대한임상병리사회지 : 제 25 권 1 호 1993 신생겸조직의 Acid fuchsin orange G(AFOG) 및 Masson s trichrome 염색의비교연구 연세대학교의과대학뱅리학교실 최연일 Key words : AFOG, Trichrome, Kidney 1. 서론 사구체질환은주요한신장병의하나로만성 사구체신염은만성신부전의가장흔한원인이 다. 사구체는혈장을초여과 (ultrafiltration) 하 여노폐물을걸러내는역할을하며, 이러한과 정중에서혈액내의면역복합체가사구체에 걸리거나또는사구체에존재하는항원에의해 면역반응이유발된다 1, 2) 사구체신염은대부분면역학적기전에의해 유도되는데, 이의진단을위해서는생검된조 직내특히사구체내에서면역물질의침착을 증명하는것이중요하다. 일반적으로사구체신 염을의심하는경우에는파라핀에포매된조직 절편으로특수염색을시행하게되는데, 통상적 으로 hema toxy lin---bosin 외에 periodic acid schiff (P.A.S. ), trichrome 및 P.A.S.-methenamin sliver 염색을시행한다 1) 이러한특수염색 은각기장점이있으며특히면역물질의침착 여부를관찰하기위하여 trichrome 염색이시 행되어왔다. 한편일종의교원질염색법인 acid fuchsin orange G(AFOG) 염색은신장생 겸시 trichrome 염색대신널리쓰이는염색법 으로 trichrome 염색에비해면역물질의검출 이더뚜렷하나 ph 에예민하다고알려져있다. 따라서저자는신장생검을시행하여면역 복합체에의한사구체신염으로진단된예에서 Masson s trichrome 3 ) 및 AFOG 염색을 4 ) 시행 하여두염색법의장 단점과특히 AFOG 용액 의 ph 변화에따르는결과를비교하여보고자 하였으며염색결과에미치는요인을찾아염색 성의특이성과민감성을높이고자이실험을 시행하였다. 1. 실험조직의선정 Il. 연구대상및방법 연세대학교의과대학병리학교실에의뢰된 신장생검조직중면역복합체의침착이확인 된사구체신염환자의생검조직 13 예를선별 하였다. 이예들은 IgA 신염 9 예, 낭창성신염 4 예였다. 2. 염색방법 신조직은 10% 포르말린에고정하고일반적 인파라핀침투과정을거쳐 3"'4μm 두께의연 속절편을각각 4 장씩만든후 Masson s trichrome 염색법과 AFOG 염색법으로염색하 였다. 1) 염색액의제조 CD Trichrome 염색용액 i) Bouin 용액 Picric acid, saturated aqueous sol.... 750ml 37-40% formalin... 250ml 빙초산... 50ml h u 1 i
ii) Weigert s iron hematoxylin A 용액 Hematoxylin... 1 g 90 % ethanol... 100ml B 용액 29% ferric chloride... 4ml 36% HCl... 1ml A:B 용액 = 1:1 혼합사용 iii) Bibrich scarlet-acid fuchsin 용액 1 % Bibrich scarlet... 90ml ix ) Phosphomolybdic-phosphotungstic acid 용액에서 10 분간염색 x) 수세 xi) Aniline blue 에서 5-10 분간염색 외 i) 수세 xiii) 95% 알콜과무수알콜에서탈수시키고, xylene 에서투명시킨후봉입한다. @ AFOG 염색 i ) 탈파라핀시키고함수시킨다. ii) Bouin 용액에하룻밤방치시킨다. 1 % acid fuchsin... 10ml iii) Weigert s iron hematoxyilin 에 10 분간염 벙초산... 1ml 색 iv) Phosphomolybdic-phosphotungstic acid 용액 Phosphomolybdic acid... 5 g Phosphotungstic acid... 5 g 증류수... 200ml v) Aniline blue 용액 Aniline blue... 2.5 g 빙초산... 2.0ml 증류수... 100ml @ AFOG 용액 i ) Weigert s iron hematoxylin ii) 1 % phosphomolybdic acid 용액 iii) AFOG 용액 Aniline blue 1 g 을증류수 200ml 에끓여녹 인다음, 차게석혀셔 orange G 2 g 과 acid fuchsin 3 g 을더하여녹인다. 이때 ph 1. 09 로맞추어제조한다. 2) 염색방법 CD Masson s trichrome 염색 i ) 탈파라핀사키고함수시킨다. ii) Bouin 용액에 56 V C 에서 1 시간두거나 실온에서하룻밤둔다. 둔다. iii ) 노란색이빠질때까지수세시킨다. ψ) 증류수에행군다. v) Weigert s iron hematoxylin 에서 10 분간 vi) 수세 vii) Biebrich scarlet-acid fuchsin 용액에 10 분간염색 viii) 수세 iv) 1 % HCl 알콜에서감별시킨다. v ) 따뜻한알칼리용액에잠시둔다. vi) 1 % phosphomolybdic acid 에 5 분간염색 시킨다. 띠 i) 수세 viii) AFOG 용액에서 5 분간염색시킨다 ( 이때 ph 에따라나눈용액으로각각염색한다 ). ix) 수세 x) 95% 알콜과무수알콜에서탈수시키고 xylene 에서투명시킨후봉입한다. m. 결과 신장생검조직을 AFOG 염색용액으로염색 한전예에서사구체내면역복합체가붉게염 색되었다. 이러한염색정도는신선한염색용액 (ph 1. 09) 을사용시가장강하였으나제조후 10 일정도경과한 AFOG 용액 (ph 1. 37) 으로 염색한것도비슷한결과를나타냈다. 또 ph 1. 37 의 AFOG 용액을이용하여 5 분간염색한 것파 20 분간염색한결과도비슷하였다. 그러 나더오래경과된 ph 1. 51 의 AFOG 용액으 로염색시염색성이현저히떨어졌다. Trichrome 염색법으로염색시기존의면역복합체 는붉게염색되었으나주변조직이붉게염색되는경향이있었다. 세뇨관 (tubule) 의세포질은 AFOG 염색법으 로염색시짧은오렌지색으로염색되나 trichrome 염색법으로염색한것은붉게염색되 었다. 세뇨관내재흡수된단백질은 AFOG 염
색시붉은과립상으로염색되었으나, trichrome 염색법으로는단백질이없는경우와있는경우 모두붉게염색되어구분이힘들었다. 이외에조직내적혈구는 AFOG 염색법에의 AFOG 염색법으로염색시세뇨관의세포질은 짧은오렌지색으로, 세뇨관내재흡수된단백질 은빨간색으로염색되어재흡수된단백질이없는경우에도세뇨관의세포질이전반적으로붉 한염색결과, 노란 - 오렌지색 (yellow-o r ange) 게염색되는 trichrome 염색보다감별력이우 으로염색되어다른조직들과구분이확실하수하였다. 나, trichrome 염색법으로시행한것은적혈구 AFOG 염색이 ph 에민감하다고하여 10 일 까지빨간색으로염색되어 fibrin thrombi 와의 구분이명확지않았다. 그러나, 결체조직에대 한염색은두방법모두푸르게염색되었고판독이용이하였다. N. 고찰 사구체신염은대부분면역학적기전에의해 유발되며이경우사구체내조직학적변화와 함께면역물질들이침착하게된다 12) 사구체신염시조직학적변화는백혈구침 윤, 사구체기저막비후및맥관기질의확장, 초자양화및경화등이있으며이러한 4 가지 조직반웅이섞여서나타나게된다. 조직학적 변화및면역물질의검색을위하여신생겸조의한큰조직절편에서의염색성과비교하였는 직에일괄적으로광학현미경검사, 면역형광 현미경검사및전자현미경검사를시행하게 된다. 사구체신염을진단하는방법중광학현미 경검사의주요수단의하나인특수염색으로는 P.A.S., trichrome, P.A.S.-methenamine sliver 법 이널리이용되어왔으며, 이중 trichrome 염 색법은결체조직및면역복합체를검출해내 는데사용되어왔다 1.2) AFOG 염색법은 trichrome 과함께널리이용 되는결체조직염색법으로본연구에서는이두 염색법의장 단점을비교하여보고자하였다. 본연구에서는이두가지의결체조직염색 을시행하여비교한결과 AFOG 염색및출이용이하였다. trichrome 염색모두사구체내면역복합체가 검출되었으나 trichrome 염색의경우일부의 맥관기질도붉게염색되는경향이있어위양성 으로판정될위험성이있고또는면역복합체 가소량있는경우 AFOG 염색에비해검출의 민감도가떨어질것으로생각되었다. 또한 ω정도경과된 ph 1. 37 의 AFOG 용액을이용, 동시에염색한결과큰차이점이없었으며, 염 색시간을통상의 5 분및 20 분으로연장시킨 결과도비슷한염색성을나타냈으나 10 일이 상지난 ph 1. 51 의용액으로염색한것은염 색성이현저히떨어졌다. 이러한결과는신선 한 AFOG 용액이가장좋기는하나 10 일정도 경과시에도비교적안정된염색성을보이는것 으로생각되었으나 10 일이상지난 ph 1.51 정도된용액의염색성의안정성이현저히떨어 진것으로나타났으며, 특히 fuchsin 의염색성이 떨어진것으로생각되었다. 그러나결체조직의 염색성은두염색모두에서별차이가없다. 대부분의조직이생검조직이어서신절제술에 데, AFOG 염색결과신절세술에의한대절편 에서는세뇨관내오렌지 G 염료의염색성이 떨어지긴하였으나 fuchsin 염료는제대로염 색되어질환판정에는큰문제가없을것으로 생각하였다. V. 결론 사구체신염으로진단된예에서생검조직을 이용하여 trichrome 염색과 AFOG 염색법을 시행, 상호비교하여다음의결과를얻었다. 1. AFOG 염색법은 trichrome 염색법보다 사구체내존재하는면역복합체나단백질의검 2. AFOG 염색용액은 ph 1.09 용액이 ph 1. 37 정도된용액보다염색성이우수하나, 큰차 이는없었다. 그러나 ph 1.51 용액은염색성이 현저히떨어졌으며특히 fuchsin 의염색성이 떨어졌다. 3. Trichrome 염색은사구체내침착된단백여
~' t?1 ~ * -u ~11 ~ "-1l.h. :t! ~ "-11.. ~' "-1l.h. -11- ~ ~ :3f.@ 1t!- ~ ~, ~ ~ -T ~ 5!.. ~ ~?>1 "-11.. 1} * ~1 ~ 0lj ~ <>l ~ * ~ 0 cf~ til Ji!.7} ~ ~ q, 4. AFOG ~ 0lJ -"1 A~~~~.!i!. t1- ~ 11 All ~ojl -"1 ~.g_ ~ ~ ~ "-11.. ~ ~ 0lj Ad 0 1 ~ <>l?:1 Y- ~ lt!-ojl ~ ~ OJ "0-J g_ Pl7.l?:1?J",C q. 5. ~ ~11 ~ ~ ojl ~ ~ ~ 0lJ,<?_ f tij-!:fj 5!.. f ~. _ ~1 ~ 0lJ ~ ~ jl!--& 0 1 % 0 1 i>} ~ t1-. 01 AJ- ~ ~ :i!} ~ ~ -u i>} t?1 AFOG ~ 0lJ!:fj 01 t?1 ~ * -u ~11 Ad A }T ~11 ~ ~ ojl -"1 t?} ~ * -u ~11 ~ ~ 1t!- ~ ~ ~ ~ * ojl 4-T ~ Ad ~ g_ ~ ~ _2_ ~, AFOG ~ 0lj %~ ~ ph ~ 1-oJl rr}.s~ ~ 01J ~ :i!},c. ph ojl ~ OJ -o-j% ~ _2_ E... ph ~ } ojl -? ~ -e>}01 01= ~q. A Comparative Study on Trichrome and Acid Fuchsin Orange G Staining in Renal Biopsy Choi, Yon II Dept. of Pathology, Y onsei University College of Medicine ABSTRACT Trichrome and acid fuchsin orange G(AF OG) staining were performed simultaneously in 13 immune complex mediated glomerulo-nephritis(9 IgA nephritis and 4 lupus nephritis) for the detection of immune complex and protein. The results are as follows ; 1. Immune complex and protein droplets were detected in glomeruli more easily by AFOG stain than by trichrome stain. 2. The best result could be obtained in AFOG solution at ph 1.09, but also good at ph 1.37. The AFOG solution at ph 1.51, however, did not show good staining of the fuchsin dye. 3. Immune complex, protein droplets m glomeruli and tubular cytoplasms and red blood cells all stained red by trichrome stain, which was difficult for proper analysis. 4. Large sections showed less stainability of fuchsin dye than biopsy tissue by AFOG staining methods. 5. Connective tissue were stained blue by both methods and did not show any difference. These results indicate that AFOG is superior to trichrome stain for the detection of immune complexs in renal biopsy, however, we should be careful when adjusting ph of AFOG solution. References 1. ~ ~ ~ 2.j " :} l : ~ 2.j " :}, jl~l-}, pp.879-888, 1990. 2. Cotran R.S., Kumar V., Robbins S.L. : Robbins pathologic basic of disease, 4th edition, W. B. Saunders Co. 1989. 3. Luna L.G : Manual of histology staining methods of the A. F. I. P. 3rd edition, Me Graw-Hill Book Co. pp.94-95, 1968. 4. Zollinger H.U., Mihatsch M.J. : Renal biopsy in pathology, Springer-Verlag, pp.10-ll, 1978. -64-
Subendothelial as well as subepithelial & mesangial fuchsinophlic deposits in lupus nephritis(afog, x400) Massive protein reabsorption droplets in the tubular cytoplasm(afog, x400) Granular fuchsinophilic deposits predominantly in the glomerular mesangium in lga nephropathy(afog, x400) -65-