플라보노이드리나린배당체의염증제어능탐색 김우기경희대학교식품생명공학과 1. 서론 1.1. 연구배경 만성염증성질환의치료및완화를위하여전통적으로괴곽( 회화나무) 추출물을사용하여왔으나, 그효과물질및작용기작에대한규명은미흡한실정이다. 일부연구에서는플라보노이드류인 리나린(Linarin) 및그배당체가괴곽에다량존재하며다양한생리활성을나타냄이보고되었으나, 항산화능을비롯한일반적플라보노이드류의분석연구에집중되어왔다. 한편, 대식세포(macrophage) 는 싸이토카인의분비로인한선천적면역기작뿐아니라, T-세포의활성화를통한후천석면역기작도 제어하는세포이며, 일부연구에서리나린의염증억제능이보고되었으나, 선천적면역기작모델에 연구가집중되어있다. 따라서, 본연구에서는선천적및후천적면역기능을포괄하는리나린의 항염증기작의연구를수행하였다. 44 2015년기초연구과제총서
1.2. 리나린(Linarin) 리나린은주로감국, 구절초, 엉겅퀴등국화과식물에다량포함되어있으며, acacetin 7 번 탄소의위치에 rutinose 가결합한 flavonoid glycoside 이다. 항산화, 항알러지, 항아세틸콜린에스터 레이즈효과가있음이보고되고있다. 그림 1. 리나린구조 1.3. 리나린의기능성연구 리나린은식물유래의플라보노이드로서다양한질병모델에서그기능성이탐색되어왔다. 예를 들면, Zhang 등은허혈재관류손상모델에서리나린에의한항염증효과를연구하였으며, Arul등은 피부암모델에서리나린의항암효과를연구하였다. 또한, Yoon등은류마티즘관절염모델에서 리나린의항염증성을보고하였으며, 2011년에는리나린을유효성분으로포함하는화상치료용 조성물의특허가출원되었다. 또한, 생리활성의조절능에더하여손등은생쥐모델의경골골절 치료에서리나린이기계적강도에미치는영향을연구함으로써, 그다양한기능이보고되었다. 나아가, Ge 등은보리수나무류에서리나린및그배당체분리하여보고하였으며, 해조류에서의 리나린배당체의분리및정제과정도 Chen 등에의하여보고되었다. 또한, 정등은홍화의플라보 노이드성분을분리및분석하여그항산화능을보고하였다. 플라보노이드리나린배당체의염증제어능탐색 45
1.4. 염증 그림 2. 염증과만성질환류의상관관계 (http://altered-states.net/barry/newsletter611/) 염증(inflammation) 이란병원균, 손상조직등의유해작극제에대한생체의복합적면역반응을 총칭한다. 따라서, 정상적인염증반응은생체의방어기작으로서, 면역세포, 혈관조직, 그리고기타 신호전달물질들이상호협력적으로작용한다. 염증반응의궁극적목적은손상조직및병원균의 제거를포함하여손상조직의복원까지포함한다. 전형적인급성염증의증상은통증, 국소발열, 홍반, 부기등을동반하며정도에따라조직의기능상실까지포함한다. 46 2015년기초연구과제총서
1.5. 대식세포 그림 3. LPS 에의한대식세포염증반응기작 (Biochemical Pha, 2006) 대식세포(Macrophage) 는면역세포의한종으로서개체의염증반응을통한방어기작의역할을 하고있다. 박테리아등의외부의감염원의침투에의해염증이유발된조직으로대식세포를포함한 단핵구세포들이보내지고이단핵구세포들은대식세포또는수지상세포로분화하여염증반응을일으키고감염원을제거한다. 한편이러한우리몸의방어목적과는다르게과활성된대식세포는만성염증질환의주요한요인으로알려져있다. 비만의경우과체중으로인하여지방조직에대식세포가축적되어지고이렇게축적되어진대식세포에서는많은사이토카인이생성되어조직에만성염증을유발하고그중 TNF-α는지속적으로염증에연결된세포내신호전달을활성화시켜인슐린에의한신호전달을방해하고결과로 2 형당뇨를유발하는주요한요인으로보고되어져있다. 만성장염증질환과관절염에서도또한대식세포의축적이보고되어지고있고대식세포에의해생성된사이토카인이염증에관여하는것으로알려지고있다. 유전자치료는 RNA 간섭또는특정유전자를발현하는플라스미드를치료제로사용하는것으로이러한유전자치료제자체는질병에 플라보노이드리나린배당체의염증제어능탐색 47
연관된조직에만전달이될수없고또한대부분이혈류에서도불안정하다는문제점을안고있다. 본연구에서는 sirna 또는 DNA 플라스미드와결합을할수있는 9아르기닌과말단에시스테인기를포함한단일사슬항체를 disulfide 결합을시켜대식세포표적유전자전달체를개발하고 in vitro 상에서유전자복합체형성능력과세포부착, 세포유입향상을검증하였다. 1.6. 연구의목적 본연구는식물유래의리나린배당체의섭취로대식세포활성억제를통한선천성, 후천성면역기능제어의기작을연구함으로써, 염증성질환군의완화및예방의기능성원료로써의가능성을탐색하고자하였다. 최종연구목표 식물유래의리나린배당체의섭취로대식세포활성억제를통한선천성/ 후천성면역기능제어의기작을연구함으로써, 염증성질환군의완화및예방의기능성원료로서의가능성을탐색함. 제1 세부목표제2 세부목표 리나린배당체가대식세포의염증성및항염증성사이토카인분비를통한선천성면역기능에미치는영향에관한연구 리나린배당체가대식세포의식세포작용및 T-림프구활성화를통하여후천성면역기능에미치는영향에관한연구 2. 실험방법 2.1. 실험재료및기기 리나린은황색분말로서 ( 순도 98% 이상) ChemFaces 사 (Hubei, China) 에서구입하여사용하였다. Dulbecco s modified Eagle s medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), antibiotic antimycotic solution 은 Hyclone 사 (GE Healthcare, Logan, UT, USA) 에서구입하였으며, tumor necrosis factor (TNF-α), interleukin 1 β (IL-1β), interleukin-6 (IL-6) ELISA kits는 BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) 에서구입하여제조사의매뉴얼에따라측량하였다. Dimethylsufoxide (DMSO), ㅣipopolysaccharide (LPS), ethanol, microspheres 48 2015년기초연구과제총서
(Latex-beads), 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyltetrazolium bromide (MTT), N-1-naphthylethylene diamine, sulfanilamide, phosphoric acid, yellow green microspheres (Latex-beads), phosphate bufferde saline (PBS) 등은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) 에서구입하여사용하였다. 세포표면의마커염색을위하여 anti-mouse CD16/CD32 purified, anti-mouse MHC class Ⅱ-APC, anti-mouse CD80-FITC 항체들은 ebioscience (San Diego, CA, USA) 에서구입하여제조사의방법에따라분석하였다. MTT 및 ELISA 측정은 micro plate reader (Bio-Rad), flow cytometry는 BD Accuri C6 를, 세포주의배양은 CO incubator (Thermo Scientific) 를이용하였다. 2.2. 실험방법 2.2.1. RAW 264.7 세포배양 - 쥐유래대식세포주인 RAW 264.7 은한국세포주은행으로부터구입한뒤, 액화질소에냉동보관함으로써추후실험시동일한계대유지를통하여계대차이로인한실험오차를최소화하였다. - RAW 264.7 세포는 10% 우태아혈청 (Fetal bovine serum, FBS), 1% 항생제 (10,000 U/ml Penicillin G, 10,000 μg/ml Streptomycin, 25 μg/ml Amphotericin B) 가첨가된 DMEM 배지를사용하여 37, 5% CO 환경인 incubator 에서배양하였다. 그림4. 대식세포주배양및안정화 - 세포는 cells/ml로 24/96-well 배양플라스크에리나린을동시에접종하고 24시간뒤, 500ng/ml lipopolysaccharide(lps) 를이용하여 12/24 시간자극하였다. 플라보노이드리나린배당체의염증제어능탐색 49
그림 5. 계대배양중인 RAW264.7 세포주의현미경사진 2.2.2. 시료처리 - 리나린 ( 리나린) 은 ChemFaces사에서순도 98% 로구입하여사용하였다. - DMSO와 99.9% Ethanol 각용매에 0.1M의농도로 stock sample을만들어 -80 냉동고 에서보관하고, 실험마다세포배양에이용한동일한배지에희석하여사용하였다. 2.2.3. 세포독성확인 그림 6. MTT 발색법을이용한세포독성측정법 (https://en.wikipedia.org/wiki/mtt_assay#/media/file:mtt_reaction.png) 50 2015년기초연구과제총서
- 세포독성은 96-well plate 에적합한세포수( cells/ml) 로리나린과동시에분주하 고 24 시간동안배양하였다. 그리고 500ng/ml의 LPS로 12시간과 24 시간자극한뒤, 5mg/mL 의 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyltetrazolium bromide (MTT) 용액을이용하여 37 에서 2-4 시간동안반응시킨다. 이때생성된 formazan을 DMSO 에녹여 ELISA reader를이용하여 540nm 에서흡광도를측정하였다. - 리나린이처리된세포의생존정도는대조구의생존정도대비 % 로나타내었다. 그림 7. 모델시스템으로써의들깻잎추출물 LPS를이용한 RAW264.7 세포주분비세포독성확인법확립 플라보노이드리나린배당체의염증제어능탐색 51
2.2.4. 염증성사이토카인측정 그림 8. Sadnwich ELISA법을이용한측량법의개요 (http://anyimages.info/gallerysdwn-sandwich-elisa.htm) - 염증성사이토카인은리나린으로 24시간전처리하고 LPS(500ng/ml) 로 RAW 264.7 세포를 12 시간, 24 시간자극한후상층액을취하였다. 그리고 TNF-α, IL-1β, IL-6 ELISA kit를 이용하여 ELISA reader로 450nm 에서흡광도를측정하였다. - 제조사(eBioscience) 의실험법에따라측정하였으며, 표준곡선을기준으로흡광도에따라 상층액에함유된사이토카인의양을계산하였다. 52 2015년기초연구과제총서
그림 9. IL-6의표준곡선예시 그림 10. 모델시스템으로서의 CLA에의한 RAW264.7 세포주의분비 cytokine 정량법확립 플라보노이드리나린배당체의염증제어능탐색 53
2.2.5. Nitric oxide 측정 그림 11. Griess 시약을이용한 nitrate 발색법 (https://en.wikipedia.org/wiki/griess_test) - Nitric oxide 측정은 Griess 시약을제조하여측정하였다. Griess 시약은 0.1% N-1-naphthylethylene diamine 와 1% sulfanilamide 를 5% phosphoric acid에녹여제조한다. 그리고배양액과동량으로 Griess 시약을넣고 10분간상온에서반응시켜 540nm 에서흡광도를측정하였다. - 상층액에함유된 nitric oxide의정량은 sodium nitrite를표준물질로하여 100μM 부터 0 μm 까지표준검량곡선을이용하여산출하였다. 그림 12. 모델시스템으로서의들깻잎추출물과 LPS를이용한 RAW264.7 세포주분비 Nitric oxide의정량법확립 54 2015년기초연구과제총서
2.2.6. 대식세포의대식능측정 - 대식세포주 RAW 264.7 의대식능은 FITC-latex beads 를주입하고 FACS 를이용하여형광도를 측정하여평가하였다. 세포 ( cells/ml) 와리나린을동시에분주하고 24시간배양한 뒤, 세포만모아 FITC-latex beads 를세포수의 10배넣고 1 시간반응시킨다. 반응후, 300g에서 5분간원심분리하고차가운 PBS로씻어내는과정을 3 번반복한다. 그리고 Flow cytometry (FACS) 를이용하여전체 5000cell 수로측정한다. - 대식능은 FACS로측정한 Mean fluorescence intensity (MFI) 값으로나타낸다. 그림 13. 형광현미경을통한 FITC-latex bead 대식작용확인 2.2.7. 대식세포의세포표면단백질표현측정 - 세포표면단백질은형광표시가된 antibody 를이용하여형광도를측정하여평가하였다. 세포 ( cells/ml) 와리나린을동시에분주하고 24시간배양하고 LPS로 24 시간자극한뒤, 세포만모아먼저 anti-cd16/cd32 Fc block 을넣고 4 에서 15 분간반응시킨다. 그리고 IgG와 anti-mhc class Ⅱ -APC, anti-cd80-fitc 를넣고 4 에서 15 분간반응시키고, 300g에서 5분간원심분리하고차가운 PBS 로씻어내는과정을 3 번반복한다. Flow cytometry (FACS) 를이용하여전체 5000cell 수로측정한다. - 세포표면단백질표현정도는 FACS로측정한 Mean fluorescence intensity (MFI) 값으로 나타낸다. 플라보노이드리나린배당체의염증제어능탐색 55
2.2.8. 통계분석 - 본연구를통하여얻어진결과는 GraphPad PRISM 5.0 프로그램을이용하여분석하였다. one-way ANOVA 로 p<0.05 일때사후분석으로 Tukey's test를실시하여각농도간의 결과차이를검증하였다. 3. 결과및고찰 3.1. 최적시료처리용매및농도확인 - 리나린을녹이는용매로 DMSO 와 99.9% Ethanol 을이용하였는데, Ethanol과달리 DMSO 에 용해시킨리나린 stock 에서결정이형성됨을확인하였다. 따라서최적시료처리용매로 99.9% Ethanol 을선택하였다. - 다양한농도의리나린을처리하여 RAW264.7 세포주의생존율을 MTT 방법을통하여확인한 결과, < 그림 14> 에서보는것과같이 20-40μM 농도에서부터세포독성이나타남을확인 하였다. 그림 14. 리나린에의한 RAW264.7 세포주의생존률감소 56 2015년기초연구과제총서
- 20 μg/ml 이상의농도의리나린이생쥐의비장세포에독성을보인다는연구결과 (Han et al. 2002. Arch Pharm Res. 25: 170-177) 와유사한수치로, 실험의농도를 30, 20, 10, 5, 0μM 로설정하였다. 3.2. 리나린의 RAW 264.7 macrophage에미치는독성확인 그림 15. 농도별리나린에의한 RAW 264.7 세포주의생존율 - 다시설정한농도 (30, 20, 10, 5, 0μM) 에서독성을미치는지확인하였고, 그결과 < 그림 15> 과같이대조구의생존정도대비퍼센트는농도별로유의차가없었다. 다만 12시간에서 0과 30μM 은유의차가있었으나, 약 80% 의생존율로세포독성에큰영향을주지않는것 으로보여진다. 플라보노이드리나린배당체의염증제어능탐색 57
3.3. 염증성사이토카인생성변화 - 실험에서 Tumor necrosis factor (TNF-α), Interleukin-1β (IL-1β), Interleukin-6 (IL-6) 총 3가지의대식세포가 LPS 자극으로생성하는염증성사이토카인을측정하였다. LPS 자극후, IL-6, IL-1β 는농도의존적으로감소하는경향을보였다. 반면, TNF-α는 농도변화에따른사이토카인생성량의큰차이를보이지않았다. < 그림 16> 참조. 58 2015년기초연구과제총서
< 그림 16. 리나린에의한염증성사이토카인생성량> 3.5. Nitric oxide 생성변화 - 염증유도물질인 nitric oxide 는 < 그림 17> 에서보는것과같이 10-30μM 에서감소하였다. 다만 12시간자극후 30μM에서증가했는데이는에러바가큰것으로보아실험적인오차 발생으로값이증가한것처럼보여진다. 그림 17. 리나린에의한 Nitric oxide 생성량 플라보노이드리나린배당체의염증제어능탐색 59
3.6. 대식세포의대식능변화 - 예비실험으로 RAW264.7 세포주를 FITC-microbead 와공배양후, FACS (BD Accuri C6) 장비로분석하였다. 저장된 raw data를 Treestar Flowjo 프로그램을이용하여 FSC vs SSC plot 으로 < 그림 18 좌, P1> macrophage를 gating 한다. P1으로부터 FITC+ population < 그림 18 우, M1> 을 gating 하여총 macrophage 중대식능을보이는세포의분포를확인하였다. 그림 18. FACS 를이용한대식능측정법예시 그림 19. 리나린에의한대식작용변화 60 2015년기초연구과제총서
- 대식능은 Mean fluorescence intensity (MFI) 값으로나타냈으며, 사이토카인과 nitric oxide 경향과유사하게 10-30μM 에서감소함을보였다. < 그림 19> 참조. 3.7. 대식세포의세포표면단백질발현변화 - 예비실험으로 LPS 자극유무에따른세포표면단백질 MHC class Ⅱ의발현의정도를확인 했을때, < 그림 20> 에서보듯이형광도를나타내는그래프가오른쪽으로이동함을알수있 다. 이는세포표면단백질발현이많아져형광 antibody 의부착이많아졌고, 이에따라형광 의세기도강해져그래프가오른쪽으로이동하였다. 그림 20. LPS 자극유무에따른세포표면단백질발현 - MHC class Ⅱ의발현정도는리나린만처리하였을때 < 그림 21. 좌> 는 10-30μM에서감 소함이보여지나, LPS 자극 24 시간후 < 그림 21. 우> 에는 30μM 의농도에서만감소함을보 였다. 플라보노이드리나린배당체의염증제어능탐색 61
그림 21. 리나린에의한 MHC class Ⅱ 발현변화 - CD80 의발현정도는리나린만처리하였을때 < 그림 22. 좌> 는농도별로유의적차이를보이지 않으나, LPS 자극 24 시간후 < 그림 22. 우> 에는농도의존적으로감소하는경향을보였다. 그림 22. 리나린에의한 CD80 발현변화 62 2015년기초연구과제총서
4. 요약 - 0과 5μM 농도와비교했을때, 10-30μM 농도에서는기본적인염증반응을유발하는물질인 nitric oxide와 IL-6, IL-1β, 대식능력이농도의존적으로눈에띄게감소하였다. 세포표면 단백질 MHC class Ⅱ 발현은부분적인감소함을보였으나, CD80의발현은농도의존적으로 감소하는경향을보였다. - 현재까지리나린이염증억제효과를가짐은확인되나, 구체적인기작이밝혀지지않았다. 하지만쥐의귀염증유발모델에리나린을경구투여했을때항염증효과를입증한논문을바탕으로세포수준에서도리나린이항염증효과를가지는것이확실하다고사료된다. 또한리나린을구성하는 acacetin 이동일한세포주실험에서항염증효과를가지는논문을통해 acacetin 구조가염증을억제하는것으로추측해볼수있다. 5. 참고문헌 Han, S., et al. The effect of linarin on lps-lnduced cytokine production and nitric oxide inhibition in murine macrophages cell line RAW264. 7. Archives of pharmacal research, 2002. Kim, Y. Y., et al. Biological activities of linarin from Chrysanthemum zawadskii var. latilobum. Journal-Pharmaceutical Society of Korea, 2001. Pan, M-H., et al. Acacetin suppressed LPS-induced up-expression of inos and COX-2 in murine macrophages and TPA-induced tumor promotion in mice. Biochemical pharmacology, 2006. Yoon 외. Roles of Matrix Metalloproteinases in Tumor Metastasis and Angiogenesis. Int J Mol Med, 2013. 권형주외. 캠퍼롤을유효성분으로포함하는화상치료용조성물 ( 출원번호 1020090010534), 2011. 손승배외. 생쥐경골의골절치료에서캠퍼롤이골절부주변뼈의기계적강도에미치는영향분석. 한국정밀공학회, 2011. Zhang CP, et al. The involvement of P2X3 receptors of rat sympathetic ganglia in cardiac nociceptive transmission. J Physiol Biochem, 2007. Zhang GF, et al. Neuraminidase inhibitory terpenes from endophytic Cochliobolus sp. J Asian Nat Prod Res, 2011. Chen 등. 해조류에서의리나린배당체분리및정제. Food Chem, 2013. 정성희등. 홍화의플라보노이드성분분리및항산화활성. 대한약학회지, 2008. 플라보노이드리나린배당체의염증제어능탐색 63