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천희 국
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1 Journal of Bacteriology and Virology Vol. 40, No. 4 p DOI /jbv Original Article Immunoregulation of Murine Immunocytes to Bifidobacteria Strain Isolated from Feces of Healthy Korean Children: IL-10 Release and Proportional Change of CD4 + CD25 + Cells Dan Jin 1, Bo-Whan Kim 2, Hyeon Cheol Cho 2, Sung-Sik Yoon 3, Yoon-Sun Park 4 and Soo-Ki Kim 2,3 * 1 Immunology and Pathogenic Biology, College of Basic Medicine, Yanbian University, Yanji, China; 3 Division of Biological Science and Technology, College of Science and Technology, Institute of Bioproduct, Yonsei University, Wonju, Korea; 4 Department of Microbiology, Kwandong University of College of Medicine, Gangneung, Korea; 2 Department of Microbiology, Institute of Basic Medical Science, Wonju College of Medicine, Yonsei University, Wonju Korea Bifidobacteria is one of the prototypes of probiotics bacteria, normally inhabitating the intestinal tract of humans. To search for a potent immunoregulatory Bifidobacteria strain, we screened the Bifidobacteria strains isolated from the feces of healthy Korean children. The mrna or protein expression of an anti-inflammatory cytokine, IL-10, from mouse macrophages stimulated with live Bifidobacteria was examined. Of tested strains, Bifidobacteria A28 induced the highest IL-10 gene expression of murine macrophages. To probe immunoregulatory activity of the selected strain on the mice, we evaluated the proportional changes of CD4 + CD25 + surface marker in the murine splenocytes. Flow cytometric analysis showed that the overall percentages of CD4 + CD25 + cells in A28-treated splenocytes were higher than those of untreated splenocytes. In parallel, IL-10 release from A28-treated mouse peritoneal macrophages and splenocytes was significantly higher than that of untreated control cells. Collectively, the Bifidobacteria A28 strain isolated from the feces of healthy Korean children augments the mrna or protein expression of IL-10 release from mouse peritoneal macrophages as well as the proportion of CD4 + CD25 + cells of naïve splenocytes. These provide in vitro scientific clues that Bifidobacteria A28 might be usable for anti-inflammatory disease such as inflammatory bowel disease (IBD). Key Words: Bifidobacteria, IL-10, Macrophage, CD4 + CD25 + cell, Splenocyte 서론 비피더스균 (Bifidobaterium spp.) 은인체장내에상재균으로다양한대사와면역조절기능으로인체에유익 Received: August 20, 2010/ Revised: October 28, 2010 Accepted: November 1, 2010 * Corresponding author: Soo-Ki Kim, M.D., Ph.D. Department of Microbiology, Institute of Basic Medical Science, Wonju College of Medicine, Yonsei University, 162 Ilsan-Dong, Wonju, Gangwon, , Korea. Phone: , kim6@yonsei.ac.kr ** This was supported by R (KOSEF). 한균으로잘알려져있다. 예로비타민을만들어숙주에공급하고소화기능향상, 병원성균의감염예방, 장내균총평형유지, 혈중콜레스테롤저하및항암작용과면역조절기능에도영항을미치는것으로보고되고있다 (1~3). 특히비피더스균은대식세포, 림프구및 NK 세포의활성 (4~6) 을유도하여세포성면역증진및항체생성등의체액성면역을증진시킨다 (7). 또한췌장과파이어반주위면역세포에작용하여세균항원에대한선천면역반응을강화시킨다 (8). 최근과민면역반응의조절과관련된 IL-10과전환성장인자 (transforming growth factor, TGF)-β의분비를증가시키며, 조절성 (regulatory) T 171

2 172 D Jin, et al. 세포증식을유도하여주목받고있다 (9). 그러나, 이전의많은연구에서는서로다른비피더스균을사용하여효능이일관되지않았으며, 인간의장내에서분리한같은속의유산균이라하더라도장내미생물의적응특성상비슷한환경에서분리된균종일수록더큰효과를기대하고있다 (10). 이런증거들은비피더스균을기능성생균제또는의약품으로사용하려면사용목적에따라알맞는균주를선택해야함을제시해주고있다. 본연구에서는한국어린이분변에서분리한비피더스균의여러균주를마우스비장세포와복강대식세포에자극시항염증사이토카인인 IL-10의분비와 CD4 + CD25 + 세포수의변화를조사하여면역조절능이우수한균주를선별하고자하였다. 재료및방법비피더스균주본실험에사용된 11개비피더스균주는연세대학교문리대학생물자원공학과에서한국의건강한어린이분변에서직접분리배양한 300여개의균주중에서선택하여제공받았고, 2개표준균주인 B. catenulactum (ATCC 27539) 와 B. infantis (ATCC 15697) 는 ATCC에서분양받았다. 비피더스균의배양비피더스균은 MRS 액체배지 (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) 를이용하여, 37, 혐기성조건에서 24 시간배양하였다. 배양된균은실온에서원심분리 (2000 rpm/10분 ) 하였고, 균침전물은 phosphate-buffered saline (PBS, ph 7.4) 로두번세척하고나서농도가 cell/ml 되게 PBS로희석하였다. 분리배양은비피더스균을 BL agar (Scharlaru Chemie Microbiology, Barcelona, Spain) 평판배지에접종한후평판을 BBL TM GasPak TM Pouch Sytem (Becton Dickinson Microbiology, Sparks, MD, USA) 에넣고 37 에서 24~48 시간배양하고, 자라난 colony는다시 MRS 액체배지에서배양하였다. 실험동물생후 7주령 SPF급 BALB/c 수컷마우스를오리엔트바이오 (Seongnam, Korea) 에서구입하여연세대학교원주의 과대학동물실험사육실에서온도 22±1, 상대습도 56 ±5%, 12시간명암주기하에서사육하였다. 사료는삼양유지사료 (Wonju, Korea) 의마우스용배합사료를자유롭게먹을수있게하였고, 물은동물실의수돗물을정수하여공급하였다. 일주일간순화기간을거친후마우스를희생시켜비장세포와복강대식세포를분리하였다. 동물실험은동대학동물실험실규칙을준수하였고, 동물윤리위원회규정에의거하여실험하였다. RAW 세포주배양실험에사용된마우스대식세포주인 RAW 264.7은 ATCC 에서분양받아계대배양하여사용하였다. 세포배양은 4 mm L-glutamine, 4,500 mg/l glucose, sodium pyruvate 등이함유된 Dulbecco's modified Eagle media (DMEM, Life Technologies, Grand Island, NY, USA) 배지에 10% 우태아혈청과페니실린 100 IU/ml, 스트렙토마이신 100 μg/ml을첨가하여사용하였다. 마우스복강대식세포분리 BALB/c 마우스에무균처리한 3% thioglycolate broth (Difico Laboratories) 3 ml를복강내주사하고, 3 일후마우스를희생시켜복강을 5 ml의 PBS로 3번세척하여복강액을모은후, 원심분리 (2,000 rpm/10분 ) 하였고, 얻은복강삼출세포중배양판에 1시간부착시킨후부착세포를대식세포로사용하였다. 복강삼출세포는 DMEM에부유시킨후, cell/well 되게 24 well plate에나누어담고 5% CO 2 가함유된 37 배양기에서배양하였다. 마우스비장세포의분리마우스를경추탈구법으로희생시켜비장을꺼냈다. 한쪽에거친면이있는무균유리슬라이드를이용하여비장세포를분리하였다. 분리된세포부유액을원심분리 (1,000 rpm/10분 ) 하였다. 남아있는적혈구는 0.83% NH 4 Cl 로실온에서 5분간용해시키고, PBS로세척하였다. 분리한세포를 10% 우태아혈청이함유된 DMEM 배지에부유시킨후 well 당 개의세포를 24 well plate에나누어담고 5% CO 2 가함유된 37 배양기에서배양하였다. RNA 분리및 cdna 합성 TRIzol Reagent (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad,

3 Immunoregulation of Murine Immunocytes to Bifidobacteria 173 Table 1. Primer sequences and sizes for PCR Target gene Sequence (5' 3') Size -actin Sense TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAG 348 bp Anti-sense TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG IL-6 Sense AATGATGGATGCTACCAAAC 281 bp Anti-sense TAGCCACTCCTTCTGTGACT IL-10 Sense AGAAATCAAGGAGCATTTGA 251 bp Anti-sense CTGCAGGTGTTTTAGCTTT CA, USA) 를이용하여일차분리세포또는세포주의총 RNA를분리하였다. 약술하면, TRIzol 시약으로세포를깬후 chloroform을첨가한후 15초간진탕하였다. 원심분리후에 RNA가포함된상층액을 tube에옮겨담고 isopropanol 를첨가하여상온에 10분간두었다가원심분리 (12,000 rpm/15분 ) 하였다. 다음 RNA 침전물을제외한나머지용액을버리고 75% 에탄올을첨가하여혼합한후 4 에서원심분리 (7,500 rpm/10 분 ) 하였다. 이후상층액은제거하고 RNA 침전물을공기중에서건조시킨후 RNase 와 DNase를포함하지않은증류수로 RNA를녹이고정량하였다. cdna를합성하기위해 1 μg의 RNA, 500 ng의 oligo-dt primer, 15 U avian myeloblastosis virus 역전사효소, 20 U의 RNase inhibitor, 1 mm의 dntp, 5 mm의 MgCl 2 를혼합하여반응액을만든후 (Reverse Transcription System A3500: Promega, Madison, WI, USA) GeneAmp PCR system (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 을이용하여 42 에서 1시간반응시킨후 95 에서 5분간, 4 에서 10분간두었다가실험에사용할때까지 -20 에보관하였다. 반정량-중합효소연쇄반응 (semi quantitative PCR) 역전사반응의결과로만들어진 cdna는각각의실험목적에맞게 IL-10, IL-6, 및 β-actin에대한 primer을사용하여증폭하였다. 중합효소연쇄반응을수행하기위해 cdna 1 μl, 10 완충용액 (100 mm Tris-HCl, ph 8.3, 500 mm KCl, 15 mm MgCl 2 ), 0.2 mm dntp, 1.25 U Taq polymerase (Takara Biochemicals, Shiga, Japan), primer를넣어서 25 μl의반응액을만든후 GeneAmp PCR system 2400 (Applied Biosystems) 에넣고적절한조건으로중합효소연쇄반응을수행하였다. 중합효소반응에사용된 primer 서열과증폭조건은 Table 1과 Table 2에제시하였다. 중합 Table 2. Experimental condition for PCR Primer cdna ( l) Annealing temperature ( ) Cycle -actin IL IL 효소연쇄반응의산물은 1.5% agarose gel에 50 mv, 40분간전기영동하여관찰하였다. 유세포측정 (flow cytometry, FACS) 비피더스균으로처리된비장세포를 FITC-anti-CD4 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) 와 PE-anti- CD25 (Santa Cruz Biotechnology) 단일클론항체로 4 에서 30분간염색한후 PBS로세척하였다. 다시 PBS로세포를부유시키고, 유세포측정기를이용하여분석하였다. 결과분석은 WinMDI 2.8 분석프로그램을이용하였다. 효소면역측정법 (enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) 마우스대식세포와비장세포를 24-well plate에각각 cell/ml씩넣고각 well에비피더스 A28 균주 ( bacteria/ml) 또는 LPS (Sigma, St Louis, MO, USA) (100 ng/ml) 를첨가하고 24시간배양한후배양상층액을모아 -70 에보관하였다. 세포배양상층액에유리되어있는 IL-10의양을측정하기위하여 sandwich ELISA를수행하였다. 표준항원으로마우스 IL-10 (R&D System, Minneapolis, MN, USA) 을사용하였고, capture 항체및검출항체는 anti-mouse IL-10 (BD Biosciences, San Diego, CA, USA) 을사용하였다. 항마우스 IL-10 항체로 96-well plate 에 well당 4 μg/ml로 4 에서 12시간반응시킨후차단

174 D Jin, et al. Figure 1. Expression of IL-10 mrna in RAW 264.7 cells treated with various Bifidus strains. Lane 1, control; Lane 2, LPS 100 ng/ml; Lane 3, B. infantis; Lane 4, B.

Expression of IL-10 mrna in mouse peritoneal macrophage treated with various Bifidus strains.

4 174 D Jin, et al. Figure 1. Expression of IL-10 mrna in RAW cells treated with various Bifidus strains. Lane 1, control; Lane 2, LPS 100 ng/ml; Lane 3, B. infantis; Lane 4, B. catenulactum; Lane 5, A1; Lane 6, A2; Lane 7, A5; Lane 8, A13; Lane 9, A14; Lane 10, A16; Lane 11, A28; Lane 12, A34; Lane 13, B17; Lane 14, B2730; Lane 15, YM112 Figure 2. Expression of IL-10 mrna in mouse peritoneal macrophage treated with various Bifidus strains. Lane 1, control; Lane 2, LPS 100 ng/ml; Lane 3, A1; Lane 4, A2; Lane 5, A5; Lane 6, A13; Lane 7, A14; Lane 8, A16; Lane 9, A28; Lane 10, A34; Lane 11, B17; Lane 12, B2730; Lane 13, YM112; Lane 14, B. infantis; Lane 15, B. catenulactum 용액을넣고실온에서 2시간방치하였다. 표준 IL-10 항원과측정하고자하는세포배양상층액을 100 μl/well 씩넣고실온에서 2시간반응시켰다. 세척후 biotinylated 항마우스 IL-10 항체 (500 ng/ml) 를 well당 100 μl씩분주하여실온에서 1시간반응시킨후세척하였다. Avidin HRP (1:1,000, BD Biosciences) 용액으로실온에서 30분간반응시킨후세척하고 TMB substrate reagent (BD Biosciences,) 을분주하여 30 분간반응시켰다. 이후정지용액을넣어반응을정지시킨다음파장 430 nm에서흡광도를측정하였다. 결과비피더스균주를 RAW 세포주처리시 IL-10 과 IL-6 mrna의발현비피더스균주 13개를각각 RAW264.7 세포주에처리하여 IL-10 mrna의발현을관찰하였고, 동시에친염증성사이토카인 (proinflammatory cytokine) 인 IL-6의발현을관찰하였다. 그결과 A5, A28과 YM11의 3개균주가다른균주들에비해 RAW264.7 세포주로부터 IL-10 mrna를비교적높게발현시켰다. 또한 YM112와 B273 균주는 IL-6 mrna의발현을증가시키는반면에, IL-10 mrna의발현을증가시켰던 A5와 A28 균주는 IL-6 mrna 발현증가가나타나지않았다 (Fig. 1). 비피더스균주를마우스복강대식세포에처리시 IL- 10 mrna의발현 11개균주와 ATCC 표준균주 2개를각각 BALB/c 마우스복강에서분리한대식세포에 2시간동안처리한뒤 RT-PCR 방법으로 IL-10 mrna 발현을관찰하였다. 그결과 A28과 YM112 균에의해 IL-10 mrna가가장많이발현되었다 (Fig. 2). 선발된비피더스균주 (A28) 의마우스복강대식세포와비장세포에각각처리시 IL-10 분비능및 CD4 + CD25 + 세포수의변화 A28 균주를마우스복강대식세포와비장세포에자극한후 IL-10 분비를 ELISA 방법으로측정하였다. 그결과마우스복강대식세포와비장세포모두에서 A28 균주를처리시 IL-10의분비가증가하였다 (Fig. 3). 그리고마우스비장세포에 A28 균주를처리한다음 CD4 + CD25 + 세포수의변화에대해관찰한결과, A28 균주를처리한

Immunoregulation of Murine Immunocytes to Bifidobacteria 175 A B Figure 3. Production of IL-10 by mouse peritoneal macrophages (A) and splenocytes (B) treated with Bifidus strain A28.

5 Immunoregulation of Murine Immunocytes to Bifidobacteria 175 A B Figure 3. Production of IL-10 by mouse peritoneal macrophages (A) and splenocytes (B) treated with Bifidus strain A28. A B C D E Figure 4. Proportional increment of CD4 + CD25 + T cell in mouse splenocytes treated with Bifidus strain A28. A: CD4 + CD25 + expression in A28-untretaed mouse splenocytes; B: CD4 + CD25 + expression in A28 (10 5 cells/ml)-treated mouse splenocytes; C: CD4 + CD25 + expression in A28 (10 6 cells/ml)-treated mouse splenocytes; D: CD4 + CD25 + expression in A28 (10 7 cells/ml)-treated mouse splenocytes; E: Comparative CD4 + CD25 + expression in different numbers of A28-treated mouse splenocytes. Data were expressed as Mean ± standard error and analyzed with one-way ANOVA (*p < 0.05). 비장세포에서처리하지않은세포에비해 CD4 + CD25 + 세포수가증가하였다. 즉, 처리한세균수에비례하여 CD4 + CD25 + 세포수의증가를관찰할수있었다 (Fig. 4).

6 176 D Jin, et al. 고찰본연구결과에서비피더스균은체외실험에서면역세포를활성화하여친염증성과항염증성사이토카인을분비를유도하였다. Marin 등 (11) 의연구에서 14개의비피더스균주를각각마우스대식세포주 RAW264.7 세포와 T 세포주 EL-4에처리했을때 TNF-α, IL-6, IL-2와 IL-5 등의사이토카인분비증가를관찰할수있었는데, 모든균주가같은반응을보이지않으며, 이중 4개균주가사이토카인생성능이가장우수하였다고보고하였다. 이는비피더스균이균주에따라면역세포에대한사이토카인생성유도에차이가있음을시사한다. He 등 (12) 이건강한어린이와어른의분변, 알러지환자의분변그리고유제품에서분리한 27개비피더스균들이마우스대식세포주인 J774.1 세포에미치는영향과 Park 등 (13) 이시행한건강한사람변에서분리한 24개비피더스균들이 RAW264.7 세포에미치는영향에대한조사에서 TNF-α 와 IL-6의분비가균주마다차이가났다. 또한 Young 등 (14) 은아토피성질환이환률이높은뉴질랜드와영국의신생아변에서주로 B. adolescentis, B. bifidum, B. longum과 B. pseudocatenulatum을분리하였고, 아토피성질환발병률이낮은 Ghana의신생아변에서는주로 B. infantis를분리하였다. 이는장내균총중비피더스균의종류가아토피성질환의발생과관련성을시사한다. 동일연구에서각균주의가지세포 (dendritic cell) 에미치는반응에대한조사에서어떤비피더스균은종이같으면비슷한반응을보였고, 어떤비피더스균은종이같더라도균주가틀리면서로다른반응을나타냈다. 이것은비피더스균의면역자극기능은균종특이성뿐만아니라균주에의한특이성을시사한다 (14). 이러한결과들은비피더스균을식품으로또는의약품으로사용시목적에따라알맞은균주를선택하여사용해야함을시사한다. 본연구에서는한국의건강한어린이분변에서분리배양한비피더스균주 11개와 ATCC 표준균주 2개중에서항염증효과가있는균주를선별하고자하였다. IL-10 은항염증사이토카인중의하나로서활성화된대식세포, 단핵구, 가지세포의기능을억제하는면역조절능이보고되고있다 (15). 그러므로본연구에서는항염증효과가가장강한비피더스균주를선별하고자 13개균주를 RAW 세포와마우스복강대식세포에처리하여 IL- 10 mrna의발현을관찰하였다. 그결과 A28과 YM112 균주는두가지세포에서모두 IL-10 mrna 발현을강하게유도하였다. 그러나그중 YM112 균주는 RAW264.7 세포에서친염증사이토카인인 IL-6의발현도많이유도하였으므로최종적으로 A28 균주가항염증효과가가장우수한균주로판단되어선별하였다 (Fig. 1). 위에서선별된비피더스 A28 균주의 IL-10 생성자극의효과를조사하기위하여 A28 균주를마우스복강대식세포와비장세포에처리하여 IL-10의분비를 ELISA 방법으로측정하였다. 결과 A28 균주를처리한마우스복강대식세포나비장세포에서모두 IL-10의분비가처리하지않은세포에비해의미있게증가되었다 (p < 0.05). 이는본균주가 RNA 수준에서뿐만아니라단백질수준에서도 IL-10의분비를증가할수있음을나타낸다. CD4 + CD25 + 조절성 T 세포는보조 T 세포의아군 (subgroup) 으로서면역내성및숙주의조직특이성자가면역반응을억제하는등면역조절기능을갖고있다 (16, 17). 그리고 Niers 등은비피더스를포함한총 13개유산균을사람의말초혈액단핵구에자극하여 IL-10과같은사이토카인을분비하는량이균마다서로다르고, 또한일부비피더스균 (B. bifidum, B. infantis 등 ) 이 CD4 + CD25 + 세포의수도증가시킨다고하였다 (18). Gill 등또한 B. lactis HN019 균주를복용한중년층들의말초혈액에서 CD4 + 세포와활성화된 CD25 + 세포의수가증가되었다고보고하였다 (19). 이러한연구결과는비피더스균주가 CD4 + CD25 + 면역조절성 T 세포변화에영향을줄것이라는것을제시하고있다. 본연구에서도 A28 균주로마우스비장세포자극시 CD4 + CD25 + 세포의수가증가하였음을관찰할수있었으나, Foxp3의발현은측정하지못하여면역조절 T 세포의증가를입증하지못하였다. 최근 CD4 + CD25 + T 세포와관련하여 Foxp3의발현이면역조절 T 세포의특징이므로이를조사한다면 A28 균주에의한면역조절기전규명에기여할것으로생각된다. 그러나선별된 A28 균주가마우스면역세포에자극하여 IL-10의분비와 CD4 + CD25 + 세포의수를증가시킨다는사실은생체내에서도면역조절의가능성을제시하고있다. 본연구에서는한국의건강한어린이분변에서항염증및면역조절효과를갖는 Bifidobacteria A28 균주를시험관내선별하였고, 이균주를향후염증성장질환의연구에사용될수있는기본자료를제시하였다.

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α α α α α α α α 太陰調胃湯加減方 dbdb 마우스 肝에 대한 아디포사이토카인 및 발현에 미치는 영향 SREBPs 와 섞어서 하고 마커 또한 하여 전기 영동을 하였다 전기영동을 한 후에 에 를 쪼여서 각 를 확인하였다 이 를 프로그램을 이용해 수치화하 여 분석하였다 肝 조직 동결 절편 분리한 조직은 로 시간 동안 고정 시킨 후 에 세척한 후 물기를