에대해다음과같은결론을얻었다. 1. 연잎-연근혼합발효물은 Glucose tolerance test 및혈당수치측정시, 혈당증가폭을줄여주는경향이있다. 2. RT-PCR 분석시, 연잎-연근혼합발효물을투여했을때, Adiponectin, GLUT-4, Leptin, PPAR gamma, Visfatin 유전자의발현정도가유의성있는증가를나타냈다. 3. RT-PCR 분석시, 연잎-연근혼합발효물을투여했을때, Resistin 유전자의발현정도가유의성있는감소를나타냈다. 4. 연잎-연근혼합발효물이비만억제, 혈당조절및지질강하효과가유의하게나타났으며연추출물의발효제재는비만으로부터비롯된전당뇨, 고지혈증등의대사증후군의치료약물로개발가능성이있을것으로생각된다. 참고문헌»»» 1. 대한당뇨병학회. 픽업의핵심당뇨병학. 서울 :EPUBLIC. 2006:2-4. 2. 안영민. 한방으로이겨내는당뇨병. 서울 : 홍신문화사. 2003: 14-6. 3. Centers for Disease Controland Prevention (CDC). Prevalence of overweight and obesity among adults with diagnosed diabetes-united states, 1988-1994 and 1999-2002. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 2004;53(45):1066-8. 4. Schwartz MS, Chadha A. Type 2 diabetes mellitus in childhood: Obesity and insulin resistance. J Am Osteopath Assoc. 2008;108(9):518-24. 5. Ioannidis I. The road from obesity to type2 diabetes. Angiology. 2008;59(2Suppl):39S-43S. 6. Kim SM, Yun HJ, Yi HS, Won CW, Kim JE, Park SD. Nelumbo nucifera leaves inhibit HASMC proliferation and migration activated by TNF-α. The Society for Herbal. 2009;24(4):77-86. 7. Kim CM, Shin MG, Lee KS, Ahn DG. Dictionary or oriental herbs. Seoul:Jeongdam. 1997:4623-5. 8. Professors in Dept. of Herbalogy, College of Korean Medicine College. Herbalogy. Seoul:Younglimsa. 1995:434. 9. Ling ZQ, Xie BJ, Yang EL. Isolation, characterization, and determination of antioxidative activity of oligomeric procyanidins from the seedpod of Nelumbo nucifera Gaertn. J Agric Food Chem 2005;53:2441-5. 10. Ko BS, Jun DW, Jang JS, Kim JH, Park SM. Effect of sasa borealis and white lotus roots and leaves on insulin action and secretion in vitro. Korean J Food SCI TECH- NOL. 2006;38(1):114-20. 11. Choi YK, Sul JU, Park SK, Yu SN, Kim SH, Rhee MS, Ahn SC, Shin MS. Research trends of fermented medicinal herb - based on their clinical efficacy and safety assessment. J Life Sci. 2012;22(12):1729-39. 12. Fineman MS, Bicsak TA, Shen LZ, Taylor K, Gaines E, Varns A, Kim D, Baron AD. Effect on glycemic control of exenatide (synthetic exendin-4) additive to existing metformin and/or sulfonylurea treatment in patients with type 2 diabetes. Diabetes Care. 2003;26:2370-7. 13. Tosi F, Muggeo M, Brun E, Spiazzi G, Perobelli L, Zanolin E, Gori M, Coppini A, Moghetti P. Combination treatment with metformin and glibenclamide versus single-drug therapies in type 2 diabetes mellitus: a randomized, double-blind, comparative study. Metabolism. 2003; 52:862-7. 14. Oudjeriouat N, Moreau Y, Santimone M, Svensson B, Marchis Mouren G, Desseaux V. On the mechanism of alpha-amylase. Eur J Biochem. 2003;270:3871-9. 15. Akuljaitrong S, Buddhakala N, Chomko S, Talubmook C. Effects of flower extract from lotus (nelumbo nucifera) on hypoglycemic and hypolipidemic in streptozotocininduced diabetic rats. International Journal of Scientific & Engineering Research. 2013;4(7):1441-6. 16. Yuk CS. Coloured medicinal plants of Korea. Seoul: Academy Book Co. Korea. 1990:219-30. 17. Wenigman M. Phyto therapie. Urban & Fischer. 1996:324-6. 18. Kim SB, Rho SB, Rhyu DY, Kim DW. Effect of nelumbo nucifera leaves on hyperlipidemic and atherosclerotic bio F1B hamster. The Korean Society of Pharmacognogy. 2005;36:229-34. 19. Jung YJ, Han DO, Choi BH, Park C, Lee HJ, Kim SH, Hahm DH. Effect of fermented herbal extracts, HP-1 on enzyme activities and gene expressions related to alcohol metabolism in ethanol-loaded rats. Korean J Oriental Physiology & Pathology. 2007;21:387-91. 20. Choi YK, Sui JU, Park SK, Yu SN, Kim SH, Rhee MS, Ahn SC, Shin MS. Research trends of fermented medicinal herbs based on their clinical efficacy and safety assessment. Jounal of Life Science. 2012;22(12):1729-39. 21. Cani PD, Bibiloni R, Knauf C, Waget A, Neyrinck AM, Delzenne NM, Burcelin R. Changes in gut microbiota control metabolic endotoxemia-induced inflammation in high-fat diet induced obesity and diabetes in mice. Diabetes. 2008;57(6):1470-81. 22. Park JH, Kim HJ, Lee MJ. The role of gut microbiota in www.e-jkmr.org 11

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