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The Korean Journal of Pathology 2008; 42: 94-9 비소세포암종의 Epidermal Growth Factor Receptor 발현과 EGFR 돌연변이와의관계 석상희 김미진 영남대학교의과대학병리학교실 Epidermal Growth Factor Receptor Expression of Non-small Cell Carcinoma and Its Relationship with Genomic Mutation Sang hee Seok and Mi Jin Kim Department of Pathology, Yeungnam University of College of Medicine, Deagu, Keorea 접수 : 2008년 1월 7일게재승인 : 2008년 4월 3일 책임저자 : 김미진우 705-717 대구광역시남구대명 5 동 317-1 영남대학교의과대학병리학교실전화 : 053-620-3334 Fax: 053-622-8432 E-mail: mjkim@ynu.ac.kr Background : It has recently been clarified that epidermal growth factor receptor (EGFR), which is a receptor tyrosine kinase of the erbb family, is abnormally activated in non-small cell lung carcinomas (NSCLC) and this fact is being utilized for creating targeted therapy. In this study, we aimed to identify the frequency of the EGFR expression and gene mutation in NSCLC, and to determine the correlation between them. Methods : Immunohistochemical staining for EGFR, C-erbB-2, cytokeratin 7, p53 and thyroid transcription factor-1, and EGFR mutation analysis were performed using paraffin-embedded archival tissue from 228 cases of NSCLC; this included 112 squamous cell carcinomas and 116 adenocarcinomas. Results : An EGFR expression and gene mutation occurred in 112 casees (53.5%) and 52 cases (22.8 %), respectively. EGRF mutation was more frequent in the adenocarcinomas than in the squamous cell carcinomas, in non-smokers than in smokers, and in females than in males. EGFR mutation was significantly associated with an EGFR protein expression, and especially in adenocarcinomas. Conclusion : The EGFR expression in NSCLC was associated with EGFR mutation, and especially in adenocarcinomas. More studies are needed to prove the clinical significance of the EGFR expression for creating targeted therapy to treat NSCLC. Key Words : Carcinoma, Non-Small-Cell Lung; Receptor, Epidermal Growth Factor; Mutation; Immunohistochemistry 폐암은전세계적으로암사망의주요한원인으로알려져있다. 미국의경우 2006년한해에만도 174,000명이폐암으로진단을받았으며, 이중에 162,000명이폐암으로사망한것으로추정되고있다. 1 원발성폐암의예후를평가하는데가장믿을만한인자는 TMN병기인데, 이는수술적절제나항암제, 방사선치료와같은보조요법으로치료하더라도 5년생존율이병기 IA환자 75%, 병기 IIIA환자 25% 로여전히불량하다. 2 암의발생은화학물질, 방사선, 바이러스를포함하는여러가지환경적인요인과종양유전자, 종양억제유전자, 세포자멸사와 DNA 복구에관련된유전자의변화등에관련되어있는데, 최근이러한암의분자적메커니즘을이해함에따라새로운치료법인, 표적치료가가능하게되었다. 3,4 즉많은악성종양에서 protein tyrosine kinase가중요한역할을하는것으로밝혀졌으며, 특히 erbb family의 receptor tyrosine kinase 인 epidermal growth factor receptor (EGFR) 이비소세포폐암종을 포함한많은상피세포종양에서비정상적으로활성화되어있고, 이 EGFR-tyrosine kinase의활성화가지속적인세포증식, 주변조직에대한침범, 원격전이, 혈관형성을일으키며세포생존을증가시킨다고밝혀졌다. 이에따라현재비소세포페암종치료에유용한 tyrosine kinase 억제제인 gefitinib (Iressa ) 와 erlotinib (Tarceva ) 가개발되어있는데, 이들은특히 tyrosine kinase domain의특정부위에돌연변이가있는경우에효과가좋다고보고되어있다. 5 그밖에 EGFR-tyrosine kinase inhibitor (TKI) 에대한반응을측정할수있는방법으로유전자복제수 (gene copy number) 와 EGFR의면역조직화학적발현 (protein immunohistochemical expression) 등도보고되어있으나이에는아직논란의여지가많다. 6 본연구에서는비소세포암종의 EGFR 발현율과돌연변이율및상호연관성을분석하고, 부수적으로 C-erbB-2, cytokeratin 7 (CK7), p53 그리고 thyroid transcription factor-1 (TTF- 94

95 비소세포암종의 Epidermal Growth Factor Receptor 발현과 EGFR 돌연변이와의 관계 1)을 포함하는 생물학적 표지자의 발현 정도를 조사하였다. 재료와 방법 2005년 9월부터 2007년 3월까지 영남대학병원 병리과에서 기 관지경 생검 및 침 생검으로 원발성 폐암이 진단된 비소세포폐 암종 228예(편평세포암종 112예, 샘암종 116예)를 대상으로 하 였다. 시행에 앞서 모든 조직을 % 중성 포르말린에 고정한 후, 파라핀블록을 만들고 각각의 조직에 대하여 EGFR (28-0005, 1:0, Zymed, San Francisco, CA, USA), C-erbB-2 (180111, 1:80, Zymed, San Francisco, CA, USA), CK7 (MP018, 1:30, Dako, Glostrup, Denmark), p53 (NCL-L-P53-D07, 1:200, Novocastra, UK) 그리고 TTF-1 (M3575, 1:40, Dako, Glostrup, Denmark) 항체를 적용하여 면역조직화학염색을 하 였으며, EGFR 돌연변이를 분석하였다. EGFR 돌연변이 분석 에는 1 cm2 면적, m 두께의 장 이상의 파라핀 조직을 이용하였으며, 파라핀 조직에서 genomic DNA를 추출하여 exon 18-24 중 선택 부위에 대한 PCR을 시행하였다. Sequencing 후에는 known/unkown mutation 또는 polymorphism 분석을 하였으며, 연구 대상의 병리 진단 보고서를 참고하고 보관된 조 직슬라이드를 재검토하여 조직학적 유형과 분화도를 조사하였으 며, 대상 환자의 의무 기록을 통해 나이, 성별 등 임상 양상과 병기를 분류하였다. 이때 EGFR과 C-erbB-2는 세포막에, p53와 TTF-1은 종양 세포의 핵에 그리고 CK7은 세포질에 짙은 갈색으로 염색되는 것을 양성으로 판독하였다. 또한, EGFR과 C-erbB-2의 발현 정 도를 염색이 된 종양 세포의 비율과 염색 정도에 따라 다음과 같이 판독하였다. 즉, 완전한 음성 반응과 극히 국소적이며 매우 희미한 염색 그리고 세포질에 염색된 경우를 0, 대부분의 조 직에서 암세포의 세포막 일부에 약하게 염색된 경우를 1+, 암세포의 세포막 전체가 중등도의 염색이 된 경우를 2+, 그 리고 암세포의 세포막 전체가 강하게 염색된 경우를 3+ 로준 A B C D E F G H I Fig. 1. EGFR, C-erbB-2, CK7, p53, and TTF-1 expression of non-small cell lung cancer (A) EGFR 1+, (B) EGFR 2+, (C) EGRF 3+, (D) CerbB-2 1+, (E) C-erbB-2 2+, (F) C-erbB-2 3+, (G) CK 7, (H) p53, (I) TTF-1.

96 석상희 김미진 정량화하였다 (Fig. 1). 한편, 연구결과는 SPSS프로그램 (Window 표준버전 11.0, SPSS Inc., IL, USA) 을이용하여분석하였으며, p값이 0.05 미만인것을통계학적의미가있는것으로하였다. 또한면역조직화학염색결과및유전자돌연변이검사결과의상관성검증에는 2 검정방법을사용하였다. 임상적특징 결 환자의임상양상은 Table 1과같다. 이때남녀의비는 2.6:1 ( 남성 165명, 여성 63명 ) 로남자가많았으며, 평균연령은샘암종이 64.67세 (±9.82세), 편평상피암종 67.96세 (±8.12세) 로샘암종환자가편평세포암종환자보다나이가적었다 (p=0.021). 또한편평세포암종환자의대부분은남자 (89.3%) 였지만, 샘암종에있어남녀의비는 1.3:1였다 (p=0.000). 그리고편평세포암종환자중 91.1% (2/112예) 가흡연력이있는반면샘암종 Table 1. Immunohistochemical expression and clincopathological features of non-small cell lung cancer Features (n=228) EGFR CK7 P53 TTF-1 C-erbB-2 Stage I-II (48) 24 29 23 19 4 (50.0) (60.4) (47.9) (39.6) (8.3) III-IV (180) 98 115 97 70 27 (54.4) (63.9) (53.9) (38.9) (15.0) Sex Male (165) 86 87 91 48 17 (52.1) (52.7) (55.2) (29.1) (.3) Female (63) 36 57 29 41 14 (57.1) (90.5)* (46.0) (65.1)* (22.2)* Tumor type Squamous cell 71 39 66 9 3 carcinoma (112) (62.3) (34.8) (58.9) (8.0) (2.7) Adenocarcinoma 67 5 54 80 28 (116) (57.8) (90.5)* (46.6) (69.8)* (24.1)* Differentiation Well (62) 29 50 23 45 17 (46.8) (80.6)* (37.1) (72.6)* (27.4)* Moderate (65) 36 24 42 14 8 (55.4) (36.9) (64.6) (21.5) (12.3) Poor (1) 56 69 55 29 6 (55.4) (68.3) (54.5) (28.7) (5.9) Age 65 (80) 44 54 35 34 13 (55.0) (67.5) (43.8) (42.5) (16.3) > 65 (148) 78 90 85 55 18 (52.7) (60.8) (57.4) (37.2) (12.2) EGFR, epidermal growth factor receptor; CK7, cytokeratin 7; TTF-1, thyroid transcription factor-1. *p-value <0.05. 과 환자중에서는 54.3% (63/116예) 만이흡연력이있었으며 (p= 0.000), 조직학적인형태에따른 TNM병기의차이는없었다 (p=0.151). 면역조직화학적발현원발성비소세포폐암종의면역조직화학염색양상은 Fig. 1과같다. EGFR, C-erbB-2, CK7, p53 및 TTF-1의발현율은각각 53.5%, 12.2%, 61.3%, 57.1%, 42.4% 였는데, 특히 EGFR의발현빈도는샘암종보다 (49.4%) 편평세포암종 (59.8%) 에서더높았다. 그러나이는통계적으로유의한차이는아니었다 (p= 0.060). C-erbB-2는여성 (22.2%, p=0.022), 샘암종 (24.8%, p=0.000) 그리고고분화암종 (27.4%, p=0.001) 에서발현빈도가높았으며, CK7, TTF-1도각각여성의 90.5% (p=0.000) 와 65.1% (p=0.000), 샘암종의 92.1% (p=0.000) 와 69.6% (p= 0.000), 그리고고분화암종의 80.6% (p=0.000) 와 72.6% (p= 0.000) 에서높게발현되었으나, TNM병기, 나이와는통계학적인의미가없었다 (Table 1). p53 발현율은어떤변수와도유의한관계를보이지않았다. EGFR 돌연변이양상및면역조직화학적발현과의관계 228예의비소세포폐암종중 22.8% (52/228예) 에서 EGFR 돌연변이가관찰되었는데, 편평상피암종과샘암종이각각 14.3% (16/112예) 와 31.0% (36/116예) 에서돌연변이를보여통계적으로유의한차이를나타내었다 (p=0.003). 한편, 돌연변이는여성 (41.3%, 26/63예, p=0.000) 과비흡연자 (36.5%, 23/63예, p=0.002) 에서많이관찰되었는데, 성별과흡연유무에대한이러한차이는편평상피암종보다샘암종에서뚜렷하게나타났다. 특히, 편평상피암종에서는여성 33.3% (4/12예) 와남성 12.0% (12/0예) 에서 EGFR 유전자돌연변이가관찰되었으며 (p= 0.068), 비흡연자.0%(1/예 ) 와흡연자 14.7% (15/2) 에서유전자돌연변이가관찰되었다 (p=1.000). 그러나샘암종에서는여성 43.1% (22/51예) 와남성 21.5% (14/65예) 에서유전자돌연변이가관찰되었고 (p=0.013), 비흡연자 41.5% (22/53예) 와흡연자 22.2% (14/63) 에서유전자돌연변이가관찰되었다 (p=0.025). 또한, 돌연변이검사와면역조직화학염색에서단백발현과돌연변이결과가일치를보인경우는 124예 (54.4%) 였으며, 두검사에서불일치를보인 4예중에서돌연변이검사는음성, 면역조직화학염색에서는양성을보인예는 87예 (83.7%) 였고, 돌연변이검사는양성, 면역조직화학염색에서는음성을보인예는 17예 (16.3%) 였다. 특히, EGFR 돌연변이가없는군 (49.4%, 87/176예 ) 보다유전자돌연변이가있는군 (67.3%, 35/52예 ) 에서 EGFR 단백발현이나타나는예가더많았으며 (p=0.023), 샘암종에서 EGFR 유전자돌연변이와 EGFR 단백발현은강

비소세포암종의 Epidermal Growth Factor Receptor 발현과 EGFR 돌연변이와의관계 97 EGFR mutation (%) 40 35 30 25 20 15 5 0 35 Adenocarcinoma* 31.6 Squamous cell carcinoma 11.3 Never* 28.8 Ever Histology Smoking Sex 14 Female* 37.1 Female Male 12.1 *p<0.05 A EGFR mutation (%) 50 45 40 35 30 25 20 15 5 0 Never* Ever 41.5 22.2 Smoking Female* Male 43.1 21.5 Sex *p<0.05 B 30 EGFR mutation (%) 25 20 15 5 0 Never Ever 14.7 Smoking 33.3 Male 12 Sex C Fig. 2. Clinicopathological features and EGFR mutation. (A) There is a significant difference between the parameters including histologic type, smoking, and gender, and EGFR mutation in NSCLC. (B) There is a significant difference between the parameters including smoking, and gender, and EGFR mutation in adenocarcinomas, (C) but not in squamous cell carcinomas. 한연관성을보여주었다 (p=0.017) (Fig. 2). 고찰 ErbB-1 또는 HER-1이라고도알려진 EGFR은 ErbB/HER family에속하는 170-kDa tyrosine kinase receptor로 19 리간드와결합한후이합체를형성하고, tyrosine kinase (TK) domain 의 autophosphorylation에의해활성화된다. 그후다양한하류경로로신호를전달하고, 그것에의하여세포증식, 침투, 전이와혈관형성에영향을주며세포사멸을억제한다. 20 EGFR의단백과발현, 유전자증폭또는비정상적인활성화를포함한 EGFR 이상은많은형태의암종에서검출되는데, 특히호흡기의경우기관지편평상피의형성이상병변에서 EGFR 발현의증가가관찰되었다. 또, EGFR 돌연변이샘암근처의정상조직내에서도 EGFR TK domain의돌연변이가관찰되었는데, 이는 EGFR 신호가폐암의초기발병기전에서중요한역할을한다는것을암시하는것이다. 21 한편, 비소세포폐암종의 EGFR 발현은 27% 에서 83% 까지다양하게보고되고있으며, 22 예후에미치는영향에대한연구결과는다양하다. 23 EGFR 과발현은주로편평세포암종에서나타나며 (60-85%), 샘암종과대세포암종에서는그정도가낮다 (-50%). 24 이연구에서 EGFR은비소세포폐암종 228예중 53.5% (122예) 에서발현되었으며, 편평세 포암종이 59.8% 로샘암종 47.4% 에비해발현율이높았지만, 유의한차이는아니었다 (p=0.060). 또한앞선다른연구들과마찬가지로조직학적분화도나병기와도통계학적유의성이관찰되지않았다. 25 한편, EGFR이폐암의형성에중요한역할을한다는근거하에 EGFR을암치료에이용하기위한많은시도가이루어졌는데, 가장많이연구된것이 EGFR의 TK domaim 억제제이다. 26 이러한표적치료의효과를최대한향상시키기위해서는해당약물에반응이좋은환자군을선택하는것이중요한데, 현재까지 EGFR TK inhibitor (TKI) 에대한치료반응을예측하는독립인자로인정받고있는것은동아시아인과샘암종그리고비흡연자와여성이다. 27 이연구에서 EGFR 유전자돌연변이빈도는샘암종 (31.0%, p=0.003), 여성 (41.3%, p=0.000) 그리고비흡연자 (36.5%, p=0.002) 에서높게나타났으며, 성별과흡연력에서의 EGFR 유전자돌연변이의빈도차이는샘암종에서현저하게나타났다. 샘암종은비흡연자에서가장흔히나타나는형태의암인데, 1,000 증례이상의샘암종을분석했을때, 비흡연자의 55%, 흡연자의 17% 에서 EGFR 유전자의돌연변이가나타났다. 28 또남성 (14%) 보다는여성 (45%) 에게서더흔하게돌연변이가나타났다. 29 이러한 EGFR 돌연변이에서성의역할은아직밝혀지지않았지만, 에스트로겐을포함한성호르몬이관여할것이라는보고가있다. 30

98 석상희 김미진 한편, 대부분의연구에서 EGFR 돌연변이가있는비소세포폐암종환자는 EGFR TKI 치료에대한반응정도가 65-0% 라고보고되고있는데, 31 Hirsch와 Capppuzzo 등도폐암에서 TKI 에대한반응의예측인자로 EGFR의조직내발현을실험하였다. 이연구에서 Hirsch 등 32 은비소세포폐암종에서 EGFR 유전자 copy number와단백발현사이의뚜렷한일치를보고했으며, Capppuzzo 등 33 은 EGFR 발현이 TKI 감수성과밀접하게관련이있음을보고하였다. 특히, 이연구에서는 EGFR 유전자돌연변이와 EGFR 단백발현과의상관성을살펴보았는데, 유전자돌연변이가있는군이돌연변이가없는군보다 EGFR 단백발현의빈도가높게나타났으며, 통계적으로도유의한차이를보였다 (p=0.023). 또한, 샘암종에서 EGFR 유전자돌연변이와 EGFR 단백발현이강한연관성을보였는데, 34 이것은편평상피암종에서 EGFR 유전자증폭과 EGFR 단백발현이강한연관성을보인것과는상반되는결과이다. 따라서앞으로 FISH 등의유전자증폭검사를추가하여 EGFR 유전자돌연변이, 유전자증폭, 단백발현사이의상관관계및생존율에미치는영향등을연구해야할것이다. 한편 C-erbB-2는 erbb (HER) family 중하나인종양단백으로인간의다양한암에관여하는데, 그중유방암에서가장집중적으로연구되고있다. 7,8 이종양단백이활성화되면성장인자와비슷한방법으로세포분열을촉진하며, 원발성유방암의 25% 에서 30% 까지과발현된다. C-erbB-2의과발현은주로고등급의유방암과관련이있으며림프절전이가있는유방암환자에게중요한예후인자로인정받고있다. 9, 이 C-erbB-2는비소세포페암종 30% 이상에서발현되었다고보고되었으나, 11 이연구에서는단지 13.6% 에서만발현되었다. 이러한차이는각연구기관마다사용한검사방법의차이때문일수있는데, 본연구에서는유방암을진단하기위하여개발된면역조직화학염색법을사용하였고, 가장흔히사용하는점수계산기준 (scoring criteria) 을적용하였다. C-erbB-2의발현은암종의유형과도관련이있는데, 본연구에서는편평세포암종 (2.7%) 보다샘암종 (24.1%) 에서 C-erbB-2 의발현율이높았고, 최근발표된연구에서도주로샘암종에서더높게발현되었다고보고되고있다. 12 또한, C-erbB-2의과발현이분화가나쁜종양에서더흔히나타난다는연구결과도있는데, 9 본연구에서는 C-erbB-2 발현이고분화암종에서더높게나타났다. 하지만이는 C-erbB-2의발현율이낮고증례수가적기때문에나타난결과일수있으므로, 더많은증례로다시연구할필요가있을것이다. TTF-1은원래는 thyroglobulin과 thyroperoxidase 유전자의갑상선특이전사촉진자로, 성인의폐의 2형허파꽈리세포 ( 과립허파꽈리세포 ) 와무섬모기관지세포에서발견된다. 13,14 최근 TTF-1은원발성폐암과전이성폐암의진단을위한표지자로사용되고있는데, 특히전이성샘암종의원발장소가폐라는것을밝히는데 15 그리고흉막중피종과원발성폐암을감별하는 데유용하게사용되고있다. 16 이연구에서 TTF-1의과발현은편평세포암종 8.0%, 샘암종 69.8% 로샘암종에서더높게나타났으며, 특히고분화샘암종에서더높게나타났다. 한편, TTF-1은 SP-A, SP-B, SP-C, 그리고 -kda 클라라세포유전자촉진자를포함하는폐분화에관여하는유전자의조절과밀접한관련이있는데, 이는 TTF-1 발현이세포분화와관련되어있다는가설을뒷받침한다. 17 특히갑상선종양에서 TTF-1 발현은고분화갑상선암에만한정되어있는반면, 생물학적으로공격적인악성갑상선암에서는보통 TTF-1은발현되지않는것으로알려져있다. 18 이연구에서는 TTF-1이저분화암종보다는고분화암종에서더흔히발현된다는것을알수있었다. 결론적으로, 228예의비소세포폐암종에서 53.5% 의 EGFR 단백발현과 22.8% 의 EGFR 유전자돌연변이를확인하였으나, EGFR 단백발현은예후예측인자로생각되는비소세포폐암종의조직학적유형, 분화도, 병기와유의한관계가없었다. 그러나 EGFR 단백발현이 EGFR 유전자돌연변이와는유의한상관성을보였으며, 특히샘암종에서더욱뚜렷한양상을보였다. 하지만이결과를비소세포폐암종의 EGFR TKI 치료반응에대한예측인자로적용하기에는더많은연구가필요할것으로생각된다. 참고문헌 1. Jemal A, Siegel R, Ward E, et al. Cancer statistics, 2006. CA Cancer J Clin 2006; 56: 6-30. 2. Mountain CF. The international system for staging lung cancer. Semin Surg Oncol 2000; 18: 6-15. 3. Herbst RS. Targeted therapy in non-small-cell lung cancer. Oncology 2002; 16 (9 Suppl 9): 19-24. 4. Massarelli E, Herbst RS. Use of novel second-line targeted therapies in non-small cell lung cancer. Semin Oncol 2006; 33 (Suppl 1): S9-19. 5. Paez JG, Janne PA, Lee JC, et al. EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy. Science 2004; 304: 1497-500. 6. Prudkin L, Wistuba II. Epidermal growth factor receptor abnormalities in lung cancer: pathogenetic and clinical implications. Ann Diagn Pathol 2006; : 306-15. 7. Jacobs TW, Gown AM, Yaziji H, Barnes MJ, Schnitt SJ. Specificity of HercepTest in determining the HER-2/neu status of breast cancers using the United States Food and Drug Administration-approved scoring system. J Clin Oncol 1999; 17: 1983-7. 8. Fernandez Val JF, Losada J, Arregui Murua MA, Sarria R. Cell proliferation, nuclear ploidy, and EGFR and HER2/neu tyrosine kinase

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